Summary
Um protocolo é apresentado para extrair o conteúdo lipídico total da parede celular de uma ampla gama de micobactérias. Além disso, são mostrados protocolos de extração e analíticas dos diferentes tipos de ácidos micólicos. Um protocolo cromatográfico de camada fina para monitorar esses compostos micobacterianos também é fornecido.
Abstract
As espécies de micobactérias podem diferir umas das outras na taxa de crescimento, presença de pigmentação, morfologia da colônia exibida em mídia sólida, bem como outras características fenotípicas. No entanto, todos eles têm em comum o caráter mais relevante das micobactérias: sua parede celular única e altamente hidrofóbica. As espécies de micobactérias contêm um complexo ligado à membrana-covalente que inclui arabinogalactan, peptidoglycan e longas cadeias de ácidos micólicos com tipos que diferem entre espécies de micobactérias. Além disso, as micobactérias também podem produzir lipídios localizados, não covalentemente ligados, em suas superfícies celulares, como dimicocerosates de fleiocerol (PDIM), glicólipídios fenólicos (PGL), glicopeptidolipids (GPL), acitretros (AT) ou mannoídeos fosfatidil-inositol (PIM), entre outros. Alguns deles são considerados fatores de virulência em micobactérias patogênicas, ou lipídios antigênicos críticos na interação hospedeira-micobactéria. Por essas razões, há um interesse significativo no estudo dos lipídios micobacterianos devido à sua aplicação em diversas áreas, desde a compreensão de seu papel na patogenicidade das infecções por micobactérias, até uma possível implicação como agentes imunomodulatórios para o tratamento de doenças infecciosas e outras patologias como o câncer. Aqui, é apresentada uma abordagem simples para extrair e analisar o teor total lipídico e a composição de ácido mcólico das células de micobactéria cultivadas em meio sólido usando misturas de solventes orgânicos. Uma vez que os extratos lipíduos são obtidos, a cromatografia de camada fina (TLC) é realizada para monitorar os compostos extraídos. O experimento de exemplo é realizado com quatro micobactérias diferentes: o mycolicibacterium brumae e Mycolicibacterium fortuitum, o atenuado Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG), e o patógeno oportunista de rápido crescimento Mycobacterium abscessus, demonstrando que métodos mostrados no presente protocolo podem ser usados para uma ampla gama de mycobacteria.
Introduction
Mycobacterium é um gênero que compreende espécies patogênicas e não patogênicas, caracterizada por ter uma parede celular altamente hidrofóbica e impermeável formada por seus lipídios peculiares. Especificamente, a parede celular micobacteriana contém ácidos micólicos, que são α-alquila e β-hidroxis, nos quais o α-ramo é constante em todos os ácidos micólicos (exceto pelo comprimento) e a cadeia de β, chamada cadeia meromycolate, é uma longa cadeia alifática que pode conter diferentes grupos químicos funcionais descritos junto com a literatura (α-, α'-, metoxical Κ-, epóxi-, carboxy-, e ω-1-metoxi-mycolates), produzindo assim sete tipos de ácidos míclicos (I-VII)1. Além disso, outros lipídios com importância inquestionável também estão presentes na parede celular das espécies de micobactérias. Espécies patogênicas como Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose2 produzir fatores específicos de virulência à base de lipídios, como dimicocerosates de fleuorol (PDIMs), glicolipídio fenólico (PGL), di-, tri-, e penta-acyltrehaloses (DAT, TAT e PAT), ou sulfolipídios, entre outros3. Sua presença na superfície micobacteriana tem sido associada com a capacidade de modificar a resposta imune do hospedeiro e, portanto, a evolução e persistência do micobacterium dentro do hospedeiro4. Por exemplo, a presença de triacylglycerols (TAG) tem sido associada ao fenótipo hipervirulento da subadequação lineage 2-Pequim de M. tuberculosis, possivelmente devido à sua capacidade de atenuar a resposta imune hospedeiro5,6. Outros lipídios relevantes são lipooligosaccarídeos (LOSs) presentes em micobactérias tuberculosas e não intuberréuas. No caso de Mycobacterium marinum, a presença de LOSs em sua parede celular está relacionada à motilidade deslizante e à capacidade de formar biofilmes e interfere no reconhecimento por receptores de reconhecimento de padrões de macrófago, afetando a absorção e eliminação das bactérias por fagocitos hospedeiros7,8. Além disso, a ausência ou presença de alguns lipídios permite que membros da