Summary
Представлен протокол извлечения общего содержания липидов в клеточной стенке широкого спектра микобактерий. Кроме того, показаны протоколы экстракции и анализа различных типов миколовых кислот. Также предусмотрен тонкослойный хроматографический протокол для мониторинга этих микобактериальных соединений.
Abstract
Виды микобактерий могут отличаться друг от друга скоростью роста, наличием пигментации, морфологией колонии, отображаемой на твердых средах, а также другими фенотипическими характеристиками. Тем не менее, все они имеют общий наиболее актуальный характер микобактерий: их уникальную и высокогидрофобную клеточную стенку. Виды микобактерий содержат мембранно-ковалентный связанный комплекс, который включает арабиногалактан, пептидобликан и длинноцепные миколовые кислоты с типами, которые различаются между видами микобактерий. Кроме того, микобактерии могут также продуцировать липиды, которые расположены, нековалентно связанные, на их клеточных поверхностях, такие как фтиоцерин димикоцерозаты (PDIM), фенольные гликолипиды (PGL), гликопептидолипиды (GPL), ацилтрегалозы (AT) или фосфатидил-инозитоловые маннозиды (PIM), среди прочих. Некоторые из них считаются факторами вирулентности патогенных микобактерий или критическими антигенными липидами во взаимодействии хозяин-микобактерия. По этим причинам существует значительный интерес к изучению микобактериальных липидов из-за их применения в нескольких областях, от понимания их роли в патогенности микобактерийных инфекций, до возможного подтекста в качестве иммуномодулирующих агентов для лечения инфекционных заболеваний и других патологий, таких как рак. Здесь представлен простой подход к извлечению и анализу общего содержания липидов и состава миколиновой кислоты клеток микобактерий, выращенных в твердой среде с использованием смесей органических растворителей. После получения липидных экстрактов проводится тонкослойная хроматография (TLC) для мониторинга экстрагированных соединений. Пример эксперимента проводится с четырьмя различными микобактериями: экологически быстрорастущей Mycolicibacterium brumae и Mycolicibacterium fortuitum, ослабленной медленно растущей Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) и оппортунистическим патогеном быстрорастущим Mycobacterium abscessus, демонстрируя, что методы, показанные в настоящем протоколе, могут быть использованы для широкого спектра микобактерий.
Introduction
Mycobacterium род, который включает патогенные и непатогенные виды, характеризующиеся высокогидрофобной и непроницаемой клеточной стенкой, образованной их специфическими липидами. В частности, клеточная стенка микобактерии содержит миколовые кислоты, которые являются α-алкильными и β-гидроксикислотами, в которых α-ветвь постоянна во всех миколовых кислотах (за исключением длины), а β-цепь, называемая меромиколатной цепью, представляет собой длинную алифатическую цепь, которая может содержать различные функциональные химические группы, описанные вместе с литературой (α-, α'-, метокси-, κ-, эпоксидные, карбокси- и ω-1-метокси-миколаты), поэтому продуцирует семь типов микольных кислот (I-VII)1. Более того, другие липиды, имеющие неоспоримое значение, также присутствуют в клеточной стенке видов микобактерий. Патогенные виды, такие как Mycobacterium tuberculosis, возбудитель туберкулеза2 продуцируют специфические факторы вирулентности на основе липидов, такие как фтиоцериновые димикоцерозаты (PDIMs), фенольные гликолипиды (PGL), ди-, три- и пента-ацилтрегалозы (DAT, TAT и PAT) или сульфолипиды, среди прочих3. Их присутствие на поверхности микобактерий было связано со способностью модифицировать иммунный ответ хозяина и, следовательно, эволюцией и персистенцией микобактерии внутри хозяина.4. Например, присутствие триацилглицерилов (TAG) было связано с гипервирулентным фенотипом lineage 2-Beijing sub-lineage of M. tuberculosis, возможно, из-за его способности обезсточивать иммунный ответ хозяина5,6. Другими соответствующими липидами являются липулигосахариды (LOS), присутствующие в туберкулезных и нетуберкулезных микобактериях. В случае Mycobacterium marinum, наличие LOSs в его клеточной стенке связано со скользящей подвижностью и способностью образовывать биопленки и препятствует распознаванию рецепторами распознавания образов макрофагов, влияя на поглощение и устранение бактерий фагоцитами хозяина7,8. Кроме того, отсутствие или присутствие некоторых липидов позволяет классифицировать представителей одного и того же вида на различные морфотипы с вирулентными или ослабленными профилями при взаимодействии с клетками-хозяевами. Например, отсутствие гликопептидолипидов (ГПЛ) в