Summary
Viene presentato un protocollo per estrarre il contenuto lipidico totale della parete cellulare di una vasta gamma di micobatteri. Inoltre, vengono mostrati i protocolli di estrazione e analisi dei diversi tipi di acidi micolici. Viene inoltre fornito un protocollo cromatografico a strato sottile per monitorare questi composti micobatterici.
Abstract
Le specie di micobatteri possono differire l'una dall'altra nel tasso di crescita, nella presenza di pigmentazione, nella morfologia della colonia visualizzata su mezzi solidi e in altre caratteristiche fenotipiche. Tuttavia, tutti hanno in comune il carattere più rilevante dei micobatteri: la sua parete cellulare unica e altamente idrofoba. Le specie di micobatteri contengono un complesso legato alla membrana-covalente che include arabinogalattano, peptidoglicano e lunghe catene di acidi micolici con tipi che differiscono tra le specie di micobatteri. Inoltre, i micobatteri possono anche produrre lipidi che si trovano, non legati covalentemente, sulle loro superfici cellulari, come i dimicoceroti di policomerosati (PDIM), glicolipidi fenolici (PGL), glicopeptidolipidi (GPL), acilmalosi (AT) o mannosidi fosfatidi-inositolo (PIM), tra gli altri. Alcuni di essi sono considerati fattori di virulenza nei micobatteri patogeni o lipidi antigenici critici nell'interazione ospite-micobatteri. Per questi motivi, c'è un notevole interesse nello studio dei lipidi micobatterici a causa della loro applicazione in diversi campi, dalla comprensione del loro ruolo nella patogenicità delle infezioni da micobatteri, a una possibile implicazione come agenti immunomodulatori per il trattamento di malattie infettive e altre patologie come il cancro. Qui, viene presentato un semplice approccio per estrarre e analizzare il contenuto lipidico totale e la composizione dell'acido micolico delle cellule di micobatteri coltivate in un mezzo solido utilizzando miscele di solventi organici. Una volta ottenuti gli estratti lipidici, viene eseguita la cromatografia a strato sottile (TLC) per monitorare i composti estratti. L'esperimento di esempio viene eseguito con quattro diversi micobatteri: il Mycolicibacterium brumae e il Mycolicibacterium fortuitum a crescita lenta attenuati, il Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) a crescita rapida e il patogeno opportunistico a crescita rapida Mycobacterium abscessus, dimostrando che i metodi mostrati nel presente protocollo possono essere utilizzati per una vasta gamma di micobatteri.
Introduction
Mycobacterium è un genere che comprende specie patogene e non patogene, caratterizzate dall'avere una parete cellulare altamente idrofoba e impermeabile formata dai loro peculiari lipidi. In particolare, la parete cellulare micobatterica contiene acidi micolici, che sono acidi grassi α-alchilici e β-idrossi, in cui il ramo α è costante in tutti gli acidi micolici (ad eccezione della lunghezza) e la catena β, chiamata catena meromicolato, è una lunga catena alifatica che può contenere diversi gruppi chimici funzionali descritti insieme alla letteratura (α-, α'-, metossi-, κ-, epossidici, carbossi e ω-1-metossi-micolati), producendo quindi sette tipi di acidi micolici (I-VII)1. Inoltre, altri lipidi di indiscutibile importanza sono presenti anche nella parete cellulare delle specie di micobatteri. Specie patogene come Mycobacterium tuberculosis, l'agente eziologico della tubercolosi2 producono specifici fattori di virulenza a base lipidica come i dimicoceroti di polimicoceroti (PDIM), glicolipidi fenolici (PGL), di-, tri- e penta-acilmalefalosi (DAT, TAT e PAT), o sulfolipidi, tra gli altri3. La loro presenza sulla superficie micobatterica è stata associata alla capacità di modificare la risposta immunitaria dell'ospite e, quindi, all'evoluzione e alla persistenza del micobatterio all'interno dell'ospite4. Ad esempio, la presenza di triacilgliceroli (TAG) è stata associata al fenotipo ipervirulento del lignaggio 2-Pechino del lignaggio di M. tuberculosis, forse a causa della sua capacità di attenuare la risposta immunitaria dell'ospite5,6. Altri lipidi rilevanti sono i lipooligosaccaridi (LOS) presenti nei micobatteri tubercolari e non tubercolari. Nel caso di Mycobacterium marinum, la presenza di LOS nella sua parete cellulare è correlata alla motilità scorrevole e alla capacità