mesma espécie sejam classificados em diferentes morótipos com perfis virulentos ou atenuados ao interagir com células hospedeiras. Por exemplo, a ausência de glycopeptidolipids (GPL) no morfótipo áspero de Mycobacterium abscessus tem sido associado com a capacidade de induzir acidificação intrafarosômica e, consequentemente, apoptose celular9, ao contrário do morótipo liso que possui GPLs em sua superfície. Além disso, o conteúdo lipídico da parede celular micobacteriana está relacionado com a capacidade de modificar a resposta imune no hospedeiro. Isso é relevante no contexto do uso de algumas micobactérias para desencadear um perfil imunológico protetor contra diferentes patologias10,11,12,13. Foi demonstrado, por exemplo, que Mycolicibacterium vaccae, um micobacterium saprofítico, que atualmente está em ensaios clínicos de fase III como vacina imunoterapêutica para tuberculose, apresentam dois morfotipos coloniais. Enquanto o fenótipo liso, que contém um poliéster em sua superfície, desencadeia uma resposta Th2, o fenótipo áspero desprovido do poliéster pode induzir um perfil Th1 quando interage com células imunes hospedeiras14. O repertório de lipídios presentes na célula micobacteriana não depende apenas das espécies de micobactérias, mas também das condições das culturas micobacterianas: tempo de incubação15,16 ou composição do meio de cultura17,18. De fato, mudanças na composição média da cultura afetam a atividade antitumoral e imunoestimulatória de M. bovis BCG e Mycolicibacterium brumae in vitro17. Além disso, o perfil imunológico protetor desencadeado por M. bovis BCG contra M. tuberculosis desafio em modelos de camundongos também depende da mídia cultural em que M. bovis BCG cresce17. Estes poderiam então estar relacionados com a composição lipídica das micobactérias em cada condição cultural. Por todas essas razões, o estudo do conteúdo lipídico das micobactérias é relevante. Um procedimento visual para extrair e analisar a composição lipídica da parede celular micobacteriana é apresentado.
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Protocol
1. Extração do total de lipídios não covalentes da micobactéria (Figura 1)
- Arranhe 0,2 g de micobactérias de uma mídia sólida e adicione a um tubo de vidro com tampas de parafuso de revestimento politetrafluoroethlene (PTFE). Adicione uma solução composta por 5 mL de clorofórmio e 10 mL de metanol (clorofórmio:metanol, 1:2).
NOTA: Quando forem utilizados solventes orgânicos, apenas o recipiente de vidro deve ser utilizado. Não são permitidos recipientes plásticos. Além disso, são necessárias tampas de parafuso de forro PTFE para garrafas.
ATENÇÃO: O clorofórmio é uma substância potencialmente tóxica e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
ATENÇÃO: O metanol é uma substância potencialmente tóxica e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito). - Deixe o tubo em constante agitação durante a noite para extrair lipídios não ligados ao covalente da superfície celular micobacteriana.
NOTA: Se uma plataforma de agitação orbital não estiver disponível, a agitação constante pode ser substituída por agitação manual periódica com a maior frequência possível. - Cubra um funil de vidro com um papel filtro, filtre os solventes orgânicos e colete-os em um tubo de vidro.
- Use um fluxo de gás nitrogênio para evaporar a fase líquida no tubo. Encha o tubo com gás nitrogênio, cubra e guarde a 4 °C.
NOTA: Conecte uma pipeta pasteur de vidro ao fluxo de gás nitrogênio para evaporar especificamente o tubo desejado. Além disso, mantenha o tubo dentro de um aquecedor de bloco seco para tubos a 37 °C. Quando o solvente evaporar, encha o tubo com gás nitrogênio antes de fechá-lo. - Adicione 15 mL de uma solução de clorofórmio:metanol (2:1) aos detritos celulares. Deixe o tubo em constante agitação durante a noite para extrair lipídios não ligados ao covalente da superfície celular micobacteriana.
NOTA: Se uma plataforma de agitação orbital não estiver disponível, a agitação constante pode ser substituída por agitação manual periódica com a maior frequência possível. - Deixe a mistura descansar por 1h. Com uma pipeta Pasteur, recupere os solventes orgânicos. Cubra um funil de vidro com um papel filtro e filtre os solventes orgânicos e colete-os no mesmo tubo de vidro anteriormente utilizado na etapa 1.3. Use um fluxo de gás nitrogênio para evaporar a fase líquida no tubo. Encha o tubo com gás nitrogênio, feche-o e armazene-o novamente a 4 °C.
