Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

पतली परत क्रोमेटोग्राफी द्वारा माइकोबैक्टीरिया की लिपिड संरचना का विश्लेषण

Published: April 16, 2021 doi: 10.3791/62368
Automatic Translation
1, 1, 1
1Departament de Genètica i de Microbiologia, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

Summary

माइकोबैक्टीरिया की एक विस्तृत श्रृंखला की सेल दीवार की कुल लिपिड सामग्री निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है। इसके अलावा, विभिन्न प्रकार के माइकोलिक एसिड के निष्कर्षण और विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल दिखाए जाते हैं। इन माइकोबैक्टीरियल यौगिकों की निगरानी के लिए एक पतली परत क्रोमेटोग्राफिक प्रोटोकॉल भी प्रदान किया जाता है।

Abstract

माइकोबैक्टीरिया प्रजातियां विकास की दर, पिगमेंटेशन की उपस्थिति, ठोस मीडिया पर प्रदर्शित कॉलोनी आकृति विज्ञान, साथ ही अन्य फेनोटाइपिक विशेषताओं में एक-दूसरे से भिन्न हो सकती हैं। हालांकि, वे सभी आम में माइकोबैक्टीरिया के सबसे प्रासंगिक चरित्र हैं: इसकी अनूठी और अत्यधिक हाइड्रोफोबिक सेल दीवार। माइकोबैक्टीरिया प्रजातियों में झिल्ली-सहसंयोजक लिंक्ड कॉम्प्लेक्स होता है जिसमें अरबिनोगालेक्टन, पेप्टिडोग्लाइकन और माइकोलिक एसिड की लंबी श्रृंखला शामिल होती है, जो माइकोबैक्टीरिया प्रजातियों के बीच भिन्न होती है। इसके अतिरिक्त, माइकोबैक्टीरिया लिपिड का उत्पादन भी कर सकता है जो उनकी कोशिका सतहों पर स्थित हैं, गैर-सहसंयोजक रूप से जुड़े हुए हैं, जैसे कि फथियोसेरोल डिमिकोसेरोसेट (पीडीआईएम), फिनोलिक ग्लाइकोक्लिपिड्स (पीजीएल), ग्लाइकोपेप्टिडोक्लिपिड्स (जीपीएल), अकिल्ट्रेहलोस (एए) या फोस्फेटिडिल-इनोसिटॉल मैनसाइडो (पीआईएसएम), दूसरों के बीच। उनमें से कुछ को रोगजनक माइकोबैक्टीरिया में उग्रता कारक माना जाता है, या मेजबान-माइकोबैक्टीरिया इंटरैक्शन में महत्वपूर्ण एंटीजेनिक लिपिड। इन कारणों से, कई क्षेत्रों में उनके आवेदन के कारण माइकोबैक्टीरियल लिपिड के अध्ययन में महत्वपूर्ण रुचि है, माइकोबैक्टीरिया संक्रमणों की रोगजनकता में उनकी भूमिका को समझने से, संक्रामक रोगों और कैंसर जैसी अन्य विकृतियों के उपचार के लिए इम्यूनोमोडुलेटरी एजेंटों के रूप में संभावित प्रभाव तक। यहां, कुल लिपिड सामग्री को निकालने और विश्लेषण करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण और कार्बनिक सॉल्वैंट्स के मिश्रण का उपयोग करके एक ठोस माध्यम में उगाई जाने वाली माइकोबैक्टीरिया कोशिकाओं की माइकोलिक एसिड संरचना प्रस्तुत की जाती है। एक बार लिपिड अर्क प्राप्त हो जाने के बाद, निकाले गए यौगिकों की निगरानी के लिए पतली परत क्रोमेटोग्राफी (टीएलसी) किया जाता है। उदाहरण प्रयोग चार अलग-अलग माइकोबैक्टीरिया के साथ किया जाता है: पर्यावरण तेजी से बढ़ते माइकोलिसिबैक्टीरियम ब्रूमे और माइकोलिसिबैक्टीरियम फोर्टुइटम, तनु धीमी गति से बढ़ते माइकोबैक्टीरियम बोविस बैसिलस कैलमेट-गुएरिन (बीसीजी), और अवसरवादी रोगजनक तेजी से बढ़ते माइकोबैक्टीरियम फोड़ा, यह प्रदर्शित करता है कि वर्तमान प्रोटोकॉल में दिखाए गए तरीकों का उपयोग माइकोबैक्टीरिया की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए किया जा सकता है।