di formare biofilm e interferisce con il riconoscimento da parte dei recettori di riconoscimento del pattern macrofagico, influenzando l'assorbimento e l'eliminazione dei batteri da parte dei fagociti ospiti7,8. Inoltre, l'assenza o la presenza di alcuni lipidi consente ai membri della stessa specie di essere classificati in diversi morfotipi con profili virulenti o attenuati quando interagiscono con le cellule ospiti. Ad esempio, l'assenza di glicopeptidolipidi (GPL) nel morfotipo grezzo di Mycobacterium abscessus è stato associato alla capacità di indurre acidificazione intrafagosomica, e di conseguenza apoptosi cellulare9, a differenza del morfotipo liscio che possiede GPL nella loro superficie. Inoltre, il contenuto lipidico della parete cellulare micobatterica è correlato alla capacità di modificare la risposta immunitaria nell'ospite. Questo è rilevante nel contesto dell'uso di alcuni micobatteri per innescare un profilo immunitario protettivo contro diverse patologie10,11,12,13. È stato dimostrato, ad esempio, che Mycolicibacterium vaccae, un micobatterio saprofita, che è attualmente in studi clinici di fase III come vaccino immunoterapeutico per la tubercolosi, mostra due morfotipi coloniali. Mentre il fenotipo liscio, che contiene un poliestere nella sua superficie, innesca una risposta Th2, il fenotipo ruvido privo del poliestere può indurre un profilo Th1 quando interagisce con le cellule immunitarie dell'ospite14. Il repertorio di lipidi presenti nella cellula micobatterica non dipende solo dalle specie di micobatteri, ma anche dalle condizioni delle colture micobatteriche: tempo di incubazione15,16 o composizione del terreno di coltura17,18. Infatti, i cambiamenti nella composizione del terreno di coltura influenzano l'attività antitumorale e immunostimolante di M. bovis BCG e Mycolicibacterium brumae in vitro17. Inoltre, il profilo immunitario protettivo innescato da M. bovis BCG contro M. tuberculosis la sfida nei modelli di topi dipende anche dai mezzi di coltura in cui M. bovis BCG cresce17. Questi potrebbero quindi essere correlati alla composizione lipidica dei micobatteri in ogni condizione di coltura. Per tutti questi motivi, lo studio del contenuto lipidico dei micobatteri è rilevante. Viene presentata una procedura visiva per estrarre e analizzare la composizione lipidica della parete cellulare micobatterica.
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Protocol
1. Estrazione dei lipidi totali non legati ai covalenti dai micobatteri (Figura 1)
- Graffiare 0,2 g di micobatteri da un mezzo solido e aggiungere a un tubo di vetro con tappi a vite in politetrafluoroetilene (PTFE). Aggiungere una soluzione composta da 5 ml di cloroformio e 10 ml di metanolo (cloroformio:metanolo, 1:2).
NOTA: quando si cioè abituati solventi organici, deve essere utilizzato solo il recipiente di vetro. Non sono ammessi contenitori di plastica. Inoltre, sono necessari tappi a vite in PTFE per bottiglie.
ATTENZIONE: Il cloroformio è una sostanza potenzialmente tossica ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
ATTENZIONE: Il metanolo è una sostanza potenzialmente tossica ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile). - Lasciare il tubo in costante agitazione durante la notte per estrarre i lipidi non legati ai covalenti dalla superficie cellulare micobatterica.
NOTA: se non è disponibile una piattaforma di agitazione orbitale, l'agitazione costante può essere sostituita da un'agitazione manuale periodica il più frequentemente possibile. - Coprire un imbuto di vetro con una carta da filtro, filtrare i solventi organici e raccoglierli in un tubo di vetro.
- Utilizzare un flusso di gas azoto per far evaporare la fase liquida nel tubo. Riempire il tubo con azoto gassoso, coprirlo e conservarlo a 4 °C.
NOTA: Collegare una pipetta Pasteur di vetro al flusso di azoto gassoso per far evaporare specificamente il tubo desiderato. Inoltre, mantenere il tubo all'interno di un riscaldatore a blocchi asciutti per tubi a 37 °C. Quando il solvente evapora, riempire il tubo con azoto gassoso prima di chiuderlo. - Aggiungere 15 mL di una soluzione di cloroformio:metanolo (2:1) ai detriti cellulari. Lasciare il tubo in costante agitazione durante la notte per estrarre i lipidi non legati ai covalenti dalla superficie cellulare micobatterica.