2. Extração de ácido micólico por methanólise ácida (Figura 2A)
- Adicione 2-5 mL de solução esterificante em um tubo de vidro hermético com uma tampa de parafuso de forro PTFE. Adicione 0,2 g de biomassa de micobactéria no tubo de vidro.
NOTA: A solução esterificante é formada pela mistura de 30 mL de metanol, 15 mL de tolueno e 1 mL de ácido sulfúrico. As células de micobactérias podem ser retiradas de culturas sólidas ou, mesmo de células delipidadas após a realização da extração de lipídios não covalentes totais de micobactérias (células remanescentes após filtragem na etapa 1.6).
ATENÇÃO: O tolueno é uma substância inflamável e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
ATENÇÃO: O ácido sulfúrico é uma substância corrosiva e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito). - Misture o conteúdo por vórtice. Deixe a mistura ficar dentro de um banho seco a 80 °C durante a noite.
- Deixe o tubo esfriar até atingir a temperatura ambiente e, em seguida, adicione 2 mL de n-hexano ao tubo. Misture o conteúdo por vórtice por 30 s e deixe o tubo se instalar até que duas fases claras apareçam.
ATENÇÃO: o n-hexano é uma substância inflamável, irritante, ambientalmente prejudicial e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito). - Recuperar a fase superior correspondente à fase n-hexano. Transfira para um novo tubo.
- Repita o passo 2.3. Recupere a fase superior novamente e transfira-a para o mesmo tubo usado na etapa 2.4.
- Evaporar o conteúdo do tubo usando um fluxo de gás nitrogênio. Encha o tubo com gás nitrogênio, feche-o e armazene-o a 4 °C.
3. Extração de ácido micolico por saponificação e metilação (Figura 2B)
- Arranhe 0,2 g de micobactérias de uma mídia sólida e adicione a um tubo de vidro com uma tampa de parafuso PTFE.
- Adicione 2 mL de solução metanol-benzeno (80:20) contendo hidróxido de potássio de 5%. Misture o conteúdo por vórtice. Aqueça a mistura por 3h a 100 °C.
ATENÇÃO: O benzeno é uma substância inflamável, cancerígena e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito). - Deixe o tubo esfriar até a temperatura ambiente. Adicione 20% de ácido sulfúrico para acidificar as amostras para alcançar pH = 1.
- Adicione 3 mL de éter de dietil. Misture suavemente o conteúdo com vórtice.
- Que as duas fases se formem se estabelecendo. Recupere a fase do éter de dietil e transfira para um novo tubo. Repita o passo de lavagem por um total de três vezes.
- Lave o extrato de éter de dietil com 2 mL de água destilada e transfira a parte superior correspondente ao éter de dietil para um novo tubo. Repita o passo de lavagem por um total de três vezes.
- Adicione 2 g de sulfato de sódio anidro sobre o extrato de éter de dietil para secá-lo.
- Filtre a suspensão. Evaporar o conteúdo usando um fluxo de gás nitrogênio.
- Para realizar a etapa de metilação, dissolva 3 g de N-nitroso-N-metil ureia em uma solução pré-reformada formada por 45 mL de éter dietilo e 9 mL de 40% KOH em água destilada.
ATENÇÃO: N-nitroso-N-metilurea é uma substância tóxica, irritante, cancerígena e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito). - Transfira o supernatante (diazometano) para um novo frasco resfriado em gelo contendo pelotas de hidróxido de potássio (aproximadamente 30 g).
NOTA: Se o supernaspe não for usado imediatamente, pode ser armazenado a -20 °C por uma máxima de 1h.
ATENÇÃO: As pelotas de hidróxido de potássio são uma substância irritante e corrosiva. Este material deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual apropriados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrílho).
ATENÇÃO: O diazometano é altamente tóxico e potencialmente explosivo. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar com vidro de segurança usando equipamentos de proteção individual apropriados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito). - Adicione 2 mL da solução éter contendo diazometano, obtido na etapa 3.10, no extrato de éter dietil seco que contém ácidos micólicos, obtidos na etapa 3.8. Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.
