Summary
Hier bieten wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll mit Tipps zur Generierung von Xenografts und Richtlinien für die Tumorverhaltensanalyse, die Immunfluoreszenz mit voller Montätralisierung und die konfokale Bildgebungsquantifizierung.
Abstract
Zebrafisch Larven Xenografts sind weit verbreitet für die Krebsforschung verwendet, um in vivo und Echtzeit-Studien über menschlichen Krebs durchzuführen. Die Möglichkeit, die Reaktion auf Krebstherapien (Chemo, Strahlentherapie und BiologischeS), Angiogenese und Metastasen mit einzelliger Auflösung schnell zu visualisieren, stellt das Zebrafisch-Xenograft-Modell als Top-Wahl für die Entwicklung präklinischer Studien.
Der Zebrafisch Larven-Xenograft-Assay bietet mehrere experimentelle Vorteile im Vergleich zu anderen Modellen, aber wahrscheinlich ist der auffälligste die Reduzierung der Größe Skala und folglich Zeit. Diese Reduzierung der Skala ermöglicht einzellige Bildgebung, die Verwendung einer relativ geringen Anzahl von menschlichen Zellen (kompatibel mit Biopsien), mittel-hohen Durchsatz-Arzneimittel-Screenings, aber vor allem ermöglicht eine signifikante Verkürzung der Zeit des Assays. All diese Vorteile machen den Zebrafisch Xenograft Assay extrem attraktiv für zukünftige personalisierte Medizinanwendungen.
Viele Zebrafisch Xenograft Protokolle wurden mit einer großen Vielfalt von menschlichen Tumoren entwickelt; Ein allgemeines und standardisiertes Protokoll zur effizienten Erzeugung von Zebrafischlarven-Xenografts fehlt jedoch noch. Hier bieten wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll mit Tipps zur Generierung von Xenografts und Richtlinien für die Tumorverhaltensanalyse, die Immunfluoreszenz mit vollwertigen Modulen und die konfokale Bildgebungsquantifizierung.
Introduction
Zebrafische (Danio rerio) entwickeln sich zu einem mächtigen Wirbeltiermodell, um Entwicklung und Krankheit zu untersuchen. Zebrafish hat hochkonservierte genetische Merkmale (70 % genetische Homologie und 84 % krankheitsbedingte Gene) und grundlegende organmorphologische Merkmale mit dem Menschen1,2. Diese Konservierung ermöglicht die Verwendung von Zebrafischen, um mehrere menschliche Krankheiten zu modellieren, einschließlich Krebs3,4.
Die Handhabung und Wartung von Zebrafischen ist viel einfacher und kostengünstiger als Mäuse aufgrund ihrer geringen Größe, hohe Fruchtbarkeit das ganze Jahr über und externe Düngung3,5. Zebrafisch-Embryonen benötigen keine live-Fütterung während ihrer ersten 5-7 Tage des Lebens und wurden als effektives Modell für Entwicklung, Infektion und Krebsverwendet 1,4,6,7. Zebrafisch-Embryonen schlüpfen 48 Stunden nach der Befruchtung (hpf) und sind freischwimmende Tiere mit allen Organen gebildet, ein schlagendes Herz und funktionelles Kreislaufsystem, Leber, Gehirn, Nierenmark, etc.1,3. Auch in diesem Stadium der Entwicklung ist nur angeborene Immunität im Spiel, adaptive Immunität ist immer noch entwicklung, so dass eine allgemeine effiziente Transplantation von menschlichen Zellen ohne Notwendigkeit für die Verwendung von immungeschwächten Mutanten7,8. Dennoch ist es wichtig zu beachten, dass nicht alle menschlichen Zellen gleich9 engraft werden und dassz.B.bei Leukämiezellen gezeigt wurde, dass Phagozyten (Neutrophile und Makrophagen) für eine effiziente Engraftmentierung erschöpft werden müssen 10 .
Die genetische Traktionsfähigkeit des Zebrafischs und die optische Transparenz seiner frühen embryonalen Stadien ermöglichen eine intravitale Einzelzellbildgebung mit hoher Auflösung und damit die Etablierung modernster Bildgebungstechniken in verschiedenen Bereichen der Biologie. Darüber hinaus sind diese Merkmale im Zusammenhang mit Krebs nützlich für Echtzeitstudien der frühesten Stadien von Wirtstumor-Wechselwirkungen, wie die Untersuchung des angiogenen und metastasierenden Potenzials, sowie Interaktionen mit dem angeborenen Immunsystem8,9,11,12,13.
Obwohl im kurzen Xenograft-Test keine Zeit für metastasierende "Evolution" bleibt- ist es möglich, die metastasierende Kapazität der Tumorzellen zu analysieren (d.h. ihre Effizienz, durch metastasierende Schritte wie Invasion, Intravasation, Überleben im Kreislauf, Extravasation und Kolonisation zu gehen und daher diese Prozesse in vivo und in Echtzeit8,11,13,14)zu untersuchen.
Die Eigenschaften seines Lebenszyklus stellen den Zebrafisch als einzigartiges Modell für die personalisierte Medizin bei Krebs. Assays können in einer kürzeren Zeitspanne durchgeführt werden und Ergebnisse erhalten in ein paar Wochen7,8,9,11,12,15,16. Die Höhe und Durchführbarkeit dieser Assays bieten Ärzten und Forschern die Möglichkeit, translationale Ergebnisse zu erhalten, die für Krebspatienten nützlich sein können, für die Zeit ein wesentliches Bedürfnis ist.
Trotz der zunehmenden Versuche, erfolgreiche Zebrafisch-Embryo-Xenografts zu erzeugen, besteht nach wie vor Bedarf an der Standardisierung des Injektionsverfahrens sowie der Bewertung der Zelllebensfähigkeit und des Tumorverhaltens nach der Injektion.
In diesem Protokoll bieten wir Forschern eine klare und detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Injektion menschlicher Krebszelllinien in Zebrafischembryonen und anschließende Fixierung, Immunostainierung, Bildgebung und Quantifizierung des Tumorzellverhaltens.
Protocol
Das Zebrafischmodell (Danio rerio) wurde gemäß den Standardprotokollen der Europäischen Tierschutzgesetzgebung, der Richtlinie 2010/63/EU (Europäische Kommission, 2016) und der Champalimaud Fish Platform behandelt und gepflegt. Alle Protokolle wurden vom Champalimaud Animal Ethical Committee und den portugiesischen institutionellen Organisationen -ORBEA ('gréo de Bem-Estar e'téica Animal/Animal Welfare and Ethics Body) und dGAV (Dire'o Geral de Alimenta'o e Veterin'ria/Generaldirektion für Lebensmittel und Veterinärwesen) genehmigt.
HINWEIS: Bevor Sie mit dem Hauptexperiment beginnen, üben Sie mit der zellgebundenen Zelllinie HCT116 des menschlichen Dickdarmkrebses (CRC). Diese Zelllinie ist leicht zuzubereiten (hoch proliferativ), leicht zu injizieren und engraftt sehr effizient (ca. 95-100%). Beginnen Sie mit Zellen in überschüssigen (ca. 12x106 Zellen, T-75 Kolben) und überschüssigem Fisch (400 Fische) bis zur Beherrsung der Technik, da viele Zellen und Fische während des Trainings verloren gehen. Die Experimentatoren sind bereit, sobald die Transplantation von 95 % in HCT116 Xenografts erreicht ist. Siehe Abbildung 1 für einen Schaltplan des vollständigen Protokolls.
1. Einrichten der Injektion
- Zwei Wochen vor der Injektion zellenin kulturerweitern (siehe Tabelle 1 für eine detaillierte Anleitung des optimalen In-vitro-Konfluences zur Injektion mehrerer Zelllinien).
- Drei Tage vor der Injektion, überqueren Sie die Zebrafische des gewünschten Hintergrunds.
2. 24 h vor der Injektion
- Reinigen Sie die Zebrafisch-Embryoplatten (entsorgen Sie alle toten und nicht entwickelten Embryonen) und erfrischen Sie E3 medium.
- Entsorgen Sie im Zellkulturraum das Zellkulturmedium aus den für die Injektion geplanten Kolben, waschen Sie einmal mit 1x Phosphat-gepufferter Saline (PBS), um die abgestorbenen Zellen zu entfernen und frisches Medium hinzuzufügen.
- Bereiten Sie die Werkzeuge für das Injektionsverfahren vor, wie z. B.: Mikroinjektionsnadeln, Agaroseplatten und Haarnadeln, um Embryonen für die Injektion auszurichten (Abbildung 2A-D, unten beschrieben).
- Mikroinjektionsnadeln (Abbildung 2A)
- Verwenden Sie Borosilikatglaskapillaren (4 Zoll, OD 1,0 mm, Kein Filament in einem Mikropipette-Zieher (Wärme: ≈500; fil: 10; vel: 50; dec: 60; ziehen: 100).
- Plattenvorbereitung (Abbildung 2B)
- 2% Agarose in H2O vorbereiten, erhitzen und eine Schicht gelöster Agarose in den Deckel einer sauberen Petrischale gießen. Lassen Sie es polymerisieren und mit Hilfe eines Lineals, machen drei bis vier gerade Agarose Linien für die Ausrichtung der Embryonen.