Introduction

Mycobacterium एक जीनस है जिसमें रोगजनक और गैर-रोगजनक प्रजातियां शामिल हैं, जो उनके अजीब लिपिड द्वारा गठित अत्यधिक हाइड्रोफोबिक और अभेद्य कोशिका दीवार होने की विशेषता है। विशेष रूप से, माइकोबैक्टीरियल सेल वॉल में माइकोलिक एसिड होता है, जो α-alkyl और β-हाइड्रोक्सी फैटी एसिड हैं, जिसमें α-शाखा सभी माइकोलिक एसिड (लंबाई को छोड़कर) में स्थिर है और β-श्रृंखला, जिसे मेरोमायकोलेट चेन कहा जाता है, एक लंबी एलिफेटिक चेन है जिसमें साहित्य के साथ वर्णित विभिन्न कार्यात्मक रासायनिक समूह हो सकते हैं (α-, α', मेथॉक्सी इसलिए सात प्रकार के माइकोलिक एसिड (आई-VII) का उत्पादन करते हैं, एपॉक्सी-, कार्बोक्सी-, और ω-1-मेथॉक्सी-माइकोलेट्स, इसलिए सात प्रकार के माइकोलिक एसिड का उत्पादन करते हैं1. इसके अलावा, साइबर महत्व वाले अन्य लिपिड भी माइकोबैक्टीरिया प्रजातियों की सेल दीवार में मौजूद हैं। रोगजनक प्रजातियां जैसे Mycobacterium tuberculosis, तपेदिक का कारक एजेंट2 विशिष्ट लिपिड-आधारित उग्रता कारकों जैसे कि फेथियोसेरोल डिमिकोसेरोसेट (पीडीआईएम), फेनोलिक ग्लाइकोलिपिड (पीजीएल), डी-, त्रि-और पेंटा-एकिलट्रेहलोस (डैट, टीएटी, और पैट), या सल्फोलिपिड्स का उत्पादन करें।3. माइकोबैक्टीरियल सतह पर उनकी उपस्थिति मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को संशोधित करने की क्षमता के साथ जुड़ी हुई है और इसलिए, मेजबान के अंदर माइकोबैक्टीरियम का विकास और दृढ़ता4. उदाहरण के लिए, ट्राइसिलग्लिसेरोल (टैग) की उपस्थिति वंश 2-बीजिंग उप-वंश के हाइपरवायरुलेंट फेनोटाइप के साथ जुड़ी हुई है M. tuberculosis, संभवतः मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को कम करने की अपनी क्षमता के कारण5,6. अन्य प्रासंगिक लिपिड तपेदिक और गैर-ट्यूबरकस माइकोबैक्टीरिया में मौजूद लिपूलिगोसाकराइड्स (एलओएस) हैं। के मामले में Mycobacterium marinum, इसकी सेल दीवार में LOSs की उपस्थिति फिसलने गतिशीलता और बायोफिल्म बनाने की क्षमता से संबंधित है और मैक्रोफेज पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स द्वारा मान्यता के साथ हस्तक्षेप करती है, जो मेजबान फैगोसाइट्स द्वारा बैक्टीरिया को तेज और उन्मूलन को प्रभावित करती है7,8. इसके अतिरिक्त, कुछ लिपिड की अनुपस्थिति या उपस्थिति मेजबान कोशिकाओं के साथ बातचीत करते समय उग्र या क्षीण प्रोफाइल के साथ विभिन्न मॉर्फोटाइप में वर्गीकृत होने की अनुमति देती है। उदाहरण के लिए, किसी न किसी मॉर्फोटाइप में ग्लाइकोपिप्टिडोक्लिपिड्स (जीपीएल) की अनुपस्थिति Mycobacterium abscessus इंट्राफागोसोमल एसिडिफिकेशन को प्रेरित करने की क्षमता से जुड़ा हुआ है, और इसके परिणामस्वरूप सेल एपोप्टोसिस9, चिकनी मॉर्फोटाइप के विपरीत जो उनकी सतह में जीपीएलएस के पास होता है। इसके अलावा, माइकोबैक्टीरियल सेल वॉल की लिपिड सामग्री मेजबान में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को संशोधित करने की क्षमता से संबंधित है। यह विभिन्न विकृतियों के खिलाफ एक सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल को ट्रिगर करने के लिए कुछ माइकोबैक्टीरिया का उपयोग करने के संदर्भ में प्रासंगिक है10,11,12,13. उदाहरण के लिए, यह प्रदर्शित किया गया है कि Mycolicibacterium vaccae, एक सैप्रोफाइटिक माइकोबैक्टीरियम, जो वर्तमान में तपेदिक के लिए इम्यूनोथेराप्यूटिक वैक्सीन के रूप में तीसरे चरण के नैदानिक परीक्षणों में है, दो औपनिवेशिक मॉर्फोटाइप प्रदर्शित करता है। जबकि चिकनी फेनोटाइप, जिसमें इसकी सतह में एक पॉलिएस्टर होता है, Th2 प्रतिक्रिया को ट्रिगर करता है, पॉलिएस्टर से रहित मोटा फेनोटाइप एक Th1 प्रोफ़ाइल को प्रेरित कर सकता है जब यह मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बातचीत करता है14. माइकोबैक्टीरियल सेल में मौजूद लिपिड का प्रदर्शनों की सूची न केवल माइकोबैक्टीरिया प्रजातियों पर निर्भर करती है, बल्कि माइकोबैक्टीरियल संस्कृतियों की स्थितियों पर भी निर्भर करती है: समय इनक्यूबेशन15,16 या संस्कृति माध्यम की संरचना17,18. वास्तव में, संस्कृति माध्यम संरचना में परिवर्तन एंटीट्यूमर और इम्यूनोस्टिमुलेटरी गतिविधि को प्रभावित करते हैं M. bovis बीसीजी और Mycolicibacterium brumae in vitro17. इसके अलावा, सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल से शुरू M. bovis बीसीजी के खिलाफ M. tuberculosis चूहों मॉडल में चुनौती भी संस्कृति मीडिया जिसमें M. bovis बीसीजी बढ़ता है17. ये तब प्रत्येक संस्कृति स्थिति में माइकोबैक्टीरिया की लिपिड संरचना से संबंधित हो सकते हैं। इन सभी कारणों से, माइकोबैक्टीरिया की लिपिड सामग्री का अध्ययन प्रासंगिक है। माइकोबैक्टीरियल सेल दीवार की लिपिड संरचना को निकालने और विश्लेषण करने के लिए एक दृश्य प्रक्रिया प्रस्तुत की गई है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. माइकोबैक्टीरिया से कुल गैर-सहसंयोजक-लिंक्ड्स कानिष्कर्षण (चित्रा 1)

  1. एक ठोस मीडिया से माइकोबैक्टीरिया के स्क्रैच 0.2 ग्राम और पॉलीटट्राफ्लोरोएथलीन (पीटीएफई) लाइनर स्क्रू कैप के साथ एक ग्लास ट्यूब में जोड़ें। क्लोरोफॉर्म के 5 एमएल और मेथनॉल के 10 एमएल (क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल, 1:2) से मिलकर एक समाधान जोड़ें।
    नोट: जब ऑर्गेनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग किया जाता है, तो केवल ग्लास प्राप्तकर्ता का उपयोग किया जाना चाहिए। प्लास्टिक के कंटेनरों की अनुमति नहीं है। इसके अलावा, बोतलों के लिए PTFE लाइनर स्क्रू कैप की जरूरत है।
    सावधानी: क्लोरोफॉर्म एक संभावित विषाक्त और अत्यंत खतरनाक पदार्थ है। इसका उपयोग उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक आईवियर, और नाइट्रिल दस्ताने) पहने हुए लेमिनार फ्लो हुड में किया जाना चाहिए।
    सावधानी: मेथनॉल एक संभावित विषाक्त और अत्यंत खतरनाक पदार्थ है। इसका उपयोग उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक आईवियर, और नाइट्रिल दस्ताने) पहने हुए लेमिनार फ्लो हुड में किया जाना चाहिए।
  2. माइकोबैक्टीरियल सेल सतह से गैर-सहसंयोजक-लिंक्ड्स निकालने के लिए रात भर लगातार सरगर्मी में ट्यूब छोड़ दें।
    नोट: यदि एक कक्षीय मिलाते हुए मंच उपलब्ध नहीं है, तो लगातार सरगर्मी को आवधिक मैनुअल सरगर्मी द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  3. एक फ़िल्टर पेपर के साथ एक ग्लास कीप को कवर करें, ऑर्गेनिक सॉल्वैंट्स को फ़िल्टर करें, और उन्हें ग्लास ट्यूब में इकट्ठा करें।
  4. ट्यूब में तरल चरण को वाष्पित करने के लिए नाइट्रोजन गैस प्रवाह का उपयोग करें। ट्यूब को नाइट्रोजन गैस से भरें, कवर करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: विशेष रूप से वांछित ट्यूब को वाष्पित करने के लिए नाइट्रोजन गैस की धारा में एक ग्लास पाश्चर पिपेट कनेक्ट करें। इसके अतिरिक्त, ट्यूब के लिए एक सूखी ब्लॉक हीटर के अंदर ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। जब सॉल्वेंट वाष्पित हो जाए तो उसे बंद करने से पहले ट्यूब को नाइट्रोजन गैस से भर दें।
  5. क्लोरोफॉर्म के समाधान के 15 एमएल जोड़ें: सेलुलर मलबे में मेथनॉल (2:1)। माइकोबैक्टीरियल सेल सतह से गैर-सहसंयोजक-लिंक्ड्स निकालने के लिए रात भर लगातार सरगर्मी में ट्यूब छोड़ दें।
    नोट: यदि एक कक्षीय मिलाते हुए मंच उपलब्ध नहीं है, तो लगातार सरगर्मी को आवधिक मैनुअल सरगर्मी द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  6. मिश्रण को 1 घंटे के लिए आराम करने दें। एक पाश्चर पिपेट के साथ, ऑर्गेनिक सॉल्वैंट्स को ठीक करें। एक फिल्टर पेपर के साथ एक ग्लास कीप को कवर करें और ऑर्गेनिक सॉल्वैंट्स को फ़िल्टर करें और उन्हें पहले चरण 1.3 में उपयोग की जाने वाली उसी ग्लास ट्यूब में एकत्र करें। ट्यूब में तरल चरण को वाष्पित करने के लिए नाइट्रोजन गैस प्रवाह का उपयोग करें। ट्यूब को नाइट्रोजन गैस से भरें, इसे बंद कर दें और इसे फिर से 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. एसिड मेथनथेनोसिस द्वारा माइकोलिक एसिड निष्कर्षण(चित्रा 2A)