- Evaporar a suspensão a 40 °C. Encha o tubo com gás nitrogênio, feche-o e armazene os lipídios metilados a 4 °C.
NOTA: Evaporar o diazometano da solução éter sob a capa de fluxo laminar, até que o éter perca a cor amarela.
4. Análise de cromatografia de camada fina (TLC)
- Saturar a câmara TLC de vidro. Para isso, cubra uma das paredes da câmara TLC com um pedaço de papel filtro e deixe que ela esteja em contato com a fase móvel composta pela mistura de solventes. Coloque o volume restante do solvente na parte inferior da câmara TLC.
NOTA: A parte inferior da câmara TLC deve ser coberta por pelo menos 1 cm da fase móvel. Nos experimentos atuais, foram utilizadas diferentes fases móveis para o desenvolvimento dos TLCs. Eles consistiam de 85 mL de n-hexano mais 15 mL de éter dietil; 100 mL de diclorometano; 90 mL de clorofórmio, 10 mL de metanol e 1 mL de água; 30 mL de clorofórmio, mais 8 mL de metanol, e 1 mL de água; 60 mL de clorofórmio, mais 35 mL de metanol, e 8 mL de água; Clorofórmio de 95 mL mais 5 mL de metanol; e 90 mL de éter de petróleo (60-80 °C) mais 10 mL de éter de ditila.
NOTA: No TLC bidimensional, use n-hexano:acetona (95:5) na primeira direção três vezes, e use um único desenvolvimento com tolueno:acetona (97:3) na segunda direção para analisar a composição do ácido mcólico. Para analisar os PIMs, use clorofórmio:metanol:água (60:30:6) na primeira direção uma vez, e use clorofórmio:ácido acético:metanol:água (40:25:3:6) na segunda direção. Para analisar o PDIM e o AG, utilize o éter de petróleo (60-80 °C): acetato etílico (98:2) na primeira direção três vezes, e utilize um único desenvolvimento com éter de petróleo (60-80 °C): acetona (98:2) na segunda direção.
ATENÇÃO: O éter de diethyl é uma substância potencialmente tóxica e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
ATENÇÃO: O diclorometano é uma substância potencialmente tóxica e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
ATENÇÃO: O éter de petróleo é uma substância inflamável, ambientalmente prejudicial e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
ATENÇÃO: O ácido acético é uma substância inflamável e corrosiva em potencial. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
ATENÇÃO: O acetato de etila é uma substância inflamável e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
ATENÇÃO: A acetona é uma substância inflamável e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito). - Feche a câmara TLC para saturar por pelo menos 20 minutos. Enquanto isso, dissolva os lipídios presentes no tubo de vidro em 0,2-1 mL de clorofórmio.
NOTA: O volume utilizado para dissolver os lipídios pode ser modificado dependendo da concentração desejada ou esperada da amostra. - Aplique 10 μL de cada suspensão usando um tubo de vidro capilar diretamente na placa TLC e deixe a amostra secar por 5 minutos à temperatura ambiente.
NOTA: As amostras devem ser aplicadas na parte inferior da placa, deixando 1 cm de cada lado. As amostras devem ser separadas uma da outra por pelo menos 0,5 cm. Uma vez que a amostra é aplicada na placa, os tubos podem ser evaporados novamente com gás nitrogênio e armazenados a 4 °C para uso posterior. - Insira a placa na câmara TLC saturada que contém a fase móvel. Permita que a fase móvel passe pelo TLC.
NOTA: Qualquer movimento aplicado na câmara TLC afeta o solvente em funcionamento na placa e afeta a mobilidade lipídica. No caso de realizar tlc bidimensionais, duas câmaras TLC são necessárias para conter ambos os sistemas de elução. - Retire a placa da câmara TLC quando o solvente atingir 1 cm de distância da extremidade superior da placa. Deixe a placa sob fluxo laminar até que a sílica esteja totalmente seca.
NOTA: No caso de analisar a composição do ácido mórclico, utilizando n-hexano e diethyl-éter (85:15), repita as etapas 4.4 e 4,5 vezes mais, até executar a fase móvel três vezes sobre a placa TLC. - Revelar a placa com a mancha necessária; aqueça a placa, se necessário.