- Haarnadelbaugruppe (Abbildung 2C-D)
- Legen Sie 1 Haar in ein Glaskapillarrohr und lassen Sie ca. 1 Zentimeter Haar außerhalb des Rohres zurück.
- Die Außenspitze des Haares mit Hilfe von Zangen in das Glaskapillarrohr, das eine Schleife von 0,5 mm Länge bildet, zu krümmen.
- Versiegeln Sie den Rand des Kapillarrohres mit einem Tropfen Nagellack. Dies wird auch helfen, die Schleife an Ort und Stelle zu beheben. Lassen Sie es trocknen. Wiederholen Sie den Vorgang am anderen Rand des Rohres.
- Schneiden Sie ein Stück elektrisches Klebeband (widerstandsfähiger, undurchlässig und starrer als normales Klebeband).
- Versiegeln Sie das Band um die Kapillare, um es vor dem Bruch zu schützen.
- Mikroinjektionsnadeln (Abbildung 2A)
3. Injektionstag
- Trennen Sie die geschlüpften Embryonen von ungeschlüpften Eiern. Die Zugabe von 1x Pronase (0,6 mg/ml, Tabelle 3) zum Embryomedium in diesem Stadium kann das Schlüpfen verstärken. Legen Sie die Embryonen bis zur Injektion in den Inkubator (bei 28 °C).
HINWEIS: Lassen Sie die Embryonen nicht länger als 1 Stunde in der Pronaselösung, da das Enzym auf die geschlüpften Embryonen wirkt und ihr Sterblichkeitsrisiko erhöht. Stellen Sie sicher, dass das Entwicklungsstadium der Embryonen dem 48-Hpf entspricht (Abbildung 3A, A'), um das Risiko von Ödemen und Sterblichkeit zu vermeiden. - Bereiten Sie 1x Tricaine (aus einem 25x Lager) vor.
HINWEIS: Ein detailliertes Rezept finden Sie in Tabelle 3 und im Zebrafish Information Network - ZFIN Webseite17.
4. Zelletikettierung zur Injektion
HINWEIS: Die Kennzeichnung der Zellen kann entweder direkt in einem Kolben oder in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr nach enzymatischer Ablösung erfolgen. Weitere Informationen finden Sie unter Diskussion.
- Entfernen Sie das Zellkulturmedium und waschen Sie den Kolben zweimal (2x) mit 1X PBS.
- Beschriften Sie die Zellen mit einem lipophilen Farbstoff der Wahl entweder direkt im Kolben (2 ml Lösung/T75 Kolben) oder in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr nach enzymatischer Ablösung. Vermeiden Sie die Exposition gegenüber Licht und brüten Sie Zellen bei 37 °C (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2 für Bedingungen/Lösungen).
- Wenn die Etikettierung im Kolben
- Entfernen Sie den Farbstoff, waschen Sie ihn mit 1x PBS und lösen Sie die Zellen mit EDTA und einem Zellschaber.
- Übertragen Sie Zellen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge für 5 Minuten bei 300 x g dann zu Schritt 4.5 gehen.
- Bei Etikettierung im 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr:
- Zentrifuge 5 Minuten bei 300 x g, um den Farbstoff zu entfernen und den Überstand zu entsorgen. In 1x PBS zum Waschen aufladen.
- Zentrifuge 5 Minuten bei 300 x g und dann zu Schritt 4.5.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit Zellkulturmedium wieder auf (für ein 50-L-Pellet-Add-150-200-L-Medium).
- Quantifizieren Sie die Zelllebensfähigkeit mit einer Neubauer-Kammer mit Trypan-Blauausschluss oder einer anderen Methode ihrer Wahl.
- Zentrifugieren Sie 4 Minuten bei 300 x g und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellen im Injektionsmedium wieder aus.
HINWEIS: Die empfohlene Zellkonzentration (im Allgemeinen von 0,25-0,5x106 Zellen/L) und Medium findet sich in Tabelle 1. - Von diesem Punkt an, halten Sie die Zellen auf Eis.
5. Injektionsverfahren
- Anästhetisieren Sie die Embryonen in 1x Tricain für 5 Minuten.
- Mit einer Pasteur-Pipette aus Kunststoff eine kleine Menge anästhesierter Embryonen auf die Agaroseplatte übertragen und mit Hilfe einer Haarnadelschlaufe sorgfältig ausrichten. Achten Sie darauf, den Abstand zwischen den Embryonen zu halten, insbesondere zwischen dem Eigelb eines und dem Kopf des nächsten (Abbildung 4A).
HINWEIS: Die Anzahl der zu richtenden Embryonen variiert je nach dem Sachverstand des Forschers, der die Injektionen durchführt. Beginnen Sie mit ein paar (ca. 10-20). Für einen Schaltplan der korrekten Positionierung der Embryonen in der Agar/Agarose-Platte siehe Abbildung 4A. - Stellen Sie sicher, dass die ausgerichteten Embryonen nicht in der Agaroseplatte austrocknen, um die Sterblichkeit zu verhindern, indem Sie der Platte sorgfältig 1-3 Tropfen 1x Tricain-Lösung hinzufügen.
- Tippen Sie leicht auf das Mikrozentrifugenrohr, um die Zellen wieder aufzuhängen. Die Injektionsnadel mit der Zellsuspension mit einer Mikroladerspitze zurückladen, die Luftblasen vermeidet, da sie die Integrität der Embryonen beeinträchtigen können.
- Öffnen Sie das Luftdruckventil (40 psi), stellen Sie den Mikroinjektor ein und legen Sie die Mikroinjektionsnadel vorsichtig in den Halter.
HINWEIS: Verwenden Sie die folgenden empfohlenen Mikroinjektor-Einstellungen: Haltedruck - Entlüftung (3 psi); Auswurfdruck - Entlüftung; Reichweite - 100 ms. - Schneiden Sie die Mikroinjektionsnadel in der Nähe der Spitze mit Dumont Zange #5 oder ähnliches unter dem Stereomikroskop.
HINWEIS: Die Spitze muss stumpf und dünn genug sein, damit die Zellen ohne Verstopfung passieren können und um zu vermeiden, dass die Embryonen beschädigt und Zellen verloren werden. Eine dicke Mikroinjektionsnadelspitze verletzt den Embryo und fördert die Bildung von Ödemen oder Zebrafischsterben. Graticule wird nicht für die Nadelkalibrierung verwendet. Eine ausführliche Erläuterung finden Sie unter Diskussion. - Vor der Injektion der Embryonen testen Sie den Mikroinjektordruck, der mit dem niedrigsten Auswurfdruck beginnt, bis in 1-3 Impulsen ein Volumen erreicht wird, das der Größe des Auges des Zebrafisch-Embryos ähnelt.
HINWEIS: Es wird empfohlen, wann immer dies zu Beginn des Trainings mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop möglich ist. Dies ermöglicht eine einfachere Identifizierung fluoreszierender Zellen. - Sorgfältig in die Mitte des Eigelbs des Embryos durchstechen, den Nadelwinkel senken und vorsichtig drücken, bis die Spitze der Nadel den Perivitellineraum (PVS) erreicht (Abbildung 4B-D).
- Drücken Sie das Mikroinjektorpedal und injizieren Sie die Zellen in das PVS. Verwenden Sie das Auge des Embryos als Leitfaden. Versuchen Sie, ein Volumen von Zellen ähnlich der Größe des Embryos Auge und so weit wie möglich aus dem Herzen zu injizieren, um Herzödem zu verhindern.
- Entfernen Sie vorsichtig die Nadel und bewegen Sie sich auf den nächsten Embryo.
- Stellen Sie bei Bedarf den Mikroinjektordruck ein.
HINWEIS: Zellen neigen dazu, zu verstopfen, so dass der Druck erhöht werden kann. Bei Bedarf ist es möglich, die Kapillare zu schneiden (um den Durchmesser zu erhöhen) und gleichzeitig den Druck zu reduzieren. - Übertragen Sie die injizierten Embryonen auf eine saubere Petrischale (Tabelle 4) mit 1x Tricaine-Lösung und lassen Sie sie für 5-10 Minuten ruhen. Dies wird Zeit für die Wunde zu schließen.
HINWEIS: Um die Embryonen von der Agarplatte auf die Petrischale zu übertragen, fügen Sie ein paar Tropfen 1x Tricaine-Lösung auf die Embryonen und sorgfältig sammeln sie mit einer Kunststoff Pasteur Pipette. Lassen Sie die gesammelten Embryonen in einer neuen Petrischale mit 1x Tricain-Lösung fallen. - Entfernen Sie die 1x Tricaine Lösung und fügen Sie frisches E3 Medium hinzu.
- Inkubieren Sie die Xenografts bei 34 °C (eine beeinträchtigte Temperatur zwischen menschlichen Zelllinien Überleben und Zebrafisch Entwicklung8).
6. Metastasierender Assay
- Bei ca. 1 Stunde Nachinjektion (hpi) die injizierten Embryonen auf einem fluoreszierenden Stereomikroskop abschirmen und die Xenografts in 2 Gruppen sortieren, je nach Abwesenheit (Abbildung 5A) oder Vorhandensein (Abbildung 5B) von Zellen im Umlauf.
