Summary
Çok çeşitli mikobakterilerin hücre duvarının toplam lipit içeriğini çıkarmak için bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, farklı mikolik asit türlerinin ekstraksiyon ve analitik protokolleri gösterilmiştir. Bu mikobakteriyel bileşikleri izlemek için ince katmanlı bir kromatografik protokol de sağlanmaktadır.
Abstract
Mikobakteri türleri büyüme hızında, pigmentasyon varlığında, katı medyada görüntülenen koloni morfolojisinde ve diğer fenotipik özelliklerde birbirinden farklı olabilir. Bununla birlikte, hepsi mikobakterilerin en alakalı karakterine sahiptir: benzersiz ve son derece hidrofobik hücre duvarı. Mikobakteri türleri, mikobakteri türleri arasında farklılık gösteren türlere sahip arabinogalactan, peptidoglikan ve uzun mikolik asit zincirlerini içeren membran-kovalent bağlantılı bir kompleks içerir. Ek olarak, mikobakteriler ayrıca bulunan lipitleri de üretebilir, phthiocerol dimycocerosates (PDIM), fenolik glikolipidler (PGL), glikoptidolipidler (GPL), acyltrehaloses (AT) veya fosfatidil-inositol mannosides (PIM) gibi hücre yüzeylerinde, yaygın olarak bağlı değildir. Bazıları patojenik mikobakterilerde virülans faktörleri veya konak-mikobakteri etkileşiminde kritik antijenik lipitler olarak kabul edilir. Bu nedenlerle mikobakteriyel lipitlerin mikobakteri enfeksiyonlarının patojenikliğindeki rollerini anlamalarından, bulaşıcı hastalıkların ve kanser gibi diğer patolojilerin tedavisinde immünomodülatör ajanlar olarak olası bir imaya kadar çeşitli alanlarda uygulanması nedeniyle incelenmesine önemli bir ilgi vardır. Burada, organik çözücülerin karışımları kullanılarak katı bir ortamda yetiştirilen mikobakteri hücrelerinin toplam lipit içeriğini ve mikolik asit bileşimini çıkarmak ve analiz etmek için basit bir yaklaşım sunulmaktadır. Lipit özleri elde edildikten sonra, çıkarılan bileşikleri izlemek için ince tabaka kromatografisi (TLC) yapılır. Örnek deney dört farklı mikobakteri ile gerçekleştirilir: çevresel hızlı büyüyen Mycolicibacterium brumae ve Mycolicibacterium fortuitum, zayıflamış yavaş büyüyen Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) ve fırsatçı patojen hızlı büyüyen Mycobacterium apsesi, mevcut protokolde gösterilen yöntemlerin çok çeşitli mikobakteriler için kullanılabileceğini göstermiştir.
Introduction
Mycobacterium patojenik ve patojenik olmayan türlerden oluşan bir cinstir, kendine özgü lipitleri tarafından oluşturulan son derece hidrofobik ve geçirimsiz bir hücre duvarına sahip olması ile karakterizedir. Özellikle, mikobakteri hücre duvarı mikolik asitler içerir, tüm mikolik asitlerde (uzunluk hariç) α dalının sabit olduğu α-alkil ve β-hidroksi yağ asitleri olan ve meromycolate zinciri olarak adlandırılan β zinciri, literatürle birlikte tanımlanan farklı fonksiyonel kimyasal grupları içerebilen uzun bir alifatik zincirdir (α, α', metoksi-, φ-, epoksi-, karboksi-ve ω-1-metoksi- mikolatlar), bu nedenle yedi tür mikolik asit üretir (I-VII)1. Ayrıca, mikobakteri türlerinin hücre duvarında tartışmasız öneme sahip diğer lipitler de mevcuttur. Patojenik türler gibi Mycobacterium tuberculosis, tüberkülozun etken maddesi2 phthiocerol dimycocerosates (PDIM), fenolik glikolipid (PGL), di,tri-ve penta-acyltrehaloses (DAT, TAT ve PAT) veya sulfolipids gibi spesifik lipid bazlı virülans faktörleri üretir3. Mikobakteri yüzeyindeki varlıkları, konak immün yanıtı değiştirme yeteneği ve bu nedenle konakçı içindeki mikobakterinin evrimi ve kalıcılığı ile ilişkilendirilmiştir.4. Örneğin, triacylglycerols (TAG) varlığı Lineage 2-Pekin alt soy hipervirulent fenotip ile ilişkilendirilmiştir M. tuberculosis, muhtemelen konak bağışıklık tepkisini zayıflatıcı kapasitesi nedeniyle5,6. Diğer ilgili lipitler tüberküloz ve nontuberculous mikobakterilerde bulunan lipooligosaccharides (LOSs) 'dir. Durumunda Mycobacterium marinum, HÜCRE DUVARINDA LOSS'un varlığı sürgü hareketliliği ve biyofilm oluşturma yeteneği ile ilgilidir ve makrofaj örüntü tanıma reseptörleri tarafından tanınmasına müdahale eder, konak fagositler tarafından bakterilerin alımını ve yok olmasını etkiler7,8. Ek olarak, bazı lipitlerin yokluğu veya varlığı, aynı