  1. एक पीएफई लाइनर स्क्रू कैप के साथ एक हर्मेटिक ग्लास ट्यूब में 2-5 एमएल एस्टेरिफाइंग समाधान जोड़ें। ग्लास ट्यूब में 0.2 ग्राम माइकोबैक्टीरिया बायोमास जोड़ें।
    नोट: मेथनॉल के 30 एमएल, टोल्यून के 15 एमएल और सल्फ्यूरिक एसिड के 1 एमएल को मिलाकर एस्टेरिफिंग सॉल्यूशन बनता है। माइकोबैक्टीरिया कोशिकाओं को ठोस संस्कृतियों से लिया जा सकता है या यहां तक कि माइकोबैक्टीरिया (चरण 1.6 में फ़िल्टर करने के बाद शेष कोशिकाओं) से कुल गैर-सहसंयोजक-लिंक्ड्स के निष्कर्षण के बाद भी, परिसीमन कोशिकाओं से।
    सावधानी: टोल्यून एक ज्वलनशील और बेहद खतरनाक पदार्थ है। इसका उपयोग उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक आईवियर, और नाइट्रिल दस्ताने) पहने हुए लेमिनार फ्लो हुड में किया जाना चाहिए।
    सावधानी: सल्फ्यूरिक एसिड एक संक्षारक और खतरनाक पदार्थ है। इसका उपयोग उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक आईवियर, और नाइट्रिल दस्ताने) पहने हुए लेमिनार फ्लो हुड में किया जाना चाहिए।
  2. भंवर से सामग्री मिलाएं। मिश्रण को रात भर 80 डिग्री सेल्सियस पर सूखे स्नान के अंदर खड़े होने दें।
  3. ट्यूब को ठंडा होने दें जब तक कि यह कमरे के तापमान तक न पहुंच जाए और फिर ट्यूब में एन-हेक्सेन का 2 एमएल जोड़ें। 30 एस के लिए भंवर से सामग्री मिलाएं और ट्यूब को दो स्पष्ट चरण दिखाई देने तक व्यवस्थित करने की अनुमति दें।
    सावधानी: एन-हेक्सान एक संभावित ज्वलनशील, अड़चन, पर्यावरण की दृष्टि से हानिकारक और बेहद खतरनाक पदार्थ है। इसका उपयोग उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक आईवियर, और नाइट्रिल दस्ताने) पहने हुए लेमिनार फ्लो हुड में किया जाना चाहिए।
  4. एन-हेक्सेन चरण के अनुरूप ऊपरी चरण को ठीक करें। इसे एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. चरण 2.3 दोहराएं। ऊपरी चरण को फिर से ठीक करें और इसे चरण 2.4 में उपयोग की जाने वाली उसी ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. नाइट्रोजन गैस प्रवाह का उपयोग करके ट्यूब की सामग्री को वाष्पित करें। ट्यूब को नाइट्रोजन गैस से भरें, उसे बंद कर दें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. सैपोनिफिकेशन और मिथाइलेशन द्वारा माइकोलिक एसिड एक्सट्रैक्ट्रैकरेशन(चित्रा 2B)

  1. एक ठोस मीडिया से माइकोबैक्टीरिया के स्क्रैच 0.2 ग्राम और एक PTFE स्क्रू कैप के साथ एक ग्लास ट्यूब में जोड़ें।
  2. 5% पोटेशियम हाइड्रोक्साइड युक्त मेथनॉल-बेंजीन समाधान (80:20) के 2 एमसीएल जोड़ें। भंवर से सामग्री मिलाएं। मिश्रण को 3 घंटे के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
    सावधानी: बेंजीन एक ज्वलनशील, कैंसरजनक और खतरनाक पदार्थ है। इसका उपयोग उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक आईवियर, और नाइट्रिल दस्ताने) पहने हुए लेमिनार फ्लो हुड में किया जाना चाहिए।
  3. ट्यूब को कमरे के तापमान में ठंडा करने दें। पीएच = 1 प्राप्त करने के लिए नमूनों को अम्लीय करने के लिए 20% सल्फ्यूरिक एसिड जोड़ें।
  4. डायथिल ईथर के 3 एमएल जोड़ें। धीरे-धीरे भंवर से सामग्री मिलाएं।
  5. बसने से दोनों चरणों को रूप दें। डायथिल ईथर चरण को ठीक करें और एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। कुल तीन बार वॉश स्टेप दोहराएं।
  6. डिथाइल ईथर निकालने को 2 एमएल आसुत पानी से धोएं और ऊपरी हिस्से को डायथिल ईथर के अनुरूप एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। कुल तीन बार वॉश स्टेप दोहराएं।
  7. इसे सुखाने के लिए डायथिल ईथर एक्सट्रैक्ट पर 2 ग्राम निर्जल सोडियम सल्फेट डालें।
  8. निलंबन को फ़िल्टर करें। नाइट्रोजन गैस प्रवाह का उपयोग करके सामग्री को वाष्पित करें।
  9. मिथाइलेशन स्टेप करने के लिए, डिथाइल ईथर के 45 एमएल और आसुत पानी में 40% कोह के 9 एमएल द्वारा गठित एक प्रीकूल्ड समाधान में एन-नाइट्रोसो-एन-मिथाइल यूरिया के 3 ग्राम को भंग करें।
    सावधानी: एन-नाइट्रोसो-एन-मिथाइल्यूरिया एक विषाक्त, अड़चन, कैंसरजनक और खतरनाक पदार्थ है। इसका उपयोग उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक आईवियर, और नाइट्रिल दस्ताने) पहने हुए लेमिनार फ्लो हुड में किया जाना चाहिए।
  10. पोटेशियम हाइड्रोक्साइड छर्रों (लगभग 30 ग्राम) युक्त बर्फ में ठंडा एक नए फ्लास्क में सुपरनैंट (डायजेओमेथेन) स्थानांतरित करें।
    नोट: यदि सुपरनेट का तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है, तो इसे अधिकतम 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    सावधानी: पोटेशियम हाइड्रोक्साइड छर्रों एक अड़चन और संक्षारक पदार्थ हैं। इस सामग्री का उपयोग उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक आईवियर और नाइट्रिल दस्ताने) पहने हुए लेमिनार प्रवाह हुड में किया जाना चाहिए।
    सावधानी: डायज़ोमेथेन अत्यधिक विषाक्त और संभावित विस्फोटक है। इसका उपयोग उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक आईवियर, और नाइट्राइल दस्ताने) पहने हुए सुरक्षा ग्लास के साथ एक लेमिनार प्रवाह हुड में किया जाना चाहिए।
  11. डायोज़ोमेथेन युक्त ईथर समाधान के 2 एमएल जोड़ें, जो चरण 3.10 में प्राप्त किया गया है, सूखे डायथाइल ईथर अर्क में जिसमें माइकोलिक एसिड होता है, जो चरण 3.8 में प्राप्त होता है। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  12. निलंबन को 40 डिग्री सेल्सियस पर वाष्पित करें। ट्यूब को नाइट्रोजन गैस से भरें, इसे बंद करें, और मेथिलेटेड लिपिड को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: लैमिनार प्रवाह हुड के तहत ईथर समाधान से डायजोल को वाष्पित करें, जब तक कि ईथर पीला रंग खो न दे।

