gP2S, et informationsstyringssystem til CryoEM-eksperimenter

Summary

gP2S er en webapplikation til sporing af kryoEM-eksperimenter. Dens vigtigste funktioner er beskrevet, ligesom de trin, der kræves for at installere og konfigurere applikationen. Når det er konfigureret, giver applikationen en mulighed for nøjagtigt at registrere metadata, der er forbundet med negative plet- og kryoEM-eksperimenter.

Abstract

Kryogene elektronmikroskopi (cryoEM) er blevet en integreret del af mange lægemiddelopdagelsesprojekter, fordi krystallografi af proteinmålet ikke altid er opnåeligt, og cryoEM giver et alternativt middel til at understøtte strukturbaseret liganddesign. Når der beskæftiger sig med et stort antal forskellige projekter, og inden for hvert projekt et potentielt stort antal ligand-protein co-strukturer, nøjagtig registrering hurtigt bliver udfordrende. Mange eksperimentelle parametre er indstillet for hvert mål, herunder ved prøveforberedelsen, gitterforberedelse og mikroskopistadier. Derfor kan nøjagtig registrering være af afgørende betydning for at muliggøre langsigtet reproducerbarhed og for at lette effektivt teamwork, især når trin i cryoEM-arbejdsgangen udføres af forskellige operatører. For at hjælpe med at håndtere denne udfordring udviklede vi et webbaseret informationsstyringssystem til cryoEM, kaldet gP2S.

Ansøgningen holder styr på hvert forsøg, fra prøve til endelig atommodel, i forbindelse med projekter, en liste, som opretholdes i ansøgningen, eller eksternt i et separat system. Brugerdefinerede styrede ordforråd for forbrugsvarer, udstyr, protokoller og software hjælper med at beskrive hvert trin i cryoEM-arbejdsgangen på en struktureret måde. gP2S kan i vid udstrækning konfigureres og kan, afhængigt af teamets behov, eksistere som et selvstændigt produkt eller være en del af et bredere økosystem af videnskabelige applikationer, der via REST API'er integreres med projektstyringsværktøjer, applikationer, der sporer produktionen af proteiner eller af små molekyler, eller applikationer, der automatiserer dataindsamling og -lagring. Brugere kan registrere oplysninger om hver gitter- og mikroskopisession, herunder vigtige eksperimentelle metadata og parameterværdier, og afstamningen af hver eksperimentel artefakt (prøve, gitter, mikroskopisession, kort osv.) registreres. gP2S fungerer som en cryoEM eksperimentel arbejdsgangsarrangør, der muliggør nøjagtig registrering for teams og er tilgængelig under en open source-licens.

Introduction

Informationsstyring på cryoEM-faciliteter
Fra og med 2014 er antallet af kryogene elektronmikroskopi (kryoEM)^{1-faciliteter} vokset eksplosivt, med mindst 300 avancerede systemer installeret rundt om i verden², herunder i en række farmaceutiske virksomheder, hvilket afspejler en voksende rolle for cryoEM i lægemiddelforskning³. Disse faciliteters opgaver og deres krav til datasporing og -styring er^{forskellige 4}. Nogle, for eksempel nationale cryoEM-centre, har til opgave at modtage EM-net, indsamle datasæt og returnere data til brugerne til strukturbestemmelse, måske efter en automatiseret billedbehandling. I sådanne anlæg er sporing af nettets herkomst, dets tilknytning til et brugerforslag eller tilskud og afstamning fra gitter til datasæt afgørende, men andre faktorer, såsom metoden til rensning af proteinprøven eller den endelige strukturbestemmelsesproces, er mindre eller slet ikke relevante. I andre faciliteter, såsom lokale akademiske faciliteter, er hver slutbruger ansvarlig for at udarbejde deres egne prøver og net, gennemføre mikroskopi, styre de rå data og dens behandling og offentliggøre resultaterne. Der er ikke noget strengt behov for metadatasporing fra en sådan facilitets side, fordi denne rolle opfyldes af slutbrugeren eller dennes principal investigator.