türün üyelerinin konak hücrelerle etkileşime girerken virülan veya zayıf profillere sahip farklı morfotipler halinde sınıflandırılmasına izin verir. Örneğin, kaba morfotipinde glikopeptidolipidlerin (GPL) bulunmaması Mycobacterium abscessus intrafagozomal asitleşmeye ve dolayısıyla hücre apoptozuna neden olma yeteneği ile ilişkilendirilmiştir.9, yüzeylerinde GPL'lere sahip pürüzsüz morfotipin aksine. Ayrıca, mikobakteri hücre duvarının lipit içeriği konakçıda immün yanıtı değiştirme yeteneği ile ilgilidir. Bu, farklı patolojilere karşı koruyucu bir bağışıklık profilini tetiklemek için bazı mikobakterilerin kullanılması bağlamında geçerlidir.10,11,12,13. Örneğin, Mycolicibacterium vaccae, şu anda tüberküloz için immünoterapik bir aşı olarak faz III klinik çalışmalarda bulunan bir saprofitik mikobakteri, iki kolonyal morfotip gösterir. Yüzeyinde bir polyester içeren pürüzsüz fenotip bir Th2 yanıtını tetiklerken, polyesterden yoksun kaba fenotip, konak bağışıklık hücreleriyle etkileşime girdiğinde bir Th1 profiline neden olabilir.14. Mikobakteri hücresinde bulunan lipitlerin repertuarı sadece mikobakteri türlerine değil, aynı zamanda mikobakteri kültürlerinin koşullarına da bağlıdır: kuluçka zamanı15,16 veya kültür ortamının bileşimi17,18. Aslında, kültür orta bileşimindeki değişiklikler antitümör ve immünostimülatör aktivitesini etkiler. M. bovis BCG ve Mycolicibacterium brumae in vitro17. Ayrıca, tarafından tetiklenen koruyucu bağışıklık profili M. bovis BCG karşı M. tuberculosis fare modellerinde meydan okuma, aynı zamanda M. bovis BCG büyüyor17. Bunlar daha sonra her kültür durumunda mikobakterilerin lipid bileşimi ile ilgili olabilir. Tüm bu nedenlerden dolayı, mikobakterilerin lipit içeriğinin incelenmesi önemlidir. Mikobakteri hücre duvarının lipit bileşimini çıkarmak ve analiz etmek için görsel bir prosedür sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Toplam kovalent bağlantılı olmayan lipitlerin mikobakterilerden çıkarılması (Şekil 1)
- Katı bir ortamdan 0,2 g mikobakteri çizin ve politetrafloroetilen (PTFE) astar vidalı kapaklı bir cam tüpe ekleyin. 5 mL kloroform ve 10 mL metanolden oluşan bir çözelti ekleyin (kloroform:metanol, 1:2).
NOT: Organik çözücüler kullanıldığında sadece cam alıcı kullanılmalıdır. Plastik kaplara izin verilmez. Ayrıca, şişeler için PTFE astar vidalı kapaklara ihtiyaç vardır.
DİkKAT: Kloroform potansiyel olarak toksik ve son derece tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven) giyen bir laminar akış davlumbazında kullanılmalıdır.
DİkKAT: Metanol potansiyel olarak toksik ve son derece tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven) giyen bir laminar akış davlumbazında kullanılmalıdır. - Mikobakteri hücre yüzeyinden kovalent bağlantılı olmayan lipitleri çıkarmak için tüpü gece boyunca sürekli karıştırarak bırakın.
NOT: Yörüngesel bir sallama platformu mevcut değilse, sürekli karıştırma, periyodik manuel karıştırma ile mümkün olduğunca sık değiştirilebilir. - Bir cam hunisini bir filtre kağıdı ile örtün, organik çözücüleri filtreleyin ve bir cam tüpte toplayın.
- Tüpteki sıvı fazı buharlaştırmak için azot gazı akışı kullanın. Tüpü azot gazı ile doldurun, örtün ve 4 °C'de saklayın.
NOT: İstenilen tüpü özellikle buharlaşmak için azot gazı akışına bir cam Pasteur pipet bağlayın. Ayrıca, tüpü 37 °C'deki tüpler için kuru blok ısıtıcının içinde saklayın. Çözücü buharlaştığında, kapatmadan önce tüpü azot gazı ile doldurun. - Hücresel döküntüye 15 mL kloroform:metanol (2:1) çözeltisi ekleyin. Mikobakteri hücre yüzeyinden kovalent bağlantılı olmayan lipitleri çıkarmak için tüpü gece boyunca sürekli karıştırarak bırakın.
NOT: Yörüngesel bir sallama platformu mevcut değilse, sürekli karıştırma, periyodik manuel karıştırma ile mümkün olduğunca sık değiştirilebilir. - Karışımı 1 saat dinlendirin. Pasteur pipet ile organik çözücüleri geri kazan. Bir cam huniyi bir filtre kağıdı ile örtün ve organik çözücüleri filtreleyin ve daha önce adım 1.3'te kullanılan aynı cam tüpte toplayın. Tüpteki sıvı fazı buharlaştırmak için azot gazı akışı kullanın. Tüpü azot gazı ile doldurun, kapatın ve 4 °C'de tekrar saklayın.
