여기서는 종양 거동 분석, 전산 면역형화 및 공초점 이미징 정량화를 위한 xenografts 및 지침을 생성하는 팁과 함께 단계별 프로토콜을 제공합니다.
Zebrafish 애벌레 xenografts널리 생체 및 인간 암의 실시간 연구에서 수행 하는 암 연구에 사용 되 고. 항암 요법(화학요법, 방사선 요법 및 생물학), 혈관신생 및 단일 세포 해상도의 전이에 대한 반응을 빠르게 시각화할 수 있는 가능성은 제브라피시 이종이이식 모델을 임상 전 연구를 개발하기 위한 최고의 선택으로 배치합니다.
제브라피시 애벌레 제노이식 분석은 다른 모델에 비해 여러 가지 실험적인 이점을 제공하지만, 아마도 가장 눈에 띄는 것은 크기 규모의 감소와 결과적으로 시간입니다. 규모의 이 감소는 단하나 세포 화상 진찰을 허용하고, 상대적으로 적은 수의 인간 세포 (생검과 호환), 중간 처리량 약물 검진의 사용을 허용하지만, 가장 중요한 것은 분석의 시간의 상당한 감소를 가능하게한다. 이러한 모든 장점은 미래의 개인화 된 의학 응용 프로그램에 대한 제브라 피쉬 xenograft 분석이 매우 매력적으로 만듭니다.
많은 제브라피시 이노이식 프로토콜은 인간의 종양의 넓은 다양성으로 개발되었습니다; 그러나, 제브라피시 애벌레 제노이식을 효율적으로 생성하는 일반적이고 표준화된 프로토콜은 여전히 부족합니다. 여기서 우리는 종양 거동 분석, 전체 마운트 면역 형광 및 공초점 이미징 정량화를 위한 xenografts 및 지침을 생성하는 팁과 함께 단계별 프로토콜을 제공합니다.
Zebrafish (Danio rerio)는 발달과 질병을 연구하는 강력한 척추 동물 모델 유기체로 부상하고 있습니다. Zebrafish는 매우 보존된 유전(~70% 유전상동성 및 ~84% 질병 관련 유전자)과인간1,2와기본 기관 형태학적 특징을 공유합니다. 이 보존은 제브라피쉬를 사용하여 암3,4를포함한 여러 인간 질환을 모델링할 수 있습니다.
제브라피쉬의 취급 및 유지보수는 생쥐보다 훨씬 쉽고 비용 효율적이며, 일년 내내 높은 배설도, 외장 수정3,5로인해 더욱 효과적이다. Zebrafish 배아는 생애 첫 5-7일 동안 생수급을 필요로 하지 않으며 발달, 감염 및암1,4,6,7을위한 효과적인 모델로 사용되어 왔다. Zebrafish 배아는 48시간 후 수정(hpf)에서 부화하고 모든 장기가 형성된 자유로운 수영 동물이며, 심장과 기능순환 시스템, 간, 뇌, 신장 골수등이다. 또한, 이 단계에서는 선천성 면역만이 작용하고 있으며, 적응성 면역력이 여전히 발달하고 있어면역절돌연변이7,8을사용할 필요 없이 인간 세포의 일반적인 효율적인 이식을 가능하게 한다. 그럼에도 불구하고, 모든 인간 세포가 동등하게9로 이식되는 것은 아니며, 예를 들어 백혈병 세포의 경우 식세포(호중구 및 대식세포)가 효율적인 생생을 위해고갈되어야 한다는 것을 보여주었다.
제브라피시 유전적 관성과 초기 배아 단계의 광학적 투명성은 고해상도로 단일 세포 내 인트라비티드 이미징을 허용하므로 다양한 생물학 분야에서 최첨단 이미징 기술을 수립할 수 있습니다. 더욱이, 암의 맥락에서, 이러한 특징은 혈관신생 및 전이성 전이성 전위, 그리고 타고난 면역계통과의상호 작용8,9,11,12,13과의상호 작용과 같은 숙주 종양 상호 작용의 초기 단계의 실시간 연구에 유용하다.
짧은 이노크소식분석에서 전이성 “진화”에 대한 시간이 없지만 종양 세포의 전이성 용량을 분석할 수 있습니다(즉, 침략, 흡폐, 순환 생존, 사치, 식민지화 와 같은 전이성 단계를 거치도록 하는 효율성, 따라서 생체 내 및 본래8,11,14)
그 수명 주기의 특성은 암에서 개인화 된 의학을위한 독특한 모델로 제브라피쉬를 배치합니다. 아세이는 짧은 시간 범위에서 수행될 수 있으며, 몇 주7,8,9,11,12,15,16에서얻은 결과를 얻을 수 있다. 이 assays의 셀러리티와 타당성은 의사와 연구원에게 시간이 필수적인 필수 인 암 환자에게 유용 할 수있는 번역 결과를 얻을 수있는 가능성을 제공합니다.