грубом морфотипе Mycobacterium abscessus был связан со способностью индуцировать внутрифагосомальное подкисление и, следовательно, клеточный апоптоз.9, в отличие от гладкого морфотипа, который обладает GPL в своей поверхности. Кроме того, содержание липидов в клеточной стенке микобактерии связано со способностью модифицировать иммунный ответ у хозяина. Это актуально в контексте использования некоторых микобактерий для запуска защитного иммунного профиля против различных патологий.10,11,12,13. Например, было продемонстрировано, что Mycolicibacterium vaccae, сапрофитная микобактерия, которая в настоящее время находится в фазе III клинических испытаний в качестве иммунотерапевтической вакцины против туберкулеза, демонстрирует два колониальных морфотипа. В то время как гладкий фенотип, который содержит полиэстер на своей поверхности, вызывает ответ Th2, грубый фенотип, лишенный полиэстера, может индуцировать профиль Th1, когда он взаимодействует с иммунными клетками хозяина.14. Репертуар липидов, присутствующих в микобактериальной клетке, зависит не только от видов микобактерий, но и от условий микобактериальных культур: время инкубации15,16 или состав питательной среды17,18. На самом деле изменения в составе культурального среды влияют на противоопухоляжную и иммуностимулаторную активность M. bovis БЦЖ и Mycolicibacterium brumae in vitro17. Кроме того, защитный иммунный профиль, вызванный M. bovis БЦЖ против M. tuberculosis Проблема в моделях мышей также зависит от культуры среды, в которой M. bovis БЦЖ растет17. Затем они могут быть связаны с липидным составом микобактерий в каждом состоянии культуры. По всем этим причинам актуально изучение содержания липидов микобактерий. Представлена визуальная процедура извлечения и анализа липидного состава клеточной стенки микобактерии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Извлечение общих нековалентных липидов из микобактерий(рисунок 1)
- Выцарапайте 0,2 г микобактерий из твердой среды и добавьте в стеклянную трубку политетрафторэтленовые (PTFE) вкладыши винтовых колпачков. Добавьте раствор, состоящий из 5 мл хлороформа и 10 мл метанола (хлороформ:метанол, 1:2).
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании органических растворителей следует использовать только стеклянный реципиент. Пластиковые контейнеры не допускаются. Кроме того, необходимы винтовые крышки из PTFE для бутылок.
ВНИМАНИЕ: Хлороформ является потенциально токсичным и чрезвычайно опасным веществом. Его необходимо использовать в ламинарной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторное пальто, защитные очки и нитриловые перчатки).
ВНИМАНИЕ: Метанол является потенциально токсичным и чрезвычайно опасным веществом. Его необходимо использовать в ламинарной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторное пальто, защитные очки и нитриловые перчатки). - Оставьте трубку в постоянном перемешивание на ночь, чтобы извлечь нековалентные липиды из поверхности микобактериальных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если орбитальная встряхивающая платформа недоступна, постоянное перемешивание может быть заменено периодическим ручным перемешиванием как можно чаще. - Накройте стеклянную воронку фильтровальной бумагой, отфильтруйте органические растворители и соберите их в стеклянную трубку.
- Используйте поток газообразного азота для испарения жидкой фазы в трубке. Наполните трубку газообразным азотом, накройте крышкой и храните при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подключите стеклянную пипетку Пастера к потоку газообразного азота, чтобы специально испарить нужную трубку. Кроме того, поддерживайте трубку внутри сухого блочного нагревателя для труб при температуре 37 °C. Когда растворитель испарится, заполните трубку газообразным азотом, прежде чем закрывать ее. - Добавьте 15 мл раствора хлороформа:метанола (2:1) к клеточному мусору. Оставьте трубку в постоянном перемешивание на ночь, чтобы извлечь нековалентные липиды из поверхности микобактериальных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если орбитальная встряхивающая платформа недоступна, постоянное перемешивание может быть заменено периодическим ручным перемешиванием как можно чаще. - Дайте смеси отдохнуть в течение 1 ч. С помощью пипетки Пастера восстановите органические растворители. Накройте стеклянную воронку фильтровальной бумагой и отфильтруйте органические растворители и соберите их в ту же стеклянную трубку, которая ранее использовалась на этапе 1.3. Используйте поток газообразного азота для испарения жидкой фазы в трубке. Заполните трубку газообразным азотом, закройте ее и снова храните при 4 °C.