4. पतली परत क्रोमेटोग्राफी (टीएलसी) विश्लेषण

  1. ग्लास टीएलसी चैंबर को संतृप्त करें। ऐसा करने के लिए, टीएलसी चैंबर की दीवारों में से एक को फिल्टर पेपर के टुकड़े से कवर करें और इसे सॉल्वैंट्स के मिश्रण द्वारा रचित मोबाइल चरण के संपर्क में रहने दें। सॉल्वेंट की शेष मात्रा को टीएलसी कक्ष के नीचे रखें।
    नोट: टीएलसी कक्ष के नीचे मोबाइल चरण के कम से कम 1 सेमी द्वारा कवर किया जाना चाहिए। वर्तमान प्रयोगों में टीएलसी विकसित करने के लिए अलग-अलग मोबाइल चरणों का प्रयोग किया गया। इनमें एन-हेक्सेन के 85 एमएल प्लस 15 एमएल डायथिल ईथर शामिल थे; डाइक्लोरोमेथेन की 100 एमएल; क्लोरोफॉर्म की 90 एमएल, मेथनॉल की 10 एमएल और 1 एमएल पानी; क्लोरोफॉर्म के 30 एमएल, प्लस 8 एमएल मेथनॉल, और 1 एमएल पानी; क्लोरोफॉर्म के 60 एमएल, प्लस 35 एमएल मेथनॉल, और 8 एमएल पानी; 95 एमएल क्लोरोफॉर्म प्लस 5 एमएल मेथनॉल; और पेट्रोलियम ईथर के 90 एमएल (60-80 डिग्री सेल्सियस) प्लस डायथाइल ईथर के 10 एमएल।
    नोट: दो आयामी टीएलसी में, तीन बार पहली दिशा में एन-हेक्साने:एसीटोन (95:5) का उपयोग करें, और माइकोलिक एसिड संरचना का विश्लेषण करने के लिए दूसरी दिशा में टोल्यून (97:3) के साथ एक ही विकास का उपयोग करें। PIMs का विश्लेषण करने के लिए, क्लोरोफॉर्म का उपयोग करें: मेथनॉल: पानी (60:30:6) पहली दिशा में एक बार, और क्लोरोफॉर्म का उपयोग करें: एसिटिक एसिड: मेथनॉल: पानी (40:25:3:6) दूसरी दिशा में। पीडीआईएम और एजी का विश्लेषण करने के लिए, पेट्रोलियम ईथर (60-80 डिग्री सेल्सियस): एथिल एसीटेट (98:2) का उपयोग पहली दिशा में तीन बार करें, और दूसरी दिशा में पेट्रोलियम ईथर (60-80 डिग्री सेल्सियस): एसीटोन (98:2) के साथ एक ही विकास का उपयोग करें।
    सावधानी: डायथिल ईथर एक संभावित विषाक्त और खतरनाक पदार्थ है। इसका उपयोग उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक आईवियर, और नाइट्रिल दस्ताने) पहने हुए लेमिनार फ्लो हुड में किया जाना चाहिए।
    सावधानी: डाइक्लोरोमेथेन एक संभावित विषाक्त और खतरनाक पदार्थ है। इसका उपयोग उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक आईवियर, और नाइट्रिल दस्ताने) पहने हुए लेमिनार फ्लो हुड में किया जाना चाहिए।
    सावधानी: पेट्रोलियम ईथर एक संभावित ज्वलनशील, पर्यावरण की दृष्टि से हानिकारक और बेहद खतरनाक पदार्थ है । इसका उपयोग उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक आईवियर, और नाइट्रिल दस्ताने) पहने हुए लेमिनार फ्लो हुड में किया जाना चाहिए।
    सावधानी: एसीटिक एसिड एक संभावित ज्वलनशील और संक्षारक पदार्थ है। इसका उपयोग उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक आईवियर, और नाइट्रिल दस्ताने) पहने हुए लेमिनार फ्लो हुड में किया जाना चाहिए।
    सावधानी: एथिल एसीटेट एक ज्वलनशील और खतरनाक पदार्थ है। इसका उपयोग उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक आईवियर, और नाइट्रिल दस्ताने) पहने हुए लेमिनार फ्लो हुड में किया जाना चाहिए।
    सावधानी: एसीटोन एक ज्वलनशील और खतरनाक पदार्थ है। इसका उपयोग उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक आईवियर, और नाइट्रिल दस्ताने) पहने हुए लेमिनार फ्लो हुड में किया जाना चाहिए।
  2. टीएलसी चैंबर को बंद करने के लिए यह कम से 20 मिनट के लिए तर । इस बीच, क्लोरोफॉर्म के 0.2-1 एमएल में ग्लास ट्यूब में मौजूद लिपिड को भंग करें।
    नोट: लिपिड को भंग करने के लिए उपयोग की जाने वाली मात्रा को नमूने की वांछित या अपेक्षित एकाग्रता के आधार पर संशोधित किया जा सकता है।
  3. टीएलसी प्लेट पर सीधे केशिका ग्लास ट्यूब का उपयोग करके प्रत्येक निलंबन के 10 माइक्रोन लागू करें और नमूना को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सूखने दें।
    नोट: नमूने प्रत्येक पक्ष पर 1 सेमी छोड़ने प्लेट के नीचे भाग में लागू किया जाना चाहिए । नमूनों को कम से कम 0.5 सेमी के लिए दूसरे से अलग किया जाना चाहिए। एक बार जब नमूना प्लेट पर लागू हो जाता है, तो ट्यूबों को नाइट्रोजन गैस के साथ फिर से सुखाया जा सकता है और आगे के उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. प्लेट को मोबाइल चरण वाले संतृप्त टीएलसी कक्ष में डालें। मोबाइल फेज को टीएलसी के माध्यम से चलने दें।
    नोट: टीएलसी चैंबर पर लागू कोई भी आंदोलन प्लेट पर चल रहे सॉल्वेंट को प्रभावित करता है और लिपिड गतिशीलता को प्रभावित करता है। दो आयामी टीएलसी प्रदर्शन के मामले में, दो टीएलसी कक्षों में दोनों एल्यूशन सिस्टम को शामिल करने की आवश्यकता होती है।
  5. जब सॉल्वेंट प्लेट के ऊपरी छोर से 1 सेमी की दूरी पर पहुंच जाए तो प्लेट को टीएलसी चैंबर से हटा दें। प्लेट को लैमिनार फ्लक्स के नीचे छोड़ दें जब तक कि सिलिका पूरी तरह से सूख न जाए।
    नोट: माइकोलिक एसिड संरचना का विश्लेषण करने के मामले में, एन-हेक्साने और डायथाइल-ईथर (85:15) का उपयोग करके, टीएलसी प्लेट पर तीन बार मोबाइल चरण चलाने तक, 4.4 और 4.5 दो गुना अधिक कदम दोहराएं।
  6. आवश्यक दाग के साथ थाली प्रकट; जरूरत पड़ने पर थाली गर्म करें।
    नोट: वर्तमान प्रयोग में, टीएलसी प्लेटों को स्प्रे करने के लिए निम्नलिखित समाधानों में से 15-20 एमएल का उपयोग किया गया था: 10% मोलिब्डाटोफोस्फोरिक एसिड हाइड्रेट इथेनॉल में तब तक जब तक प्लेट उज्ज्वल पीली न हो जाए, इसके बाद प्लेट को 120 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया जाए; सल्फ्यूरिक एसिड में 20% α-नैफथॉल के इथेनॉल में 5% और उसके बाद प्लेट को 120 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया जाता है; फॉस्फेट बैंड दिखाई देने या सल्फ्यूरिक एसिड में 1% एथॉन होने तक मोलिब्डेनम ब्लू रिएजेंट (4.2 मीटर सल्फ्यूरिक एसिड में 1.3% मोलिब्डेनम ऑक्साइड) ।
    सावधानी: मोलिब्डाटोफोस्फोरिक एसिड हाइड्रेट एक ज्वलनशील और संक्षारक पदार्थ है। इसका उपयोग उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक आईवियर, और नाइट्रिल दस्ताने) पहने हुए लेमिनार फ्लो हुड में किया जाना चाहिए।
    सावधानी: इथेनॉल एक संभावित ज्वलनशील और खतरनाक पदार्थ है। इसका उपयोग उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक आईवियर, और नाइट्रिल दस्ताने) पहने हुए लेमिनार फ्लो हुड में किया जाना चाहिए।
    सावधानी: 1- नफथोल एक ज्वलनशील, संक्षारक और बेहद खतरनाक पदार्थ है। इसका उपयोग उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक आईवियर, और नाइट्रिल दस्ताने) पहने हुए लेमिनार फ्लो हुड में किया जाना चाहिए।
    सावधानी: मोलिब्डेनम ब्लू स्प्रे रिएजेंट एक संक्षारक, विषाक्त और बेहद खतरनाक पदार्थ है। इसका उपयोग उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक आईवियर, और नाइट्रिल दस्ताने) पहने हुए लेमिनार फ्लो हुड में किया जाना चाहिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