2. Asit metanolizi ile mikolik asit ekstraksiyonu (Şekil 2A)
- PTFE astar vidalı kapaklı hermetik cam bir tüpe 2-5 mL esterleştirici çözelti ekleyin. Cam tüpe 0,2 g mikobakteri biyokütlesi ekleyin.
NOT: Esterleştirici çözelti, 30 mL metanol, 15 mL toluen ve 1 mL sülfürik asit karıştırılarak oluşturulur. Mikobakteri hücreleri katı kültürlerden veya hatta mikobakterilerden toplam kovalent bağlantılı olmayan lipitlerin ekstraksiyonu yapıldıktan sonra delipidated hücrelerden alınabilir (adım 1.6'da filtrelendikten sonra kalan hücreler).
DİkKAT: Toluen yanıcı ve son derece tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven) giyen bir laminar akış davlumbazında kullanılmalıdır.
DİkKAT: Sülfürik asit aşındırıcı ve tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven) giyen bir laminar akış davlumbazında kullanılmalıdır. - İçeriği girdapla karıştırın. Karışımın bir gecede 80 °C'de kuru bir banyonun içinde durmasına izin verin.
- Tüpün oda sıcaklığına ulaşana kadar soğumasını bekleyin ve ardından tüpe 2 mL n-hekzan ekleyin. İçeriği 30 s boyunca girdapla karıştırın ve iki net faz görünene kadar tüpün oturmasını sağlar.
DİkKAT: n-heksam potansiyel yanıcı, tahriş edici, çevreye zarar veren ve son derece tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven) giyen bir laminar akış davlumbazında kullanılmalıdır. - N-heksam evresine karşılık gelen üst fazı kurtarın. Yeni bir tüpe aktarın.
- 2.3 adımını yineleyin. Üst fazı tekrar kurtarın ve 2.4 adımında kullanılan aynı tüpe aktarın.
- Azot gazı akışı kullanarak tüpün içeriğini buharlaştır. Tüpü azot gazı ile doldurun, kapatın ve 4 °C'de saklayın.
3. Safirleştirme ve metilasyon ile mikolik asit ekstraksiyonu (Şekil 2B)
- Katı bir ortamdan 0,2 g mikobakteri çizin ve PTFE vidalı bir cam tüpe ekleyin.
- % 5 potasyum hidroksit içeren 2 mL metanol-benzen çözeltisi (80:20) ekleyin. İçeriği girdapla karıştırın. Karışımı 100 °C'de 3 saat ısıtın.
DİkKAT: Benzen yanıcı, kanserojen ve tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven) giyen bir laminar akış davlumbazında kullanılmalıdır. - Tüpün oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. pH elde etmek için numuneleri asitleştirmek için% 20 sülfürik asit ekleyin = 1.
- 3 mL dietil eter ekleyin. İçeriği girdapla yavaşça karıştırın.
- İki aşamanın yerleşerek oluşmasına izin verin. Dietil eter fazını kurtarın ve yeni bir tüpe aktarın. Yıkama adımını toplam üç kez tekrarlayın.
- Dietil eter ekstresini 2 mL damıtılmış su ile yıkayın ve dietil etere karşılık gelen üst kısmı yeni bir tüpe aktarın. Yıkama adımını toplam üç kez tekrarlayın.
- Kurutmak için dietil eter ekstresinin üzerine 2 g susuz sodyum sülfat ekleyin.
- Süspansiyonu filtreleyin. Azot gazı akışı kullanarak içeriği buharlaştır.
- Metilasyon adımını gerçekleştirmek için, damıtılmış suda 45 mL dietil eter ve 9 mL% 40 KOH tarafından oluşturulan önceden soğulmuş bir çözeltide 3 g N-nitroso-N-metil üre çözün.
DİkKAT: N-nitroso-N-metilüre toksik, tahriş edici, kanserojen ve tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven) giyen bir laminar akış davlumbazında kullanılmalıdır. - Süpernatantı (diazomethane) potasyum hidroksit peletleri (yaklaşık 30 g) içeren buzda soğutulmuş yeni bir şişeye aktarın.
NOT: Süpernatant hemen kullanılmazsa, -20 °C'de maksimum 1 saat saklanabilir.
DİkKAT: Potasyum hidroksit peletleri tahriş edici ve aşındırıcı bir maddedir. Bu malzeme, uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven) giyen bir laminar akış davlumbazında kullanılmalıdır.
DİkKAT: Diazomethane oldukça zehirli ve potansiyel olarak patlayıcıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven) giyen güvenlik camına sahip laminer akış davlumbazında kullanılmalıdır. - Adım 3.10'da elde edilen diazomethane içeren eter çözeltisinin 2 mL'lik kısmını, adım 3.8'de elde edilen mikolik asitleri içeren kurutulmuş dietil eter özüne ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatır.
- Süspansiyonu 40 °C'de buharlaştır. Tüpü azot gazı ile doldurun, kapatın ve metillenmiş lipitleri 4 ° C'de saklayın.