2. Экстракция миколиновой кислоты кислотным метанолизом(Рисунок 2А)
- Добавьте 2-5 мл этерифицирующего раствора в герметичную стеклянную трубку с завинчивающейся крышкой из PTFE. Добавьте 0,2 г биомассы микобактерий в стеклянную трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этерификационный раствор образуется путем смешивания 30 мл метанола, 15 мл толуола и 1 мл серной кислоты. Клетки микобактерий могут быть взяты из твердых культур или даже из делипидированных клеток после выполнения экстракции общих нековалентно-связанных липидов из микобактерий (оставшихся клеток после фильтрации на этапе 1.6).
ВНИМАНИЕ: Толуол является легковоспламеняющимся и чрезвычайно опасным веществом. Его необходимо использовать в ламинарной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторное пальто, защитные очки и нитриловые перчатки).
ВНИМАНИЕ: Серная кислота является коррозионным и опасным веществом. Его необходимо использовать в ламинарной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторное пальто, защитные очки и нитриловые перчатки). - Перемешайте содержимое путем вихря. Дайте смеси постоять внутри сухой ванны при 80 °C в течение ночи.
- Дайте трубке остыть, пока она не достигнет комнатной температуры, а затем добавьте в трубку 2 мл н-гексана. Перемешайте содержимое путем вихря в течение 30 с и дайте трубке осесть до появления двух четких фаз.
ВНИМАНИЕ: н-гексан является потенциально легковоспламеняющимся, раздражающим, вредным для окружающей среды и чрезвычайно опасным веществом. Его необходимо использовать в ламинарной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторное пальто, защитные очки и нитриловые перчатки). - Восстанавливают верхнюю фазу, соответствующую n-гексановой фазе. Перенесите его в новую трубку.
- Повторите шаг 2.3. Снова восстановите верхнюю фазу и перенесите ее в ту же трубу, которая использовалась на этапе 2.4.
- Испаряйте содержимое трубки с помощью потока газообразного азота. Заполните трубку газообразным азотом, закройте ее и храните при 4 °C.
3. Экстракция миколиновой кислоты путем омыления и метилирования(рисунок 2B)
- Выцарапайте 0,2 г микобактерий из твердой среды и добавьте в стеклянную трубку с помощью винтовой крышки из PTFE.
- Добавить 2 мл метанол-бензольного раствора (80:20), содержащего 5% гидроксида калия. Перемешайте содержимое путем вихря. Нагревайте смесь в течение 3 ч при 100 °C.
ВНИМАНИЕ: Бензол является легковоспламеняющимся, канцерогенным и опасным веществом. Его необходимо использовать в ламинарной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторное пальто, защитные очки и нитриловые перчатки). - Дайте трубке остыть до комнатной температуры. Добавьте 20% серной кислоты для подкислительного соединения образцов для достижения рН = 1.
- Добавьте 3 мл диэтилового эфира. Аккуратно перемешайте содержимое путем вихря.
- Пусть две фазы образуются путем оседания. Восстановить фазу диэтилового эфира и перенести в новую трубку. Повторите этап стирки в общей сложности три раза.
- Вымойте экстракт диэтилового эфира 2 мл дистиллированной воды и переложите верхнюю часть, соответствующую диэтилову эфиру, в новую трубку. Повторите этап стирки в общей сложности три раза.
- Добавьте 2 г безводного сульфата натрия поверх экстракта диэтилового эфира, чтобы высушить его.
- Отфильтруйте суспензию. Испаряйте содержимое с помощью потока газообразного азота.
- Для выполнения этапа метилирования растворяют 3 г N-нитрозо-N-метилмочаминочевины в предварительно охлажденный раствор, образованный 45 мл диэтилового эфира и 9 мл 40% КОН в дистиллированной воде.
ВНИМАНИЕ: N-нитрозо-N-метилмочевина является токсичным, раздражающим, канцерогенным и опасным веществом. Его необходимо использовать в ламинарной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторное пальто, защитные очки и нитриловые перчатки). - Переложите супернатант (диазометан) в новую колбу, охлаждаемую во льду, содержащую гранулы гидроксида калия (примерно 30 г).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если супернатант не используется сразу, его можно хранить при -20 °C в течение максимум 1 ч.
ВНИМАНИЕ: Гранулы гидроксида калия являются раздражающим и коррозионным веществом. Этот материал должен использоваться в ламинарной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторное пальто, защитные очки и нитриловые перчатки).
