Summary
En protokoll presenteres for å trekke ut det totale lipidinnholdet i celleveggen til et bredt spekter av mykobakterier. Videre vises ekstraksjons- og analytiske protokoller av de forskjellige typer mykolsyrer. En tynnlags kromatografisk protokoll for å overvåke disse mykobakterielle forbindelsene er også gitt.
Abstract
Mycobacteria arter kan avvike fra hverandre i veksthastigheten, tilstedeværelse av pigmentering, kolonimorfologien som vises på faste medier, samt andre fenotypiske egenskaper. Imidlertid har de alle til felles den mest relevante karakteren av mykobakterier: dens unike og svært hydrofobe cellevegg. Mycobacteria arter inneholder et membran-kovalent knyttet kompleks som inkluderer arabinogalactan, peptidoglykan, og lange kjeder av mykolsyrer med typer som varierer mellom mykobakterier arter. I tillegg kan mykobakterier også produsere lipider som er plassert, ikke-kovalente, på celleoverflatene, for eksempel feniocerol dimykocerosater (PDIM), fenoliske glykolipider (PGL), glykopeptidolipider (GPL), akryltrehaloser (AT) eller fosfatidil-inositol mannosider (PIM), blant andre. Noen av dem betraktes som virulensfaktorer i patogen mykobakterier, eller kritiske antigene lipider i host-mykobakterier interaksjon. Av disse grunnene er det en betydelig interesse for studiet av mykobakterielle lipider på grunn av deres anvendelse på flere felt, fra å forstå deres rolle i patogeniteten av mykobakterier infeksjoner, til en mulig implikasjon som immunmodulerende midler for behandling av smittsomme sykdommer og andre patologier som kreft. Her presenteres en enkel tilnærming for å trekke ut og analysere det totale lipidinnholdet og myksyresammensetningen av mykobakterierceller som vokser i et fast medium ved hjelp av blandinger av organiske løsningsmidler. Når lipidekstraktene er oppnådd, utføres tynnlagskromatografi (TLC) for å overvåke de ekstraherte forbindelsene. Eksempeleksperimentet utføres med fire forskjellige mykobakterier: den miljømessige raskt voksende Mycolicibacterium brumae og Mycolicibacterium fortuitum, den svekkede langsomt voksende Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG), og det opportunistiske patogenet raskt voksende Mycobacterium abscessus, som viser at metoder vist i den nåværende protokollen kan brukes til et bredt spekter av mykobakterier.
Introduction
Mycobacterium er et slekt som består av patogene og ikke-patogene arter, preget av å ha en svært hydrofob og ugjennomtrengelig cellevegg dannet av deres særegne lipider. Spesielt inneholder den mykobakterielle celleveggen mykolsyrer, som er α-alkyl og β-hydroksy fettsyrer, der α-grenen er konstant i alle mykolsyrer (unntatt lengden) og β-kjeden, kalt meromycolate kjeden, er en lang alifatisk kjede som kan inneholde forskjellige funksjonelle kjemiske grupper beskrevet sammen med litteraturen (α-, α'-, metoksy-, metoksy-, κ-, epoksy-, karboksy- og ω-1-metoksy-mykolater), og produserer derfor syv typer mykolsyrer (I-VII)1. Videre er andre lipider med utvilsomt betydning også til stede i celleveggen til mykobakterier. Patogene arter som Mycobacterium tuberculosis, årsaksmiddelet til tuberkulose2 produsere spesifikke lipidbaserte virulensfaktorer som phthiocerol dimycocerosates (PDIMs), fenolisk glykolipid (PGL), di-, tri- og penta-acyltrehaloser (DAT, TAT og PAT), eller sulfolipider, blant andre3. Deres tilstedeværelse på den mykobakterielle overflaten har vært forbundet med evnen til å endre vertens immunrespons og derfor utviklingen og utholdenheten til mykobakterien inne i verten.4. For eksempel har tilstedeværelsen av triacylglyseroler (TAG) vært forbundet med den hypervirulente fenotypen av lineage 2-Beijing underlinje av M. tuberculosis, muligens på grunn av sin evne til å dempe vertens immunrespons5,6. Andre relevante lipider er lipooligosakkarider (LOS) tilstede i tuberkuløs og ikketuberculous mykobakterier. Når det gjelder Mycobacterium marinum, tilstedeværelsen av LOSs i celleveggen er relatert til glidende motilitet og evnen til å danne biofilmer og forstyrrer anerkjennelse av makrofag mønstergjenkjenningsreseptorer, som påvirker opptak og eliminering av bakteriene av vertsfosytter.7,8. I tillegg tillater fraværet eller tilstedeværelsen av noen lipider medlemmer av samme art å bli