HINWEIS: Auch wenn nur eine Krebszelle im Herzen oder Kreislauf nachgewiesen wird, schließen Sie diese Xenografts in die Gruppe der Xenografts mit Zellen im Umlauf ein. Alternativ können Zellen direkt in den Kreislauf injiziert werden, um die Anzahl der Xenografts in dieser Gruppe zu erhöhen.
7. 1 Tag nach der Injektion
- Auf einem fluoreszierenden Stereomikroskop jeden Embryo sorgfältig analysieren und diejenigen mit richtig injizierten Tumoren auswählen (Abbildung 6).
HINWEIS: Bei Bedarf die injizierten Embryonen vor dem Screening mit Tricain 1X-Lösung ansien. - Verwerfen Sie die folgenden Embryonen/Xenografts (Abbildung 6A-A''):
• ohne Tumor/abnormale Morphologie/tot,
• mit Herz- und/oder Eigelbödem,
• mit Tumorzellen nur im Eigelb,
• mit sehr wenigen Krebszellen. - Sortieren Sie ausgewählte Xenografts nach ihrer Tumorgröße. Verwenden Sie die Größe des Auges zum Vergleich (Abbildung 6B-B'', 6C).
• Tumoren kleiner als die Größe des Auges (+),
• Tumoren in der Größe des Auges (++),
• Tumoren größer als die Größe des Auges (+++). - Verteilen Sie die Xenografts nach dem gewünschten experimentellen Layout und starten Sie den Arzneimitteltest (Kontrolle vs. Medikament, etc.). Ersetzen Sie die Medikamente und E3 medium täglich (Tabelle 4).
- Inkubieren Sie die Xenografts, die die Temperatur von 34°C bis zum Ende des Assays beibehalten.
8. 4 Tage nach der Injektion
- Am letzten Tag des Assays die Xenografts mit 1x Tricain-Lösung anästhesien und sorgfältig auf der Agarplatte ausrichten.
HINWEIS: Entsorgen Sie alle toten oder geschwollenen Xenografts. Medikamentöse Behandlungen und einige Tumorzellen können Toxizität induzieren und schließlich Xenograft Mortalität verursachen. Diese Xenografts werden nicht für die Transplantationsquantifizierung berücksichtigt. - Zur Bestimmung des Prozentsatzes der Engraftment: auf einem fluoreszierenden Stereomikroskop analysieren Sie jeden lebenden Xenograft und bewerten die Abwesenheit (Abbildung 6D) / Anwesenheit (Abbildung 6E) von Tumoren im PVS.
- Zur Bestimmung des Prozentsatzes der Metastasierung: Auf einem fluoreszierenden Stereomikroskop jedes Xenograft analysieren und das Vorhandensein/Fehlen von Mikrometastasen im kaudalen hämatopoetischen Gewebe (CHT) der beiden zuvor definierten Gruppen (CIRC und NO CIRC, Abbildung 6F) bewerten
- Wählen Sie nach dem Versuchsaufbau die Xenografts aus, die von Interesse sind, und euthanisieren Sie sie mit 25x Tricaine (Tabelle 3).
- Fixieren Sie sie in 4% Formaldehyd (FA) für mindestens 4 Stunden bei Raumtemperatur (RT) oder über Nacht bei 4 °C.
HINWEIS: Verwenden Sie methanolfreies Formaldehyd (16% FA) bei 4% in PBS/0,1% Triton verdünnt. Füllen Sie die Rohre nach oben mit fixativ. Positionieren Sie die Rohre horizontal, um eine homogene Fixierung aller Xenografts zu gewährleisten, die Durchlässigkeit zu erhöhen und zu verhindern, dass sich der Zebrafisch am Boden aggregiert. - Alternativ können Sie sie mit PIPES (pro 1 ml: 100 l von 1 M PIPES Natriumsalz (4 °C); 1 l mit 1 M MgSO4 (RT); 4 l mit 0,5 m EGTA (RT); 93,7 l von 16% FA (RT); 801,3 l ddH2O) befestigen.
HINWEIS: PIPES bewahrt die Fluoreszenz von Transgenlinien RFP und mCherry besser als 4% FA. - Wenn die Immunfärbung an einem anderen Tag durchgeführt wird, ersetzen Sie die FA durch 100% Methanol (MetOH). Xenografts, die in 100% Methanol fixiert sind, können bei -20 °C unbegrenzt gelagert werden.
HINWEIS: MetOH kann die Effizienz einiger Färbungen (z. B. Phalloidin) beeinträchtigen und eine fluoreszierende Kennzeichnung abschrecken. Bestätigen Sie die Wirksamkeit der Antikörper in MetOH-Festen Proben im Voraus.
9. Ganzer Mount-Immunostaining für konfokale Bildgebung
HINWEIS: Die gesamte Mount-Immunfluoreszenz-Technik dauert 3 Tage geteilt wie folgt: Der erste Tag ist für die Permeabilisierung der Xenografts und primäre Antikörper-Inkubation. Der zweite Tag zum Waschen und sekundären Antikörperinkubation und der dritte Tag zum Waschen, Fixieren von Xenografts und Lagerung in den Montagemedien.
- Tag 1
- Wenn die Xenografts in 100% MetOH gelagert wurden, rehydrieren Sie sie durch eine Reihe von abnehmenden MetOH-Konzentrationen (75%, 50%, 25% MetOH verdünnt in PBS/0.1% Triton). Wenn in FA fixiert, ersetzen Sie es durch PBS/0,1% Triton.
- 4x 5 Minuten in PBS/0.1% Triton waschen.
- 1x 5 Minuten in H2O waschen.
HINWEIS: Die Rohre müssen horizontal immer in Fixations-, Permeabilisations- und Waschschritten positioniert werden, sofern nicht anders angegeben. - H2O gegen eiskaltes Aceton ersetzen und bei -20 °C 7 Minuten brüten.
HINWEIS: Legen Sie ein 50 ml-Rohr mit Aceton bei -20 °C, damit es einsatzbereit ist. Mikrozentrifugenrohre müssen vertikal auf einem Rack positioniert werden, damit das Aceton nicht austritt. - 2x 10 Minuten in PBS/0.1%Triton waschen.
- Inkubieren mit PBDX_GS Blockierlösung für 1 h bei RT (PBDX_GS Sperrpuffer: 50 ml 1x PBS; 0,5 g Rinderserumalbumin - BSA; 0,5 ml DMSO; 250 l 10% Triton; 750 l Ziegenserum - GS (15 l/1 ml)).
- Entfernen Sie PBDX_GS und fügen Sie die primäre Antikörperverdünnung um 40 L hinzu (in der Regel 1:100).
HINWEIS: Das Volumen der primären Antikörperverdünnung variiert je nach Anzahl der Xenografts, die im Mikrozentrifugenrohr vorhanden sind. Stellen Sie sicher, dass alle Xenografts unter Getaucht sind. - 1 Stunde bei RT und dann über Nacht bei 4 °C inkubieren. Rohre vertikal positionieren.
- Tag 2
- Primären Antikörper entfernen und 2x 10 Minuten in PBS/0,1% Triton waschen.
- 4x für 30 min in PBS/0.05% Tween waschen.
HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen im Dunkeln durchgeführt werden (verwenden Sie Aluminiumfolie, um Rohre vor Licht zu schützen). - Entfernen Sie PBS/0,05% Tween und fügen Sie die sekundäre Antikörperverdünnung (in der Regel 1:200 - 1:400) + DAPI (50 g/ml) in PBDX_GS verdünnt.
- 1 Stunde bei RT und dann über Nacht bei 4 °C inkubieren. Rohre vertikal positionieren und vor Licht schützen.
- Tag 3 (verwenden Sie Aluminiumfolie, um Rohre vor Licht zu schützen)
- Sekundäre Antikörperverdünnung entfernen und 4x 15 Minuten in PBS/0,05% Tween waschen.
- Fix bei Raumtemperatur für 20 Minuten in 4% FA.
- Waschen Sie 1x für 5 Minuten in PBS/0.05% Tween.
- Entfernen Sie PBS/0.05% Tween und fügen Sie jedem Mikrozentrifugenrohr 1 Tropfen wässriges Montagemedium hinzu. Positionieren Sie die Rohre vertikal.
- Bei 4 °C bis zur Montage vor Licht geschützt montieren oder lagern. Positionieren Sie die Rohre vertikal.
10. Montage von Xenografts
HINWEIS: Schützen Sie Mikrozentrifugenrohre während des gesamten Prozesses vor dem Licht. Zebrafish Xenografts sind zwischen 2 Abdeckungen (24 x 60 mm bei 1,5) montiert. Dies ermöglicht es, die montierten Xenografts während der konfokalen Bildgebung zu kippen, so dass beide Seiten des Tumors (oben und unten) zugänglich sind. Verwenden Sie keine Kunststoffpipetten mit Montagemedium - die Xenografts können in der Pipette gefangen werden. Siehe Abbildung 7 für die schematische Darstellung der folgenden Schritte.
- Beschriften Sie den Deckelrutsch Y und versiegeln Sie die Ränder des Coverslip X mit Petroleumgelee oder Silikonfett, um das Auslaufen der Montagemedien zu vermeiden.