ВНИМАНИЕ: Диазометан очень токсичен и потенциально взрывоопасен. Его необходимо использовать в ламинарной проточной вытяжке с защитным стеклом в соответствующих средствах индивидуальной защиты (лабораторное пальто, защитные очки и нитриловые перчатки). - Добавьте 2 мл раствора эфира, содержащего диазометан, полученный на этапе 3.10, в высушенный экстракт диэтилового эфира, содержащий миколовые кислоты, полученный на этапе 3.8. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Испарить суспензию при 40 °C. Заполните трубку газообразным азотом, закройте ее и храните метилированные липиды при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Испаряют диазометан из раствора эфира под ламинарным капотом, пока эфир не потеряет желтый цвет.
4. Тонкослойный хроматографический анализ (TLC)
- Насытите стеклянную камеру TLC. Для этого накройте одну из стенок камеры TLC листом фильтровальной бумаги и дайте ей контактировать с подвижной фазой, состоящей из смеси растворителей. Поместите оставшийся объем растворителя на дно камеры TLC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дно камеры TLC должно быть покрыто не менее чем 1 см подвижной фазы. В настоящих экспериментах для разработки TLC использовались различные подвижные фазы. Они состояли из 85 мл н-гексана плюс 15 мл диэтилового эфира; 100 мл дихлорметана; 90 мл хлороформа, 10 мл метанола и 1 мл воды; 30 мл хлороформа плюс 8 мл метанола и 1 мл воды; 60 мл хлороформа плюс 35 мл метанола и 8 мл воды; 95 мл хлороформа плюс 5 мл метанола; и 90 мл нефтяного эфира (60-80 °C) плюс 10 мл диэтилового эфира.
ПРИМЕЧАНИЕ: В двумерном TLC используют n-гексан:ацетон (95:5) в первом направлении три раза, и используют однократное развитие с толуолом:ацетоном (97:3) во втором направлении для анализа состава миколиновой кислоты. Для анализа PEM используйте хлороформ:метанол:вода (60:30:6) в первом направлении один раз, а во втором направлении используйте хлороформ:уксусная кислота:метанол:вода (40:25:3:6). Для анализа PDIM и AG используют нефтяной эфир (60-80 °C): этилацетат (98:2) в первом направлении три раза, и используют одну разработку с нефтяным эфиром (60-80 °C): ацетон (98: 2) во втором направлении.
ВНИМАНИЕ: Диэтиловый эфир является потенциально токсичным и опасным веществом. Его необходимо использовать в ламинарной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторное пальто, защитные очки и нитриловые перчатки).
ВНИМАНИЕ: Дихлорметан является потенциально токсичным и опасным веществом. Его необходимо использовать в ламинарной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторное пальто, защитные очки и нитриловые перчатки).
ВНИМАНИЕ: Нефтяной эфир является потенциально легковоспламеняющимся, вредным для окружающей среды и чрезвычайно опасным веществом. Его необходимо использовать в ламинарной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторное пальто, защитные очки и нитриловые перчатки).
ВНИМАНИЕ: Уксусная кислота является потенциальным легковоспламеняющимся и коррозионным веществом. Его необходимо использовать в ламинарной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторное пальто, защитные очки и нитриловые перчатки).
ВНИМАНИЕ: Этилацетат является легковоспламеняющимся и опасным веществом. Его необходимо использовать в ламинарной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторное пальто, защитные очки и нитриловые перчатки).
ВНИМАНИЕ: Ацетон является легковоспламеняющимся и опасным веществом. Его необходимо использовать в ламинарной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторное пальто, защитные очки и нитриловые перчатки). - Закройте камеру TLC, чтобы насытить ее не менее чем на 20 минут. Тем временем растворяют липиды, присутствующие в стеклянной трубке, в 0,2-1 мл хлороформа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем, используемый для растворения липидов, может быть изменен в зависимости от желаемой или ожидаемой концентрации образца. - Нанесите 10 мкл каждой суспензии с помощью капиллярной стеклянной трубки непосредственно на пластину TLC и дайте образцу высохнуть в течение 5 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны наноситься в нижней части пластины, оставляя по 1 см с каждой стороны. Образцы должны быть отделены друг от друга на глубину не менее 0,5 см. После того, как образец нанесен на пластину, трубки могут быть снова испарились с газообразным азотом и сохранены при 4 °C для дальнейшего использования. - Вставьте пластину в насыщенную камеру TLC, содержащую подвижную фазу. Позвольте мобильной фазе пройти через TLC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любое движение, применяемое к камере TLC, влияет на работающий растворитель на пластине и влияет на подвижность липидов. В случае выполнения двумерного TLC требуется две камеры TLC, содержащие обе системы элюирования. - Извлеките пластину из камеры TLC, когда растворитель достигнет расстояния 1 см от верхнего конца пластины. Оставьте пластину под ламинарной флюсом до тех пор, пока кремнезем полностью не высохнет.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае анализа состава миколиновой кислоты с использованием н-гексана и диэтил-эфира (85:15) повторяют шаги 4.4 и 4.5 еще два раза, до запуска подвижной фазы три раза над пластиной TLC. - Выявить пластину с нужным пятном; при необходимости нагреть пластину.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем эксперименте для распыления пластин TLC использовали 15-20 мл следующих растворов: 10% гидрата молибдатофосфорной кислоты в этаноле до тех пор, пока пластина не окрасится ярко-желтой, с последующим нагревом пластины при 120 °C; 5% в этаноле 20% α-нафтол в серной кислоте с последующим нагреванием пластины при 120 °C; Молибденовый синий реагент (1,3% оксида молибдена в 4,2 М серной кислоты) до появления фосфатных полос или 1% антрона в серной кислоте.