NOT: Diazomethaneyi laminer akış başlığının altındaki eter çözeltisinden buharlaştırın, ta ki eter sarı rengi kaybedene kadar.
4. İnce tabaka kromatografisi (TLC) analizi
- Cam TLC haznesini doyur. Bunu yapmak için, TLC odasının duvarlarından birini bir filtre kağıdı parçasıyla örtün ve çözücülerin karışımından oluşan mobil fazla temas etmesine izin verin. Çözücünün kalan hacmini TLC haznesinin altına yerleştirin.
NOT: TLC haznesinin altı mobil fazın en az 1 cm'si ile kaplanmalıdır. Mevcut deneylerde, TLC'leri geliştirmek için farklı mobil aşamalar kullanıldı. 85 mL n-heksamın artı 15 mL dietil eterden oluşuyordu; 100 mL diklorometan; 90 mL kloroform, 10 mL metanol ve 1 mL su; 30 mL kloroform, artı 8 mL metanol ve 1 mL su; 60 mL kloroform, artı 35 mL metanol ve 8 mL su; 95 mL kloroform artı 5 mL metanol; ve 90 mL petrol eter (60-80 °C) artı 10 mL dietil eter.
NOT: İki boyutlu TLC'de, ilk yönde üç kez n-heksamin:aseton (95:5) kullanın ve mikolik asit bileşimini analiz etmek için ikinci yönde toluen:aseton (97:3) ile tek bir gelişme kullanın. PIM'leri analiz etmek için, ilk yönde bir kez kloroform:methanol:su (60:30:6) kullanın ve ikinci yönde kloroform:asetik asit:metanol:su (40:25:3:6) kullanın. PDIM ve AG'yi analiz etmek için petrol eterini (60-80 °C): etil asetat (98:2) üç kez birinci yönde kullanın ve ikinci yönde petrol eter (60-80 °C):aseton (98:2) ile tek bir gelişme kullanın.
DİkKAT: Dietil eter potansiyel olarak toksik ve tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven) giyen bir laminar akış davlumbazında kullanılmalıdır.
DİkKAT: Dikloromethane potansiyel olarak toksik ve tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven) giyen bir laminar akış davlumbazında kullanılmalıdır.
DİkKAT: Petrol eter potansiyel yanıcı, çevreye zarar veren ve son derece tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven) giyen bir laminar akış davlumbazında kullanılmalıdır.
DİkKAT: Asetik asit potansiyel yanıcı ve aşındırıcı bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven) giyen bir laminar akış davlumbazında kullanılmalıdır.
DİkKAT: Etil asetat yanıcı ve tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven) giyen bir laminar akış davlumbazında kullanılmalıdır.
DİkKAT: Aseton yanıcı ve tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven) giyen bir laminar akış davlumbazında kullanılmalıdır. - EN AZ 20 dk doyurmak için TLC haznesini kapatın. Bu arada, cam tüpte bulunan lipitleri 0,2-1 mL kloroformda çözün.
NOT: Lipitleri çözmek için kullanılan hacim, numunenin istenen veya beklenen konsantrasyonuna bağlı olarak değiştirilebilir. - Her süspansiyonun 10 μL'sini doğrudan TLC plakasına kılcal cam tüp kullanarak uygulayın ve numuneyi oda sıcaklığında 5 dakika kurutun.
NOT: Numuneler plakanın alt kısmına her iki tarafta 1 cm bırakarak uygulanmalıdır. Numuneler en az 0,5 cm boyunca birbirinden ayrılmalıdır. Numune plakaya uygulandıktan sonra, tüpler azot gazı ile tekrar buharlaştırılabilir ve daha fazla kullanım için 4 °C'de saklanabilir. - Plakayı mobil fazı içeren doymuş TLC haznesine yerleştirin. Mobil fazın TLC üzerinden çalışmasına izin verin.
NOT: TLC haznesine uygulanan herhangi bir hareket plakadaki çalışan çözücüyü etkiler ve lipit hareketliliğini etkiler. İki boyutlu TLC'nin gerçekleştirilmesi durumunda, her iki elüasyon sistemini de içermesi için iki TLC odası gerekir. - Çözücü plakanın üst ucundan 1 cm mesafeye ulaştığında plakayı TLC odasından çıkarın. Silika tamamen kuruyana kadar tabağı laminar akı altında bırakın.
NOT: Mikolik asit bileşiminin analizinde, n-hekzane ve dietil-eter (85:15) kullanılarak, mobil fazı TLC plakası üzerinde üç kez çalıştırılana kadar 4.4 ve 4.5 adımlarını iki kat daha fazla tekrarlayın. - Plakayı gerekli leke ile ortaya koyun; gerekirse plakayı ısıtın.
NOT: Mevcut deneyde, TLC plakalarını püskürtmek için aşağıdaki çözeltilerin 15-20 mL'si kullanıldı: plaka parlak sarı olana kadar etanolde% 10 Molibdatofosforik asit hidrat, ardından plakayı 120 ° C'de ısıtma; Sülfürik asitte % 20 α-naftalin etanolinde% 5 ve ardından plakayı 120 ° C'de ısıtma; Molibden Mavi reaktif (4.2 M sülfürik asitte% 1.3 molibden oksit) fosfat bantları ortaya çıkana kadar veya sülfürik asitte% 1 anthrone.