विभिन्न माइकोबैक्टीरिया प्रजातियों में मौजूद लिपिड की एक विस्तृत श्रृंखला दिखाने के उद्देश्य से, एम बोविस बीसीजी को चुना गया क्योंकि यह किसी न किसी और धीमी गति से बढ़ने वाला माइकोबैक्टीरिया है। इस प्रक्रिया में रफ एंड फास्ट ग्रोइंग एम फोर्टुइटम और एम ब्रूमाई को जोड़ा गया और अंत में एम फोड़ा का चिकना मॉर्फोटाइप भी शामिल किया गया। ये चार प्रजातियां हमें माइकोबैक्टीरिया-व्युत्पन्न लिपिड जैसे एसीलट्रेहेलोस (एटी), जीपीएलएस, पीडीआईएम, पीजीएल, पीआईएम, टीडीएम और टीएमएम के व्यापक स्पेक्ट्रम की कल्पना करने की अनुमति देती हैं। इसके अलावा, सभी चार प्रजातियों में अलग-अलग माइकोलिक एसिड पैटर्न होते हैं।

माइकोलिक एसिड एक्सट्रैक्ट प्रोटोकॉल करने के बाद, लिपिड अर्क का विश्लेषण 1D-टीएलसी विश्लेषण के माध्यम से दो अलग-अलग, समान रूप से वैध, एल्यूशन सिस्टम(चित्रा 3 ए,बी)का उपयोग करके किया गया था। पहला मोबाइल चरण(चित्रा 3 ए)एन-हेक्सेन और डायथाइल-ईथर (85:15) द्वारा रचा गया था, और प्लेट को तीन बार चलाया गया था। दूसरे मोबाइल चरण में डाइक्लोरोमेथेन का 100% शामिल था और प्लेट को एक बार(चित्रा 3B)किया गया था। दोनों एल्यूशन सिस्टम में, माइकोलिक एसिड नमूना आवेदन की उत्पत्ति से टीएलसी प्लेट के बीच में लगभग स्थित हैं। जैसा कि चित्रा 3 से पता चलता है, एम ब्रूमे के पास केवल टाइप आई माइकोलिक एसिड, सभी माइकोबैक्टीरिया प्रजातियों में मौजूद एक माइकोलिक एसिड है। एम बोविस बीसीजी में टाइप I और IV, एम फोर्टुइटम टाइप I और V, और एम फोड़ा,टाइप I और II माइकोलिक एसिड प्रोफाइल हैं। मिथाइलेशन प्रक्रियाओं के दो प्रकार के प्रदर्शन हमें प्रकार वी माइकोलिक एसिड की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए अनुमति देता है क्योंकि प्रकार वी माइकोलिक एसिड एसिड मेथनॉलिसिस प्रक्रिया के दौरान cleaved है । जैसा कि चित्र 3 से पता चलता है, केवल सैपोनिफिकेशन प्रक्रिया के बाद टाइप वी माइकोलिक एसिड के अनुरूप जगह थी। मेथनथेनोसिस के बाद, टीएलसी ने टाइप वी क्लीवेज से व्युत्पन्न यौगिकों को दिखाया जो आवेदन बिंदु19के पास चले गए। नौसिखिया शोधकर्ताओं के लिए, 2D-TLC प्रत्येक माइकोलिक एसिड प्रकार(चित्रा 3C,D) की पहचान करने के लिए एक पूरक विधि के लिए अनुमति दे सकताहै। माइकोलिक एसिड अर्क को सबसे पहले पेट्रोलियम ईथर (60-80 डिग्री सेल्सियस) और एसीटोन (95:5) द्वारा बनाई गई एक एल्यूशन प्रणाली में तीन बार चलाया जाना चाहिए। फिर, प्लेट को टोल्यून और एसीटोन (97:3) द्वारा गठित मोबाइल चरण के साथ दूसरी दिशा में चलाया जाना चाहिए। 2डी-टीएलसी का उपयोग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के साथ मिलकर माइकोलिक एसिड के कार्यात्मक समूहों की पहचान करने और रासायनिक रूप से चित्रित करने के लिए किया गया है और इसका उपयोग माइकोलिक एसिड20, 21, 22की विशेषता के लिए बड़े पैमाने पर किया गयाहै। इसलिए, माइकोलिक एसिड पैटर्न विभिन्न प्रजातियों के बीच साझा माइकोलिक एसिड पैटर्न के कारण अन्य विश्लेषणों के संयोजन में व्यवस्थित माइकोबैक्टीरियल मूल्यांकन में मूल्य की जैव रासायनिक विशेषताओं में से एक है।

गैर-सहसंयोजक लिंक्ड्स निकालने के लिए उपर्युक्त प्रक्रिया को करने के बाद, माइकोबैक्टीरिया कोशिकाओं में पाए जाने वाले लिपिड प्रोफाइल के ध्रुवता और आकार के कार्य में विभिन्न एल्यूशन सिस्टम का चयन किया गया था। एल्यूशन सिस्टम में सॉल्वैंट्स के आदर्श संयोजन को टीएलसी प्लेट के मध्य क्षेत्र में वांछित लिपिड की कल्पना करने में सक्षम होना चाहिए ताकि वांछित होने पर उनकी आगे की शुद्धि को सुविधाजनक बनाया जा सके। चित्रा 4में, टीएलसी प्लेटों को एल्यूशन सिस्टम से ऑर्डर किया जाता है जो सबसे ध्रुवीय लिपिड(चित्रा 4A)को एल्यूशन सिस्टम पर निगरानी रखने की अनुमति देता है जो सबसे ध्रुवीय लिपिड(चित्रा 4E)की कल्पना करने की अनुमति देता है।