I vores kryoEM-facilitet centraliseres håndtering og optimering af prøver, gitre, dataindsamlings- og behandlingsprotokoller og resultater (kort, modeller) på tværs af mange projekter på en lille gruppe praktikere. Dette giver udfordringer i eksperimentel (meta)datastyring. Den eksperimentelle afstamning af strukturer, fra atommodel helt tilbage til den nøjagtige identitet af proteiner og ligands, via gitterforberedelsesparametre og dataindsamlingsprotokoller, skal registreres og bevares nøjagtigt. Disse metadata skal gøres tilgængelige for en række menneskelige operatorer. For eksempel kan en person, der laver billedbehandling, have brug for at vide, hvilken konstruktion af et protein der blev brugt, og hvad billedparametrene var, selvom de hverken rensede proteinet eller selv indsamlede cryoEM-dataene; informatiksystemer såsom automatiserede datastyrings dæmoner skal identificere det projekt, som et mikroskop i øjeblikket indsamler data for, for korrekt og systematisk at tildele mappenavne.

Der findes flere informationsstyringssystemer til støtte for cryoEM-faciliteter. Måske mest komplette blandt dem er EMEN2⁵, som kombinerer funktioner i en elektronisk lab notebook, et information management system, og nogle elementer i en forretningsproces management værktøj. Bruges på mange synkrotroner, ISPyB⁶, oprindeligt bygget til at understøtte røntgenstrålelinjer til krystallografi, understøtter nu også cryoEM dataindsamling. Scipion⁷ er en rig og kraftfuld indpakning omkring billedbehandling pakker, som giver brugerne mulighed for at optage billedbehandling arbejdsgange og dele dem, for eksempel via det offentlige depot EMPIAR^8,9, og er også integreret med ISPyB at muliggøre on-the-fly cryoEM databehandling.

Her beskriver vi gP2S (for Genentech Protein to Structure), et moderne og let cryoEM information management system bygget til at understøtte arbejdsgangen fra renset protein og lille molekyle ligand frem til den endelige atommodel.

Oversigt over gP2S
gP2S er et brugervenligt webbaseret cryoEM-informationsstyringssystem, der letter nøjagtig registrering af cryoEM-laboratorier og multibruger- og multiprojektfaciliteter. Følgende enheder, deres relationer og tilknyttede metadata spores: projekter, udstyr, forbrugsvarer, protokoller, prøver, gitre, mikroskopisessioner, billedbehandlingssessioner, kort og atommodeller. Brugerne kan også tilføje fritekstkommentarer, herunder eventuelt vedhæftede filer, hvilket giver mulighed for omfattende anmærkninger af alle objekter, der er registreret i gP2S. Frontend er designet til at lette brugen med touchscreen-enheder og testet grundigt på 12,9 "iPad Pros, hvilket gør det muligt at bruge gP2S på laboratoriet bænk, mens du forbereder prøver og gitre (Figur 1), samt ved computeren, når du betjener mikroskopet, behandling af billeder eller deponering modeller. Hver side i frontend har til formål at reducere manuel indtastning af data ved at forudindstille parametre til fornuftige standardværdier, når det er muligt.

Backend af gP2S har en række HVILE API-slutpunkter (REpresentational State Transfer Application Programming Interface), hvilket gør det muligt at integrere gP2S i eksisterende arbejdsprocesser og scripts. Datamodellen er designet til at muliggøre nøjagtig registrering af negative pletter og kryoEM-arbejdsprocesser, herunder forgrening, for eksempel med en prøve, der bruges på flere gitre, data fra flere mikroskopisessioner, der flettes ind i en enkelt databehandlingssession, eller en databehandlingssession, der giver flere kort.