- Die Xenografts mit einer gläsernen Pasteurpipette auf den Deckslip X übertragen.
- Richten Sie sie vorsichtig mit einer Haarnadel aus und entfernen Sie die überschüssigen wässrigen Montagemedien.
- Fügen Sie wässrige Montagemedien zu Coverslip Y hinzu.
- Legen Sie Coverslip Y vorsichtig auf dem Coverslip X. Drücken Sie nicht auf die Abdeckungen, da dies die Xenografts möglicherweise stören kann.
- Legen Sie die montierten Abdeckungen auf ein Mikroskopschlitten und befestigen Sie sie mit transparentem Klebeband. Dies ermöglicht eine einfachere Manipulation für konfokale Bildgebung und Lagerung.
11. Konfokale Bildgebung
HINWEIS: Eine apochromatische 25-fache Tauchobjektivlinse mit Wasserkorrektur ist optimal für die Abbildung von PVS-Tumoren mit einzelliger Auflösung (Beispiele siehe Abbildung 8C-C" und Abbildung 9A).
- Erfassen Sie Samples mit der Z-Stack-Funktion mit einem Intervall von 5 m zwischen den einzelnen Slices. Für Bilder, die auf die 3D-Rekonstruktion abzielen, in insbesondere Gefäßen, verwenden Sie ein Intervall von 1-3 m zwischen den Scheiben (Abbildung 8A).
12. Analyse und Quantifizierung
- Verwenden Sie FIJI/ImageJ Software oder ähnliches für die konfokale Bildverarbeitung und -analyse.
- Öffnen Sie die Rohdaten (.czi, .lsm, etc.) in der FIJI-Software.
- Um im Composite-Modus alle oder nur einen einzelnen Kanal auszuwählen, klicken Sie auf: Bild > Farben > Channels Tool.
- Um Helligkeits- und Kontraststufen anzupassen, klicken Sie auf Bild > > Farbbalance anpassen.
- Zur Quantifizierung der Tumorgröße
- Wählen Sie drei repräsentative Segmente des Tumors aus, von oben, mitte und unten, pro Z-Stack pro Xenograft (Abbildung 8 A).
HINWEIS: Die konfokale Auflösung erreicht eine Tumortiefe von 60-70 m. Wenn der Tumor groß ist, ist es möglicherweise nicht möglich, sein Gesamtvolumen abzubilden. - Öffnen Sie eine Kalkulationstabelle, um die Daten mit Anmerkungen zu kommentieren.
- Zählen Sie alle DAPI-Kerne, die den Tumorzellen in den 3 ausgewählten Scheiben entsprechen (Abbildung 8 A, B). Um dies zu tun:
- Öffnen Sie das Zellenzähler-Plugin von FIJI/ImageJ, indem Sie auf Plugins > Analyze > Cell-Zähler klicken.
- Klicken Sie im Werkzeug Zellenzähler auf Initialisieren, wählen Sie einen Zählertyp aus, und klicken Sie auf das Bild, um den Zählmodus manuell zu starten. Für jeden Klick addiert der Zähler, wie viele Zellen gezählt werden (Anzahl der Klicks).
- Speichern Sie nach dem Zählen eines vollständigen Slices die Zellennummer im entsprechenden Excel-Dokument.
- Zurück nach Fidschi, klicken Sie im Zellenzähler-Fenster auf Zurücksetzen, um die Informationen zu löschen, wenn derselbe Zähler verwendet wird. Andernfalls können die Informationen beibehalten werden, und andere Leistungsindikatoren können mit anderen Slices (oder Zellen) verwendet werden.
- Wechseln Sie zum zweiten repräsentativen Slice, und wiederholen Sie die vorherigen Schritte. Sammeln Sie alle Daten.
HINWEIS: DAPI-Gegenfärbung wird häufig verwendet, um Zellzahlen aufgrund der klaren Definition einzelner Zellen zu zählen, jedoch können andere zellspezifische Färbungen verwendet werden.
- Um die Gesamtzahl der Zellen im Tumor zu erhalten, verwenden Sie die folgende Formel:
HINWEIS: Die Korrekturnummer 1,5 wurde für Zellen mit einem durchschnittlichen Kerndurchmesser von 10 bis 12 m geschätzt. Diese Korrektur muss möglicherweise angepasst werden, wenn die Zellen größer/kleiner sind. Weitere Informationen zu dieser Methode finden Sie unter Dicussion.
- Wählen Sie drei repräsentative Segmente des Tumors aus, von oben, mitte und unten, pro Z-Stack pro Xenograft (Abbildung 8 A).
- Um andere Marker zu quantifizieren (Immunzellen, mitotische Figuren, PPH3, aktivierte Caspase3, Ki67, etc.), quantifizieren Sie alle Slices mit dem gleichen Plugin (siehe Abbildung 8C-C'' für die Visualisierung mitotischer Figuren). Dividieren Sie die Gesamtzahl der gezählten Zellen durch die entsprechende Tumorgröße und multiplizieren Sie sie mit 100, um den Prozentsatz zu erhalten.
HINWEIS: Achten Sie darauf, dass sich einige Zellen zwischen zwei Slices befinden, gehen Sie im Z-Stack hin und her, um sicherzustellen, dass eine Zelle nicht zweimal gezählt wird.
Representative Results
Zebrafish Xenograft als Werkzeug zur Untersuchung von Krebstherapien.
Die HCT116-Darmkrebs-Zelllinie wurde mit CM-DiI gekennzeichnet und in die PVS von 2 Tagen nach der Befruchtung (dpf) injiziert. Nach der Injektion wurden Xenografts bei 34 °C inkubiert, eine Temperatur, die das Wachstum von Tumorzellen ermöglicht, ohne die Entwicklung von Zebrafischen zu beeinträchtigen. Am nächsten Tag wurden Xenografts nach dem Vorhandensein oder Fehlen einer Tumormasse in der PVS untersucht (nicht richtig injizierte Zebrafische wurden verworfen und eingeschläfert)(Abbildung 6A-A''). Xenografts wurden nach ihrer Tumorgröße gruppiert (Abbildung 6B-B'') und nach dem Zufallsprinzip verteilt (in einer 6-Well-Platte: 12 Xenografts pro Brunnen) in nicht behandelten Kontrollen und FOLFIRI-Chemotherapie (0,18 mM Folinsäure, 0,08 mM Irinotecan und 4,2 m Fluorouracil (5-FU)).
Kontrolle E3 und Drogen wurden täglich ersetzt und tote Zebrafische entsorgt. 4 dpi und drei Tage nach der Behandlung (dpt) wurde die Transplantation wie in Schritt 8.2 des Protokolls quantifiziert. Die Transplantation wird als Häufigkeit von Xenografts betrachtet, die eine Tumormasse in der PVS bei 4 dpi darstellen. Wenn zum Beispiel am Ende des Experiments 40 lebende Larven und 35 von 40 einen Tumor in der PVS aufweisen, beträgt die Engraftmentrate 87,5%. Xenografts wurden eingeschläfert und fixiert, um Tumorgröße und Apoptose durch Immunfluoreszenz und konfokale Mikroskopie zu bewerten.
Die Immunfluoreszenz wurde durchgeführt, um apoptotische Zellen zu detektieren, mit Anti-Cleaved Caspase 3 Antikörper (Asp175) (Kaninchen, 1:100, #CST 9661) und DAPI (50 g/ml) für die Kerne-Gegenfärbung. Bildstapel-Datensätze (jeweils 5um) wurden in einem KONFokalen Mikroskop LSM710 erfasst und Datenanalysen mit FIJI/ImageJ-Software durchgeführt, wie in Schritt 12erläutert. Quantifizierung des mitotischen Index, Apoptose (% der aktivierten Caspase3) und Tumorgröße, zeigte, dass FOLFIRI induziert eine signifikante Abnahme der Mitose (Mann Whitney Test, P<0.0001) und eine signifikante Induktion der Apoptose (Mann Whitney Test, P<0.0001), begleitet von einer 54% Reduktion der Tumorgröße (P<0.001) (Abbildung 8C-E, Abbildung 9A- E).
Diese Eigenschaften sind nützlich in Hochdurchsatz phänotisch Drogen-Screens sowie die Zelle intrinsische und physiologische Effekte von mehreren Krebsbehandlungen in einem kurzen Zeitrahmen zu testen.
Charakterisierung von Humanzebrafisch-Xenografts mit humanspezifischen Antikörpern
Wie bei allen Xenograft-Modellen besteht die Gefahr, dass die Zellen falsch identifiziert werden. Zum Beispiel können Makrophagen menschliche Krebszellen phagozytosisieren, mit dem lipophilen Farbstoff gekennzeichnet werden und dann entlang des Zebrafischwirts reisen und somit können diese Zellen mit Tumormikrometastasen verwechselt werden. Daher ist die Kennzeichnung von Xenografts mit spezifischen menschlichen Antikörpern wie humanen HLA, ki-67 oder menschlichen Mitochondrien (hMITO) entscheidend für die anfängliche Charakterisierung und auch für das Kennenlernen der Morphologie der Tumorzellen (Abbildung 9F-I).
Zebrafish Xenograft zur Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen.