NOTA: No presente experimento, 15-20 mL das seguintes soluções foram utilizadas para pulverizar as placas TLC: 10% hidratofosfórico de ácido molybdatophosphoric no etanol até que a placa esteja amarela brilhante, seguida pelo aquecimento da placa a 120 °C; 5% no etanol de 20% α-naftol em ácido sulfúrico seguido de aquecimento da placa a 120 °C; Reagente azul de molhênio (1,3% óxido de molbênio em ácido sulfúrico de 4,2 M) até que as bandas de fosfato apareceram ou 1% de anthrone em ácido sulfúrico.
ATENÇÃO: O hidratofosfórico de umidade é uma substância inflamável e corrosiva. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
ATENÇÃO: O etanol é uma substância inflamável e perigosa em potencial. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
ATENÇÃO: 1-Naftil é uma substância inflamável, corrosiva e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
ATENÇÃO: O reagente de spray azul de molhênio é uma substância corrosiva, tóxica e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
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Representative Results
Com o objetivo de mostrar uma ampla gama de lipídios presentes em diferentes espécies de micobactérias, M. bovis BCG foi selecionado por ser micobactérias ásperas e de crescimento lento. O áspero e rápido crescimento M. fortuitum e M. brumae foram adicionados no procedimento e, finalmente, o morfotipo liso de M. abscesso também foi incluído. Essas quatro espécies nos permitem visualizar um amplo espectro de lipídios derivados de micobactérias, como acitrehaloses (AT), GPLs, PDIM, PGL, PIM, TDM e TMM. Além disso, todas as quatro espécies têm padrões diferentes de ácido mílico.
Após a realização dos protocolos de extração de ácido míclico, os extratos lipídicos foram analisados por meio da análise 1D-TLC utilizando dois sistemas diferentes, igualmente válidos, de eluição(Figura 3A,B). A primeira fase móvel (Figura 3A) foi composta por n-hexano e diethyl-éter (85:15), e a placa foi executada três vezes. A segunda fase móvel consistiu em 100% de diclorometano e a placa foi eluida uma vez(Figura 3B). Em ambos os sistemas de elução, os ácidos míclicos estão localizados aproximadamente no meio da placa TLC a partir da origem da aplicação da amostra. Como a Figura 3 mostra, M. brumae só possui ácidos mórclicos tipo I, um ácido mcólico presente em todas as espécies de micobactérias. M. bovis BCG tem perfis de ácidos mcólicos tipo I e IV, M. fortuitum e V, e M. abscesso,perfis de ácidos mcólicos tipo I e II. A realização de dois tipos de procedimentos de metilação nos permite confirmar a presença de ácido micocólico tipo V, uma vez que o ácido micocólico tipo V é cortado durante o procedimento de methanolise ácida. Como mostra a Figura 3, somente após o procedimento de saponificação foi observado o ponto correspondente ao ácido mecólico tipo V observado. Após a methanolise, o TLC mostrou os compostos derivados do decote tipo V que migraram perto do ponto de aplicação19. Para os pesquisadores neófitos, o 2D-TLC pode permitir um método complementar para identificar cada tipo de ácido míclico(Figura 3C,D). Os extratos de ácido mórclico devem ser executados pela primeira vez em um sistema de eluição formado por éter de petróleo (60-80 °C) e acetona (95:5) três vezes. Em seguida, a placa deve ser executada na segunda direção com uma fase móvel formada por tolueno e acetona (97:3). 2D-TLC combinado com espectrometria de massa (MS) tem sido usado para identificar e caracterizar quimicamente os grupos funcionais dos ácidos míclicos e tem sido usado extensivamente para caracterizar ácidos míclicos20,21,22. Portanto, o padrão de ácido mcólico é uma das características bioquímicas de valor na avaliação micobacteriana sistemática em combinação com outras análises devido a padrões de ácido micoclic compartilhados entre diferentes espécies.
Após a realização do procedimento acima mencionado para extrair os lipídios não covalentes ligados, diferentes sistemas de elução foram selecionados em função da polaridade e tamanho do perfil lipídico encontrado nas células de micobactérias. A combinação ideal de solventes nos sistemas de elução deve permitir visualizar os lipídios desejados na zona média da placa TLC para facilitar sua purificação adicional, se desejar. Na Figura 4,as placas TLC são encomendadas do sistema de eluição que permite que os lipídios mais apolares sejam monitorados(Figura 4A) para o sistema de eluição que permite que os lipídios mais polares sejam visualizados(Figura 4E).