Systemarkitektur
gP2S er et klassisk tredelt program (Figur 2). I denne modulopbyggede arkitektur er systemet opdelt i tre separate lag, der hver især er ansvarlige for at udføre forskellige opgaver, og hver udskiftelig eller modificerbar uafhængigt af de andre. (1) Præsentationslaget (eller frontend) giver brugeren adgang via webbrowser (grundigt testet med Chrome og Safari), giver mulighed for at oprette og ændre arbejdsgangselementer (herunder datavalidering) og viser eksperimentelle data som individuelle enheder, projektbaserede lister og fulde arbejdsprocesrapporter. (2) Tjenestelaget (eller backend) fungerer som et mellemliggende lag mellem brugergrænsefladen og lagringssystemet - det har kerneforretningslogik, udsætter den tjeneste-API, der bruges af frontend, integreres med datalagring og LDAP (Lightweight Directory Access Protocol) system til brugergodkendelse og danner grundlag for yderligere integration med eksterne systemer. (3) Persistenslaget (dataadgang) er ansvarligt for lagring af eksperimentelle data, brugerkommentarer og vedhæftede filer.

Nøgleteknologier og -rammer
For at lette udviklingen, opførelsen og vedligeholdelsen af gP2S-applikationen blev der anvendt flere teknologier og rammer i projektet. De vigtigste er: Vue.js 2.4.2¹⁰ for frontend og SpringBoot 1,3¹¹ med indlejret Tomcat 8 server til backend. Programmet bruger MySQL 5.7- og MongoDB 4.0.6-databaser til lagring og LDAP¹² til godkendelse. Som standard leveres og installeres alle disse komponenter som ét program.

I alt bruger applikationen hundredvis af forskellige biblioteker enten direkte eller indirekte. De mest fremtrædende er anført i tabel 1.

Datamodel
Der kan skelnes mellem tre typer enheder i gP2S-datamodellen (figur 3): arbejdsgangsenheder relateret til data indsamlet under forsøg (f.eks. prøver eller mikroskopisessioner); udstyr og protokolenheder, der beskriver data, der er fælles for alle projekter (f.eks. mikroskoper eller vitrifikationsprotokoller) andre enheder, der spiller støttende eller tekniske roller i systemet (f.eks. kommentarer eller standardværdier).

Roden af arbejdsprocesdatatræet er objektet Project. Hvert projekt består af en række proteiner og/eller ligands, der er byggesten til oprettelse af sample-enheder. Hvert eksempel kan bruges til at oprette flere gitre, som igen bruges i mikroskopisessioner (et gitter pr. mikroskopisession). Sidstnævnte er tildelt behandlingssessioner, der kan give et eller flere kort. Den sidste enhed i træet er atommodellen, der er oprettet ved hjælp af et eller flere kort. Som følge heraf er alle arbejdsgangsrelaterede objekter, fra protein til model, altid bundet til et bestemt projekt via dets forfædre. Et sådant design skaber dataaggregater, der er nemme at behandle enten ved frontend-modulet eller ved hjælp af eksterne systemer ved hjælp af API'en.

Ud over arbejdsprocesdata er der objekter, der beskriver udstyr, der bruges i eksperimenter eller protokoller, der blev fulgt under forberedelse af gitre. Det er en forudsætning at definere disse objekter for at oprette eksperimentelle arbejdsprocesobjekter, f.eks.

Den sidste type dataenhed, der samlet kaldes "Andet", bruges til tekniske formål (f.eks. vedhæftede filer eller standardværdier). Denne kategori omfatter kommentarobjekter, der kan knyttes til alle arbejdsprocesser eller udstyrs-/protokolobjekter.

Softwaretilgængelighed
Open source-versionen af gP2S er tilgængelig under en Apache License Version 2.0²⁶fra https://github.com/arohou/gP2S. Et Docker-billede til at køre gP2S er tilgængeligt fra https://hub.docker.com/r/arohou/gp2s. En lukket kildeafdeling af gP2S er under fortsat udvikling hos Roche &Genentech.

Kørsel af gP2S-programmet
Der er to måder at køre gP2S på: som docker-objektbeholder eller som et enkeltstående Java-program. Det optimale valg afhænger af destinationsinstallationsmiljøet. Hvis for eksempel muligheden for at tilpasse eller forbedre koden, så den passer til brugernes specifikke behov, ønskes, skal hele applikationen først genbygges. I dette tilfælde anbefales det at køre gP2S som et enkeltstående program.