एसील ग्लाइसेरोल (एजी) और पीडीआईएम माइकोबैक्टीरियल सेल वॉल में मौजूद सबसे अपोलर लिपिड में से दो हैं और पेट्रोलियम ईथर द्वारा गठित मोबाइल चरण का उपयोग करके 1D-टीएलसी विश्लेषणों के माध्यम से आसानी से कल्पना की जाती है: डाईथाइल ईथर (90:10)। चित्रा 4 ए से पता चलता है कि एजीएस एम बोविस बीसीजी, एम फोर्टुइटम और एम ब्रूमाई में मौजूद थे लेकिन एम फोड़ाके चिकनी मॉर्फोटाइप में नहीं । यद्यपि 1D-टीएलसी ने एम बोविस बीसीजी और एम फोर्टुइटममें पीडीआईएम की उपस्थिति का सुझाव दिया था, लेकिन जब 2डी-टीएलसी विश्लेषण(चित्रा 4 बी)किया गया था तो एम बोविस बीसीजी में ही इसकी पुष्टि की गई थी। कुल मिलाकर, ये परिणाम कम से कम दो अलग-अलग एल्यूशन सिस्टम द्वारा माइकोबैक्टीरियल यौगिक की उपस्थिति को पुष्ट करने के महत्व को प्रदर्शित करते हैं। माइकोबैक्टीरिया संरचना में विश्लेषण करने के लिए एक और दिलचस्प लिपिड पीजीएल है। चुने गए माइकोबैक्टीरिया में, पीजीएल केवल एम बोविस बीसीजी में मौजूद है, और यह ध्यान देने योग्य है जब टीएलसी को क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल (95:5)(चित्रा 4C)से मिलकर एल्यूशन सिस्टम के साथ eluted किया जाता है। अधिक ध्रुवीय घटकों की कल्पना करने के विचार के बाद, 90:10:1 (क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल: पानी) के मिश्रण से मिलकर एल्यूशन सिस्टम का उपयोग जीपीएलएस(चित्रा 4डी)की उपस्थिति की निगरानी के लिए किया गया था, जो केवल एम फोड़ा चिकनी मॉर्फोटाइप में मौजूद हैं। एक ही टीएलसी में: पीजीएल, ट्रेहलोस डिमाइकोलेट (टीडीएम), एकिल ट्रेहलोस (एटी), और ट्रेहालोस मोनोमायकोलेट (टीएमएम) भी देखा जा सकता है। PGL, GPLs, टीडीएम, एटी भी थाली के शीर्ष पर मनाया गया जब एल्यूशन सिस्टम में 30:8:1 (क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल: पानी)(चित्रा 4E)शामिल था। टीएम प्लेट के बीच में स्थित है। टीडीएम और टीएमएम को सभी माइकोबैक्टीरिया अध्ययन में स्पष्ट रूप से व्यक्त किया गया था। फॉस्फेटिडिल-इनोसिटॉल मैननोसाइड्स (पीईएम) के बावजूद प्लेट के तल पर मनाया जाता है, PIMs का विश्लेषण करने के लिए सबसे अच्छा एल्यूशन सिस्टम 60:35:8 (क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल:पानी) है जैसा कि चित्र 5A,बीमें दिखाया गया है। जबकि सभी चीनी युक्त लिपिड को एंथ्रोन(चित्रा 5A)के साथ प्रकट किया जाता है, PIMs में फॉस्फेट समूह होते हैं जो विशेष रूप से मोलिब्डेनम ब्लू रिएजेंट(चित्रा 5B)के साथ प्रकट होते हैं। माइकोलिक एसिड, एजी और पीडीआईएम के समान, PIMs को 2D-टीएलसी विश्लेषण(चित्रा 5C)के माध्यम से भी आसानी से कल्पना की जा सकती है। इसके अलावा, माइकोबैक्टीरिया का विश्लेषण करने के मामले में जो एलओएसएस, पीईएम और एलओएसएस को संश्लेषित करने में सक्षम हैं, को रेन एट अल8में विस्तृत रूप में एक ही 2D एल्यूशन सिस्टम का उपयोग करके अलग किया जाएगा।

Figure 1
चित्रा 1:ठोस मीडिया पर उगाए गए माइकोबैक्टीरिया की लिपिड सामग्री निकालने की प्रक्रिया की योजना। माइकोबैक्टीरिया कोशिकाओं पर मौजूद लिपिड को समझने के लिए मुख्य कदम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:ठोस मीडिया पर उगाए गए माइकोबैक्टीरिया की माइकोलिक एसिड सामग्री निकालने की प्रक्रिया की योजना। माइकोबैक्टीरिया कोशिकाओं पर मौजूद माइकोलिक एसिड को समझने के लिए मुख्य कदम या तो(ए)एसिड मेथनॉलेसिस या(बी)सैपोनिफिकेशन का उपयोग करके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:माइकोबैक्टीरिया से लिपिड निष्कर्षण के प्रतिनिधि परिणाम। एन-हेक्साने के 85 एमएल में विकसित माइकोलिक एसिड का पतली परत क्रोमेटोग्राफी (टीएलसी) विश्लेषण, साथ ही डायथिल ईथर (तीन रन) का 15 एमएल और डाइक्लोरोमेथेन का(बी)100 एमएल। (ग)95:5 (एन-हेक्साने: एसीटोन) (तीन रन) में पहली दिशा में और 97:3 (टोल्यून: एसीटोन) में विकसित एसिड मेथनॉलिसिस द्वारा निकाले गए माइकोलिक एसिड का दो आयामी टीएलसी विश्लेषण दूसरी दिशा में । (घ)95:5 (एन-हेक्साने: एसीटोन) (तीन रन) में विकसित एम फोर्टुइटम द्वारा निकाले गए माइकोलिक एसिड का दो-आयामी टीएलसी विश्लेषण पहली दिशा में और 97:3 (टोल्यून: एसीटोन) दूसरी दिशा में । टीएलसी को इथेनॉल में 10% मोलिब्डाटोफोस्फोरिक एसिड हाइड्रेट के साथ पता चला और इसके बाद प्लेट को 120 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया गया। एम बोविस बीसीजी कनॉट (लाइन 1 और 1'); एम फोर्टुइटम (लाइन 2 और 2'); एम फोड़ा चिकनी मॉर्फोटाइप (लाइन 3 और 3') और एम ब्रूमाई (लाइन 4 और 4')। एसिड मेथनथेनॉलिसिस द्वारा प्राप्त 1-4 माइकोलिक एसिड और सैपोनिफिकेशन द्वारा प्राप्त 1'-4'-4'माइकोलिक एसिड। मैं, α-mycolates; II, α'-mycolates; चतुर्थ, केटोमीकोलेट्स; वी, एपॉक्सीमाइकोलेट्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:माइकोबैक्टीरिया से लिपिड निष्कर्षण के प्रतिनिधि परिणाम। (ए)एइलग्लाइसेरोल (एजी) और फेथियोसेरोल डिमिकोसेरोसेट (पीडीआईएम) का टीएलसी विश्लेषण 90:10 (पेट्रोलियम ईथर (60-80 डिग्री सेल्सियस) :d इयिथाइल ईथर) में विकसित हुआ। (ख)पीडीआईएम और एजी का दो आयामी टीएलसी विश्लेषण 98:2 (पेट्रोलियम ईथर (60-80 डिग्री सेल्सियस): एथिल एसीटेट) (तीन रन) पहली दिशा में और 98:2 (पेट्रोलियम ईथर (60-80 डिग्री सेल्सियस): एसीटोन) दूसरी दिशा में विकसित हुआ । (C)95:5 (क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल) में विकसित फिनोलिक ग्लाइकोलिपिड (पीजीएल) का टीएलसी विश्लेषण। (घ)टीएलसी विश्लेषण 90:10:1 (क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल:पानी) में विकसित पीजीएल, ग्लाइकोपेप्टिडोक्लिड (जीपीएल), ट्रेहलोस डाइमीकोलेट (टीडीएम), एकिल ट्रेलोस (एटी), और ट्रेहालोसे मोनोमायकोलेट (टीएमएम) में विकसित हुआ। (ई)30:8:1 (क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल:पानी) में विकसित पीजीएल, जीपीएल, एटी, टीएमएम और फॉस्फेटिडिल-इनोसिटॉल मैनोसाइड्स (पीईएम) का टीएलसी विश्लेषण। ए-बी-सी को इथेनॉल में 10% मोलिब्डाटोफोस्फोरिक एसिड हाइड्रेट के साथ प्रकट किया गया था और इसके बाद प्लेट को 120 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया गया था। D-ई को सल्फरिक एसिड में 20% α-नेफ्थथोल के इथेनॉल में 5% के साथ पता चला और 120 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया गया। लाइन 1: एम बोविस बीसीजी कनॉट; लाइन 2: एम फोर्टुइटम; लाइन 3: एम फोड़ा चिकनी मॉर्फोटाइप; लाइन 4: एम ब्रूमाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5:माइकोबैक्टीरिया से PIMs के प्रतिनिधि परिणाम। (ए-बी)60:35:8 (क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल:पानी) में विकसित PIMs का टीएलसी विश्लेषण। (ग)पीईएम का दो आयामी टीएलसी विश्लेषण पहली दिशा में 60:30:6 (क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल: पानी) और दूसरी दिशा में 40:25:3:6 (क्लोरोफॉर्म:एसिटिक एसिड: मेथनॉल:पानी) दूसरी दिशा में विकसित हुआ । ए-सी सल्फ्यूरिक एसिड में 1% एंथ्रोन के साथ पता चला और उसके बाद 120 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को गर्म करने के बाद बी को मोलिब्डेनम ब्लू रिएजेंट के साथ तब तक पता चला जब तक फॉस्फेट बैंड दिखाई नहीं दिया गया। लाइन 1: एम बोविस बीसीजी कनॉट; लाइन 2: एम फोर्टुइटम; लाइन 3: एम फोड़ा चिकनी मॉर्फोटाइप; लाइन 4: एम ब्रूमाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