NOTA: se non è disponibile una piattaforma di agitazione orbitale, l'agitazione costante può essere sostituita da un'agitazione manuale periodica il più frequentemente possibile. - Lasciare riposare la miscela per 1 ora. Con una pipetta Pasteur, recuperare i solventi organici. Coprire un imbuto di vetro con una carta da filtro e filtrare i solventi organici e raccoglierli nello stesso tubo di vetro precedentemente utilizzato nella fase 1.3. Utilizzare un flusso di gas azoto per far evaporare la fase liquida nel tubo. Riempire il tubo con azoto gassoso, chiuderlo e conservarlo nuovamente a 4 °C.
2. Estrazione dell'acido micolico mediante metanolosi acida (Figura 2A)
- Aggiungere 2-5 ml di soluzione esterificante in un tubo di vetro ermetico con un tappo a vite in PTFE. Aggiungere 0,2 g di biomassa di micobatteri nel tubo di vetro.
NOTA: La soluzione esterificante si forma mescolando 30 ml di metanolo, 15 ml di toluene e 1 mL di acido solforico. Le cellule dei micobatteri possono essere prelevate da colture solide o, anche, da cellule delipidate dopo aver eseguito l'estrazione di lipidi totali non legati ai covalenti dai micobatteri (cellule rimanenti dopo il filtraggio nella fase 1.6).
ATTENZIONE: Il toluene è una sostanza infiammabile ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
ATTENZIONE: L'acido solforico è una sostanza corrosiva e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile). - Mescola il contenuto vorticosamente. Lasciare riposare la miscela all'interno di un bagno asciutto a 80 °C durante la notte.
- Lasciare raffreddare il tubo fino a raggiungere la temperatura ambiente e quindi aggiungere 2 ml di n-esano al tubo. Mescolare il contenuto vorticosamente per 30 s e lasciare che il tubo si depositi fino a quando non compaiono due fasi chiare.
ATTENZIONE: l'n-esano è una sostanza potenzialmente infiammabile, irritante, dannosa per l'ambiente ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile). - Recuperare la fase superiore corrispondente alla fase n-esano. Trasferiscilo su un nuovo tubo.
- Ripetere il passaggio 2.3. Recuperare nuovamente la fase superiore e trasferirla nello stesso tubo utilizzato nel passaggio 2.4.
- Evaporare il contenuto del tubo utilizzando un flusso di gas azoto. Riempire il tubo con azoto gassoso, chiuderlo e conservarlo a 4 °C.
3. Estrazione dell'acido micolico mediante saponificazione e metilazione (Figura 2B)
- Graffiare 0,2 g di micobatteri da un supporto solido e aggiungere a un tubo di vetro con un tappo a vite in PTFE.
- Aggiungere 2 ml di soluzione di metanolo-benzene (80:20) contenente idrossido di potassio al 5%. Mescolare il contenuto vorticosamente. Riscaldare la miscela per 3 ore a 100 °C.
ATTENZIONE: Il benzene è una sostanza infiammabile, cancerogena e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile). - Lasciare raffreddare il tubo a temperatura ambiente. Aggiungere il 20% di acido solforico per acidificare i campioni per ottenere pH = 1.
- Aggiungere 3 ml di etere etilico. Mescolare delicatamente il contenuto vorticosamente.
- Lascia che le due fasi si formino assestandosi. Recuperare la fase dell'etere etilico e trasferirla in un nuovo tubo. Ripetere la fase di lavaggio per un totale di tre volte.
- Lavare l'estratto di etere etilico con 2 ml di acqua distillata e trasferire la parte superiore corrispondente all'etere etilico in un nuovo tubo. Ripetere la fase di lavaggio per un totale di tre volte.
- Aggiungere 2 g di solfato di sodio anidro sopra l'estratto di etere etilico per asciugarlo.
- Filtrare la sospensione. Evaporare il contenuto utilizzando un flusso di gas azoto.
- Per eseguire la fase di metilazione, sciogliere 3 g di N-nitroso-N-metilurea in una soluzione preraffreddata formata da 45 ml di etere etilico e 9 ml di KOH al 40% in acqua distillata.
ATTENZIONE: N-nitroso-N-metilurea è una sostanza tossica, irritante, cancerogena e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile). - Trasferire il surnatante (diazometano) in un nuovo pallone raffreddato in ghiaccio contenente pellet di idrossido di potassio (circa 30 g).
NOTA: Se il surnatante non viene utilizzato immediatamente, può essere conservato a -20 °C per un massimo di 1 ora.
ATTENZIONE: I pellet di idrossido di potassio sono una sostanza irritante e corrosiva. Questo materiale deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
ATTENZIONE: Il diazometano è altamente tossico e potenzialmente esplosivo. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare con vetro di sicurezza che indossa adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile). - Aggiungere 2 mL della soluzione di etere contenente diazometano, ottenuta nella fase 3.10, nell'estratto essiccato di etere etilico contenente acidi micolici, ottenuto nella fase 3.8. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Evaporare la sospensione a 40 °C. Riempire il tubo con azoto gassoso, chiuderlo e conservare i lipidi metilati a 4 °C.