Glicerols acimais (AG) e PDIMs são dois dos lipídios mais apolares presentes na parede celular micobacteriana e são facilmente visualizados através de análises 1D-TLC usando uma fase móvel formada por éter de petróleo:éter de ditila (90:10). A Figura 4A mostra que os AGs estavam presentes em M. bovis BCG, M. fortuitum e M. brumae, mas não no morfotipo liso de M. abscesso. Embora o 1D-TLC tenha sugerido a presença de PDIM em M. bovis BCG e M. fortuitum,ele só foi corroborado em M. bovis BCG quando a análise 2D-TLC foi realizada(Figura 4B). Ao todo, esses resultados demonstram a importância de corroborar a presença de um composto micobacteriano por pelo menos dois sistemas de eluição diferentes. Outro lipídio interessante para analisar na composição de micobactérias é o PGL. Nas micobactérias escolhidas, o PGL só está presente em M. bovis BCG, e é perceptível quando o TLC é elucido com o sistema de eluição composto por clorofórmio e metanol (95:5)(Figura 4C). Seguindo a ideia de visualizar componentes mais polares, o sistema de elução constituído pela mistura de 90:10:1 (clorofórmio:metanol:água) foi utilizado para monitorar a presença de GPLs(Figura 4D),que só estão presentes em M. abscesso suave morphótipo. No mesmo TLC: PGL, dimycolate trehalose (TDM), trehaloses aciis (AT) e monomilato de trehalose (TMM), também podem ser observados. PGL, GPLs, TDM, AT também foram observados na parte superior da placa quando o sistema de elução consistia de 30:8:1 (clorofórmio:metanol:água)(Figura 4E). TMM está localizado no meio da placa. TDM e TMM foram claramente expressos em todas as micobactérias estudadas. Apesar dos pinosides fosfaticos-inositol (PIMs) serem observados na parte inferior da placa, o melhor sistema de eluição para analisar PIMs é 60:35:8 (clorofórmio:metanol:água) como mostrado na Figura 5A,B. Enquanto todos os lipídios contendo açúcar são revelados com anthrone(Figura 5A),os PIMs contêm grupos de fosfato que são especificamente revelados com o reagente Azul de Molhênio(Figura 5B). Semelhantes aos ácidos míclicos, AG e PDIMs, os PIMs também podem ser facilmente visualizados através de análises 2D-TLC(Figura 5C). Além disso, no caso de análise de micobactérias capazes de sintetizar LOSs, PIMs e LOSs seriam diferenciados utilizando o mesmo sistema de eluição 2D, conforme detalhado em Ren et al.8.
Figura 1: Esquema do procedimento de extração de conteúdo lipídico de micobactérias cultivadas em mídia sólida. Principais passos para decifrar lipídios presentes nas células de micobactérias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esquema do procedimento para extração de teor de ácido mcólico de micobactérias cultivadas em mídia sólida. Principais passos para decifrar ácidos micólicos presentes nas células de micobactérias usando(A) methanolise ácida ou(B)saponificação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados representativos da extração lipídica de micobactérias. Análise cromatografia de camada fina (TLC) dos ácidos micólicos desenvolvidos em (A) 85 mL de n-hexano, mais 15 mL de éter de ditila (três corridas), e (B) 100 mL de diclorometano. (C) Análise tlc bidimensional dos ácidos míclicos extraídos pela methanolise ácida desenvolvida em 95:5 (n-hexano:acetona) (três corridas) na primeira direção e 97:3 (tolueno:acetona) na segunda direção. (D) Análise tlc bidimensional dos ácidos mcólicos de M. fortuitum extraídos pela saponificação desenvolvida em 95:5 (n-hexane:acetona) (três corridas) na primeira direção e 97:3 (tolueno:acetona) na segunda direção. Os TLCs foram revelados com 10% de hidratofosfórico molybdatophosphorico no etanol seguido de aquecimento da placa a 120 °C. M. bovis BCG Connaught (Linha 1 e 1'); M. fortuitum (Linha 2 e 2'); M. abscesso suave (Linha 3 e 3') e M. brumae (Linha 4 e 4'). 