DİkKAT: Molibdatofosforik asit hidrat yanıcı ve aşındırıcı bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven) giyen bir laminar akış davlumbazında kullanılmalıdır.
DİkKAT: Etanol potansiyel yanıcı ve tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven) giyen bir laminar akış davlumbazında kullanılmalıdır.
DİkKAT: 1-Naftalin yanıcı, aşındırıcı ve son derece tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven) giyen bir laminar akış davlumbazında kullanılmalıdır.
DİkKAT: Molibden Mavi Sprey Reaktif aşındırıcı, toksik ve son derece tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven) giyen bir laminar akış davlumbazında kullanılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farklı mikobakteri türlerinde bulunan çok çeşitli lipitleri göstermek amacıyla, Pürüzlü ve yavaş büyüyen mikobakteriler olduğu için M. bovis BCG seçildi. Prosedüre kaba ve hızlı büyüyen M. fortuitum ve M. brumae eklendi ve son olarak M. apsesinin pürüzsüz morfotipine de yer verildi. Bu dört tür, akiltrehalozlar (AT), GPL'ler, PDIM, PGL, PIM, TDM ve TMM gibi mikobakterilerden türetilmiş geniş bir lipit spektrumunu görselleştirmemize izin verir. Ayrıca, dört türün de mikolik asit desenleri farklıdır.
Mikolik asit ekstraksiyon protokolleri yapıldıktan sonra lipid özleri iki farklı, eşit geçerlilikte, elütion sistemi kullanılarak 1D-TLC analizi ile analiz edilmiştir (Şekil 3A,B). İlk mobil faz (Şekil 3A) n-heksam ve dietil-eter (85:15) tarafından oluşturulmuş ve plaka üç kez çalıştırılmıştır. İkinci mobil faz dikloromethanenin% 100'ünden oluşuyordu ve plaka bir kez eluted edildi(Şekil 3B). Her iki elüsyon sisteminde de mikolik asitler örnek uygulamanın kökeninden yaklaşık olarak TLC plakasının ortasında bulunur. Şekil 3'ün gösterdiği gibi, M. brumae sadece tüm mikobakteri türlerinde bulunan bir mikolik asit olan tip I mikolik asitlere sahiptir. M. bovis BCG tip I ve IV, M. fortuitum tip I ve V ve M. apse,tip I ve II mikolik asit profillerine sahiptir. İki tür metilasyon işlemi yapmak, V tipi mikolik asit metanoliz işlemi sırasında V tipi mikolik asitin bölünmesini onaylamamızı izin verir. Şekil 3'ün gösterdiği gibi, ancak saponifikasyon işleminden sonra V tipi mikolik aside karşılık gelen nokta gözlendi. Metanolizden sonra, TLC uygulama noktası19'unyakınında göç eden V tipi bölünmeden elde edilen bileşikleri gösterdi. Neofit araştırmacılar için, 2D-TLC her mikolik asit tipini tanımlamak için tamamlayıcı bir yönteme izin verebilir (Şekil 3C, D). Mikolik asit özleri ilk olarak petrol eter (60-80 °C) ve aseton (95:5) tarafından üç kez oluşturulan bir elüsyon sisteminde çalıştırılmalıdır. Daha sonra, plaka toluen ve aseton tarafından oluşturulan bir mobil faz ile ikinci yönde çalıştırılmalıdır (97:3). 2D-TLC kütle spektrometresi (MS) ile birlikte mikolik asitlerin fonksiyonel gruplarını tanımlamak ve kimyasal olarak karakterize etmek için kullanılmıştır ve mikolik asitleri karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmıştır20,21,22. Bu nedenle mikolik asit deseni, farklı türler arasında paylaşılan mikolik asit desenleri nedeniyle diğer analizlerle birlikte sistematik mikobakteriyel değerlendirmede değerin biyokimyasal özelliklerinden biridir.
Yaygın olmayan bağlı lipitleri çıkarmak için yukarıda belirtilen prosedür yapıldıktan sonra, mikobakteri hücrelerinde bulunan lipit profilinin polaritesi ve boyutu işlevinde farklı elüasyon sistemleri seçilmiştir. Elution sistemlerindeki çözücülerin ideal kombinasyonu, istenirse daha fazla saflaşmalarını kolaylaştırmak için TLC plakasının orta bölgesinde istenen lipitlerin görselleştirilmesini sağlamalıdır. Şekil 4'te TLC plakaları, en apolar lipitlerin izlenmesini sağlayan elüasyon sisteminden (Şekil 4A) en polar lipitlerin görselleştirilmesini sağlayan elüasyon sistemine kadar sipariş edilir (Şekil 4E).