NOTA: Evaporare il diazometano dalla soluzione di etere sotto la cappa a flusso laminare, fino a quando l'etere perde il colore giallo.
4. Analisi cromatografica su strato sottile (TLC)
- Saturare la camera TLC di vetro. Per fare questo, coprire una delle pareti della camera TLC con un pezzo di carta da filtro e lasciarlo a contatto con la fase mobile composta dalla miscela di solventi. Posizionare il volume rimanente del solvente sul fondo della camera TLC.
NOTA: Il fondo della camera TLC deve essere coperto da almeno 1 cm della fase mobile. Nei presenti esperimenti, sono state utilizzate diverse fasi mobili per sviluppare i TLC. Consistevano in 85 mL di n-esano più 15 mL di etere etilico; 100 ml di diclorometano; 90 mL di cloroformio, 10 ml di metanolo e 1 mL di acqua; 30 ml di cloroformio, più 8 ml di metanolo e 1 mL di acqua; 60 ml di cloroformio, più 35 ml di metanolo e 8 ml di acqua; 95 mL di cloroformio più 5 ml di metanolo; e 90 mL di etere di petrolio (60-80 °C) più 10 ml di etere etilico.
NOTA: Nella TLC bidimensionale, utilizzare n-esano:acetone (95:5) nella prima direzione tre volte e utilizzare un singolo sviluppo con toluene:acetone (97:3) nella seconda direzione per analizzare la composizione dell'acido micolico. Per analizzare i PIM, utilizzare cloroformio:metanolo:acqua (60:30:6) nella prima direzione una volta, e usare cloroformio:acido acetico:metanolo:acqua (40:25:3:6) nella seconda direzione. Per analizzare PDIM e AG, utilizzare l'etere di petrolio (60-80 °C): acetato di etile (98: 2) nella prima direzione tre volte e utilizzare un singolo sviluppo con etere di petrolio (60-80 ° C): acetone (98: 2) nella seconda direzione.
ATTENZIONE: L'etere etilico è una sostanza potenzialmente tossica e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
ATTENZIONE: Il diclorometano è una sostanza potenzialmente tossica e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
ATTENZIONE: L'etere di petrolio è una sostanza potenzialmente infiammabile, dannosa per l'ambiente ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
ATTENZIONE: L'acido acetico è una sostanza potenzialmente infiammabile e corrosiva. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
ATTENZIONE: L'acetato di etile è una sostanza infiammabile e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
ATTENZIONE: L'acetone è una sostanza infiammabile e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile). - Chiudere la camera TLC per saturarla per almeno 20 minuti. Nel frattempo, sciogliere i lipidi presenti nel tubo di vetro in 0,2-1 ml di cloroformio.
NOTA: Il volume utilizzato per sciogliere i lipidi può essere modificato a seconda della concentrazione desiderata o prevista del campione. - Applicare 10 μL di ogni sospensione utilizzando un tubo di vetro capillare direttamente sulla piastra TLC e lasciare asciugare il campione per 5 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: I campioni devono essere applicati nella parte inferiore della piastra lasciando 1 cm su ciascun lato. I campioni devono essere separati l'uno dall'altro per almeno 0,5 cm. Una volta applicato il campione sulla piastra, i tubi possono essere nuovamente evaporati con azoto gassoso e conservati a 4 °C per un ulteriore utilizzo. - Inserire la piastra nella camera TLC satura contenente la fase mobile. Consenti alla fase mobile di passare attraverso la TLC.
NOTA: qualsiasi movimento applicato alla camera TLC influisce sul solvente in esecuzione sulla piastra e influisce sulla mobilità lipidica. Nel caso di esecuzione di TLC bidimensionali, sono necessarie due camere TLC per contenere entrambi i sistemi di eluizione. - Rimuovere la piastra dalla camera TLC quando il solvente raggiunge 1 cm di distanza dall'estremità superiore della piastra. Lasciare la piastra sotto flusso laminare fino a quando la silice non è completamente asciutta.
NOTA: Nel caso di analisi della composizione dell'acido micolico, utilizzando n-esano e etere dietile (85:15), ripetere i passaggi 4.4 e 4.5 due volte di più, fino a eseguire la fase mobile tre volte sulla piastra TLC. - Rivelare la piastra con la macchia richiesta; riscaldare la piastra se necessario.