klassifisert i forskjellige morfotyper med virulente eller dempe profiler når de samhandler med vertsceller. For eksempel er fraværet av glykopeptidolipider (GPL) i den grove morfotypen av Mycobacterium abscessus har vært assosiert med evnen til å indusere intrafaggosomal forsuring, og følgelig celleapoptose9, i motsetning til den glatte morfotypen som har GPLer i overflaten. Videre er lipidinnholdet i den mykobakterielle celleveggen relatert til evnen til å endre immunresponsen hos verten. Dette er relevant i sammenheng med bruk av noen mykobakterier for å utløse en beskyttende immunprofil mot forskjellige patologier.10,11,12,13. Det har for eksempel blitt demonstrert at Mycolicibacterium vaccae, en saprofytisk mykobakteri, som for tiden er i kliniske fase III-studier som en immunterapeutisk vaksine mot tuberkulose, viser to koloniale morfotyper. Mens den glatte fenotypen, som inneholder en polyester i overflaten, utløser en Th2-respons, kan den grove fenotypen uten polyester indusere en Th1-profil når den samhandler med vertsimmunceller.14. Repertoaret av lipider tilstede i mykobakterielle cellen avhenger ikke bare av mykobakterier, men også på forholdene til mykobakterielle kulturer: inkubasjonstidspunkt15,16 eller sammensetningen av kulturmediet17,18. Faktisk påvirker endringer i kulturmediumsammensetningen antitumor- og immunostimulatorisk aktivitet av M. bovis BCG og Mycolicibacterium brumae in vitro17. Dessuten utløses den beskyttende immunprofilen av M. bovis BCG mot M. tuberculosis utfordringen i musmodeller avhenger også av kulturmediene der M. bovis BCG vokser17. Disse kan da være relatert til lipidsammensetningen av mykobakterien i hver kulturtilstand. Av alle disse grunnene er studiet av lipidinnholdet i mykobakterier relevant. En visuell prosedyre for å trekke ut og analysere lipidsammensetningen til den mykobakterielle celleveggen presenteres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ekstraksjon av de totale ikke-kovalente lipidene fra mykobakterier (figur 1)
- Ripe 0,2 g mykobakterier fra et solidt medium og legg til et glassrør med en polytetrafluorethlene (PTFE) foringsskruehett. Tilsett en løsning som består av 5 ml kloroform og 10 ml metanol (kloroform:metanol, 1:2).
MERK: Når organiske løsemidler brukes, skal kun glassmottaker brukes. Ingen plastbeholdere er tillatt. Videre er PTFE foringsskruehetter for flasker nødvendig.
FORSIKTIG: Kloroform er et potensielt giftig og ekstremt farlig stoff. Den må brukes i en laminær strømningshette iført passende personlig verneutstyr (laboratoriebelegg, vernebriller og nitrilhansker).
FORSIKTIG: Metanol er et potensielt giftig og ekstremt farlig stoff. Den må brukes i en laminær strømningshette iført passende personlig verneutstyr (laboratoriebelegg, vernebriller og nitrilhansker). - La røret stå i konstant omrøring over natten for å trekke ut ikke-kovalente lipider fra den mykobakterielle celleoverflaten.
MERK: Hvis en orbital ristingsplattform ikke er tilgjengelig, kan konstant omrøring erstattes av periodisk manuell omrøring så ofte som mulig. - Dekk en glasstrakt med et filterpapir, filtrer de organiske løsningsmidlene og samle dem i et glassrør.
- Bruk en nitrogengassfluks for å fordampe væskefasen i røret. Fyll røret med nitrogengass, dekk og oppbevar det ved 4 °C.
MERK: Koble en pasteurpipette av glass til strømmen av nitrogengass for å fordampe ønsket rør spesielt. I tillegg, opprettholde røret inne i en tørr blokk varmeapparat for rør ved 37 °C. Når løsningsmidlet fordampes, fyll røret med nitrogengass før du lukker det. - Tilsett 15 ml kloroform: metanol (2:1) til cellulært rusk. La røret stå i konstant omrøring over natten for å trekke ut ikke-kovalente lipider fra den mykobakterielle celleoverflaten.
MERK: Hvis en orbital ristingsplattform ikke er tilgjengelig, kan konstant omrøring erstattes av periodisk manuell omrøring så ofte som mulig. - La blandingen hvile i 1 time. Med en Pasteur pipette, gjenopprett de organiske løsningsmidlene. Dekk en glasstrakt med et filterpapir og filtrer de organiske løsningsmidlene og samle dem i samme glassrør som tidligere ble brukt i trinn 1.3. Bruk en nitrogengassfluks for å fordampe væskefasen i røret. Fyll røret med nitrogengass, lukk det og oppbevar det igjen ved 4 °C.