1-4 ácidos mórlicos obtidos por methanólise ácida e ácidos mórclicos de 1'-4' obtidos pela saponificação. Eu, α-mycolates; II, α'-mycolates; IV, cetomycolates; V, epóximycolates. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados representativos da extração lipídica de micobactérias. (A) Análise TLC de acilglicerols (AG) e dimycocerosates de phthiocerol (PDIMs) desenvolvidos em 90:10 (éter de petróleo (60-80 °C):d ether de iibtila. (B) Análise tlc bidimensional de PDIMs e AG desenvolvida em 98:2 (éter de petróleo (60-80 °C):acetato etílico) (três corridas) na primeira direção e 98:2 (éter de petróleo (60-80 °C):acetona) na segunda direção. (C) Análise TLC de glicolipídio fenólico (PGL) desenvolvida em 95:5 (clorofórmio:metanol). (D) Análises TLC desenvolvidas em 90:10:1 (clorofórmio:metanol:água) de PGL, glycopeptidolipids (GPL), dimycolate trehalose (TDM), trehaloses aciis (AT) e monomycolato trehalose (TMM). (E) Análise TLC de PGL, GPL, AT, TMM e mannosides fosfattidyl-inositol (PIMs) desenvolvida em 30:8:1 (clorofórmio:metanol:água). A-B-C foram revelados com 10% de hidratofosfórico de ácido molybdatophosphorico no etanol seguido de aquecimento da placa a 120 °C. D-E foram revelados com 5% no etanol de 20% α-naftol em ácido sulfúrico e aquecido a 120 °C. Linha 1: M. bovis BCG Connaught; Linha 2: M. fortuitum; Linha 3: M. abscesso morfotipo liso; Linha 4: M. brumae. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados representativos de PIMs de mycobacteria. (A-B) Análise tlc de PIMs desenvolvida em 60:35:8 (clorofórmio:metanol:água). (C) Análise tlc bidimensional de PIMs desenvolvida em 60:30:6 (clorofórmio:metanol:água) na primeira direção e 40:25:3:6 (clorofórmio:ácido acético:metanol:água) na segunda direção. A-C foram revelados com 1% de anthrone em ácido sulfúrico seguido de aquecimento da placa a 120 °C. B foi revelado com reagente Azul Molbdenum até que as bandas de fosfato apareceram. Linha 1: M. bovis BCG Connaught; Linha 2: M. fortuitum; Linha 3: M. abscesso morfotipo liso; Linha 4: M. brumae. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um protocolo simples considerado como o método padrão-ouro para a extração de compostos lipídicos não covalentes ligados da parede celular micobacteriana é apresentado. Uma visualização adicional por TLCs unidimensionais dos lipídios extraídos de quatro micobactérias diferentes é mostrada.
Duas misturas combinadas consecutivas de clorofórmio e metanol para recuperar o teor lipídico das células micobacterianas é a mistura de solvente mais utilizada23,24,25,26,27,28,29. Esta mistura permite a recuperação de uma ampla gama de lipídios apolares e polares das células. No entanto, alguns outros métodos foram descritos na literatura para extrair lipídios micobacterianos totais ou específicos, que foram recentemente revisados por Hameed et al.29. Por exemplo, o método Folch é um dos protocolos mais utilizados desenvolvidos para recuperar o total de lipídios micobacterianos dos tecidos30 e também foi adaptado a culturas micobacterianas puras. Consiste em suspender células micobacterianas em clorofórmio:metanol (1:2), seguido de centrifugação e a adição de clorofórmio para obter uma razão de 1:1. Finalmente, o KCl é usado para remover componentes nãolipíduos do extrato31. Em paralelo, outros protocolos foram desenvolvidos para extrair lipídios específicos. Slayden et al. usou uma mistura de clorofórmio:metanol mais acetona para recuperar especificamente glicólipídios como TDM ou TMM32. Ao todo, os métodos publicados baseiam-se na exposição de células micobacterianas a diferentes concentrações de solventes, principalmente clorofórmio e metanol. Da mesma forma, alguns sais são ocasionalmente adicionados para descartar outros componentes celulares presentes na amostra.