Acyl gliseroller (AG) ve PDIM'ler mikobakteri hücre duvarında bulunan en apolar lipitlerden ikisidir ve petrol eter:dietil eter (90:10) tarafından oluşturulan mobil bir faz kullanılarak 1D-TLC analizleri ile kolayca görselleştirilir. Şekil 4A, M. bovis BCG, M. fortuitum ve M. brumae'de AG'lerin bulunduğunu, ancak M. apsesininpürüzsüz morfotipinde bulunmadığını göstermektedir. 1D-TLC, M. bovis BCG ve M. fortuitum'daPDIM varlığını önermekle birlikte, sadece M. bovis BCG'de 2D-TLC analizi yapıldığı zaman doğrulanmıştır (Şekil 4B). Tamamen, bu sonuçlar mikobakteriyen bir bileşiğin varlığını en az iki farklı elütion sistemi ile doğrulamanın önemini göstermektedir. Mikobakteri bileşiminde analiz etmek için bir başka ilginç lipit PGL'dir. Seçilen mikobakterilerde PGL sadece M. bovis BCG'de bulunur ve TLC kloroform ve metanolden (95:5) oluşan elüsyon sistemi ile elflendiğinde fark edilir(Şekil 4C). Daha fazla polar bileşenin görselleştirilmesi fikrinin ardından, sadece M. apse pürüzsüz morfotipinde bulunan GPL'lerin(Şekil 4D)varlığını izlemek için 90:10:1 (kloroform:metanol:su) karışımından oluşan elüasyon sistemi kullanılmıştır. Aynı TLC'de: PGL, trehalose dimycolate (TDM), acyl trehaloses (AT) ve trehalose monomycolate (TMM) de gözlenebilir. Elution sistemi 30:8:1 (kloroform:metanol:su)(Şekil 4E)oluştuğunda plakanın üst kısmında PGL, GPL'ler, TDM, AT da gözlenmiştir. TMM plakanın ortasında yer almaktadır. TDM ve TMM, incelenen tüm mikobakterilerde açıkça ifade edilmiştir. Plakanın altında fosfatidyl-inositol mannosides (PIM) gözlenmesine rağmen, PIM'leri analiz etmek için en iyi elution sistemi Şekil 5A,B'degösterildiği gibi 60:35:8 'dir(kloroform:metanol:su). Tüm şeker içeren lipitler antron ile ortaya çıkarken (Şekil 5A), PIM'ler özellikle Molibden Mavi reaktifi (Şekil 5B)ile ortaya çıkan fosfat grupları içerir. Mikolik asitler, AG ve PDIM'lere benzer şekilde, PIM'ler de 2D-TLC analizleri ile kolayca görselleştirilebilir (Şekil 5C). Ayrıca, LOS'ları sentezleyebilen mikobakterilerin analiz edilmesi durumunda, PIM'ler ve LOS'lar, Ren ve ark.8'de ayrıntılı olarak açık olduğu gibi, aynı 2B elution sistemi kullanılarak ayırt edilir.
Şekil 1: Katı ortamda yetişen mikobakterilerin lipit içeriğini çıkarma prosedürünün şeması. Mikobakteri hücrelerinde bulunan lipitleri deşifre etmek için ana adımlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Katı ortamda yetişen mikobakterilerin mikolik asit içeriğini çıkarma prosedürünün şeması. Mikobakteri hücrelerinde bulunan mikolik asitleri(A)asit metanolizi veya (B) saponifikasyonu kullanarak deşifre etmek için ana adımlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mikobakterilerden lipid ekstraksiyonunun temsili sonuçları. (A)85 mL n-heksam, artı 15 mL dietil eter (üç çalıştırma) ve (B) 100 mL dikloromethanede geliştirilen mikolik asitlerin ince katmanlı kromatografi (TLC) analizi. (C) Asit methanoliz ile çıkarılan mikolik asitlerin iki boyutlu TLC analizi ilk yönde 95:5 (n-heksen:aseton) (üç koşu) ve ikinci yönde 97:3 (toluen:aseton) olarak geliştirilmiştir. (D) İlk yönde 95:5 (n-hekzane:aseton) (üç koşu) ve ikinci yönde 97:3 (toluen:aseton) olarak geliştirilen saponifikasyon ile çıkarılan M. fortuitum'dan mikolik asitlerin iki boyutlu TLC analizi. TLC'ler etanolde% 10 molibdafosforik asit hidrat ile ortaya çıkarıldı ve ardından plaka 120 °C. M. bovis BCG Connaught'da ısıtıldı (Hat 1 ve 1'); M. fortuitum (Satır 2 ve 2'); M. abscessus pürüzsüz morfotip (Hat 3 ve 3') ve M. brumae (Hat 4 ve 4'). Asit metanolizi ile elde edilen 1-4 mikolik asit ve saponifikasyon ile elde edilen 1'-4' mikolik asit. Ben, α-mikolatlar; II, α'-mikolatlar; IV, ketomycolates; V, epoksimycolates. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Mikobakterilerden lipid ekstraksiyonunun temsili sonuçları. (A) 90:10'da geliştirilen asilglycerols (AG) ve phthiocerol dimycocerosates 'in (PDIM) TLC analizi (petrol eter (60-80 °C):d iethyl eter). (B) PDIM'lerin ve AG'nin iki boyutlu TLC analizi birinci yönde 98:2 (petrol eter (60-80 °C):etil asetat) (üç çalıştırma), ikinci yönde ise 98:2 (petrol eter (60-80 °C):aseton) olarak geliştirilmiştir. (C) Fenolik glikolipid (PGL) TLC analizi 95:5 'te (kloroform:metanol) geliştirilmiştir. (D) PGL, glikoeptidolipidler (GPL), trehaloz dimycolate (TDM), acyl trehaloses (AT) ve trehalose monomikolat (TMM) 90:10:1 (kloroform:metanol:su) içinde geliştirilen TLC analizleri. (E) PGL, GPL, AT, TMM ve fosfatidil-inositol mannosides (PIM) TLC analizi 30:8:1 (kloroform:metanol:su) geliştirilen. A-B-C, etanolde % 10 molibdatofosforik asit hidrat ile ortaya çıktı ve ardından plaka 120 ° C'de ısıtıldı. D-E, sülfürik asitte% 20 α-naftalin etanolinde% 5 ile ortaya çıktı ve 120 ° C'de ısıtıldı. Satır 1: M. bovis BCG Connaught; Satır 2: M. fortuitum; Satır 3: M. apse pürüzsüz morfotip; Satır 4: M. brumae. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Mikobakterilerden PIM'lerin temsili sonuçları. (A-B) 60:35:8'de geliştirilen PIM'lerin TLC analizi (kloroform:metanol:su). (C) pimlerin iki boyutlu TLC analizi ilk yönde 60:30:6 (kloroform:metanol:su) ve ikinci yönde 40:25:3:6 (kloroform:asetik asit:metanol:su) olarak geliştirilmiştir. A-C sülfürik asitte %1 anthrone ile ortaya çıktı ve ardından plaka 120 °C'de ısıtıldı. B fosfat bantları ortaya çıkana kadar Molibden Mavi reaktifi ile ortaya çıktı. Satır 1: M. bovis BCG Connaught; Satır 2: M. fortuitum; Satır 3: M. apse pürüzsüz morfotip; Satır 4: M. brumae. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikobakteri hücre duvarından yaygın olarak bağlı olmayan lipit bileşiklerinin çıkarılması için altın standart yöntem olarak kabul edilen basit bir protokol sunulmuştur. Dört farklı mikobakterinin çıkarılan lipitlerinden bir ve iki boyutlu TLC'ler tarafından daha fazla görselleştirme gösterilmiştir.
Mikobakteri hücrelerinin lipidik içeriğini kurtarmak için art arda iki kombine kloroform ve metanol karışımı en yaygın kullanılan çözücü karışımıdır23 , 24,25,26,27,28,29. Bu karışım, hücrelerden çok çeşitli apolar ve polar lipitlerin geri kazanılmasına izin sağlar. Bununla birlikte, literatürde hameed ve ark.29tarafından yakın zamanda gözden geçirilmiş olan toplam veya spesifik mikobakteri lipitlerini çıkarmak için başka bazı yöntemler tanımlanmıştır. Örneğin, Folch yöntemi, doku30'dan toplam mikobakteriyal lipitleri kurtarmak için geliştirilen en yaygın kullanılan protokollerden biridir ve ayrıca saf mikobakteri kültürlerine uyarlanmıştır. Kloroform:metanol (1:2) içinde mikobakteriyel hücrelerin askıya alınmasından, ardından santrifüjleme ve kloroform ilavesi ile 1:1 oranı elde etmekten oluşur. Son olarak, KCl özü31'dennonlipid bileşenleri kaldırmak için kullanılır. Buna paralel olarak, spesifik lipitleri çıkarmak için başka protokoller geliştirilmiştir. Slayden veark. özellikle TDM veya TMM32gibi glikolipidleri kurtarmak için kloroform:metanol artı aseton karışımı kullandı. Tamamen, yayınlanan yöntemler mikobakteriyel hücrelerin başta kloroform ve metanol olmak üzere farklı çözücü konsantrasyonlarına maruz bırakılmasına dayanmaktadır. Aynı şekilde, numunede bulunan diğer hücre bileşenlerini atmak için zaman zaman bazı tuzlar eklenir.
Yaygın olmayan bağlı lipitlere ek olarak, iki farklı işlemle mikolik asit ekstraksiyonu da gösterilmiştir. Asidik metanoliz, mikolik asitlerin daha az tehlikeli reaktiflerle kolayca çıkarılmasına izin verirken, saponifikasyon prosedürü, metanoliz işlemleri sırasında bölünen V tipi mikolik asit de dahil olmak üzere tüm mikolik asit türlerinin yapısını korur. Lipitler çıkarıldıktan sonra, 1D veya 2D-TLC bunları izlemek için standart yöntemlerdir ve kullanılan test lipitlerin fizikokimyasal özelliklerine bağlı olarak değişir. Her molekülün polaritesi ve büyüklüğü, mikobakterinin bir parçasını oluşturan lipitlerin belirlenmesine izin vererek ihtiyaç duyulan elüasyon sisteminin seçimini belirleyecektir. Mikobakteri lipitler arasındaki tutma faktörleri (Rf) farklı olduğunda tek boyutlu TLC seçilebilirken, 2D-TLC farklı lipitler moleküler ağırlık ve polarite özelliklerini paylaştığında görselleştirmeyi kolaylaştırır. Tanımlamayı kolaylaştırmak için, benzer Rf'yi karşılaştırmak için saflaştırılmış lipitler çıkarılan örneğe paralel olarak çalıştırılmalıdır. Bir lipitin tanımlanması, bilinen saflaştırılmış kontrol ile aynı Rf ile çalıştığında en az iki TLC sisteminde (iki farklı mobil faz) elde edilebilir. Saflaştırılmış lipitler ticari tedarikçilerden veya mikobakteriyel araştırma laboratuvarlarından temin edilebilir. Son olarak, molekülün biyokimyasal doğası, TLC plakalarını ortaya çıkarmak için hangi lekenin kullanılabileceğini gösterir. Karbon bağlarına bağlanırken herhangi bir organik bileşenin görselleştirilmesini sağlayan fosfobilybdic asit gibi evrensel boyama yöntemleri vardır. A-naftalin veya anthrone gibi diğerleri şeker kalıntılarına özel renkler sağlarken, molibden mavisi özellikle fosfat kalıntılarına bağlanır.
Mikobakterilerin lipit içeriğini analiz etmek için en önemli husus, organik çözücülerin plastikle teması numuneleri kirletebileceğinden ve TLC plakalarında gözlemlenebildiğinden, prosedürler boyunca plastik malzeme kullanımından kaçınmaktır. Ayrıca, mikobakteri yetiştiriciliği için kullanılan kültür orta bileşiminin yanı sıra sıcaklık veya kuluçka günlerinin, daha önce açıklandığı gibi her mikobakterinin lipit desenini değiştirebileceğini düşünmek de önemlidir16. Sıvı ve katı ortamda yetişen mikobakteriler, yaygın olmayan bağlı lipitleri veya mikolik asitleri çıkarmak için kullanılabilir. Sıvı kültüründen hücre elde ederken, numunede sıvı ortam bulunmasını önlemek için yeterince filtrelenmeli ve kurutulmalıdır. Ayrıca, sıvı ortamdan mikobakteriler kullanılırken, bakterilerin zaman içinde tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için deneyler arasında düzgün ve eşit şekilde yetiştirilmesi gerekir. Ayrıca, mikobakteriyal hücreler, mevcut makalede gösterdiğimiz gibi, en dış lipitlerin organik çözücüler kullanılarak kurtarılabileceği ve TLC tarafından izlenebileceği17, 33 ,34 , 35,36 peliküllerinde de yetiştirilebilir.
Mikobakteri lipit ekstraksiyon prosedürlerinin ana sınırlaması toksik çözücülerin güvenli koşullarda kullanımı olmaya devam etmektedir. TLC prosedürü, gaz kromatografisi veya yüksek performanslı sıvı kromatografisi gibi diğer tekniklere göre daha az hassastır. Ayrıca, TLC numunelerin ölçülmesine izin vermez ve çıkarılan bileşiklerin yapısını tanımlamak için daha fazla teknik uygulanması gerekir. Örneğin, lipid izomerlerini ayırt etmek için nükleer manyetik rezonans yapılması gerekir. Mikobakteri lipit yapısını ilk kez tanımlamak için kütle spektrometresi veya kızılötesi spektroskopi yapılması dikkat çekicidir. Bu nedenle, lipid sınıflarının nicel ve nitel analizi normalde yüksek veya ultra performanslı sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi37,38, 39 ,40gibi farklı ekstraksiyon, derivatizasyon, kromatografik ve algılama yöntemlerinin kombinasyonlarını gerektirir. Son çalışmalar, tek adımlı ince katmanlı kromatografi-alev iyonizasyon algılama tekniğinin kullanılmasının Actinobacteria41'demikolik asitlerin nicelleştirilmesine ve ön taramasına izin verdiğini göstermiştir. Bununla birlikte, TLC mikobakterilerin lipidik bileşimini taramak ve değerlendirmek için son derece kullanışlı, zaman kazandıran ve ucuz bir tekniktir. Genel olarak, burada sunulan prosedürler, mikobakteri hücrelerinin en alakalı özelliğini analiz etmek için temel araçlar sağlayan çok yönlüdür: karmaşık hücre duvarı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma İspanya Bilim, Yenilik ve Üniversiteler Bakanlığı (RTI2018-098777-B-I00), FEDER Fonları ve Catalunya Generalitat (2017SGR-229) tarafından finanse edildi. Sandra Guallar-Garrido, Generalitat de Catalunya'dan bir doktora sözleşmesinin (FI) sahibidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
References
- Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
- Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
- Jackson, M.
- Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).
- Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
- Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).
- Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).
- Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
- Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
- Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
- Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
- Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232 (2016).
- Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
- Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
- Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
- Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).
- Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
- Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
- Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , CPC Press. London, UK. 139-143 (1986).
- Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
- Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
- Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
- Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
- Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
- Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
- Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
- Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
- Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , Springer. Singapore. (2020).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
- Slayden, R. A., Barry, C. E.
- Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
- Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
- Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
- Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).
- Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB". Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
- Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
- Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).