2. Mykolsyreekstraksjon ved syremethanolyse (Figur 2A)
- Tilsett 2-5 ml esterifiseringsløsning i et hermetisk glassrør med en PTFE foringsskruehette. Tilsett 0,2 g mykobakterierbiomasse i glassrøret.
MERK: Esterifiserende løsning dannes ved å blande 30 ml metanol, 15 ml toluen og 1 ml svovelsyre. Mykobakterierceller kan tas fra faste kulturer eller, selv fra delipiderte celler etter å ha utført utvinning av totale ikke-kovalente koblede lipider fra mykobakterier (gjenværende celler etter filtrering i trinn 1.6).
FORSIKTIG: Toluen er et brannfarlig og ekstremt farlig stoff. Den må brukes i en laminær strømningshette iført passende personlig verneutstyr (laboratoriebelegg, vernebriller og nitrilhansker).
FORSIKTIG: Svovelsyre er et etsende og farlig stoff. Den må brukes i en laminær strømningshette iført passende personlig verneutstyr (laboratoriebelegg, vernebriller og nitrilhansker). - Bland innholdet ved å virvelere. La blandingen stå inne i et tørt bad ved 80 °C over natten.
- La røret avkjøles til det når romtemperaturen og tilsett deretter 2 ml n-heksan til røret. Bland innholdet ved å virvelere i 30 s og la røret slå seg ned til to klare faser vises.
FORSIKTIG: n-heksan er et potensielt brannfarlig, irriterende, miljøskadelig og ekstremt farlig stoff. Den må brukes i en laminær strømningshette iført passende personlig verneutstyr (laboratoriebelegg, vernebriller og nitrilhansker). - Gjenopprett den øvre fasen som tilsvarer n-heksanfasen. Overfør den til et nytt rør.
- Gjenta trinn 2.3. Gjenopprett den øvre fasen igjen og overfør den til det samme røret som ble brukt i trinn 2.4.
- Fordamp innholdet i røret ved hjelp av en nitrogengassfluks. Fyll røret med nitrogengass, lukk det og oppbevar det ved 4 °C.
3. Myksyreutvinning ved saponering og metylering (Figur 2B)
- Ripe 0,2 g mykobakterier fra et solidt medium og legg til et glassrør med en PTFE skruehett.
- Tilsett 2 ml metanol-benzenoppløsning (80:20) som inneholder 5% kaliumhydroksid. Bland innholdet ved å virvelere. Varm blandingen i 3 timer ved 100 °C.
FORSIKTIG: Benzen er et brannfarlig, kreftfremkallende og farlig stoff. Den må brukes i en laminær strømningshette iført passende personlig verneutstyr (laboratoriebelegg, vernebriller og nitrilhansker). - La røret avkjøles til romtemperatur. Tilsett 20% svovelsyre for å surgjøre prøvene for å oppnå pH = 1.
- Tilsett 3 ml dietyleter. Bland innholdet forsiktig ved å virvelere.
- La de to fasene dannes ved å bosette seg. Gjenopprett dietyleterfasen og overfør til et nytt rør. Gjenta vasketrinnet i totalt tre ganger.
- Vask dietyleterekstraktet med 2 ml destillert vann og overfør den øvre delen som tilsvarer diettens eter til et nytt rør. Gjenta vasketrinnet i totalt tre ganger.
- Tilsett 2 g vannfri natriumsulfat over dietyleterekstraktet for å tørke det.
- Filtrer suspensjonen. Fordamp innholdet ved hjelp av en nitrogengassfluks.
- For å utføre metyleringstrinnet oppløses 3 g N-nitroso-N-metyl urea i en ferdigkjølt løsning dannet av 45 ml dietyleter og 9 ml 40% KOH i destillert vann.
FORSIKTIG: N-nitroso-N-metylurea er et giftig, irriterende, kreftfremkallende og farlig stoff. Den må brukes i en laminær strømningshette iført passende personlig verneutstyr (laboratoriebelegg, vernebriller og nitrilhansker). - Overfør supernatanten (diazometan) til en ny kolbe avkjølt i is som inneholder kaliumhydroksidpellets (ca. 30 g).
MERK: Hvis supernatanten ikke brukes umiddelbart, kan den oppbevares ved -20 °C i maksimalt 1 time.
FORSIKTIG: Kaliumhydroksidpellets er et irriterende og etsende stoff. Dette materialet må brukes i en laminær strømningshette iført passende personlig verneutstyr (laboratoriebelegg, vernebriller og nitrilhansker).
FORSIKTIG: Diazomethane er svært giftig og potensielt eksplosiv. Den må brukes i en laminær strømningshette med sikkerhetsglass iført passende personlig verneutstyr (laboratoriebelegg, vernebriller og nitrilhansker). - Tilsett 2 ml av eteroppløsningen som inneholder diazometan, oppnådd i trinn 3.10, i det tørkede dietyleterekstraktet som inneholder myksyrer, oppnådd i trinn 3.8. Inkuber i 15 min ved romtemperatur.