माइकोबैक्टीरियल सेल दीवार से गैर-सहावता से जुड़े लिपिड यौगिकों को निकालने के लिए सोने के मानक विधि के रूप में माना जाने वाला एक सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है। चार अलग-अलग माइकोबैक्टीरिया के निकाले गए लिपिड से एक और दो आयामी टीएलसी द्वारा आगे का दृश्य दिखाया गया है।

माइकोबैक्टीरियल कोशिकाओं की लिपिडिक सामग्री को ठीक करने के लिए क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल का लगातार दो संयुक्त मिश्रण सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला विलायक मिश्रण23, 24,25,26,27,28,29,29है । यह मिश्रण कोशिकाओं से ध्रुवीय और ध्रुवीय लिपिड की एक विस्तृत श्रृंखला की वसूली की अनुमति देता है। फिर भी, साहित्य में कुल या विशिष्ट माइकोबैक्टीरियल लिपिड निकालने के लिए कुछ अन्य तरीकों का वर्णन किया गया है, जिनकी हाल ही में हमीद एट अल29द्वारा समीक्षा की गई है। उदाहरण के लिए, फोल्च विधि ऊतकों30 से कुल माइकोबैक्टीरियल लिपिड को ठीक करने के लिए विकसित सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल में से एक है और इसे शुद्ध माइकोबैक्टीरियल संस्कृतियों के लिए भी अनुकूलित किया गया है। इसमें क्लोरोफॉर्म में माइकोबैक्टीरियल कोशिकाओं को निलंबित करना होता है: मेथनॉल (1:2), इसके बाद अपकेंद्रित्र और क्लोरोफॉर्म के अलावा 1:1 का अनुपात प्राप्त करने के लिए। अंत में, केसीएल का उपयोग एक्सट्रैक्ट31से गैर-लिमिड घटकों को हटाने के लिए किया जाता है। समानांतर में, विशिष्ट लिपिड निकालने के लिए अन्य प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। स्लेजन एट अलने क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल प्लस एसीटोन के मिश्रण का उपयोग विशेष रूप से टीडीएम याटीएमएम 32जैसे ग्लाइकोलिपिड्स को ठीक करने के लिए किया। कुल मिलाकर, प्रकाशित तरीके सॉल्वैंट्स, मुख्य रूप से क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल की विभिन्न सांद्रता के लिए माइकोबैक्टीरियल कोशिकाओं को उजागर करने पर आधारित हैं। इसी तरह, नमूने पर मौजूद अन्य सेल घटकों को त्यागने के लिए कभी-कभी कुछ लवण जोड़े जाते हैं।

गैर-विभिन्न रूप से जुड़े लिपिड के अलावा, दो अलग-अलग प्रक्रियाओं द्वारा माइकोलिक एसिड निष्कर्षण भी दिखाया गया है। जबकि अम्लीय मेथनथेनोसिस कम खतरनाक अभिकर्षकों के साथ माइकोलिक एसिड के आसान निष्कर्षण की अनुमति देता है, सैपोनिफिकेशन प्रक्रिया सभी माइकोलिक एसिड प्रकारों की संरचना को संरक्षित करती है, जिसमें टाइप वी माइकोलिक एसिड शामिल है, जो मेथनॉलिसिस प्रक्रियाओं के दौरान क्लीव किया जाता है। एक बार लिपिड निकाले जाने के बाद, 1D-या 2D-TLC उनकी निगरानी करने के लिए मानक तरीके हैं, और परख का उपयोग लिपिड की भौतिक रसायन विशेषताओं के आधार पर भिन्न होता है। प्रत्येक अणु की ध्रुवीयता और आकार आवश्यक एल्यूशन प्रणाली के चयन का निर्धारण करेगा, जो माइकोबैक्टीरियम का हिस्सा यानी लिपिड के निर्धारण की अनुमति देता है। एक आयामी टीएलसी को चुना जा सकता है जब माइकोबैक्टीरियल लिपिड के बीच प्रतिधारण कारक (आरएफ) अलग होते हैं, जबकि 2D-टीएलसी दृश्य की सुविधा देता है जब विभिन्न लिपिड आणविक वजन और ध्रुवीयता विशेषताओं को साझा करते हैं। पहचान को सुविधाजनक बनाने के लिए, समान आरएफ की तुलना करने के लिए निकाले गए नमूने के समानांतर शुद्ध लिपिड चलाए जाने चाहिए। लिपिड की पहचान तब हासिल की जा सकती है जब यह कम से कम दो टीएलसी सिस्टम (दो अलग-अलग मोबाइल चरणों) में ज्ञात शुद्ध नियंत्रण के रूप में एक ही आरएफ के साथ चलती है। शुद्ध लिपिड वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं से या माइकोबैक्टीरियल अनुसंधान प्रयोगशालाओं से प्राप्त किया जा सकता है। अंत में, अणु की जैव रासायनिक प्रकृति इंगित करती है कि टीएलसी प्लेटों को प्रकट करने के लिए किस दाग का उपयोग किया जा सकता है। फॉस्फोमोलिब्डिक एसिड जैसे सार्वभौमिक धुंधला विधियां हैं जो किसी भी कार्बनिक घटक के दृश्य को कल्पना करने में सक्षम बनाती हैं क्योंकि यह कार्बन बांड से बांधती है। जबकि अन्य जैसे कि ए-नैफथोल या एंथ्रोन चीनी अवशेषों को विशिष्ट रंग प्रदान करते हैं, मोलिब्डेनम नीला विशेष रूप से फॉस्फेट अवशेषों को बांधता है।