NOTA: Nel presente esperimento, sono stati utilizzati 15-20 ml delle seguenti soluzioni per spruzzare le piastre TLC: 10% di idrato di acido molibdatofosforico in etanolo fino a quando la piastra è di colore giallo brillante, seguito dal riscaldamento della piastra a 120 °C; 5% in etanolo del 20% α-naftolo in acido solforico seguito da riscaldamento della piastra a 120 °C; Reagente blu di molibdeno (1,3% di ossido di molibdeno in acido solforico 4,2 M) fino a quando non sono comparse bande di fosfato o 1% di antrone in acido solforico.
ATTENZIONE: L'acido molibdatofosforico idrato è una sostanza infiammabile e corrosiva. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
ATTENZIONE: L'etanolo è una sostanza potenzialmente infiammabile e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
ATTENZIONE: 1-Naphthol è una sostanza infiammabile, corrosiva ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
ATTENZIONE: Molibdeno Blue Spray Reagent è una sostanza corrosiva, tossica ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
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Representative Results
Con l'obiettivo di mostrare una vasta gamma di lipidi presenti in diverse specie di micobatteri, M. bovis BCG è stato selezionato in quanto è un micobatteri ruvido e a crescita lenta. Nella procedura sono stati aggiunti M. fortuitum e M. brumae ruvidi e a crescita rapida e, infine, è stato incluso anche il morfotipo liscio di M. abscessus. Queste quattro specie ci permettono di visualizzare un ampio spettro di lipidi derivati da micobatteri come acilmalosi (AT), GPL, PDIM, PGL, PIM, TDM e TMM. Inoltre, tutte e quattro le specie hanno diversi modelli di acido micolico.
Dopo aver eseguito i protocolli di estrazione dell'acido micolico, gli estratti lipidici sono stati analizzati attraverso l'analisi 1D-TLC utilizzando due diversi, ugualmente validi, sistemi di eluizione (Figura 3A,B). La prima fase mobile (Figura 3A) era composta da n-esano ed etere dietile (85:15), e la piastra è stata eseguita tre volte. La seconda fase mobile consisteva nel 100% di diclorometano e la piastra è stata eluita una volta (Figura 3B). In entrambi i sistemi di eluizione, gli acidi micolici si trovano approssimativamente al centro della piastra TLC dall'origine dell'applicazione del campione. Come mostra la Figura 3, M. brumae possiede solo acidi micolici di tipo I, un acido micolico presente in tutte le specie di micobatteri. M. bovis · BCG ha profili di acidi micolici di tipo I e IV, M. fortuitum di tipo I e V e M. abscessus,di tipo I e II. L'esecuzione di due tipi di procedure di metilazione ci consente di confermare la presenza di acido micolico di tipo V poiché l'acido micolico di tipo V viene scisso durante la procedura di metanolosi acida. Come mostra la Figura 3, solo dopo la procedura di saponificazione è stato osservato il punto corrispondente all'acido micolico di tipo V. Dopo la metanolosi, TLC ha mostrato i composti derivati dalla scissione di tipo V che sono migrati vicino al punto diapplicazione 19. Per i ricercatori neofiti, 2D-TLC può consentire un metodo complementare per identificare ogni tipo di acido micolico (Figura 3C,D). Gli estratti di acido micolico devono essere prima eseguiti in un sistema di eluizione formato da etere di petrolio (60-80 °C) e acetone (95:5) tre volte. Quindi, la piastra deve essere eseguita nella seconda direzione con una fase mobile formata da toluene e acetone (97:3). La 2D-TLC combinata con la spettrometria di massa (MS) è stata utilizzata per identificare e caratterizzare chimicamente i gruppi funzionali degli acidi micolici ed è stata ampiamente utilizzata per caratterizzare gli acidi micolici20,21,22. Pertanto, il modello di acido micolico è una delle caratteristiche biochimiche di valore nella valutazione micobatterica sistematica in combinazione con altre analisi a causa di modelli di acido micolico condivisi tra diverse specie.
Dopo aver eseguito la procedura sopra menzionata per estrarre i lipidi legati non covalenti, sono stati selezionati diversi sistemi di eluizione in funzione della polarità e delle dimensioni del profilo lipidico presente nelle cellule dei micobatteri. La combinazione ideale di solventi nei sistemi di eluizione dovrebbe consentire di visualizzare i lipidi desiderati nella zona centrale della piastra TLC per facilitare la loro ulteriore purificazione, se lo si desidera. In Figura 4,le piastre TLC sono ordinate dal sistema di eluizione che consente di monitorare i lipidi più apolari (Figura 4A) al sistema di eluizione che consente di visualizzare i lipidi più polari (Figura 4E).
I gliceroli acilici (AG) e i PDIM sono due dei lipidi più apolari presenti nella parete cellulare micobatterica e sono facilmente visualizzabili attraverso analisi 1D-TLC utilizzando una fase mobile formata da etere di petrolio: etere dietilico (90:10). La figura 4A mostra che gli AG erano presenti in M. bovis BCG, M. fortuitum e M. brumae ma non nel morfotipo liscio di M. abscessus. Sebbene 1D-TLC suggerisse la presenza di PDIM in M. bovis BCG e M. fortuitum, è stata corroborata in M. bovis BCG solo quando è stata eseguita l'analisi 2D-TLC (Figura 4B). Complessivamente, questi risultati dimostrano l'importanza di corroborare la presenza di un composto micobatterico da parte di almeno due diversi sistemi di eluizione. Un altro lipide interessante da analizzare nella composizione dei micobatteri è PGL. Nei micobatteri scelti, il PGL è presente solo in M. bovis BCG, ed è evidente quando TLC viene eluito con il sistema di eluizione costituito da cloroformio e metanolo (95:5) (Figura 4C). Seguendo l'idea di visualizzare più componenti polari, il sistema di eluizione costituito dalla miscela di 90:10:1 (cloroformio:metanolo:acqua) è stato utilizzato per monitorare la presenza di GPL (Figura 4D), che sono presenti solo nel morfotipo liscio di M. abscessus. Nella stessa TLC: PGL, trealosio dimicolato (TDM), acile trealosi (AT) e trealosio monomicolato (TMM), possono anche essere osservati. PGL, GPL, TDM, AT sono stati osservati anche nella parte superiore della piastra quando il sistema di eluizione consisteva in 30:8:1 (cloroformio:metanolo:acqua) (Figura 4E). TMM si trova al centro della piastra. TDM e TMM sono stati chiaramente espressi in tutti i micobatteri studiati. Nonostante i mannosidi fosfatidi-inositolo (IM) siano osservati nella parte inferiore della piastra, il miglior sistema di eluizione per analizzare i PIM è 60:35:8 (cloroformio:metanolo:acqua) come mostrato in Figura 5A,B. Mentre tutti i lipidi contenenti zucchero sono rivelati con antrone (Figura 5A), i PIM contengono gruppi fosfato che sono specificamente rivelati con il reagente Molibdeno Blu (Figura 5B). Simile agli acidi micolici, AG e PDIM, i PIM possono anche essere facilmente visualizzati attraverso analisi 2D-TLC (Figura 5C). Inoltre, nel caso di analisi di micobatteri in grado di sintetizzare LOS, PIM e LOS sarebbero differenziati utilizzando lo stesso sistema di eluizione 2D, come dettagliato in Ren et al.8.
Figura 1: Schema della procedura di estrazione del contenuto lipidico di micobatteri coltivati su mezzi solidi. Principali passi per decifrare i lipidi presenti sulle cellule dei micobatteri. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema della procedura per l'estrazione del contenuto di acido micolico dei micobatteri coltivati su mezzi solidi. Principali passi per decifrare gli acidi micolici presenti sulle cellule dei micobatteri usando la metanolosi acida(A)o la saponificazione(B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risultati rappresentativi dell'estrazione lipidica dai micobatteri. Analisi cromatografica su strato sottile (TLC) degli acidi micolici sviluppata in (A) 85 mL di n-esano, più 15 mL di etere etilico (tre cicli) e (B) 100 mL di diclorometano. (C) Analisi TLC bidimensionale degli acidi micolici estratti mediante metanolosi acida sviluppata in 95:5 (n-esano:acetone) (tre cicli) nella prima direzione e 97:3 (toluene:acetone) nella seconda direzione. (D) Analisi TLC bidimensionale degli acidi micolici di M. fortuitum estratti per saponificazione sviluppata in 95:5 (n-esano:acetone) (tre cicli) nella prima direzione e 97:3 (toluene:acetone) nella seconda direzione. I TLC sono stati rivelati con idrato di acido molibdatofosforico al 10% in etanolo seguito dal riscaldamento della piastra a 120 °C. M. bovis BCG Connaught (Linee 1 e 1'); M. fortuitum (linee 2 e 2'); M. abscessus morphotype liscio (Linee 3 e 3') e M. brumae (Linee 4 e 4'). 1-4 acidi micecolici ottenuti per metanolisi acida e acidi micecolici 1'-4' ottenuti per saponificazione. Io, α-micecolati; II, α'-micecolati; IV, chetomicoti; V, epossimicoti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi dell'estrazione lipidica dai micobatteri. (A) Analisi TLC di acilgliceroli (AG) e dimicoceroti di phthiocerol (PDIM) sviluppati in 90:10 (etere di petrolio (60-80 °C) :d etere etilico). (B) Analisi TLC bidimensionale di PDIM e AG sviluppata in 98:2 (etere di petrolio (60-80 °C):acetato di etile) (tre tirature) nella prima direzione e 98:2 (etere di petrolio (60-80 °C):acetone) nella seconda direzione. (C) Analisi TLC del glicolipide fenolico (PGL) sviluppato in 95:5 (cloroformio:metanolo). (D) Analisi TLC sviluppate in 90:10:1 (cloroformio:metanolo:acqua) di PGL, glicopeptidolipidi (GPL), trealosio dimiccolato (TDM), acile trealosi (AT) e trealosio monomiccolato (TMM). (E) Analisi TLC di PGL, GPL, AT, TMM e mannosidi fosfatidil-inositolo (PIM) sviluppati in 30:8:1 (cloroformio:metanolo:acqua). A-B-C sono stati rivelati con il 10% di idrato di acido molibdatofosforico in etanolo seguito dal riscaldamento della piastra a 120 ° C. D-E sono stati rivelati con il 5% in etanolo del 20% di α-naftolo in acido solforico e riscaldato a 120 ° C. Linea 1: M. bovis BCG Connaught; Linea 2: M. fortuitum; Linea 3: M. abscessus morfotipo liscio; Linea 4: M. brumae. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Risultati rappresentativi dei PIP dei micobatteri. (A-B) Analisi TLC dei PIM sviluppati in 60:35:8 (cloroformio:metanolo:acqua). (C) Analisi TLC bidimensionale di PIM sviluppata in 60:30:6 (cloroformio:metanolo:acqua) nella prima direzione e 40:25:3:6 (cloroformio:acido acetico:metanolo:acqua) nella seconda direzione. A-C sono stati rivelati con l'1% di antrone in acido solforico seguito dal riscaldamento della piastra a 120 °C. B è stato rivelato con il reagente Molybdenum Blue fino a quando non sono apparse bande di fosfato. Linea 1: M. bovis BCG Connaught; Linea 2: M. fortuitum; Linea 3: M. abscessus morfotipo liscio; Linea 4: M. brumae. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Viene presentato un semplice protocollo considerato come il metodo gold standard per l'estrazione di composti lipidici non legati in modo covalente dalla parete cellulare micobatterica. Viene mostrata un'ulteriore visualizzazione da parte di TLC mono e bidimensionali dai lipidi estratti di quattro diversi micobatteri.
Due miscele combinate consecutive di cloroformio e metanolo per recuperare il contenuto lipidico delle cellule micobatteriche è la miscela solvente più utilizzata23,24,25,26,27,28,29. Questa miscela consente il recupero di una vasta gamma di lipidi apolari e polari dalle cellule. Tuttavia, alcuni altri metodi sono stati descritti in letteratura per estrarre lipidi micobatterici totali o specifici, che sono stati recentemente esaminati da Hameed et al.29. Ad esempio, il metodo Folch è uno dei protocolli più utilizzati sviluppati per recuperare i lipidi micobatterici totali dai tessuti30 ed è stato anche adattato a colture micobatteriche pure. Consiste nel sospendere le cellule micobatteriche in cloroformio:metanolo (1:2), seguito dalla centrifugazione e dall'aggiunta di cloroformio per ottenere un rapporto di 1:1. Infine, KCl viene utilizzato per rimuovere i componenti nonlipidi dall'estratto31. Parallelamente, sono stati sviluppati altri protocolli per estrarre lipidi specifici. Slayden etal. hanno usato una miscela di cloroformio: metanolo più acetone per recuperare specificamente glicolipidi come TDM o TMM32. Complessivamente, i metodi pubblicati si basano sull'esposizione delle cellule micobatteriche a diverse concentrazioni di solventi, principalmente cloroformio e metanolo. Allo stesso modo, alcuni sali vengono occasionalmente aggiunti per scartare altri componenti cellulari presenti sul campione.
Oltre ai lipidi non legati in modo covalente, viene mostrata anche l'estrazione di acido micolico mediante due diverse procedure. Mentre la metanolosi acida consente la facile estrazione di acidi micolici con reagenti meno pericolosi, la procedura di saponificazione preserva la struttura di tutti i tipi di acido micolico, incluso l'acido micolico di tipo V, che viene scisso durante le procedure di metanolisi. Una volta estratti i lipidi, 1D- o 2D-TLC sono metodi standard per monitorarli, e il saggio utilizzato varia a seconda delle caratteristiche fisico-chimiche dei lipidi. La polarità e le dimensioni di ciascuna molecola determineranno la selezione del sistema di eluizione necessario, consentendo la determinazione dei lipidi che fanno parte del micobatterio. La TLC unidimensionale può essere scelta quando i fattori di ritenzione (Rf) tra i lipidi micobatterici sono diversi, mentre la 2D-TLC facilita la visualizzazione quando diversi lipidi condividono caratteristiche di peso molecolare e polarità. Per facilitare l'identificazione, i lipidi purificati devono essere eseguiti in parallelo al campione estratto per confrontare Rf simili. L'identificazione di un lipide può essere ottenuta quando funziona con la stessa Rf di quella del noto controllo purificato almeno in due sistemi TLC (due diverse fasi mobili). I lipidi purificati possono essere ottenuti da fornitori commerciali o da laboratori di ricerca micobatterici. Infine, la natura biochimica della molecola indica quale macchia può essere utilizzata per rivelare le piastre TLC. Esistono metodi di colorazione universali, come l'acido fosfomolibdico che consente di visualizzare qualsiasi componente organico mentre si lega ai legami di carbonio. Mentre altri come l'a-naftolo o l'antrone forniscono colori specifici ai residui di zucchero, il blu di molibdeno si lega specificamente ai residui di fosfato.
La considerazione più importante per analizzare il contenuto lipidico dei micobatteri è evitare l'uso di materiale plastico durante le procedure poiché il contatto di solventi organici con la plastica può contaminare i campioni e può essere osservato nelle piastre TLC. È anche importante considerare che la composizione del terreno di coltura utilizzata per la coltivazione dei micobatteri, così come la temperatura o i giorni di incubazione, possono modificare il modello lipidico di ciascun micobatterio, come precedentemente descritto16. I micobatteri coltivati su mezzi liquidi e solidi possono essere utilizzati per estrarre i lipidi legati non covalenti o gli acidi micolici. Quando si ottengono cellule da coltura liquida, devono essere adeguatamente filtrate ed essiccate per evitare la presenza di mezzi liquidi nel campione. Inoltre, quando si utilizzano micobatteri da mezzi liquidi, i batteri devono essere coltivati correttamente e in modo equo tra gli esperimenti al fine di ottenere risultati riproducibili nel tempo. Inoltre, le cellule micobatteriche possono essere coltivate anche supellicole 17,33,34,35,36,da cui i lipidi più esterni possono essere recuperati utilizzando solventi organici e monitorati da TLC, come abbiamo mostrato nel presente articolo.
Il principale limite delle procedure di estrazione lipidica micobatterica rimane l'utilizzo di solventi tossici in condizioni di sicurezza. La procedura TLC è meno sensibile di altre tecniche, come la gascromatografia o la cromatografia liquida ad alte prestazioni. Inoltre, le TLC non consentono la quantificazione dei campioni e devono essere applicate ulteriori tecniche per identificare la struttura dei composti estratti. Ad esempio, la risonanza magnetica nucleare deve essere eseguita per distinguere gli isomeri lipidici. È interessante notare che per descrivere la struttura di un lipide micobatterico per la prima volta, sono necessarie spettrometria di massa o spettroscopia infrarossa. Pertanto, l'analisi quantitativa e qualitativa delle classi lipidiche richiede normalmente combinazioni di diversi metodi di estrazione, derivatizzazione, cromatografia e rilevamento, come la cromatografia liquida ad alte o ultra prestazioni spettrometria di massa tandem e spettroscopia di risonanza magnetica nucleare37,38,39,40. Recenti studi hanno dimostrato che l'utilizzo di una tecnica di rilevamento della cromatografia a strato sottile-fiamma a fase singola consente la quantificazione e lo screening preliminare degli acidi micolici in Actinobacteria41. Tuttavia, la TLC è una tecnica estremamente utile, che fa perdere tempo ed è economica per lo screening e la valutazione della composizione lipidica dei micobatteri. Nel complesso, le procedure qui presentate sono altamente versatili fornendo strumenti di base per analizzare la caratteristica più rilevante delle cellule di micobatteri: la sua complessa parete cellulare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dal Ministero spagnolo della Scienza, dell'Innovazione e delle Università (RTI2018-098777-B-I00), dai Fondi FEDER e dalla Generalitat della Catalogna (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido è la destinataria di un contratto di dottorato (FI) presso la Generalitat de Catalunya.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
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