- Fordamp suspensjonen ved 40 °C. Fyll røret med nitrogengass, lukk det og oppbevar de metylerte lipidene ved 4 °C.
MERK: Fordamp diazometanen fra eteroppløsningen under laminær strømningshetten, til eteren mister den gule fargen.
4. Analyse av tynn lagkromatografi (TLC)
- Mette TLC-kammeret i glass. For å gjøre dette, dekk en av veggene i TLC-kammeret med et stykke filterpapir og la det være i kontakt med den mobile fasen sammensatt av blandingen av løsningsmidler. Plasser det gjenværende volumet av løsningsmidlet på bunnen av TLC-kammeret.
MERK: Bunnen av TLC-kammeret må dekkes med minst 1 cm av den mobile fasen. I de nåværende eksperimentene ble forskjellige mobile faser brukt til å utvikle TLD-ene. De besto av 85 ml n-heksan pluss 15 ml dietyleter; 100 ml dichloromethane; 90 ml kloroform, 10 ml metanol og 1 ml vann; 30 ml kloroform, pluss 8 ml metanol og 1 ml vann; 60 ml kloroform, pluss 35 ml metanol og 8 ml vann; 95 ml kloroform pluss 5 ml metanol; og 90 ml petroleum eter (60-80 °C) pluss 10 ml dietyleter.
MERK: I det todimensjonale TLC, bruk n-heksan:aceton (95:5) i første retning tre ganger, og bruk en enkelt utvikling med toluen:aceton (97:3) i den andre retningen for å analysere myksyresammensetning. For å analysere PIMs, bruk kloroform:metanol:water (60:30:6) i første retning en gang, og bruk kloroform:eddiksyre:metanol:vann (40:25:3:6) i den andre retningen. For å analysere PDIM og AG, bruk petroleum eter (60-80 °C):etylacetat (98:2) i første retning tre ganger, og bruk en enkelt utvikling med petroleum eter (60-80 °C):aceton (98:2) i andre retning.
FORSIKTIG: Dietyleter er et potensielt giftig og farlig stoff. Den må brukes i en laminær strømningshette iført passende personlig verneutstyr (laboratoriebelegg, vernebriller og nitrilhansker).
FORSIKTIG: Dichloromethane er et potensielt giftig og farlig stoff. Den må brukes i en laminær strømningshette iført passende personlig verneutstyr (laboratoriebelegg, vernebriller og nitrilhansker).
FORSIKTIG: Petroleumseter er et potensielt brannfarlig, miljøskadelig og ekstremt farlig stoff. Den må brukes i en laminær strømningshette iført passende personlig verneutstyr (laboratoriebelegg, vernebriller og nitrilhansker).
FORSIKTIG: Eddiksyre er et potensielt brannfarlig og etsende stoff. Den må brukes i en laminær strømningshette iført passende personlig verneutstyr (laboratoriebelegg, vernebriller og nitrilhansker).
FORSIKTIG: Etylacetat er et brannfarlig og farlig stoff. Den må brukes i en laminær strømningshette iført passende personlig verneutstyr (laboratoriebelegg, vernebriller og nitrilhansker).
FORSIKTIG: Aceton er et brannfarlig og farlig stoff. Den må brukes i en laminær strømningshette iført passende personlig verneutstyr (laboratoriebelegg, vernebriller og nitrilhansker). - Lukk TLC-kammeret for å mette det i minst 20 minutter. I mellomtiden oppløs lipidene som er tilstede i glassrøret i 0,2-1 ml kloroform.
MERK: Volumet som brukes til å oppløse lipidene kan endres avhengig av ønsket eller forventet konsentrasjon av prøven. - Påfør 10 μL av hver suspensjon ved hjelp av et kapillærglassrør direkte på TLC-platen og la prøven tørke i 5 minutter ved romtemperatur.
MERK: Prøver må påføres nederst på platen og etterlates 1 cm på hver side. Prøver må skilles fra hverandre i minst 0,5 cm. Når prøven er påført på platen, kan rør fordampes igjen med nitrogengass og lagres ved 4 °C for videre bruk. - Sett platen inn i det mettede TLC-kammeret som inneholder den mobile fasen. La den mobile fasen gå gjennom TLC.
MERK: Enhver bevegelse som påføres TLC-kammeret påvirker det løpende løsningsmidlet på platen og påvirker lipidmobiliteten. Ved utførelse av todimensjonal TLC kreves to TLC-kamre for å inneholde begge elutionsystemene. - Fjern platen fra TLC-kammeret når løsningsmidlet når 1 cm avstand fra den øvre enden av platen. La platen stå under laminær flux til silikaen er helt tørket.