माइकोबैक्टीरिया की लिपिड सामग्री का विश्लेषण करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण विचार प्रक्रियाओं में प्लास्टिक सामग्री के उपयोग से बचना है क्योंकि प्लास्टिक के साथ कार्बनिक सॉल्वैंट्स का संपर्क नमूनों को दूषित कर सकता है और टीएलसी प्लेटों में देखा जा सकता है। यह विचार करना भी प्रासंगिक है कि माइकोबैक्टीरिया की खेती के लिए उपयोग की जाने वाली संस्कृति मध्यम संरचना, साथ ही तापमान या इनक्यूबेशन के दिन, प्रत्येक माइकोबैक्टीरियम के लिपिड पैटर्न को संशोधित कर सकते हैं, जैसा कि पहले16वर्णित है। तरल और ठोस मीडिया पर उगाए जाने वाले माइकोबैक्टीरिया का उपयोग गैर-सहसंयोजक लिंक्ड या माइकोलिक एसिड निकालने के लिए किया जा सकता है। तरल संस्कृति से कोशिकाओं को प्राप्त करते समय, नमूने में तरल मीडिया की उपस्थिति से बचने के लिए उन्हें पर्याप्त रूप से फ़िल्टर और सूख जाना चाहिए। इसके अलावा, तरल मीडिया से माइकोबैक्टीरिया का उपयोग करते समय, बैक्टीरिया को समय के साथ प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रयोगों के बीच ठीक से और समान रूप से उगाया जाना चाहिए। इसके अलावा, माइकोबैक्टीरियल कोशिकाओंको17,33,34,35, 36पर भी उगाया जा सकता है, जिसमें से सबसे बाहरी लिपिड को कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग करके और टीएलसी द्वारा निगरानी की जा सकती है, जैसा कि हमने वर्तमान लेख में दिखाया है।

माइकोबैक्टीरियल लिपिड निष्कर्षण प्रक्रियाओं की मुख्य सीमा सुरक्षित परिस्थितियों में विषाक्त सॉल्वैंट्स का उपयोग बनी हुई है। टीएलसी प्रक्रिया अन्य तकनीकों की तुलना में कम संवेदनशील है, जैसे गैस क्रोमेटोग्राफी या उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी। इसके अलावा, टीएलसी नमूनों के परिमाणीकरण की अनुमति नहीं देता है, और निकाले गए यौगिकों की संरचना की पहचान करने के लिए आगे की तकनीकों को लागू करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, लिपिड आइसोमर्स को अलग करने के लिए परमाणु चुंबकीय अनुनाद की आवश्यकता है । गौरतलब है कि पहली बार माइकोबैक्टीरियल लिपिड की संरचना का वर्णन करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री या इंफ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, लिपिड वर्गों के मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण के लिए सामान्य रूप से विभिन्न निष्कर्षण, व्युत्पन्न, क्रोमेग्राफिक और डिटेक्शन विधियों जैसे उच्च या अल्ट्रा-प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री और परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी37,38,39,40के संयोजन की आवश्यकता होती है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एक कदम पतली परत क्रोमेटोग्राफी-लौ आयनीकरण का पता लगाने की तकनीक का उपयोग करना Actinobacteria४१में माइकोलिक एसिड की मात्रा और प्रारंभिक स्क्रीनिंग की अनुमति देता है । फिर भी, टीएलसी माइकोबैक्टीरिया की लिपिडिक संरचना को स्क्रीन और मूल्यांकन करने के लिए एक अत्यंत उपयोगी, टाइम्सविंग और सस्ती तकनीक है। कुल मिलाकर, यहां प्रस्तुत प्रक्रियाएं माइकोबैक्टीरिया कोशिकाओं की सबसे प्रासंगिक विशेषता का विश्लेषण करने के लिए बुनियादी उपकरण प्रदान करने के लिए अत्यधिक बहुमुखी हैं: इसकी जटिल सेल दीवार।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को स्पेन के विज्ञान, नवाचार और विश्वविद्यालय मंत्रालय (RTI2018-098777-B-I00), फेडरर फंड्स और जनरलिट ऑफ कैटालुन्या (2017SGR-229) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। सैंड्रा गुल्लार-गार्रिडो जनरलिट डी कैटालुन्या से पीएचडी कॉन्ट्रैक्ट (एफआई) की प्राप्तकर्ता हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Merck 100063 CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Acetone Carlo Erba 400971N CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000
Anthrone Merck 8014610010 Anthrone for synthesis.
Benzene Carlo Erba 426113 CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l
Capillary glass tube Merck BR708709 BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark
Chloroform Carlo Erba 412653 CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L
Dry block heater J.P. Selecta 7471200
Dicloromethane Carlo Erba 412622 CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L
Diethyl ether Carlo Erba 412672 CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L
Ethyl Acetate Panreac 1313181211 CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO
Ethyl Alcohol Absolute Carlo Erba 4146072 CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L
Glass funnel VidraFOC DURA.2133148 1217/1
Glass tube VidraFOC VFOC.45066A-16125 Glass tube with PTFE recovered cap
Methanol Carlo Erba 412722 CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L
Molybdatophosphoric acid hydrate Merck 51429-74-4 CAUTION.
Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% Sigma M1942-100ML CAUTION.
n-hexane Carlo Erba 446903 CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L
n-nitroso-n-methylurea Sigma N4766 CAUTION
Orbital shaking platform DDBiolab 995018 NB-205L benchtop shaking incubator
Petroleum ether (60-80ºC) Carlo Erba 427003 CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L
Sprayer VidraFOC 712/1
Sodium sulphate anhydrous Merck 238597
Sulfuric acid 95-97% Merck 1007311000 CAUTION. Sulfuric acid 95-97%
TLC chamber Merck Z204226-1EA Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm
TLC plate Merck 1057210001 TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u
TLC Plate Heater CAMAG 223306 CAMAG TLC Plat Heater III
Toluene Carlo Erba 488551 CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L
Vortex Fisher Scientific 10132562 IKA Agitador IKA vórtex 3
1-naphthol Sigma-Aldrich 102269427 CAUTION.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
  2. Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
  3. Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
  4. Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).
  5. Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
  6. Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).
  7. Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).
  8. Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
  9. Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
  10. Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
  11. Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
  12. Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
  13. Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232 (2016).
  14. Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
  15. Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  16. Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
  17. Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).
  18. Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
  19. Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
  20. Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , CPC Press. London, UK. 139-143 (1986).
  21. Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
  22. Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
  23. Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
  24. Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
  25. Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
  26. Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
  27. Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
  28. Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
  29. Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , Springer. Singapore. (2020).
  30. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  31. Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
  32. Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
  33. Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
  34. Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
  35. Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
  36. Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
  37. Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
  38. Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).
  39. Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB". Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
  40. Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
  41. Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 170 ग्लाइकोपिप्टिड्स फेनोलिक ग्लाइकोलिपिड्स फेथियोसेरोल डिमिकोसेरोसेट एम बोविस बीसीजी एम ब्रूमे, एम फोर्टुइटम, एम फोड़ोसस,माइकोलिक एसिड टोटल लिपिड एक्सट्रेक्शन ट्रेलोस युक्त लिपिड फोस
पतली परत क्रोमेटोग्राफी द्वारा माइकोबैक्टीरिया की लिपिड संरचना का विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guallar-Garrido, S., Luquin, M.,… More

Guallar-Garrido, S., Luquin, M., Julián, E. Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography. J. Vis. Exp. (170), e62368, doi:10.3791/62368 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter