Hier bieden we een stapsgewijs protocol, met tips om xenograften te genereren en richtlijnen voor tumorgedragsanalyse, whole-mount immunofluorescentie en confocale beeldvorming kwantificering.
Zebravislarven xenografts worden veel gebruikt voor kankeronderzoek om in vivo en real-time studies naar menselijke kanker uit te voeren. De mogelijkheid om de respons op antikankertherapieën (chemo, radiotherapie en biologicals), angiogenese en metastase met eencellige resolutie snel te visualiseren, plaatst het zebravis xenograftmodel als een topkeuze om preklinische studies te ontwikkelen.
De zebravis larvale xenograft assay biedt verschillende experimentele voordelen in vergelijking met andere modellen, maar waarschijnlijk de meest opvallende is de vermindering van de grootteschaal en bijgevolg de tijd. Deze schaalvermindering maakt beeldvorming met één cel mogelijk, het gebruik van een relatief laag aantal menselijke cellen (compatibel met biopten), geneesmiddelenscreenings met een gemiddelde hoge doorvoer, maar maakt vooral een aanzienlijke vermindering van de tijd van de test mogelijk. Al deze voordelen maken de zebravis xenograft assay uiterst aantrekkelijk voor toekomstige gepersonaliseerde geneeskunde toepassingen.
Veel zebravis xenograft protocollen zijn ontwikkeld met een grote diversiteit aan menselijke tumoren; een algemeen en gestandaardiseerd protocol om zebravislarvenlarven efficiënt te genereren ontbreekt echter nog steeds. Hier bieden we een stapsgewijs protocol, met tips om xenografts te genereren en richtlijnen voor tumorgedragsanalyse, whole-mount immunofluorescentie en confocale beeldvorming kwantificering.
Zebravis (Danio rerio) ontpopt zich als een krachtig gewerveld modelorganisme om ontwikkeling en ziekte te bestuderen. Zebravis deelt sterk geconserveerde genetische (~70% genetische homologie en ~84% ziektegerelateerde genen) en fundamentele orgaanmorfologische kenmerken met mensen1,2. Deze conservering maakt het gebruik van zebravissen mogelijk om verschillende menselijke ziekten te modelleren, waaronder kanker3,4.
De behandeling en het onderhoud van zebravissen is veel gemakkelijker en kosteneffectiever dan muizen vanwege hun kleine formaat, hoge vruchtbaarheid het hele jaar door en externe bemesting3,5. Zebravisembryo’s hebben geen levende voeding nodig tijdens hun eerste 5-7 dagen van hun leven en zijn gebruikt als een effectief model voor ontwikkeling, infectie en kanker1,4,6,7. Zebravisembryo’s komen uit na 48 uur na de bevruchting (hpf) en zijn vrijzwemmende dieren met alle gevormde organen, een kloppend hart en functionele bloedsomloop, lever, hersenen, niermerg, enz.1,3. Ook in dit stadium van ontwikkeling is alleen aangeboren immuniteit in het spel, adaptieve immuniteit ontwikkelt zich nog steeds, waardoor een algemene efficiënte engraftment van menselijke cellen mogelijk is zonder gebruik van immunogecompromitteerde mutanten7,8. Niettemin is het belangrijk op te merken dat niet alle menselijke cellen even9 engraferen en dat bijvoorbeeld voor leukemiecellen is aangetoond dat fagocyten (neutrofielen en macrofagen) moeten worden uitgeput voor efficiënte engraftment10.
De genetische tracteerbaarheid van zebravissen en de optische transparantie van de vroege embryonale stadia maken intravitale beeldvorming met één cel mogelijk met een hoge resolutie en dus voor de vaststelling van state-of-the-art beeldvormingstechnieken op verschillende gebieden van de biologie. Bovendien zijn deze kenmerken in de context van kanker nuttig voor realtime studies van de vroegste stadia van gastheer-tumorinteracties, zoals het bestuderen van angiogene en gemetastaseerde mogelijkheden, evenals interacties met het aangeboren immuunsysteem8,9,11,12,13.
Hoewel er in de korte xenografttest geen tijd is voor gemetastaseerde “evolutie”- is het mogelijk om de gemetastaseerde capaciteit van de tumorcellen te analyseren (d.w.z. hun efficiëntie om gemetastaseerde stappen zoals invasie, intravasatie, overleving in omloop, extravasatie en kolonisatie te doorlopen, en daarom deze processen in vivo en in realtime te bestuderen8,11,13,14).
De kenmerken van zijn levenscyclus plaatsen de zebravis als een uniek model voor gepersonaliseerde geneeskunde bij kanker. Assays kunnen in een kortere tijdspanne worden uitgevoerd en resultaten worden verkregen in een paar weken7,8,9,11,12,15,16. De celeriteit en haalbaarheid van deze onderzoeken bieden artsen en onderzoekers de mogelijkheid om translationele resultaten te verkrijgen die nuttig kunnen zijn voor kankerpatiënten, voor wie tijd een essentiële behoefte is.
Ondanks de toenemende pogingen om succesvolle zebravisembryo xenografts te genereren, is er nog steeds behoefte aan de standaardisatie van de injectieprocedure en de evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen en tumorgedrag na injectie.
In dit protocol bieden we onderzoekers een duidelijke en gedetailleerde stapsgewijze handleiding voor de injectie van menselijke kankercellijnen in zebravisembryo’s en daaropvolgende fixatie, immunostaining, beeldvorming en kwantificering van tumorcelgedrag.
Het toenemende belang van de zebravis als model voor kankerontwikkeling en geneesmiddelenscreening heeft geresulteerd in talrijke publicaties3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. De injectie van kankercellen in zebravisembryo’s is echter een techniek die een hoge mate van behendigheid vereist die een uitdaging kan zijn voor onderzoekers. In dit protocol willen we praktische informatie en enkele tips geven die kunnen helpen bij het overwinnen van de eerste uitdagingen van het opzetten van zebravisembryo xenografts.
Celbehandeling eerdere injectie
Dit geoptimaliseerde protocol voor het genereren van zebravis xenografts met cellijnen kan worden aangepast aan verschillende soorten (kanker)cellen met verschillende morfologieën. We raden aan dat alle cellijnen die worden gebruikt voor zebravis xenografts mycoplasma vrij zijn. In tegenstelling tot andere bacteriële besmettingen genereert de aanwezigheid van mycoplasma in celkweek geen veranderingen die gemakkelijk onder de microscoop kunnen worden gedetecteerd22. Mycoplasmabesmetting kan van invloed zijn op het engraftmentpotentieel van de cellijnen, hun gevoeligheid voor geneesmiddelen en de levensvatbaarheid van de zebravisembryo’s.
Hoewel cellen zich gedurende een langere periode kunnen blijven verspreiden, kunnen hun fenotype en genotype gevoelig zijn voor veranderingen. Het is belangrijk om vertrouwd te raken met de morfologie en het gedrag van de cellijnen in cultuur. We raden aan om het aantal celpassages na ontdooiing tussen 3-12 te houden om reproduceerbare resultaten te krijgen. Daarom moeten regelmatig mycoplasmatests worden uitgevoerd.
Cellen moeten zich in hun logfase bevinden (exponentiële groeifase voordat ze samenvloeiing bereiken ~70%) op de dag van de injectie. Dit zal een adequate engraftment en een goede ontwikkeling van de kenmerken van de tumor mogelijk maken. Om variatie in het fenotype van cellen in het xenograft te voorkomen, is het van cruciaal belang om de samenvloeiing voor injectieconstante tussen experimenten te behouden. Het aantal geïnjecteerde cellen kan worden aangepast aan de kenmerken van elke cellijn, omdat sommige hogere dichtheden van injectie vereisen om te gedijen in de zebravisembryo’s.
Overwegingen bij celetikettering
Om menselijke tumorcellen beter te visualiseren voor injectie en toekomstige analyse, kunnen tumorcellen worden geëtiketteerd met fluorescerende kleurstoffen. Vanwege verschillen in celgrootte varieert het totale aantal cellen/cm2 in aanhangend culturen tussen cellijnen. Dit heeft invloed op de effectiviteit van het kleuringsprotocol en het aantal cellen dat voor injectie wordt geoogst. Grote cellen die lage aantallen per kolf (d.w.z. Hs578T) opleveren of in clusters groeien (d.w.z. BFTC905) vereisen het bundelen van meerdere kolven voor één experiment. In dit geval mag de kleuring van cellen niet rechtstreeks in de kolf worden uitgevoerd, omdat dit het gebruik van overmatige hoeveelheden kleurstof (hoge kosten) zal veroorzaken. Aan de andere kant kunnen cellen die zeer gevoelig zijn voor overmatige cycli van centrifugeren en cellen die hoge aantallen per kolf opleveren (d.w.z. HCT116) direct in de kolf worden gekleurd en vervolgens worden losgemaakt met EDTA/celschraper (Zie tabel 1voor meer informatie ).
Gebruik waar mogelijk, in plaats van een enzymatische benadering, EDTA om de cellen op de dag van injectie los te maken, zodat cellen hun celcelverbindingen sneller herstellen en minder centrifugeerstappen krijgen. Niettemin, als de cellen gevoelig zijn voor EDTA, zeer aanhangend zijn of in clusters groeien – kan een enzymatische methode worden toegepast. De optimalisatie van de ideale concentratie voor injectie en het injectiemedium is afhankelijk van de kenmerken van elke cellijn, dus het kan enige aanpassingen nodig hebben (Tabel 1).
Micro-injection kalibratie
In tegenstelling tot de levering van oligonucleotiden of geneesmiddelen in het zebravisembryo, wordt een graticule niet gebruikt om de naald te kalibreren bij het werken met cellijnen voor xenograften. Na enige tijd tijdens de injectie beginnen cellen te verstoppen en is het noodzakelijk om de punt van de naald te snijden om de diameter te vergroten of de naald helemaal te veranderen. Deze procedure belemmert de graticulekalibratie.
Om dit probleem aan te pakken, wordt het aantal toegediende cellen gereguleerd door de uitwerpdruk en de tijd die nodig is om binnen 1-3 pulsen een grootte te bereiken die vergelijkbaar is met het embryooog. Vervolgens, om de tumorgrootte verder te controleren, bij 1 dpi, worden xenografts gesorteerd op basis van de tumorgrootte zoals weergegeven in figuur 6 B-B”. Zoals weergegeven in figuur 6C voorbeeld, is deze sorteermethode efficiënt in het verminderen van de variatie van tumorgroottes: als we ze allemaal samen bundelen (+, ++, +++) is de STEV ~het dubbele van de ++-klasse (~906 cellen tot ~422 cellen) en de coëfficiëntvariatie is ~31,9% in vergelijking met 14,5% in de ++-klasse. Aangezien de referentie voor injectie volume is, varieert het totale aantal cellen sterk tussen celtypen – afhankelijk van de grootte en vorm van de cellen. Grote cellen met veel cytoplasma zoals borstkanker Hs578T produceren bijvoorbeeld veel kleinere tumoren (~ 600 cellen). Elke cellijn vereist ook een ander aantal cellen. Zo hebben de HT29 CRC- en RT112-cellijnen voor urineblaaskanker aangetoond dat hoe hoger het aantal geïnjecteerde cellen, hoe hoger de zebravissterfte. Daarom is een periode van optimalisatie tijdens het ontwikkelen van de xenograften nodig om te testen of de cellijn toxische effecten in het embryo heeft of hogere / lagere dichtheden van injectie vereist.
Injectieplaats
Een van de meest voorkomende discrepanties bij het genereren van zebravisembryo xenografts is de injectieplaats. De dooier is meestal de plaats bij uitstek voor injectie vanwege de gemakkelijke toegankelijkheid. We hebben echter waargenomen dat cellen die in de dooier worden geïnjecteerd een hogere neiging hebben om te sterven. Hoewel technisch moeilijker, raden we aan om de PVS in te injecteren en zo ver mogelijk van het hart. Binnen het PVS kunnen cellen zich aggregeren, vaten en immuuncellen rekruteren en migreren, intravaseren, extravaseren en micrometastase vormen, als ze gemetastaseerde kenmerkenvertonen 8,11.
Engraftment efficiëntie
Verschillen in de engraftmentefficiëntie en tumorgrootte tussen cellijnen bij 4 dpi worden verwacht vanwege hun verschillende mate van basale celdood / overleving / proliferatie, maar ook vanwege de aangeboren immunogeniciteit die elke cellijn kan weergeven9.
uitzaaiing
Metastase bestaat uit een multistep cascade van gebeurtenissen die kan worden onderverdeeld in twee willekeurige stadia. In de eerste fase moeten tumorcellen loskomen van de primaire plaats, migreren en aangrenzende weefsels binnendringen en vervolgens in de bloedbaan intravaseren. In de tweede fase moeten tumorcellen overleven in de bloedsomloop, extravaseren uit het bloed of de lymfevaten en uiteindelijk koloniseren op secundaire plaatsen23. Om onderscheid te maken tussen deze vroege en late gebeurtenissen en de potentiële/ vaardigheid van de verschillende tumorcellen aan te pakken om deze stappen uit te voeren, hebben we een eenvoudige test ontworpen.
Over het algemeen kunnen tumorcellen, wanneer ze in het PVS worden geïnjecteerd, direct in de circulatie komen en vervolgens fysiek vast komen te zitten in het caudale hematopoëtische weefsel (CHT) (staartgebied). Volgens de kenmerken van elke tumorcel hebben we echter gezien dat sommige tumorcellen op de CHT 4 dpi blijven en micrometastase kunnen vormen terwijl andere tumorcellen verdwijnen (gewist nadat ze in de CHT zijn gevangen).
Daarom kunnen we, door de efficiëntie van micrometastasen (bij 4 dpi) te vergelijken wanneer cellen direct in omloop werden gebracht – CIRC (cellen hoeven alleen de late stappen van metastase te doorlopen) versus wanneer niet – GEEN CIRC (cellen moeten vroege en late stappen doorlopen om een micrometastase te kunnen vormen) kunnen we hun vroege of late gemetastaseerde potentieel beoordelen. We hebben tumorcellen waargenomen die efficiënt micrometastase in de CHT kunnen vormen in beide groepen (CIRC en NO CIRC), wat suggereert dat deze cellen de capaciteit hebben om alle stappen van de gemetastaseerde cascade (SW480 en MDA-MB-468 bijvoorbeeld)8,11te ondergaan. Andere tumorcellen daarentegen hebben een zeer laag gemetastaseerd potentieel in beide groepen, waardoor ze bijna nooit micrometastase maken, zelfs wanneer ze in omloop worden geïnjecteerd (d.w.z. zichtbaar in de CHT bij 24 hpi, maar bij 4 dpi zijn ze er niet meer, Hs578T bijvoorbeeld)8. We hebben echter duidelijk een andere groep gevonden – een groep die alleen micrometastase kan vormen wanneer deze in omloop wordt geïnjecteerd (we kunnen alleen micrometastase in de CIRC-groep waarnemen). Dit suggereert dat deze cellen een lage efficiëntie hebben bij het uitvoeren van de eerste stappen van de gemetastaseerde cascade, maar aan de andere kant in staat zijn om in omloop te overleven, een verre locatie te extravaseren en te koloniseren.
Immunostaining en beeldvorming
Vóór fixatie kan dit injectieprotocol worden gebruikt voor andere live beeldvormingsbenaderingen zoals DIC-microscopie (Live Differential Interference Contrast), spinning disk microscopie, live confocale beeldvorming met hoge resolutie en microscopie van lichtplaten, enz.
Dode cellen en cellulair puin lijken helder wanneer ze worden waargenomen door de fluorescerende stereomicroscoop en kunnen worden verward met levende cellen, vooral als het doel van de studie is het gemetastaseerde potentieel van de cellijnen te beoordelen. We willen het belang benadrukken van het uitvoeren van confocale beeldvorming met specifieke levensvatbaarheidsmarkers en DAPI om de overlevingstoestand van de tumor en micrometastase te beoordelen. Het is ook van fundamenteel belang om specifieke menselijke antilichamen te gebruiken om menselijke cellen zoals anti-menselijke mitochondriën of anti-menselijke HLA te detecteren. Train bij het implementeren van het protocol experimenteerogen door de kleuring in de stereomicroscoop te vergelijken met de confocale beelden. Na enige tijd kunnen experimenteerders vuil duidelijk onderscheiden van levende cellen in de fluorescerende stereomicroscoop.
Hoewel andere methoden om tumorlast te kwantificeren, zoals het hele fluorescentiegebied, veel worden gebruikt, raden we aan om whole mount immunostaining en confocale beeldvorming uit te voeren als een nauwkeurigere methode. Niet alleen de efficiëntie van lipofiele kleurstofkleuring is zeer variabel (d.w.z. sommige cellen zijn zeer goed gekleurd, terwijl andere niet – waarschijnlijk vanwege het lipidegehalte van hun membranen), maar ook vaak lipofiele kleurstoffen vormen aggregaten, en dode cellen hebben de neiging helderder te zijn – waardoor verschillende artefacten ontstaan die kunnen worden verward met levende cellen.
Cellen kunnen worden getransduceerd met fluorescerende eiwitten om te helpen bij het volgen en om celetikettering over te slaan. Zorg er echter voor dat de transduceerde en niet-transduceerde cellen dezelfde resultaten produceren in de zebravis xenografts.
Bovendien kunnen macrofagen deze fluorescerende celresten fagocyten die fluorescerend worden gelabeld en migreren, waardoor vals-positieve gemetastaseerde cellen worden gegenereerd. Daarom raden we een reeks analytische tools aan, die natuurlijk kunnen worden uitgebreid tot vele andere uitlezingen voor een nauwkeurigere interpretatie van tumorgedrag:
Voor een confocale verwerving met een interval van 5 μm tussen segmenten in de Z-stack van de controlekankercellen HCT116 (gemiddelde nucleaire grootte van 10-12 μm diameter) met DAPI-tegenstaining, hebben we waargenomen dat ~ 50% van de cellen wordt gedeeld tussen twee opeenvolgende segmenten. Daarom, als elk segment wordt geteld, is er een hoog risico om dezelfde cellen twee keer te tellen. Heen en weer gaan tussen segmenten om problemen bij kwantificering te voorkomen, resulteert in een tijdrovende en foutgevoelige techniek. Om de kwantificering van het totale aantal cellen te vergemakkelijken en meer reproduceerbaarheid tussen onderzoekers mogelijk te maken, hebben we de tumorgrootteformule gemaakt die eerder in dit protocol is beschreven8.
We hebben een correctienummer (1,5) opgenomen om rekening te houden met de ~ 50% cellen die tussen segmenten worden gedeeld. We ontdekten dat de gemiddelde fout van handmatig tellen van de hele tumor tussen onderzoekers 20% was. Twee onderzoekers die de formule gebruikten, hadden een fout van 2%. Het gebruik van deze formule heeft een nauwkeurigheidspercentage van 93% en een reproduceerbaarheidspercentage van 98%. We hebben ook geautomatiseerde methoden getest, maar ze toonden een fout aan die hoger was dan 50% veroorzaakt door drempelinstellingen.
Vanwege de kenmerken van apoptotische cellen is de kwantificering van geactiveerde Caspase 3-cellen moeilijker. Om het aantal fouten en variatie in resultaten te verminderen, raden we aan dat de controle- en experimentele monsters door dezelfde onderzoeker worden geteld. Bovendien moet een nieuwe onderzoeker bij het leren van deze techniek afbeeldingen tellen die al door meer ervaren onderzoekers zijn gekwantificeerd om resultaten te vergelijken en te trainen.
De lengte van de test kan indien nodig worden verlengd. Het is echter belangrijk om te overwegen dat zebravislarven levende voeding nodig hebben vanaf ~ 7 dagen na bevruchting (5 dagen na injectie). Bovendien kunnen de richtlijnen en voorschriften voor dierenwelzijn die van toepassing zijn op larven ouder dan 6 dagen na bevruchting variëren.
Dit protocol biedt handige tools om een enkele onderzoeker in staat te stellen ongeveer ~ 200-300 zebravislarven per uur te injecteren; en resultaten voor de volledige test, met inbegrip van analyse en statistische interpretatie, verkregen in drie weken. We hopen dat dit protocol onderzoekers kan helpen experts te worden in het genereren van zebravis xenografts. Het is niet gemakkelijk; je moet oefenen, maar je komt er wel. Succes!
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Champalimaud Foundation, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, medegefinancierd door FCT/Lisboa2020) voor de financiering. FCT fellowships voor VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Alle leden van het Fior Lab voor kritische discussies; B. Costa en C. Rebelo de Almeida voor het delen van gegevens; en onze Lab-leden C. Rebelo de Almeida, M. Barroso en L. Leite voor hun deelname aan de video. We willen de CF Fish Facility (C. Certal, J. Monteiro et al) en champalimaud communication, events en outreach team in het bijzonder Alexandre Azinheira bedanken voor het fantastische maken van films en Catarina Ramos en Teresa Fernandes voor hun hulp.
Agar for bacteriology | VWR | 97064-336 | Agar plate |
anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) | Cell Signalling Technologies | 9661 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti-human HLA (Rabbit monoclonal) | Abcam EP1395Y | ab52922 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti- 488 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35552 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
anti- 594 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35560 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher Scientific | C34565 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
CellTracker Green CMFDA Dye | ThermoFisher Scientific | C2925 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Conical Centrifuge tube 50mL | VWR | 525-0610 | |
Conical Centrifuge tube 15mL | VWR | 525-0604 | |
DAPI | Nuclear and chromosome counterstain | ||
Laser-Based Micropipette Puller P-2000 | Sutter-Instrument | Micropipette Puller | |
Microcentrifuge tube 1.5mL | Abdos | P10202 | |
Microscope slides, cut edge | RS France | BPB016 | Slides for mounting |
Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Mounting medium |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | Microinjector |
Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | Coverslips for mounting |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | Agar plate |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | Borosilicate capillaries |
TrypLE | Gibco | 12605036 | Enzymatic detachment solution |
Vaseline | Petroleum jelly for slide sealing | ||
Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | ThermoFisher Scientific | V22886 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology | ZEISS | Fluorescence Stereo Zoom Microscope | |
Zeiss LSM 710 | ZEISS | Confocal microscope |