성공적인 제브라피시 배아 이종이이식생성시도가 증가하고 있음에도 불구하고, 주사 후 세포 생존가능성 및 종양 행동의 평가뿐만 아니라 주사 절차의 표준화에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
이 프로토콜에서 우리는 제브라피시 배아에 있는 인간 암 세포 주사제 및 후속 고정, 면역 염색, 화상 진찰 및 종양 세포 행동의 정량화를 위한 명확하고 상세한 단계별 가이드를 연구원에게 제공합니다.
암 개발 및 약물 검진의 모델로서제브라피쉬의 중요성이 증가함에 따라 수많은 간행물3,4,7,13,14,16,18,19,20,21이발생했다. 그러나, 제브라피시 배아에 있는 암세포의 주입은 연구원을 위해 도전할 수 있는 손재주성의 높은 수준을 요구하는 기술입니다. 이 프로토콜에서 우리는 제브라피시 배아 xenografts를 설치하는 초기 도전을 극복하는 데 도움이 될 수있는 실용적인 정보와 몇 가지 팁을 제공하는 것을 목표로합니다.
세포 취급 사전 주입
세포주를 가진 제브라피시 제노이식의 생성을 위한 이 최적화된 프로토콜은 상이한 형태를 가진 다양한 유형의 (암) 세포에 적응될 수 있다. 제브라피시 제노이식에 사용되는 모든 세포주는 마이코플라즈마가 없는 것이 좋습니다. 다른 세균 오염과 달리, 세포 배양에 마이코플라즈마의 존재는현미경(22)에서쉽게 검출될 수 있는 변화를 생성하지 않는다. 마이코플라즈마 오염은 세포주 이식 잠재력, 약물에 대한 민감성, 제브라피시 배아의 생존가능성에 영향을 미칠 수 있습니다.
세포가 장기간 계속 증식할 수 있지만 표현형과 유전자형은 변화에 취약할 수 있습니다. 배양시 세포주의 형태와 행동에 익숙해지는 것이 중요합니다. 재현 가능한 결과를 얻으려면 3-12 사이를 해동한 후 세포 구절수를 유지하는 것이 좋습니다. 따라서, 정기적인 마이코플라즈마 테스트는 수행되어야 한다.
세포는 로그 단계에 있어야 합니다(합류 ~70% 전에 기하급수적 성장 단계) 주사 당일. 이것은 종양의 특유한 특징의 적당한 이식 및 적당한 발달을 가능하게 할 것입니다. 이노이식 내 세포의 표현형의 변이를 방지하기 위해 실험 사이에 분사 상수를 유지하는 것이 중요합니다. 주입된 세포의 수는 제브라피시 배아에서 번창하기 위하여 주사의 더 높은 밀도를 요구할 수 있기 때문에 각 세포주의 특성에 적응될 수 있습니다.
셀 라벨링 고려 사항
주사 및 미래 분석을 위해 인간 종양 세포를 더 잘 시각화하기 위해 종양 세포는 형광 염료로 표시 될 수 있습니다. 세포 크기의 차이로 인해, 부착 배양에서 세포 /cm2의 총 수는 세포주마다 다릅니다. 이것은 염색 프로토콜의 효험뿐만 아니라 주입을 위해 수확된 세포의 수에 영향을 미칩니다. 플라스크당 낮은 숫자를 산출하거나 클러스터(즉, BFTC905)에서 성장하는 큰 셀은 단일 실험을 위해 여러 플라스크의 풀링이 필요합니다. 이 경우, 세포의 염색은 과도 한 양의 염료 (높은 비용)의 사용을 일으킬 수 있으므로 플라스크에서 직접 수행해서는 안됩니다. 한편, 원심분리의 과도한 주기에 매우 민감한 세포뿐만 아니라 플라스크당 높은 숫자를 산출하는 세포(즉, HCT116)는 플라스크에 직접 염색한 다음 EDTA/셀 스크레이퍼로 분리될 수 있습니다(자세한 내용은 표 1참조).
가능하면 효소 접근법을 사용하는 대신 EDTA를 사용하여 주입 당일 세포를 분리하여 세포세포 접합부를 보다 신속하게 복구하고 원심 분리 단계를 덜 수행합니다. 그럼에도 불구하고, 세포가 EDTA에 민감하다면 클러스터에서 매우 응집되거나 자라는 경우 효소 방법을 적용할 수 있습니다. 주사 배지뿐만 아니라 주사에 대한 이상적인 농도의 최적화는 각 세포주의 특성에 따라 달라지므로 일부 조정이 필요할 수있습니다(표 1).
미세 주입 교정
제브라피시 배아로 올리고뉴클레오티드 또는 약물을 전달하는 것과는 달리, 잎이 트개 이식을 위해 세포주로 작업할 때 그레이티쿨은 바늘을 보정하는 데 사용되지 않습니다. 주입 하는 동안 몇 시간 후, 세포 는 막히기 시작 됩니다., 그리고 그것의 직경을 증가 하거나 바늘을 완전히 변경 하는 바늘의 끝을 잘라 필요. 이 절차는 무상 교정을 방해합니다.
이 문제를 해결하기 위해, 분배된 세포의 수는 1-3 펄스 내의 배아 눈과 유사한 크기에 도달하는 데 필요한 방출 압력 및 시간에 의해 조절됩니다. 이어서, 종양 크기를 추가로 조절하기 위해, 1dpi에서, xenografts는 도 6 B-B에도시된 바와 같이 종양 크기에 따라 분류된다” . 도 6C 예제에서 와 같이, 선별의이 방법은 종양 크기의 변화를 줄이는 데 효율적입니다 : 우리가 그들 모두를 함께 풀경우 (+, ++, +++++) STEV는 ++클래스의 두 배 (~906 세포 ~ ~ 422 세포) 및 계수 변동은 ++클래스의 14,5 %에 비해 ~31.9 %입니다. 주입에 대한 참조는 부피이기 때문에 셀 유형 마다 셀 의 총 수가 많이 다릅니다 – 세포의 크기와 모양에 의존합니다. 예를 들면, 유방암 Hs578T 같이 세포질이 많은 큰 세포는, 훨씬 더 작은 종양 (~600 세포)를 일으킵니다. 또한, 각 세포주 세포의 다른 수를 필요로한다. 예를 들어, HT29 CRC 및 RT112 오줌 방광암 세포주는 주입된 세포의 수가 높을수록 제브라피시 사망률이 높다는 것을 보여주었습니다. 따라서, 세포주가 배아에 독성 효과가 있거나 주사밀도가 더 높거나 더 낮은 지밀도가 필요한지 테스트하기 위해서는 이종이이식을 개발하는 동안 최적화기간이 필요하다.
사출 사이트
제브라피시 배아 제노이식을 생성할 때 가장 흔한 불일치 중 하나는 주사 부위입니다. 노른자는 일반적으로 쉽게 접근성으로 인해 주입을위한 장소입니다. 그러나, 우리는 노른자에서 주입된 세포가 정지하는 더 높은 경향이 있다는 것을 관찰했습니다. 기술적으로 더 어렵지만, 우리는 PVS에 가능한 한 심장에서 주입하는 것이 좋습니다. PVS 내에서, 세포는 전이성 특성8,11을표시하는 경우에, 혈관 및 면역 세포를 집계하고, 결합하고, 사치시키고, micrometastasis를 형성할 수 있다.
이식 효율
4dpi에서 세포주 중 이식 효율 및 종양 크기의 차이는 기저 세포 사멸/생존/증식의 뚜렷한 정도뿐만 아니라 각 세포선이9를표시할 수 있는 타고난 면역원성 으로 인해 예상된다.
전이
전이는 두 임의단계로 나눌 수 있는 다단계 이벤트 로 구성됩니다. 첫 번째 단계에서 종양 세포는 1 차 부위에서 분리하고 인접한 조직을 마이그레이션및 침입한 다음 혈류로 침입해야합니다. 두 번째 단계에서, 종양 세포는 순환에서 살아 나야하며 혈액 이나 림프관에서 사치스럽게 만들고, 마지막으로 이차 부위(23)에서식민지화해야합니다. 이 초기 및 늦은 사건을 구별하고 이 단계를 수행하기 위하여 다른 종양 세포의 잠재력/숙련도를 다루기 위하여, 우리는 간단한 분석기를 디자인했습니다.
일반적으로, PVS에 주입될 때, 종양 세포는 순환으로 직접 입력한 다음 카우달 조혈 조직(CHT)(TAIL region)에 물리적으로 갇힐 수 있다. 그러나, 각 종양 세포의 특성에 따라 – 우리는 몇몇 종양 세포가 CHT 4 dpi에 남아 있고 그밖 종양 세포가 사라지는 동안 micrometastasis를 형성할 수 있다는 것을 보았습니다 (CHT에 붙잡힌 후에 삭제).