Ein weiterer großer Vorteil des Zebrafisch-Xenograft-Modells ist, dass es möglich ist, die Wechselwirkungen verschiedener Tumorzellen zu untersuchen und zu analysieren, wie jede Art von Zelle das Verhalten der anderen beeinflussen kann. Verschiedene menschliche Krebszellen (verschiedene Klone aus demselben Tumor oder aus verschiedenen Tumoren) können mitinjiziert werden. In diesem Beispiel wurden zwei vom selben Patienten abgeleitete CRC-Zelllinien mit unterschiedlichen lipophilen Farbstoffen gekennzeichnet und in einem Verhältnis von 1:1 zur Injektion gemischt (Abbildung 9J-K').
Beim Mischen menschlicher Zelllinien (zur Erzeugung von polyklonalen Tumoren) auf demselben Transplantat sollten Sie die Verwendung des DiO-Farbstoffs vermeiden, da dies zu einer unspezifischen Doppelfärbung führt (Tabelle 2). Verwenden Sie stattdessen z. B. CM-DiI (Zelllinie 1) mit grüner CMFDA (Zelllinie 2) oder CM-DiI (Zelllinie 1) mit Tiefrot (Zelllinie 2) (Tabelle 2, Abbildung 9J-K'),um am Ende des Experiments eine einfache Diskriminierung der Populationen zu erhalten. Um die Häufigkeit jedes Klons innerhalb des Tumors zu quantifizieren, verwenden Sie 2 verschiedene Zählertypen in FIJI, um jeden Klon zu identifizieren, und dividieren Sie dann durch die Gesamtzellenzahl (Summe aller Klone), um den relativen Anteil jedes klonenden zu erhalten (%).
Abbildung 1. Flussdiagramm Zusammenfassung des Zebrafisch xenograft Protokoll Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Materialien für Zebrafisch-Embryo-Injektion: A. Borosilikatnadel B. 2% Agarose-Platte. C Haarnadelschleife D. Schritte, um eine Haarnadelschlaufe zu machen: 1. Legen Sie 1 Haar in ein Glas Kapillarrohr, so dass etwa 1 Zentimeter Haar außerhalb der Röhre. 2-3. Kränkeln Sie die Außenspitze des Haares mit Hilfe von Zangen in das Glaskapillarrohr und bilden eine Schlaufe von 0,5 mm Länge. 4. Versiegeln Sie den Rand des Kapillarrohres mit einem Tropfen Nagellack. 5-6. Versiegeln Sie ein Stück elektrisches Klebeband um die Kapillare, um sie vor dem Brechen zu schützen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Repräsentative Stereomikroskopbilder von Zebrafischembryonen nach 48 Stunden nach der Befruchtung (48 hpf): A-A'. Normale Morphologie eines Zebrafisch-Embryos bei 48 hpf Entwicklung, bereit für Mikroinjektion B-B'. Morphologie eines Zebrafisch-Embryos, der bei 48 hpf nicht das adäquate Entwicklungsstadium für Mikroinjektionen erreicht hat und bereits einen gewissen Grad an Herzödem (schwarze Pfeilspitze) und distended Esel zeigt. A' und B' sind Vergrößerungen von A bzw. B. Maßstabsbalken stellen 500 m dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Schematische Darstellung der Zebrafisch-Mikroinjektionsplatte eingerichtet: A. Ausrichtung der anästhesierten Embryonen in 3% Agar/2% Agarose-Platte. B. Grafische Darstellung eines 2 Tage nach der Befruchtung Zebrafisch-Embryos, mit einem schwarzen Pfeil, der den Perivitelline-Raum (PVS) anzeigt. C und D. Krebszellen können mit unterschiedlichen Winkeln in die PVS injiziert werden, die im Perivitelinraum (PVS) eines 48-stunden-Embryos nach der Befruchtung injiziert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5. Metastasierender Assay. 1 Stunde nach der Injektion (1hpi) injizierte Embryonen werden nach der Abwesenheit (NO_circ) oder Anwesenheit (CIRC) von Tumorzellen im Kreislauf sortiert. Nach 4 Tagen nach der Injektion wird die Anzahl der Xenografts in beiden Gruppen, die Mikrometastasen darstellen, quantifiziert. Zellen in der Gruppe (A) NO_circ mussten alle metastasierenden Schritte durchlaufen, um eine Mikrometastasierung bilden zu können, während Zellen in der CIRC-Gruppe (B) nur den letzten Schritten der metastasierenden Kaskade unterzogen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6. Repräsentative fluoreszierende Stereomikroskopbilder von Xenografts nach 1 Tag nach der Injektion und 4 Tage nach der Injektion. Menschliche Krebszellen, die das fluoreszierende Protein TdTomato (rot) exdrückten, wurden in 2 dpf Zebrafisch-Embryonen mikroinjiziert. Bei 1 dpi die injizierten Embryonen abschirmen und die schlecht injizierten Embryonen oder Embryonen mit einem Ödem (A-A'') sortieren die gut injizierten Embryonen nach Tumorgrößen (B-B'') . C. Repräsentative Quantifizierung der Gesamtzahl der Zellen in den verschiedenen Tumorgrößenkategorien bei 1 dpi in SW620 Xenografts. Jeder Punkt stellt ein Xenograft dar, wie in Abschnitt 12.At 4 dpi erläutert, die Larven zu überprüfen und die verschiedenen Klassen zu quantifizieren: kein Tumor (D); mit Tumor in der PVS (E) und mit einer Mikrometastasierung im CHT (F). Maßstabsbalken stellen 500 m dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7. Schematische Darstellung der Xenograft-Montage für konfokale Bildgebung. 1. Beispiel für die Kennzeichnung in Coverslip Y, hellblaue Linie in Deckblatt X stellt den Umfang dar, in dem Petroleumgelee/Silikonfett aufgetragen wird, um ein Auslaufen der Montagemedien zu verhindern. 2. Beispiele für die Xenograft-Ausrichtung auf Deckslip X für konfokale Bildgebung. 3. Wässrige Montagemedien (blauer Pfeil) werden verwendet, um Coverslip Y auf dem Coverslip X. 4 zu binden. Beispiel für ordnungsgemäß montierte Abdeckungen. 5. Abdeckungen werden dann auf eine Glasrutsche gelegt und mit transparentem Klebeband befestigt. 6. Montierte Xenografts bereit für konfokale Bildgebung. Erstellt mit BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8. Visuelle Darstellung der konfokalen Mikroskopbildquantifizierung der Tumorgröße. Konfokale Bilder eines HCT116 Xenograft s. 4 Tage nach der Injektion A. Serie von Z-Stack-Slices im DAPI-Kanal, die mit einem Intervall von 5 m erfasst werden. Rote gestrichelte Linien umkreisen die drei repräsentativen Slices, die für die Zellzählung verwendet werden. B. Illustration der DAPI-Kernquantifizierung mit dem Cell Counter Plugin in ImageJ/Fiji Software. C-E. Beispiel für die Einzelzellauflösung innerhalb des Tumors, bei der es möglich ist, mitotische Figuren in DAPI oder mit einem Phospho-Histon-H3-Antikörper (grün) zu visualisieren/quantifizieren. D und E sind Vergrößerungen von C. Maßstabsbalken stellen 50 m dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9. Repräsentative Ergebnisse. A-E. DIE HCT116-Darmkrebs-Zelllinie wurde mit Vybrant CM-DiI gekennzeichnet und in die PVS von 2 Tagen nach der Befruchtung (dpf) Embryonen injiziert. Nach der Injektion wurden Xenografts bei 34 °C inkubiert. Bei 1 dpi wurden Xenografts gescreent und nach dem Zufallsprinzip in nicht behandelten Kontrollen und FOLFIRI verteilt, 3 aufeinanderfolgende Tage lang behandelt und auf 4 dpi festgelegt. A. Immunfluoreszenz wurde durchgeführt, um apoptotische Zellen zu detektieren, mit Anti-Spalten Caspase 3 Antikörper und DAPI für Kerne Gegenfärbung. Die Quantifizierung des mitotischen Index C, apoptosis (% der aktivierten Caspase3) D und Tumorgröße E, ergab, dass FOLFIRI eine signifikante Abnahme der Mitose induziert (Mann Whitney Test, P<0.0001) und eine signifikante Induktion der Apoptose (Mann Whitney Test, P<0.0001), begleitet von einer 54% Reduktion der Tumorgröße (P<0.001). Die Anzahl der analysierten Xenografts wird in der Abbildung angegeben und jeder Punkt stellt ein Xenograft dar. F-H. Repräsentative Bilder von Darmkrebs Xenografts an 4 Tagen nach der Injektion mit humanspezifischen Markern in grün (menschliche HLA, ki67 und hMITO) in der PVS und CHT Igekennzeichnet. J-J'. Konfokale Bilder von polyklonalen Xenografts, injiziert mit zwei verschiedenen menschlichen Darmkrebszelllinien, die mit lipophiler Färbung CellTracker Deep Red (Cy5 - weiß), CellTracker Green CMFDA (488 - green) und DAPI Counterstaining beschriftet sind. K-K'. Konfokale Bilder von zwei verschiedenen menschlichen Darmkrebszelllinien, die mit lipophiler Färbung CellTracker Deep Red (Cy5 - weiß), Vybrant CM DiI (594 - rot) und DAPI-Gegenfärbung beschriftet sind. Maßstabsbalken stellen 50 m dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Zelllinie | Gewebe | Spezies | Morphologie | Wachstumsmodus | Idealer Einfluss zur Injektion | Dissoziierendes Injektionsmittel | Dissoziationszeit | Protokoll für die Etikettierung | Injektionsmedium | Dividieren Sie die Gesamtzahl der Zellen durch (um eine ideale Injektionskonzentration zu erreichen) | |||||||