ВНИМАНИЕ: Гидрат молибдатофосфорной кислоты является легковоспламеняющимся и коррозионным веществом. Его необходимо использовать в ламинарной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторное пальто, защитные очки и нитриловые перчатки).
ВНИМАНИЕ: Этанол является потенциально легковоспламеняющимся и опасным веществом. Его необходимо использовать в ламинарной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторное пальто, защитные очки и нитриловые перчатки).
ВНИМАНИЕ: 1-Нафтол является легковоспламеняющимся, коррозионным и чрезвычайно опасным веществом. Его необходимо использовать в ламинарной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторное пальто, защитные очки и нитриловые перчатки).
ВНИМАНИЕ: Молибденовый синий спрей Реагент является коррозионным, токсичным и чрезвычайно опасным веществом. Его необходимо использовать в ламинарной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторное пальто, защитные очки и нитриловые перчатки).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С целью показать широкий спектр липидов, присутствующих в различных видах микобактерий, был выбран M. bovis BCG, поскольку это грубые и медленно растущие микобактерии. В процедуру были добавлены грубые и быстрорастущие M. fortuitum и M. brumae и, наконец, также был включен гладкий морфотип M. abscessus. Эти четыре вида позволяют нам визуализировать широкий спектр липидов, полученных из микобактерий, таких как ацилтрегалозы (AT), GPL, PDIM, PGL, PIM, TDM и TMM. Более того, все четыре вида имеют разные паттерны миколиновой кислоты.
После выполнения протоколов экстракции миколиновой кислоты липидные экстракты анализировали с помощью анализа 1D-TLC с использованием двух различных, одинаково действительных, элюционных систем(рисунок 3A,B). Первая подвижнаяфаза (рисунок 3А)состояла из н-гексана и диэтил-эфира (85:15), а пластину запускали три раза. Вторая подвижная фаза состояла на 100% из дихлорметана и пластина была элюирована один раз(рисунок 3B). В обеих системах элюирования миколовые кислоты расположены примерно в середине пластины TLC от начала применения образца. Как показано на рисунке 3, M. brumae обладает только миколевыми кислотами типа I, миколиновой кислотой, присутствующей во всех видах микобактерий. М. Бовис БЦЖ имеет тип I и IV, M. fortuitum типа I и V, а также M. abscessus,тип I и II профили миколиевой кислоты. Выполнение двух типов процедур метилирования позволяет подтвердить наличие миколиновой кислоты типа V, поскольку миколевая кислота типа V расщепляется во время процедуры кислотного метанолиза. Как показано на рисунке 3, только после процедуры омыления наблюдалось пятно, соответствующее миколиновой кислоте типа V. После метанолиза TLC показали производные соединения из расщепления типа V, которые мигрировали вблизи точки применения19. Для исследователей неофитов 2D-TLC может позволить дополнительный метод идентификации каждого типа миколиновой кислоты(рисунок 3C,D). Экстракты миколиновой кислоты должны быть сначала запущены в системе элюдения, образованной нефтяным эфиром (60-80 ° C) и ацетоном (95: 5) три раза. Затем пластину необходимо запустить во втором направлении с подвижной фазой, образованной толуолом и ацетоном (97:3). 2D-TLC в сочетании с масс-спектрометрией (МС) был использован для идентификации и химической характеристики функциональных групп микольных кислот и широко использовался для характеристики микольных кислот20,21,22. Таким образом, рисунок миколевой кислоты является одной из биохимических особенностей, имеющих ценность при систематической оценке микобактерий в сочетании с другими анализами из-за общих паттернов миколевой кислоты среди разных видов.