MERK: Ved analyse av myksyresammensetningen, ved hjelp av n-heksan og dietyleter (85:15), gjenta trinn 4,4 og 4,5 to ganger mer, til du kjører mobilfasen tre ganger over TLC-platen. - Avslør platen med ønsket flekk; varm opp platen om nødvendig.
MERK: I det nåværende eksperimentet ble 15-20 ml av følgende løsninger brukt til å sprøyte TLC-platene: 10% Molybdatophosphorsyrehydrat i etanol til platen er lysegul, etterfulgt av oppvarming av platen ved 120 °C; 5% i etanol på 20% α-naphthol i svovelsyre etterfulgt av oppvarming av platen ved 120 °C; Molybden Blå reagens (1,3% molybdenoksid i 4,2 M svovelsyre) til fosfatbånd dukket opp eller 1% antron i svovelsyre.
FORSIKTIG: Molybdatofosforsyrehydrat er et brannfarlig og etsende stoff. Den må brukes i en laminær strømningshette iført passende personlig verneutstyr (laboratoriebelegg, vernebriller og nitrilhansker).
FORSIKTIG: Etanol er et potensielt brannfarlig og farlig stoff. Den må brukes i en laminær strømningshette iført passende personlig verneutstyr (laboratoriebelegg, vernebriller og nitrilhansker).
FORSIKTIG: 1-Naphthol er et brannfarlig, etsende og ekstremt farlig stoff. Den må brukes i en laminær strømningshette iført passende personlig verneutstyr (laboratoriebelegg, vernebriller og nitrilhansker).
FORSIKTIG: Molybden Blue Spray Reagent er et etsende, giftig og ekstremt farlig stoff. Den må brukes i en laminær strømningshette iført passende personlig verneutstyr (laboratoriebelegg, vernebriller og nitrilhansker).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med sikte på å vise et bredt spekter av lipider tilstede i forskjellige mykobakterier, ble M. bovis BCG valgt som det er grov og langsomt voksende mykobakterier. Den grove og raskt voksende M. fortuitum og M. brumae ble tilsatt i prosedyren, og til slutt ble den glatte morfotypen til M. abscessus også inkludert. Disse fire artene tillater oss å visualisere et bredt spekter av mykobakterier-avledede lipider som acyltrehaloses (AT), GPLs, PDIM, PGL, PIM, TDM og TMM. Videre har alle fire artene forskjellige mykolsyremønstre.
Etter å ha utført mykolsyreutvinningsprotokollene, ble lipidekstrakter analysert gjennom 1D-TLC-analyse ved hjelp av to forskjellige, like gyldige elutionsystemer (figur 3A, B). Den første mobile fasen (Figur 3A) ble komponert av n-heksan og dietyleter (85:15), og platen ble kjørt tre ganger. Den andre mobile fasen besto av 100% av dichloromethane og platen ble eluted en gang (Figur 3B). I begge elutionsystemene ligger mykolsyrer omtrent midt i TLC-platen fra opprinnelsen til prøveapplikasjonen. Som figur 3 viser, har M. brumae bare type I mykolsyrer, en myksyre tilstede i alle mykobakterierarter. M. bovis BCG har type I og IV, M. fortuitum type I og V, og M. abscessus, type I og II mykolsyrer profiler. Å utføre to typer metyleringsprosedyrer tillater oss å bekrefte tilstedeværelsen av type V mykolsyre siden type V mykolsyre er spaltet under syremethanolyseprosedyren. Som figur 3 viser, først etter saponeringsprosedyren var stedet som tilsvarer type V mykolsyre observert. Etter methanolyse viste TLC de avledede forbindelsene fra type V-spalting som migrerte nær applikasjonspunktet19. For neofyttforskere kan 2D-TLC tillate en komplementær metode for å identifisere hver myksyretype (Figur 3C,D). Mykolsyreekstrakter må først kjøres i et elutionsystem dannet av petroleumseter (60-80 °C) og aceton (95:5) tre ganger. Deretter må platen kjøres i andre retning med en mobil fase dannet av toluen og aceton (97:3). 2D-TLC kombinert med massespektrometri (MS) har blitt brukt til å identifisere og kjemisk karakterisere de funksjonelle gruppene av mykolsyrer og har blitt brukt mye for å karakterisere myksyrer20,21,22. Derfor er mykolsyremønsteret en av de biokjemiske egenskapene til verdi i systematisk mykobakteriell evaluering i kombinasjon med andre analyser på grunn av delte mykolsyremønstre blant forskjellige arter.