| SW480 | Kolorektaladenokarzinom (primär) | Menschlichen | Epitheliale | Adhärente | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 Minuten | Flasche | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| SW620 | Kolorektaladenokarzinom (Metastasierung) | Menschlichen | Epitheliale | Adhärente | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 Minuten | Flasche | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HCT116 | Kolorektalkarzinom (primär), Kras mutant | Menschlichen | Epitheliale | Adhärente | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 Minuten | Flasche | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HKE3 | Kolorektalkarzinom, Kras WT | Menschlichen | Epitheliale | Adhärente | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 Minuten | Flasche | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HT-29 | Kolorektaladenokarzinom (primär) | Menschlichen | Epitheliale | Adhärente | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 Minuten | Flasche | PBS 1x | 0,2 | |||||||
| CACO-2 | Kolorektaladenokarzinom (primär) | Menschlichen | Epitheliale | Adhärente | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 Minuten | 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr | Komplettes Medium | 0,25 | |||||||
| MCF-7 | Brustadenokarzinom (Metastasierung) | Menschlichen | Epitheliale | Adhärente | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 Minuten | 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr | 60% FBS + 40% komplettes Medium | 0,5 | |||||||
| Hs578T | Brustkarzinom (primär) | Menschlichen | Epitheliale | Adhärente | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 2 Minuten | 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr | 60% FBS + 40% komplettes Medium | 0,5 | |||||||
| MDA-MB-468 | Brustadenokarzinom (Metastasierung) | Menschlichen | Epitheliale | Adhärente | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 8 Minuten | 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr | 60% FBS + 40% komplettes Medium | 0,5 | |||||||
| MDA-MB-231 | Brustadenokarzinom (Metastasierung) | Menschlichen | Epitheliale | Adhärente | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 Minuten | 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr | Komplettes Medium | 0,5 | |||||||
| RT112 | Harnblase Übergangszellkarzinom (primär) | Menschlichen | Epitheliale | Adhärente | 85% - 90% | TrypLE | 6 Minuten + Zell-Schrott | 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr | Komplettes Medium | 0,5 | |||||||
| BFTC905 | Harnblase Übergangszellkarzinom (primär) | Menschlichen | Epitheliale | Adhärente | 75% - 85% | TrypLE | 10 Minuten | 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr | 80% komplettes Medium + 20% PBS/EDTA 2 mM | 0,5 | |||||||
| J82 | Harnblase Übergangszellkarzinom (primär) | Menschlichen | Epitheliale | Adhärente | 85% - 90% | TrypLE | 10 Minuten | 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr | Komplettes Medium | 0,5 | |||||||
| RT4 | Harnblase Übergangszellkarzinom (primär) | Menschlichen | Epitheliale | Adhärente | 85% - 90% | TrypLE | 6 Minuten | 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr | Komplettes Medium | 0,5 | |||||||
| MIA PaCa-2 | Pankreasepitheliodkarzinom (primär) | Menschlichen | Epitheliale | Adhärente | 80% - 90% | TrypLE | 3 Minuten | 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr | 60% FBS + 40% komplettes Medium | 0,5 | |||||||
| PANC-1 | Pankreasepitheliodkarzinom (primär) | Menschlichen | Epitheliale | Adhärente | 80% | TrypLE | 5 Minuten | 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr | PBS/EDTA 2mM | 0,5 | |||||||
| VC8 | Lungenfibroblasten, BRCA2-mutiert, HR-mangelhaft | Chinesischer Hamster | Epitheliale | Adhärente | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 Minuten | 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr | Komplettes Medium | 0,25 | |||||||
| VC8-B2 | Lungen-Fibroblasten, humanes BRCA2, BRCA2 | Chinesischer Hamster | Epitheliale | Adhärente | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 Minuten | 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr | Komplettes Medium | 0,25 | |||||||
Tabelle 1: Optimaler In-vitro-Konfluenz zur Injektion mehrerer Zelllinien
| Zellfarbstoff | Katalognummer | Fluoreszenzspektrum (Exz. - Em.) | Bestandsverdünnung | Arbeitsverdünnung zu Flecken in einem Kolben | Arbeitsverdünnung zu Flecken in einer 1,5 ml Mikrozentrifuge | Inkubationszeit | Beobachtungen | ||||||
| Vybrant CM-DiI | V22888 | 549 nm - 569 nm | Bereits verdünnt | 4:1000 in PBS 1x | 4:1000 in PBS 1x | 15 min bei 37 oC + 4 min bei 4 oC | |||||||
| Vybrant DiO | V22886 | 484 nm - 501 nm | Bereits verdünnt | 5:1000 in PBS 1x | 5:1000 in PBS 1x | 15 min bei 37 oC + 4 min bei 4 oC | Keine gute Auflösung in der konfokalen Bildgebung nach 4 Tagen nach der Injektion | ||||||
| CellTracker Tiefrot | C34565 | 630 nm - 660 nm | 1 mM in DMSO | 0,5 - 2,5 m in PBS 1x | 0,5 - 2,5 m in PBS 1x | 15 min bei 37 oC | |||||||
| CellTracker Grün CMFDA | C7025 | 492 nm - 517 nm | 10 mM in DMSO | 0,5 - 2,5 m in PBS 1x | 0,5 - 2,5 m in PBS 1x | 15 min bei 37 oC | Produktlecks in der Bauchhöhle 48 Stunden nach der Injektion, aber ideal für Co-Injektionsstudien | ||||||
Tabelle 2: Farbstoff und Bedingungen
| Größe | Anzahl der Larven | E3 1x mittleres Volumen |
| 100 mm x 15 mm (Standard) | Bis zu 50 | 20-25 ml |
| 60 mm x 15 mm | Bis zu 20 | 10 ml |
| 6-Well-Platte | Bis zu 15 pro Brunnen | 3-4 ml pro Brunnen |
Tabelle 3: Petrischalenoptionen
| E3 medium 50x - Lagerbestand | Für 10 Liter steriles Wasser: |
| 146,9 g NaCl | |
| 6,3 g KCl | |
| 24,3 g CaCl22 H2O | |
| 40,7 g MgSO47H2O | |
| E3 medium 1x – gebrauchsfertig | 400 ml E3 mittel 50x |
| 60 ml mit 0,01% Methylenblaulösung | |
| Bis zu 20 Liter Fischsystemwasser füllen | |
| Tricaine 25x – Vorrat und Euthanasie | 2 g Tricainpulver |
| 500 ml Umkehrosmosewasser | |
| 10 ml von 1 M Tris (pH 9) | |
| Anpassung an pH 7 | |
| Tricaine 1x - Anästhesie | 20 ml Tricain25x |
| Bis zu 500 ml Systemwasser füllen | |
| 60 mg/ml Pronase - Lager 100x | 1 g Pronase |
| 16,7 ml steriles Wasser | |
| 0,6 mg/ml Pronase – 1x gebrauchsfertig | 100 l Pronase 100x |
| 9,9 ml E3 mittel 1x |
Tabelle 4: Lösungszusammensetzungen
Discussion
Die zunehmende Bedeutung des Zebrafisches als Modell für die Krebsentwicklung und das Arzneimittelscreening hat zu zahlreichen Publikationen3,4,7,13,14,16,18,19,20,21geführt. Die Injektion von Krebszellen in Zebrafisch-Embryonen ist jedoch eine Technik, die ein hohes Maß an Geschicklichkeit erfordert, das für Forscher eine Herausforderung sein kann. In diesem Protokoll wollen wir praktische Informationen und einige Tipps geben, die helfen können, die anfänglichen Herausforderungen bei der Einrichtung von Zebrafisch-Embryo-Xenografts zu meistern.
Zellhandling vor der Injektion
Dieses optimierte Protokoll für die Erzeugung von Zebrafisch-Xenografts mit Zelllinien kann an verschiedene Arten von (Krebs-)Zellen mit unterschiedlichen Morphologien angepasst werden. Wir empfehlen, dass alle Zelllinien, die für Zebrafisch-Xenografts verwendet werden, mykoplasmafrei sind. Im Gegensatz zu anderen bakteriellen Verunreinigungen erzeugt das Vorhandensein von Mykoplasmen in der Zellkultur keine Veränderungen, die leicht unter dem Mikroskop erkannt werden können22. Mykoplasmenkontamination kann das Transplantationspotenzial der Zelllinien, ihre Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten sowie die Lebensfähigkeit der Zebrafischembryonen beeinträchtigen.
Obwohl sich Zellen über einen längeren Zeitraum weiter ausbreiten können, können ihr Phänotyp und Ihr Genotyp anfällig für Veränderungen sein. Es ist wichtig, sich mit der Morphologie und dem Verhalten der Zelllinien in der Kultur vertraut zu machen. Wir empfehlen, die Anzahl der Zellpassagen nach dem Auftauen zwischen 3-12 zu halten, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Daher sollten regelmäßige Mykoplasmentests durchgeführt werden.