Além de lipídios não covalentemente ligados, a extração de ácido mcólico por dois procedimentos diferentes também é mostrada. Enquanto a methanólise ácida permite a fácil extração de ácidos mcólicos com reagentes menos perigosos, o procedimento de saponificação preserva a estrutura de todos os tipos de ácido míclico, incluindo o ácido micoclílico tipo V, que é cortado durante os procedimentos de methanolyse. Uma vez extraídos lipídios, 1D ou 2D-TLC são métodos padrão para monitorá-los, e o ensaio utilizado varia dependendo das características físico-químicas dos lipídios. A polaridade e o tamanho de cada molécula determinarão a seleção do sistema de eluição necessário, permitindo a determinação dos lipídios que fazem parte da micobacterium. O TLC unidimensional pode ser escolhido quando os fatores de retenção (Rf) entre lipídios micobacterianos são diferentes, enquanto o 2D-TLC facilita a visualização quando diferentes lipídios compartilham características de peso molecular e polaridade. Para facilitar a identificação, os lipídios purificados devem ser executados em paralelo à amostra extraída para comparar rf semelhantes. A identificação de um lipídio pode ser alcançada quando ele funciona com o mesmo Rf do conhecido controle purificado pelo menos em dois sistemas TLC (duas fases móveis diferentes). Lipídios purificados podem ser obtidos de fornecedores comerciais ou de laboratórios de pesquisa micobacteriana. Finalmente, a natureza bioquímica da molécula indica qual mancha pode ser usada para revelar placas TLC. Existem métodos universais de coloração, como o ácido fosfomólico que permite que a visualização de qualquer componente orgânico seja visualizada à medida que se liga às ligações de carbono. Enquanto outros, como o naftol ou o anthrone, fornecem cores específicas aos resíduos de açúcar, o azul molhênio se liga especificamente aos resíduos de fosfato.
A consideração mais importante para analisar o conteúdo lipídico das micobactérias é evitar o uso de material plástico ao longo dos procedimentos, uma vez que o contato de solventes orgânicos com plástico pode contaminar as amostras e pode ser observado nas placas de TLC. Também é relevante considerar que a composição média da cultura utilizada para o cultivo de micobactérias, bem como temperatura ou dias de incubação, pode modificar o padrão lipídico de cada micobacterium, como descrito anteriormente16. Mycobacterias cultivadas em mídia líquida e sólida podem ser usadas para extrair lipídios não covalentes ligados ou ácidos mórclicos. Ao obter células da cultura líquida, elas devem ser adequadamente filtradas e secas para evitar a presença de mídia líquida na amostra. Além disso, ao usar micobactérias de mídia líquida, as bactérias devem ser adequadamente e igualmente cultivadas entre experimentos, a fim de obter resultados reprodutíveis ao longo do tempo. Além disso, as células micobacterianas também podem ser cultivadas em pellicles17,33,34,35,36, das quais os lipídios mais externos podem ser recuperados usando solventes orgânicos e monitorados pelo TLC, como mostramos no presente artigo.
A principal limitação dos procedimentos de extração lipídica micobacteriana continua sendo a utilização de solventes tóxicos em condições seguras. O procedimento TLC é menos sensível do que outras técnicas, como cromatografia a gás ou cromatografia líquida de alto desempenho. Além disso, a TLC não permite a quantificação das amostras, e outras técnicas precisam ser aplicadas para identificar a estrutura dos compostos extraídos. Por exemplo, a ressonância magnética nuclear precisa ser realizada para distinguir isômeros lipídes. Vale ressaltar que para descrever a estrutura de um lipídio micobacteriano pela primeira vez, são necessárias espectrometria de massa ou espectroscopia infravermelha. Assim, a análise quantitativa e qualitativa das classes lipídicas normalmente requer combinações de diferentes métodos de extração, derivação, cromatografia e detecção, como cromatografia líquida de alto ou ultra-desempenho, espectrometria de massa e espectroscopia de ressonância magnética nuclear37,38,39,40. Estudos recentes demonstraram que o uso de uma técnica de detecção de cromatografia-chama de camada fina de um passo único permite a quantificação e a triagem preliminar de ácidos mcólicos em Actinobacteria41. No entanto, o TLC é uma técnica extremamente útil, de economia de tempo e barata para tela e avaliação da composição lipídica das micobactérias. No geral, os procedimentos aqui apresentados são altamente versáteis fornecendo ferramentas básicas para analisar a característica mais relevante das células de micobactérias: sua complexa parede celular.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelo Ministério da Ciência, Inovação e Universidades da Espanha (RTI2018-098777-B-I00), pelos Feder Funds e pela Generalitat da Catalunha (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido é beneficiária de um contrato de doutorado (FI) da Generalitat de Catalunya.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
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