Etter å ha utført ovennevnte prosedyre for å trekke ut de ikke-kovalente koblede lipidene, ble forskjellige elutionsystemer valgt i funksjon av polariteten og størrelsen på lipidprofilen som finnes i mykobakterierceller. Den ideelle kombinasjonen av løsningsmidler i elutionsystemene bør gjøre det mulig å visualisere de ønskede lipidene i midtsonen på TLC-platen for å lette deres videre rensing, om ønskelig. I figur 4bestilles TLC-plater fra elutionsystemet som gjør det mulig å overvåke de mest apolare lipidene (figur 4A) til elutionsystemet som gjør det mulig å visualisere de mest polare lipidene (figur 4E).
Acyl glyseroler (AG) og PDIMer er to av de mest apolare lipidene som finnes i den mykobakterielle celleveggen og visualiseres lett gjennom 1D-TLC-analyser ved hjelp av en mobil fase dannet av petroleum eter: dietyleter (90:10). Figur 4A viser at AG var til stede i M. bovis BCG, M. fortuitum og M. brumae, men ikke i den glatte morfotypen til M. abscessus. Selv om 1D-TLC foreslo tilstedeværelsen av PDIM i M. bovis BCG og M. fortuitum, ble det bare bekreftet i M. bovis BCG da 2D-TLC-analyse ble utført (Figur 4B). Til sammen viser disse resultatene viktigheten av å bekrefte tilstedeværelsen av en mykobakteriell forbindelse med minst to forskjellige elutionsystemer. En annen interessant lipid å analysere i mykobakterier sammensetningen er PGL. I den valgte mykobakterien er PGL bare til stede i M. bovis BCG, og det er merkbart når TLC elutes med elutionsystemet som består av kloroform og metanol (95:5) (Figur 4C). Etter ideen om å visualisere mer polare komponenter, ble elutionsystemet som består av blandingen av 90:10:1 (kloroform:metanol:vann) brukt til å overvåke tilstedeværelsen av GPLer (Figur 4D), som bare er til stede i M. abscessus glatt morfotype. I samme TLC: PGL, trehalose dimycolate (TDM), acyl trehaloser (AT) og trehalose monomycolate (TMM), kan også observeres. PGL, GPLs, TDM, AT ble også observert på toppen av platen da elutionsystemet besto av 30:8:1 (kloroform:metanol:vann) (Figur 4E). TMM er plassert midt på platen. TDM og TMM ble tydelig uttrykt i alle mykobakterier som ble studert. Til tross for at fosfatidyl-inositol mannosider (PIMer) observeres nederst på platen, er det beste elutionsystemet for å analysere PIMer 60:35:8 (kloroform:metanol:vann) som vist i figur 5A,B. Mens alle sukkerholdige lipider avsløres med anthron (figur 5A), inneholder PIMs fosfatgrupper som er spesielt avslørt med Molybden Blue reagens (Figur 5B). I likhet med myksyrer, AG og PDIMer, kan PIMer også enkelt visualiseres gjennom 2D-TLC-analyser (Figur 5C). Videre, i tilfelle av å analysere mykobakterier som er i stand til å syntetisere LOSs, PIMs og LOSs ville bli differensiert ved hjelp av samme 2D elution system, som beskrevet i Ren et al.8.
Figur 1: Ordningen med prosedyren for å trekke ut lipidinnhold av mykobakterier dyrket på faste medier. Hovedtrinn for å dechiffrere lipider tilstede på mykobakterierceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ordningen med prosedyren for å trekke ut myksyreinnhold av mykobakterier dyrket på faste medier. Hovedtrinn for å dechiffrere mykolsyrer tilstede på mykobakterierceller ved hjelp av enten (A) forsuretanolyse eller (B) saponering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative resultater av lipidekstraksjon fra mykobakterier. Tynnlags kromatografi (TLC) analyse av mykolsyrer utviklet i (A) 85 ml n-heksan, pluss 15 ml dietyleter (tre løp) og (B) 100 ml dichloromethane. (C) Todimensjonal TLC-analyse av mykolsyrer ekstrahert av syremetanolyse utviklet i 95:5 (n-heksan:aceton) (tre løp) i første retning og 97:3 (toluen:aceton) i andre retning. (D) Todimensjonal TLC-analyse av myksyrer fra M. fortuitum ekstrahert ved saponifikasjon utviklet i 95:5 (n-heksan:aceton) (tre løp) i første retning og 97:3 (toluen:acetone) i andre retning. TLD-er ble avslørt med 10% molybdatofosforsyrehydrat i etanol etterfulgt av oppvarming av platen ved 120 °C. M. bovis BCG Connaught (linje 1 og 1'); M. fortuitum (linje 2 og 2'); M. abscessus glatt morfotype (linje 3 og 3') og M. brumae (linje 4 og 4'). 