따라서, 세포가 순환에 직접 배치되었을 때 미세 전염 효율(4dpi에서)을 비교하여 – CIRC (세포는 전이의 늦은 단계를 거쳐야만) 대 하지 않을 때 – NO CIRC (세포는 미세 전이를 형성할 수 있는 초기 및 후반 단계를 통과해야 합니다)를 초기 또는 후기 metastatic 잠재력을 평가할 수 있습니다. 우리는 두 그룹 (CIRC 및 NO CIRC)에서 CHT에서 마이크로 메타아시스를 효율적으로 형성 할 수있는 종양 세포를 관찰했으며, 이러한 세포는 전이성 캐스케이드 (SW480 및MDA-MB-468)의 모든 단계를 겪을 수있는 능력을 가지고 있음을시사8,11. 대조적으로, 다른 종양 세포는 두 단에서 매우 낮은 전이성 전위력을 가지며, 거의 마이크로메타시스를 만들지 않으며, 혈중 (즉, 24 hpi에서 CHT에서 볼 수 있지만 4 dpi에서 더 이상 존재하지 않는다, Hs578T)8. 그러나, 우리는 명확하게 다른 단을 찾아냈습니다 – 순환에 주입될 때 단지 micrometastasis를 형성할 수 있는 하나 (우리는 CIRC 단에 있는 micrometastasis를 관찰할 수 있습니다). 이것은 이 세포가 전이성 폭포의 첫번째 단계를 수행하는 저효율을 가지고 있다는 것을 건의합니다 그러나 다른 한편으로는 순환에서 살아남을 수 있고, 사치화하고 먼 사이트를 식민지화할 수 있습니다.
면역 염색 및 이미징
고정하기 전에, 이 주입 프로토콜은 살아있는 차등 간섭 대조 (DIC) 현미경 검사법, 회전 디스크 현미경 검사법, 고해상도 라이브 공초점 화상 진찰 및 광시트 현미경 검사법과 같은 그밖 살아있는 화상 진찰 접근에 사용될 수 있습니다.
죽은 세포와 세포 파편은 형광 스테레오 현미경을 통해 관찰될 때 밝게 나타나고 연구 결과의 목적이 세포주의 전이성 잠재력을 평가하는 경우에 특히 살아있는 세포로 착각될 수 있습니다. 우리는 종양과 미세 메타염의 생존 상태를 평가하기 위해 특정 생존 마커 및 DAPI와 함께 공초점 이미징수행의 중요성을 강조하고 싶습니다. 또한, 특정 인간 항체를 사용하여 항인간 미토콘드리아 또는 항인간 HLA와 같은 인간 세포를 검출하는 것이 기본이다. 프로토콜을 구현할 때, 스테레오현미경의 염색을 공초점 이미지와 비교하여 실험자의 눈을 훈련시다. 몇 시간 후, 실험자는 형광 스테레오 현미경의 살아있는 세포와 파편을 명확하게 구별 할 수 있습니다.
전체 형광 영역과 같은 종양 부담을 정량화하는 다른 방법이 널리 사용되지만, 보다 정확한 방법으로 전체 마운트 면역 염색 및 공초점 이미징을 수행하는 것이 좋습니다. 뿐만 아니라 지방 성 염료 염색의 효율은 매우 가변 (즉, 일부 세포는 매우 잘 얼룩진 반면 다른 사람은 -아마 그들의 막의 지질 함량으로 인해), 뿐만 아니라 여러 번 지방 혈성 염료 형성 집계, 죽은 세포는 밝은 경향이 – 살아있는 세포에 대한 오해 될 수있는 여러 유물을 만드는.
세포는 그들의 추적에 원조하고 세포 라벨을 건너 뛰기 위하여 형광 단백질로 변환될 수 있습니다. 그러나, 변환된 및 비변환된 세포가 제브라피시 제노이식에서 동일한 결과를 생성하는지 확인하십시오.
또한, 대식세포는 이러한 형광 세포 파편이 형광으로 표시되고 이동하여 거짓 양성 전이성 세포를 생성할 수 있습니다. 따라서 종양 행동의 보다 정확한 해석을 위해 여러 가지 다른 판독도구로 확장 될 수있는 일련의 분석 도구를 권장합니다.