После выполнения вышеупомянутой процедуры извлечения нековалентных связанных липидов были выбраны различные системы элюирования в функции полярности и размера липидного профиля, обнаруженного в клетках микобактерий. Идеальная комбинация растворителей в системах элюирования должна позволить визуализировать нужные липиды в средней зоне пластины TLC для облегчения их дальнейшей очистки, если это необходимо. На рисунке 4пластины TLC упорядочены от системы элюции, которая позволяет контролировать наиболее аполярные липиды(рисунок 4A),до системы элюдения, которая позволяет визуализировать большинство полярных липидов(рисунок 4E).
Ацилглицеролы (AG) и PDIM являются двумя наиболее аполярными липидами, присутствующими в клеточной стенке микобактерии, и легко визуализируются с помощью анализа 1D-TLC с использованием подвижной фазы, образованной нефтяным эфиром: диэтиловым эфиром (90: 10). На рисунке 4A показано, что АГ присутствовали у M. bovis BCG, M. fortuitum и M. brumae, но не у гладкого морфотипа M. abscessus. Хотя 1D-TLC предполагал наличие PDIM в M. bovis BCG и M. fortuitum,это было подтверждено только в M. bovis BCG при выполнении анализа 2D-TLC(рисунок 4B). В целом, эти результаты демонстрируют важность подтверждения присутствия микобактериального соединения по меньшей мере двумя различными системами элюирования. Еще одним интересным липидом для анализа в составе микобактерий является PGL. В выбранных микобактериях PGL присутствует только в M. bovis BCG, и это заметно, когда TLC элюируют с помощью системы элюирования, состоящей из хлороформа и метанола (95:5)(рисунок 4C). Следуя идее визуализации более полярных компонентов, система элюирования, состоящая из смеси 90:10:1 (хлороформ:метанол:вода), использовалась для мониторинга наличия GPL(рисунок 4D),которые присутствуют только у гладкого морфотипа M. abscessus. В тех же TLC: PGL, трегалоза димиколат (TDM), ацилт-трегалозы (AT) и трегалоза мономиколата (TMM), также могут наблюдаться. PGL, GPL, TDM, AT также наблюдались в верхней части пластины, когда система элюирования состояла из 30: 8: 1 (хлороформ: метанол: вода)(рисунок 4E). ТММ расположен в середине пластины. ТДМ и ТММ были четко выражены во всех изученных микобактериях. Несмотря на то, что фосфатидил-инозитоловые маннозиды (PEM) наблюдаются в нижней части пластины, лучшая система элюирования для анализа PEM составляет 60: 35: 8 (хлороформ: метанол: вода), как показано на рисунке 5A,B. В то время как все сахаросодержащие липиды выявляются с помощью антрона(рисунок 5А),ПИМы содержат фосфатные группы, которые специально выявлены с помощью молибденового синего реагента(рисунок 5B). Подобно миколовым кислотам, AG и PDIM, PMM также можно легко визуализировать с помощью анализа 2D-TLC(рисунок 5C). Более того, в случае анализа микобактерий, способных синтезировать LOSs, PEM и LOSs будут дифференцированы с использованием той же системы 2D-элюирования, как подробно описано в Ren et al.8.
Рисунок 1:Схема процедуры извлечения липидного содержания микобактерий, выращенных на твердых носителях. Основные шаги по расшифровке липидов, присутствующих в клетках микобактерий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Схема процедуры извлечения миколиновой кислоты из микобактерий, выращенных на твердых носителях. Основные этапы расшифровки микольных кислот, присутствующих в клетках микобактерий, с использованием либо(А)кислотного метанолиза, либо(В)омыления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Репрезентативные результаты экстракции липидов из микобактерий. Тонкослойный хроматографический (TLC) анализ миколовых кислот, разработанный в(A)85 мл n-гексана, плюс 15 мл диэтилового эфира (три прогона) и(B)100 мл дихлорметана. (C) Двумерный TLC-анализ микольных кислот, извлеченных кислотным метанолизом, разработанный в 95:5 (н-гексан:ацетон) (три прогона) в первом направлении и 97:3 (толуол:ацетон) во втором направлении. (D)Двумерный TLC-анализ микольных кислот из M. fortuitum, извлеченных путем омыления, разработанный в 95:5 (n-гексан:ацетон) (три прогона) в первом направлении и 97:3 (толуол:ацетон) во втором направлении. TLC были выявлены с 10% гидратом молибдатофосфорной кислоты в этаноле с последующим нагреванием пластины при 120 °C. M. bovis BCG Connaught (линии 1 и 1'); M. fortuitum (линии 2 и 2'); M. abscessus гладкий морфотип (линии 3 и 3') и M. brumae (линии 4 и 4'). 