1-4 mykolsyrer oppnådd ved syremethanolyse og 1'-4' mykolsyrer oppnådd ved saponering. Jeg, α-mycolates; II, α'-mycolates; IV, ketomycolates; V, epoksymycolates. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative resultater av lipidekstraksjon fra mykobakterier. (A) TLC-analyse av acylglyseroler (AG) og feniocerol dimykocerosater (PDIMer) utviklet i 90:10 (petroleumseter (60-80 °C):d ietyl eter). (B) Todimensjonal TLC-analyse av PDIMer og AG utviklet i 98:2 (petroleum eter (60-80 °C):etylacetat) (tre løp) i første retning og 98:2 (petroleum eter (60-80 °C):aceton) i andre retning. (C) TLC-analyse av fenolglykolipid (PGL) utviklet i 95:5 (kloroform:metanol). (D) TLC analyser utviklet i 90:10:1 (kloroform:metanol:vann) av PGL, glykopeptidolipids (GPL), trehalose dimycolate (TDM), acyl trehaloser (AT) og trehalosemonymycolat (TMM). (E) TLC-analyse av PGL, GPL, AT, TMM og fosfatidyl-inositol mannosider (PIMer) utviklet i 30:8:1 (kloroform:metanol:vann). A-B-C ble avslørt med 10% molybdatofosforsyrehydrat i etanol etterfulgt av oppvarming av platen ved 120 °C. D-E ble avslørt med 5% i etanol på 20% α-naphthol i svovelsyre og oppvarmet ved 120 °C. Linje 1: M. bovis BCG Connaught; Linje 2: M. fortuitum; Linje 3: M. abscessus glatt morfotype; Linje 4: M. brumae. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative resultater fra PIMer fra mykobakterier. ( A-B ) TLC-analyse av PIMer utviklet i 60:35:8 (kloroform:metanol:vann). (C) Todimensjonal TLC-analyse av PIMs utviklet i 60:30:6 (kloroform:metanol:vann) i første retning og 40:25:3:6 (kloroform:eddiksyre:metanol:vann) i andre retning. A-C ble avslørt med 1% antron i svovelsyre etterfulgt av oppvarming av platen ved 120 °C. B ble avslørt med Molybden Blue reagens til fosfatbånd dukket opp. Linje 1: M. bovis BCG Connaught; Linje 2: M. fortuitum; Linje 3: M. abscessus glatt morfotype; Linje 4: M. brumae. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En enkel protokoll betraktet som gullstandardmetoden for utvinning av ikke-sammenhengende lipidforbindelser fra mykobakteriell cellevegg presenteres. Videre visualisering av en- og todimensjonale TLD-er fra de ekstraherte lipidene til fire forskjellige mykobakterier vises.
To påfølgende kombinerte blandinger av kloroform og metanol for å gjenopprette lipidisk innhold av mykobakterielle celler er den mest brukte løsningsmiddelblandingen23,24,25,26,27,28,29. Denne blandingen tillater utvinning av et bredt spekter av apolare og polare lipider fra cellene. Likevel har noen andre metoder blitt beskrevet i litteraturen for å trekke ut totale eller spesifikke mykobakterielle lipider, som nylig har blitt gjennomgått av Hameed et al.29. For eksempel er Folch-metoden en av de mest brukte protokollene utviklet for å gjenopprette de totale mykobakterielle lipidene fra vev30 og har også blitt tilpasset rene mykobakterielle kulturer. Den består av å suspendere mykobakterielle celler i kloroform:metanol (1:2), etterfulgt av sentrifugering og tilsetning av kloroform for å oppnå et forhold på 1:1. Til slutt brukes KCl til å fjerne ikke-lipide komponenter fraekstrakt 31. Parallelt er andre protokoller utviklet for å trekke ut spesifikke lipider. Slayden et al. brukte en blanding av kloroform: metanol pluss aceton for å spesifikt gjenopprette glykolipider som TDM eller TMM32. Til sammen er publiserte metoder basert på å utsette mykobakterielle celler for ulike konsentrasjoner av løsningsmidler, hovedsakelig kloroform og metanol. På samme måte blir noen salter av og til tilsatt for å kaste bort andre cellekomponenter som finnes på prøven.