DAPI 카운터스테인링과 대조암세포 HCT116의 Z 스택(직경 10-12 μm의 평균 핵 크기)에서 슬라이스 사이에 5μm 간격을 갖는 공초점 획득을 위해, 세포의 ~50%가 2개의 연속슬라이스 사이에서 공유되는 것을 관찰하였다. 따라서 모든 슬라이스가 계산되면 동일한 셀을 두 번 계산할 위험이 높습니다. 정량화의 문제를 피하기 위해 슬라이스 사이를 오가면 시간이 많이 걸리고 오류가 발생하기 쉬운 기술이 발생합니다. 총 세포 수의 정량화를 용이하게 하고 연구자 들 간의 더 많은 재현성을 허용하기 위해, 우리는 이전에 이프로토콜8에기술된 종양 크기 공식을 만들었습니다.
우리는 슬라이스 사이에 공유 된 ~50 %의 세포를 설명하기 위해 보정 번호 (1.5)를 포함했습니다. 우리는 연구원 사이 전체 종양의 수동 계산의 평균 오류가 20%이었다는 것을 것을을 발견했습니다. 포뮬러를 사용하는 두 명의 연구원은 2%의 오차를 가지고 있었습니다. 이 포뮬러의 사용은 93%의 정확도와 98%의 재현성률을 가지고 있습니다. 또한 자동화된 메서드를 테스트했지만 임계값 설정으로 인해 50% 이상의 오류를 보여 주였습니다.
세포 세포의 특성으로 인해 활성화된 Caspase 3 세포의 정량화가 더 어렵습니다. 결과의 실수와 변화의 수를 줄이기 위해, 우리는 제어 및 실험 샘플이 동일한 연구원에 의해 계산하는 것이 좋습니다. 또한,이 기술을 배울 때, 새로운 연구원은 이미 결과와 훈련을 비교하기 위해 경험이 풍부한 연구원에 의해 정량화 된 이미지를 계산해야합니다.
필요한 경우 분석의 길이를 연장할 수 있습니다. 그러나, 제브라피시 애벌레는 ~7일 후 수정(5일 후 주입)부터 생수급이 필요하다는 점을 고려하는 것이 중요하다. 또한, 6일 이상 유충에 적용되는 동물복지 지침 및 규정은 변할 수 있다.
이 프로토콜은 단일 연구원이 시간당 약 ~ 200-300 제브라피어 애벌레를 주입 할 수있는 유용한 도구를 제공합니다. 분석 및 통계 해석을 포함한 전체 분석 결과에 대한 결과는 3주 만에 수득됩니다. 우리는 이 프로토콜이 연구원이 제브라피시 제노이식생성에 있는 전문가가 되는 것을 도울 수 있기를 바랍니다. 그것은 쉽지 않다; 연습을 해야 하지만 거기에 도착 합니다. 행운을 빌어!
The authors have nothing to disclose.
우리는 샴페인 마우드 재단, 콘겐토 (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, FCT / 리스보아2020에 의해 공동 자금 조달)에 감사드립니다. 부사장FCT 펠로우십(SFRH/BD/118252/2016), MML(PD/BD/138203/2018). 중요한 토론을 위한 Fior Lab의 모든 구성원; B. 코스타와 C. 레벨로 드 알메이다 데이터 공유; 그리고 우리의 실험실 구성원 C. 레벨로 드 알메이다, M. 바로소와 L. 라이트 비디오에 참여. CF 피쉬 시설(C. 세르탈, J. 몬테이로 등)과 샴페인 커뮤니케이션, 이벤트 및 아웃리치 팀에게 환상적인 영화 제작에 대한 알렉산드르 아진헤이라와 카타리나 라모스와 테레사 페르난데스의 도움을 부탁드립니다.
Agar for bacteriology | VWR | 97064-336 | Agar plate |
anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) | Cell Signalling Technologies | 9661 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti-human HLA (Rabbit monoclonal) | Abcam EP1395Y | ab52922 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti- 488 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35552 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
anti- 594 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35560 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher Scientific | C34565 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
CellTracker Green CMFDA Dye | ThermoFisher Scientific | C2925 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Conical Centrifuge tube 50mL | VWR | 525-0610 | |
Conical Centrifuge tube 15mL | VWR | 525-0604 | |
DAPI | Nuclear and chromosome counterstain | ||
Laser-Based Micropipette Puller P-2000 | Sutter-Instrument | Micropipette Puller | |
Microcentrifuge tube 1.5mL | Abdos | P10202 | |
Microscope slides, cut edge | RS France | BPB016 | Slides for mounting |
Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Mounting medium |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | Microinjector |
Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | Coverslips for mounting |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | Agar plate |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | Borosilicate capillaries |
TrypLE | Gibco | 12605036 | Enzymatic detachment solution |
Vaseline | Petroleum jelly for slide sealing | ||
Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | ThermoFisher Scientific | V22886 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology | ZEISS | Fluorescence Stereo Zoom Microscope | |
Zeiss LSM 710 | ZEISS | Confocal microscope |