1-4 миколиновые кислоты, полученные кислотным метанолизом, и 1'-4' миколовые кислоты, полученные омылением. Я, α-миколадает; II, α'-миколаты; IV, кетомиколаты; V, эпоксимиколаты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Репрезентативные результаты экстракции липидов из микобактерий. (A)TLC-анализ ацилглицерилов (AG) и фтиоцерина димикоцерозатов (PDIMs), разработанный в 90:10 (нефтяной эфир (60-80 °C) :d этиловый эфир). (B) Двумерный TLC-анализ PDIMs и AG, разработанный в 98:2 (нефтяной эфир (60-80 °C): этилацетат) (три прогона) в первом направлении и 98:2 (нефтяной эфир (60-80 °C): ацетон) во втором направлении. (C)TLC-анализ фенольного гликолипида (PGL), разработанный в 95:5 (хлороформ:метанол). (D)TLC-анализы, разработанные в 90:10:1 (хлороформ:метанол:вода) PGL, гликопептидолипидов (GPL), димиколата трегалозы (TDM), ацилтегалоз (AT) и мономиколата трегалозы (TMM). (E)TLC-анализ PGL, GPL, AT, TMM и фосфатидил-инозитоловых маннозидов (PEM), разработанный в 30:8:1 (хлороформ:метанол:вода). A-B-C были выявлены с 10% гидратом молибдатофосфорной кислоты в этаноле с последующим нагреванием пластины при 120 °C. D-E были выявлены с 5% в этаноле 20% α-нафтолом в серной кислоте и нагретым при 120 °C. Линия 1: M. bovis BCG Connaught; Линия 2: M. fortuitum; Линия 3: M. abscessus гладкий морфотип; Линия 4: M. brumae. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Репрезентативные результаты PEM из микобактерий. (A-B) TLC анализ PEM, разработанный в 60:35:8 (хлороформ:метанол:вода). (C) Двумерный TLC-анализ PEM, разработанный в 60:30:6 (хлороформ:метанол:вода) в первом направлении и 40:25:3:6 (хлороформ:уксусная кислота:метанол:вода) во втором направлении. A-C были выявлены с 1% антроном в серной кислоте с последующим нагреванием пластины при 120 °C. B был выявлен с молибденовым синим реагентом до появления фосфатных полос. Линия 1: M. bovis BCG Connaught; Линия 2: M. fortuitum; Линия 3: M. abscessus гладкий морфотип; Линия 4: M. brumae. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представлен простой протокол, рассматриваемый в качестве золотого стандарта метода извлечения нековалентно связанных липидных соединений из клеточной стенки микобактерии. Показана дальнейшая визуализация одно- и двумерными ТЛК из извлеченных липидов четырех различных микобактерий.
Две последовательные комбинированные смеси хлороформа и метанола для восстановления липидного содержания микобактериальных клеток являются наиболее широко используемым растворителемсмеси 23,24,25,26,27,28,29. Эта смесь позволяет восстанавливать из клеток широкий спектр аполярных и полярных липидов. Тем не менее, некоторые другие методы были описаны в литературе для извлечения общих или специфических микобактериальных липидов, которые были недавно рассмотрены Hameed et al.29. Например, метод Фольча является одним из наиболее широко используемых протоколов, разработанных для восстановления общего количества микобактериальных липидов из тканей30, а также был адаптирован к чистым микобактериальным культурам. Он состоит из суспендинга микобактериальных клеток в хлороформе:метаноле (1:2) с последующим центрифугированием и добавлением хлороформа для получения соотношения 1:1. Наконец, KCl используется для удаления нелипидных компонентов из экстракта31. Параллельно были разработаны другие протоколы для извлечения конкретных липидов. Slayden etal. использовали смесь хлороформа: метанола плюс ацетон для специфических восстановлений гликолипидов, таких как TDM или TMM32. В целом, опубликованные методы основаны на воздействии микобактериальных клеток на различные концентрации растворителей, в основном хлороформа и метанола. Аналогичным образом, некоторые соли иногда добавляют, чтобы отбросить другие клеточные компоненты, присутствующие в образце.