Die Zellen sollten sich in ihrer Logphase befinden (exponentielle Wachstumsphase vor Erreichen des Zusammenflusses von 70 %) am Tag der Injektion. Dies wird eine angemessene Transplantation und richtige Entwicklung der unverwechselbaren Merkmale des Tumors ermöglichen. Um Eine Variation des Phänotyps von Zellen innerhalb des Xenografts zu verhindern, ist es wichtig, den Zusammenfluss für Injektionskonstanten zwischen den Experimenten beizubehalten. Die Anzahl der injizierten Zellen kann an die Eigenschaften jeder Zelllinie angepasst werden, da einige höhere Injektionsdichten erfordern können, um in den Zebrafischembryonen gedeihen zu können.
Überlegungen zur Zellkennzeichnung
Um menschliche Tumorzellen für die Injektion und zukünftige Analyse besser zu visualisieren, können Tumorzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen gekennzeichnet werden. Aufgrund von Unterschieden in der Zellgröße variiert die Gesamtzahl der Zellen/cm2 in anhaftenden Kulturen zwischen den Zelllinien. Dies wirkt sich auf die Wirksamkeit des Färbeprotokolls sowie auf die Anzahl der zur Injektion geernteten Zellen aus. Große Zellen, die niedrige Zahlen pro Kolben (d. h. Hs578T) liefern oder in Clustern wachsen (d. h. BFTC905), erfordern das Zusammenführen mehrerer Kolben für ein einzelnes Experiment. In diesem Fall sollte die Färbung von Zellen nicht direkt im Kolben durchgeführt werden, da dies die Verwendung von übermäßigen Mengen an Farbstoff (hohe Kosten) verursachen wird. Andererseits können Zellen, die sehr empfindlich auf übermäßige Zentrifugationszyklen reagieren, sowie solche, die hohe Zahlen pro Kolben ergeben (d. h. HCT116), direkt im Kolben befleckt und dann mit EDTA/Zellschaber abgelöst werden (weitere Informationen siehe Tabelle 1).
Wenn möglich, verwenden Sie EDTA, anstatt einen enzymatischen Ansatz zu verwenden, um die Zellen am Tag der Injektion zu lösen, so dass Zellen ihre Zell-Zell-Verbindungen schneller wiederherstellen und weniger Zentrifugationsschritten ausgesetzt sind. Wenn die Zellen jedoch empfindlich auf EDTA reagieren, sehr haftend sind oder in Clustern wachsen , kann eine enzymatische Methode angewendet werden. Die Optimierung der idealen Injektionskonzentration sowie des Injektionsmediums hängt von den Eigenschaften jeder Zelllinie ab, so dass einige Anpassungen erforderlich sein könnten (Tabelle 1).
Mikroinjektionskalibrierung
Im Gegensatz zur Abgabe von Oligonukleotiden oder Medikamenten in den Zebrafisch-Embryo wird ein Graticule nicht verwendet, um die Nadel bei der Arbeit mit Zelllinien für Xenografts zu kalibrieren. Nach einiger Zeit während der Injektion beginnen die Zellen zu verstopfen, und es ist notwendig, die Spitze der Nadel zu schneiden, um ihren Durchmesser zu erhöhen oder die Nadel vollständig zu ändern. Dieses Verfahren behindert die Gitterrifikulationskalibrierung.
Um dieses Problem zu lösen, wird die Anzahl der abgegebenen Zellen durch Auswurfdruck und Zeit, die benötigt wird, um eine Größe ähnlich dem Embryoauge innerhalb von 1-3 Impulsen zu erreichen, reguliert. Um die Tumorgröße weiter zu kontrollieren, werden bei 1 dpi Xenografts nach der Tumorgröße sortiert, wie in Abbildung 6 B-B"dargestellt. Wie in Abbildung 6C dargestellt, ist diese Methode der Sortierung effizient bei der Verringerung der Variation der Tumorgrößen: Wenn wir sie alle zusammen bündeln (+, ++, +++), ist der STEV das Doppelte der ++-Klasse (906 Zellen auf 422 Zellen) und die Koeffizientenvariation beträgt 31,9 % im Vergleich zu 14,5 % in der ++-Klasse. Da der Referenzwert für die Injektion Volumen ist, variiert die Gesamtzahl der Zellen stark zwischen den Zelltypen - abhängig von der Größe und Form der Zellen. Zum Beispiel produzieren große Zellen mit viel Zytoplasma wie Brustkrebs Hs578T viel kleinere Tumoren (ca. 600 Zellen). Außerdem erfordert jede Zelllinie eine unterschiedliche Anzahl von Zellen. Zum Beispiel haben die Harnblasenzelllinien HT29 CRC und RT112 gezeigt, dass je höher die Anzahl der injizierten Zellen, desto höher die Zebrafischsterblichkeit. Daher ist eine Phase der Optimierung während der Entwicklung der Xenografts erforderlich, um zu testen, ob die Zelllinie toxische Wirkungen im Embryo hat oder höhere/niedrigere Injektionsdichten erfordert.
Injektionsstelle
Eine der häufigsten Diskrepanzen bei der Erzeugung von Zebrafisch-Embryo-Xenografts ist die Injektionsstelle. Das Eigelb ist in der Regel der Ort der Wahl für die Injektion aufgrund seiner einfachen Zugänglichkeit. Wir haben jedoch beobachtet, dass Zellen, die in das Eigelb injiziert werden, eine höhere Neigung zum Absterben haben. Obwohl technisch schwieriger, empfehlen wir, in die PVS und so weit wie möglich aus dem Herzen zu injizieren. Innerhalb der PVS können Zellen aggregieren, Gefäße und Immunzellen rekrutieren und migrieren, intravasieren, extravasatieren und Mikrometastasen bilden, wenn sie metastasierende Eigenschaften aufweisen8,11.
Effizienz der Transplantation
Unterschiede in der Transplantationseffizienz und Tumorgröße zwischen Zelllinien bei 4 dpi werden aufgrund ihres unterschiedlichen Grades an Basalzelltod/-überleben/-proliferation, aber auch aufgrund der angeborenen Immunogenität erwartet, die jede Zelllinie9anzeigen kann.
Metastase
Metastasen besteht aus einer mehrstufigen Kaskade von Ereignissen, die in zwei beliebige Stufen unterteilt werden kann. Im ersten Stadium müssen sich Tumorzellen von der primären Stelle lösen, in angrenzende Gewebe wandern und eindringen und dann in den Blutkreislauf intravasieren. Im zweiten Stadium müssen Tumorzellen im Kreislauf überleben, aus dem Blut oder den Lymphgefäßen extravasieren und schließlich an sekundären Stellen besiedeln23. Um zwischen diesen frühen und späten Ereignissen zu unterscheiden und das Potenzial/die Fähigkeit der verschiedenen Tumorzellen zu adressieren, diese Schritte durchzuführen, haben wir einen einfachen Assay entworfen.
Im Allgemeinen können Tumorzellen, wenn sie in das PVS injiziert werden, direkt in den Kreislauf eintreten und dann physisch im kaudalen hämatopoetischen Gewebe (CHT) (Schwanzbereich) gefangen werden. Jedoch, nach den Eigenschaften jeder Tumorzelle - wir haben gesehen, dass einige Tumorzellen am CHT 4 dpi bleiben und in der Lage sind, Mikrometastasen zu bilden, während andere Tumorzellen verschwinden (gelöscht, nachdem sie in der CHT gefangen wurden).
Daher können wir durch den Vergleich der Mikrometastaseneffizienz (bei 4 dpi), wenn Zellen direkt in den Kreislauf gebracht wurden - CIRC (Zellen müssen nur die späten Schritte der Metastasierung durchlaufen) vs. wenn nicht - NO CIRC (Zellen müssen frühe und späte Schritte durchlaufen, um eine Mikrometastasierung bilden zu können) ihr frühes oder spätes metastasiertes Potenzial bewerten. Wir haben Tumorzellen beobachtet, die in beiden Gruppen (CIRC und NO CIRC) effizient Mikrometastasen in der CHT bilden können, was darauf hindeutet, dass diese Zellen die Fähigkeit haben, alle Schritte der metastasierenden Kaskade (SW480 und MDA-MB-468 zum Beispiel)8,11zu durchlaufen. Im Gegensatz dazu haben andere Tumorzellen in beiden Gruppen ein sehr geringes metastasiertes Potenzial, das selbst bei injektionen Mikrometastasen kaum jemals mikrometastasiert (d.h. im CHT mit 24 PSi sichtbar ist, aber bei 4 dpi nicht mehr da ist, hs578T zum Beispiel)8. Wir haben jedoch eindeutig eine andere Gruppe gefunden - eine, die nur in der Lage ist, Mikrometastasen zu bilden, wenn sie in den Kreislauf injiziert wird (wir können nur Mikrometastasen in der CIRC-Gruppe beobachten). Dies deutet darauf hin, dass diese Zellen eine geringe Effizienz bei der Durchführung der ersten Schritte der metastasierenden Kaskade haben, aber auf der anderen Seite in der Lage sind, im Kreislauf zu überleben, zu extravasatisieren und eine entfernte Stelle zu kolonisieren.