I tillegg til ikke-sammenhengende lipider, vises også myksyreutvinning ved to forskjellige prosedyrer. Mens sur methanolyse tillater enkel utvinning av mykolsyrer med mindre farlige reagenser, bevarer saponifikasjonsprosedyren strukturen til alle mykolsyretyper, inkludert type V mykylsyre, som spaltes under methanolyseprosedyrene. Når lipidene er ekstrahert, er 1D- eller 2D-TLC standardmetoder for å overvåke dem, og analysen som brukes varierer avhengig av lipidenes fysisk-kjemiske egenskaper. Polariteten og størrelsen på hvert molekyl vil bestemme valget av elutionsystemet som trengs, noe som muliggjør bestemmelse av lipidene som utgjør en del av mykobakterien. Endimensjonal TLC kan velges når oppbevaringsfaktorene (Rf) mellom mykobakterielle lipider er forskjellige, mens 2D-TLC letter visualisering når forskjellige lipider deler molekylvekt og polaritetsegenskaper. For å lette identifikasjonen, bør rensede lipider kjøres parallelt med den ekstraherte prøven for å sammenligne lignende Rf. Identifiseringen av en lipid kan oppnås når den kjører med samme Rf som for den kjente rensede kontrollen minst i to TLC-systemer (to forskjellige mobile faser). Rensede lipider kan fås fra kommersielle leverandører eller fra mykobakterielle forskningslaboratorier. Til slutt indikerer molekylets biokjemiske natur hvilken flekk som kan brukes til å avsløre TLC-plater. Det er universelle fargingsmetoder, for eksempel fosfomolybdic syre som gjør det mulig å visualisere organiske komponenter som skal visualiseres når den binder seg til karbonbindinger. Mens andre som a-naphthol eller anthrone gir spesifikke farger til sukkerrester, binder molybdenblå seg spesielt til fosfatrester.
Det viktigste hensynet til å analysere lipidinnholdet i mykobakterier er å unngå bruk av plastmateriale gjennom prosedyrene, siden kontakt med organiske løsningsmidler med plast kan forurense prøvene og kan observeres i TLC-platene. Det er også relevant å vurdere at kulturmediesammensetningen som brukes til mykobakterier dyrking, samt temperatur eller dager med inkubasjon, kan endre lipidmønsteret til hver mykobakterier, som tidligere beskrevet16. Mykobakterier dyrket på enten flytende og faste medier kan brukes til å trekke ut ikke-kovalente tilknyttede lipider eller myksyrer. Når du skaffer celler fra flytende kultur, bør de filtreres tilstrekkelig og tørkes for å unngå tilstedeværelse av flytende medier i prøven. Videre, når du bruker mykobakterier fra flytende medier, må bakterier være riktig og like dyrket mellom eksperimenter for å oppnå reproduserbare resultater over tid. Videre kan mykobakterielle celler også dyrkes på pellicles17,33,34,35,36, hvorfra de mest ytterste lipider kan gjenopprettes ved hjelp av organiske løsningsmidler og overvåkes av TLC, som vi viste i den nåværende artikkelen.
Hovedbegrensningen av mykobakterielle lipidekstraksjonsprosedyrer forblir bruken av giftige løsningsmidler under trygge forhold. TLC-prosedyren er mindre følsom enn andre teknikker, for eksempel gasskromatografi eller høyytelses væskekromatografi. Videre tillater TLC ikke kvantifisering av prøver, og ytterligere teknikker må brukes for å identifisere strukturen til de ekstraherte forbindelsene. For eksempel må kjernemagnetisk resonans utføres for å skille lipid isomerer. Det er bemerkelsesverdig at for å beskrive strukturen til en mykobakteriell lipid for første gang, er det nødvendig med massespektrometri eller infrarød spektroskopi. Dermed krever kvantitativ og kvalitativ analyse av lipidklasser normalt kombinasjoner av forskjellige ekstraksjons-, avlednings-, kromatografiske og deteksjonsmetoder, for eksempel høy- eller ultraytelses væskekromatografi tandem massespektrometri og kjernemagnetisk resonansspektroskopi37,38,39,40. Nyere studier har vist at bruk av en enkelt-trinns tynn-lags kromatografi-flammeioniseringsdeteksjonsteknikk tillater kvantifisering og foreløpig screening av mykolsyrer i Actinobacteria41. Likevel er TLC en ekstremt nyttig, tidsbesparende og billig teknikk for å screene og evaluere lipidisk sammensetning av mykobakterier. Totalt sett er prosedyrene som presenteres her svært allsidige og gir grunnleggende verktøy for å analysere den mest relevante egenskapen til mykobakterierceller: den komplekse celleveggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av det spanske vitenskaps-, innovasjons- og universitetsdepartementet (RTI2018-098777-B-I00), FEDER Funds og Generalitat of Catalunya (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido er mottaker av en ph.d.-kontrakt (FI) fra Generalitat de Catalunya.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
References
- Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
- Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
- Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
- Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).
- Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
- Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).
- Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).
- Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
- Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
- Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
- Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
- Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232 (2016).
- Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
- Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
- Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
- Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).
- Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
- Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
- Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , CPC Press. London, UK. 139-143 (1986).
- Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
- Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
- Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
- Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
- Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
- Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
- Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
- Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
- Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , Springer. Singapore. (2020).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
- Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
- Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
- Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
- Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
- Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).
- Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB". Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
- Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
- Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).