В дополнение к нековалентно связанным липидам также показана экстракция миколиновой кислоты двумя различными процедурами. В то время как кислотный метанолиз позволяет легко экстракцию миколовых кислот с менее опасными реагентами, процедура омыления сохраняет структуру всех типов миколиновой кислоты, включая миколевую кислоту типа V, которая расщепляется во время процедур метанолиза. После извлечения липидов 1D- или 2D-TLC являются стандартными методами их мониторинга, и используемый анализ варьируется в зависимости от физико-химических характеристик липидов. Полярность и размер каждой молекулы будут определять выбор необходимой системы элюации, что позволит определить липиды, которые являются частью микобактерии. Одномерный TLC может быть выбран, когда факторы удержания (Rf) между микобактериальными липидами различны, в то время как 2D-TLC облегчает визуализацию, когда разные липиды имеют молекулярную массу и характеристики полярности. Чтобы облегчить идентификацию, очищенные липиды следует запускать параллельно извлечению образца для сравнения аналогичного Rf. Идентификация липида может быть достигнута, когда он работает с тем же Rf, что и известный очищенный контроль, по меньшей мере, в двух системах TLC (две разные подвижные фазы). Очищенные липиды могут быть получены от коммерческих поставщиков или из лабораторий микобактериальных исследований. Наконец, биохимическая природа молекулы указывает, какое пятно может быть использовано для выявления пластин TLC. Существуют универсальные методы окрашивания, такие как фосфомолибдовая кислота, которая позволяет визуализировать любой органический компонент, поскольку он связывается с углеродными связями. В то время как другие, такие как а-нафтол или антрон, обеспечивают специфические цвета для остатков сахара, молибденовый синий специфически связывается с остатками фосфатов.
Наиболее важным соображением для анализа содержания липидов в микобактериях является избегание использования пластикового материала на протяжении всех процедур, поскольку контакт органических растворителей с пластиком может загрязнять образцы и может наблюдаться в пластинах TLC. Также уместно учитывать, что состав питательной среды, используемый для культивирования микобактерий, а также температура или дни инкубации могут модифицировать липидный рисунок каждой микобактерии, как описаноранее 16. Микобактерии, выращенные на жидких и твердых средах, могут быть использованы для извлечения нековалентных связанных липидов или миколовых кислот. При получении клеток из жидкой культуры их следует надлежащим образом фильтровать и сушить, чтобы избежать присутствия жидких сред в образце. Более того, при использовании микобактерий из жидких сред бактерии должны правильно и равномерно выращиваться между экспериментами, чтобы со временем получить воспроизводимые результаты. Кроме того, микобактериальные клетки также могут быть выращены на пелликлах17,33,34,35,36,из которых наиболее внешние липиды могут быть извлечены с использованием органических растворителей и контролироваться TLC, как мы показали в настоящей статье.
Основным ограничением процедур экстракции микобактериальных липидов остается использование токсичных растворителей в безопасных условиях. Процедура TLC менее чувствительна, чем другие методы, такие как газовая хроматография или высокоэффективная жидкостная хроматография. Кроме того, TLC не позволяет количественно определять образцы, и для идентификации структуры экстрагированных соединений необходимо применять дополнительные методы. Например, ядерный магнитный резонанс должен быть выполнен для различения липидных изомеров. Примечательно, что для описания структуры микобактериального липида впервые требуется масс-спектрометрия или инфракрасная спектроскопия. Таким образом, количественный и качественный анализ липидных классов обычно требует комбинаций различных методов экстракции, дериватизации, хроматографии и детектирования, таких как высокоэффективная жидкостная хроматографическая тандемная масс-спектрометрия и ядерно-магнитно-резонансная спектроскопия37,38,39,40. Недавние исследования показали, что использование одноступенчатой тонкослойной хроматографии-пламенной ионизации позволяет количественно определять и предварительно скрининга микольных кислот в актинобактериях41. Тем не менее, TLC является чрезвычайно полезным, хозяйким и дешевым методом для скрининга и оценки липидного состава микобактерий. В целом, процедуры, представленные здесь, очень универсальны, предоставляя основные инструменты для анализа наиболее актуальной особенности клеток микобактерий: их сложной клеточной стенки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось Министерством науки, инноваций и университетов Испании (RTI2018-098777-B-I00), фондами FEDER и Женералитатом Каталонии (2017SGR-229). Сандра Гуаллар-Гарридо является обладателем контракта phD (FI) от Женешитата Каталонии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
References
- Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
- Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
- Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
- Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).
- Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
- Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).
- Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).
- Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
- Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
- Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
- Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
- Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232 (2016).
- Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
- Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
- Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
- Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).
- Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
- Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
- Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , CPC Press. London, UK. 139-143 (1986).
- Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
- Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
- Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
- Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
- Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
- Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
- Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
- Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
- Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , Springer. Singapore. (2020).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
- Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
- Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
- Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
- Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
- Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).
- Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB". Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
- Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
- Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).