Immunostaining und Imaging
Vor der Fixierung kann dieses Injektionsprotokoll für andere Live-Imaging-Ansätze wie Live Differential Interference Contrast (DIC)-Mikroskopie, Spinnscheibenmikroskopie, hochauflösende Konfokalbild-Live-Bildgebung und Lichtbogenmikroskopie usw. verwendet werden.
Tote Zellen und zelluläre Trümmer erscheinen hell, wenn sie durch das fluoreszierende Stereomikroskop beobachtet werden, und können mit lebenden Zellen verwechselt werden, insbesondere wenn das Ziel der Studie darin besteht, das metastasierende Potenzial der Zelllinien zu bewerten. Wir möchten betonen, wie wichtig es ist, konfokale Bildgebung mit spezifischen Lebensfähigkeitsmarkern und DAPI durchzuführen, um den Überlebenszustand des Tumors und der Mikrometastasen zu bewerten. Auch ist es von grundlegender Bedeutung, spezifische menschliche Antikörper zu verwenden, um menschliche Zellen wie antihumane Mitochondrien oder antihumane HLA zu erkennen. Trainieren Sie bei der Implementierung des Protokolls die Experimentatoraugen, indem Sie die Färbung im Stereomikroskop mit den konfokalen Bildern vergleichen. Nach einiger Zeit können Experimentatoren Trümmer deutlich von lebenden Zellen im fluoreszierenden Stereomikroskop unterscheiden.
Obwohl andere Methoden zur Quantifizierung der Tumorbelastung, wie z. B. der gesamten Fluoreszenzbereich, weit verbreitet sind, empfehlen wir, eine ganze Mount-Immunostainierung und konfokale Bildgebung als genauere Methode durchzuführen. Nicht nur die Effizienz der lipophilen Farbstofffärbung ist sehr variabel (d.h. einige Zellen sind sehr gut gefärbt, während andere nicht -wahrscheinlich aufgrund des Lipidgehalts ihrer Membranen sind), sondern auch oft lipophile Farbstoffe bilden Aggregate, und abgestorbene Zellen neigen dazu, heller zu sein - und mehrere Artefakte zu schaffen, die mit lebenden Zellen verwechselt werden können.
Zellen können mit fluoreszierenden Proteinen transduziert werden, um bei ihrer Verfolgung zu helfen und die Zellkennzeichnung zu überspringen. Stellen Sie jedoch sicher, dass die transduzierten und nicht transduzierten Zellen die gleichen Ergebnisse in den Zebrafisch-Xenografts produzieren.
Darüber hinaus können Makrophagen diese fluoreszierenden Zellablagerungen phagozyten und fluoreszierend beschriftet werden und migrieren, wodurch falsch positive metastasierende Zellen erzeugt werden. Daher empfehlen wir eine Reihe von Analysewerkzeugen, die natürlich auf viele andere Auslesungen ausgedehnt werden können, um das Tumorverhalten genauer zu interpretieren:
- Proliferation - Quantifizierung von mitotischen Zahlen mit DAPI oder Anti-PHH3Ser10 Antikörper (Merck Millipore Cat. #06-570),
- Zelltod durch Apoptose- Antikörper-Anti-aktivierteCaspase3 Asp175 (Cell Signalling Technologies Cat. #9661) oder gleichwertig,
- Tumorgröße - DAPI-Zählung - menschliche Tumorzellen zeigen eine sehr ausgeprägte Chromatin-Organisation, so dass sie leicht von den Zebrafischzellen unterschieden werden können und immer möglich sind, mit dem Farbstoff zu überprüfen (wenn Sie Ihr Auge trainieren),
- Für metastasierende Studien,um menschliche Zellen eindeutig zu detektieren, - antihumane HLA (Abcam EP1395Y Cat. #ab52922), antihumane Mitochondrien (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Clone 113-1).
Für eine konfokale Erfassung mit einem Intervall von 5 m zwischen den Scheiben im Z-Stack der Kontrollkrebszellen HCT116 (durchschnittliche Kerngröße von 10-12 m Durchmesser) mit DAPI-Gegenfärbung haben wir beobachtet, dass 50 % der Zellen zwischen zwei aufeinanderfolgenden Scheiben aufgeteilt werden. Wenn also jedes Segment gezählt wird, besteht ein hohes Risiko, dass dieselben Zellen zweimal gezählt werden. Das Hin- und Hergehen zwischen Slices, um Probleme bei der Quantifizierung zu vermeiden, führt zu einer zeitaufwändigen und fehleranfälligen Technik. Um die Quantifizierung der Gesamtzahl der Zellen zu erleichtern und mehr Reproduzierbarkeit zwischen Forschern zu ermöglichen, haben wir die zuvor in diesem ProtokollbeschriebeneTumorgrößenformel erstellt 8 .
Wir haben eine Korrekturnummer (1.5) aufgenommen, um die 50 %-Zellen zu berücksichtigen, die zwischen Slices aufgeteilt werden. Wir fanden heraus, dass der durchschnittliche Fehler bei der manuellen Zählung des gesamten Tumors zwischen den Forschern 20% betrug. Zwei Forscher, die die Formel verwendet, hatten einen 2%-Fehler. Die Verwendung dieser Formel hat eine Genauigkeitsrate von 93 % und eine Reproduzierbarkeitsrate von 98 %. Wir haben auch automatisierte Methoden getestet, aber sie zeigten einen Fehler von mehr als 50 %, der durch Schwellenwerteinstellungen verursacht wurde.
Aufgrund der Eigenschaften apoptotischer Zellen ist die Quantifizierung aktivierter Caspase-3-Zellen schwieriger. Um die Anzahl der Fehler und Die Variation der Ergebnisse zu reduzieren, empfehlen wir, dass die Kontroll- und Versuchsproben vom selben Forscher gezählt werden. Darüber hinaus muss ein neuer Forscher beim Erlernen dieser Technik Bilder zählen, die bereits von erfahreneren Forschern quantifiziert wurden, um Ergebnisse zu vergleichen und zu trainieren.
Die Länge des Assays kann bei Bedarf verlängert werden. Es ist jedoch wichtig zu berücksichtigen, dass Zebrafischlarven ab 7 Tagen nach der Befruchtung (5 Tage nach der Injektion) eine lebende Fütterung benötigen. Darüber hinaus können die Tierschutzrichtlinien und -vorschriften für Larven, die älter als 6 Tage nach der Befruchtung sind, variieren.
Dieses Protokoll bietet nützliche Werkzeuge, die es einem einzelnen Forscher ermöglichen, etwa 200-300 Zebrafischlarven pro Stunde zu injizieren; und Ergebnisse für den vollständigen Assay, einschließlich Analyse und statistischer Interpretation, die in drei Wochen erzielt wurden. Wir hoffen, dass dieses Protokoll Forschern helfen kann, Experten bei der Erzeugung von Zebrafisch-Xenografts zu werden. Es ist nicht einfach; Sie müssen üben, aber Sie werden es erreichen. Viel Glück!
Disclosures
nichts
Acknowledgments
Wir danken der Champalimaud Foundation, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, kofinanziert von FCT/Lisboa2020) für die Finanzierung. FCT-Stipendien für VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Alle Mitglieder des Fior Lab für kritische Diskussionen; B. Costa und C. Rebelo de Almeida für den Datenaustausch; und unsere Lab-Mitglieder C. Rebelo de Almeida, M. Barroso und L. Leite für ihre Teilnahme an dem Video. Wir danken der CF Fish Facility (C. Certal, J. Monteiro et al.) und dem Team von Champalimaud Communication, Events and Outreach insbesondere Alexandre Azinheira für die fantastische Filmproduktion und Catarina Ramos und Teresa Fernandes für ihre Hilfe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar for bacteriology | VWR | 97064-336 | Agar plate |
| anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) | Cell Signalling Technologies | 9661 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
| anti-human HLA (Rabbit monoclonal) | Abcam EP1395Y | ab52922 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
| anti- 488 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35552 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
| anti- 594 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35560 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
| CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher Scientific | C34565 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| CellTracker Green CMFDA Dye | ThermoFisher Scientific | C2925 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| Conical Centrifuge tube 50mL | VWR | 525-0610 | |
| Conical Centrifuge tube 15mL | VWR | 525-0604 | |
| DAPI | Nuclear and chromosome counterstain | ||
| Laser-Based Micropipette Puller P-2000 | Sutter-Instrument | Micropipette Puller | |
| Microcentrifuge tube 1.5mL | Abdos | P10202 | |
| Microscope slides, cut edge | RS France | BPB016 | Slides for mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Mounting medium |
| Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | Microinjector |
| Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | Coverslips for mounting |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | Agar plate |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | Borosilicate capillaries |
| TrypLE | Gibco | 12605036 | Enzymatic detachment solution |
| Vaseline | Petroleum jelly for slide sealing | ||
| Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | ThermoFisher Scientific | V22886 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology | ZEISS | Fluorescence Stereo Zoom Microscope | |
| Zeiss LSM 710 | ZEISS | Confocal microscope |
References
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