Havnecontainer
Den nemmeste måde at begynde at arbejde med gP2S-programmet på er at køre det som en Docker-tjeneste. Til dette formål er et dedikeret Docker-billede blevet forberedt og offentliggjort i Docker Hub-lageret ("https://hub.docker.com/r/arohou/gp2s"). Kørsel af gP2S-afbildningen afhænger af adgangen til MySQL- og MongoDB-databaser og til en LDAP-server. I forbindelse med ikke-produktionsmiljø anbefales det at køre alle disse afhængigheder som Docker-programmer med flere containere sammen med gP2S-programmet. For at gøre dette problemfrit er der udarbejdet og leveret en docker-compose-fil (https://github.com/arohou/gP2S/blob/master/docker-compose.yml), der indeholder alle nødvendige konfigurationer af det endelige miljø, i gP2S GitHub-lageret (https://github.com/arohou/gP2S). Følgende docker billeder er afhængigheder: mysql²⁷, mongodb²⁸, apacheds²⁹.

I standardkonfigurationen slettes alle gemte data, både objekter og vedhæftede filer, når dockercontainerne fjernes. For at opbevare dataene skal der enten bruges dockervolumener, eller gP2S-applikationen skal være forbundet med dedikerede databaseforekomster (MySQL og MongoDB). ApacheDS LDAP-serverbeholderen leveres med en forudkonfigureret administratorbruger (adgangskode: hemmelighed). Disse legitimationsoplysninger skal bruges til at logge på gP2S-programmet, når det køres som en Docker-tjeneste. Til produktionsmiljøer kan den samme docker-komponere fil bruges til at implementere gP2S (og andre beholdere, hvis det er nødvendigt) som tjenester til en Docker Swarm container orkestreringsplatform.

Den fulde proces med at køre gP2S som en Docker-beholder, herunder alle detaljer om korrekt konfiguration, er beskrevet i gP2S GitHub-lageret og dækker følgende emner:

• Kørsel af det dockeriserede gP2S-program med alle afhængigheder.
• Adgang til gP2S-programmet, databasen og LDAP.
• Opdatering af gP2S-tjenesten med en ny version.
• Fjernelse af gP2S-program.
• Konfiguration af datavedholdenhed.
• Tilslutning af det dockeriserede gP2S-program til dedikerede databaser eller en LDAP-server.
• Oplysninger om konfiguration

Enkeltstående Java-program
En anden mulighed for at køre gP2S-applikationen er at opbygge en selvstændig Java-pakke. Denne fremgangsmåde bør anvendes, hvis det ikke er muligt at køre Docker-containere. Opbygning af gP2S-programmet kræver installation af en Java Development Kit version 8 eller nyere. Hele byggeprocessen administreres af maven-værktøjet, som leveres i kodebasen i GitHub-lageret. Build konfiguration er parat til at bygge frontend del først, derefter kopiere den til backend kilder, og derefter bygge det som en endelig ansøgning. På denne måde er der ingen grund til at installere andre værktøjer eller biblioteker for at forberede en fuldt fungerende gP2S-pakke. Resultatet af buildet er som standard en JAR-pakke (gemt lokalt) og Docker-billede (skubbet til lageret konfigureret i Maven pom.xml-filen). Det er vigtigt at huske, at de oplysninger, der kræves for at oprette forbindelse til eksterne systemer (databaser og LDAP-server), skal angives i en korrekt konfigurationsfil, før pakken bygges.

Når gP2S JAR-pakken er oprettet, indeholder den alle afhængigheder og konfigurationsoplysninger, der er nødvendige for at køre programmet, herunder Tomcat-applikationsserveren, der er vært for systemet. Hvis pakken er bygget med flere konfigurationsfiler, kan den køres i forskellige tilstande uden at genopbygge.

GP2S GitHub-lageret indeholder en komplet beskrivelse af processen med at opbygge og køre gP2S som et enkeltstående program og dækker følgende emner:

• Opbygning af gP2S ved hjælp af mavenværktøjet
• Opbygning og kørsel med integrerede databaser
• Opbygning og kørsel med afhængigheder, der er installeret som dockercontainere
• Opbygning og kørsel med dedikerede databaser
• Konfiguration af godkendelse

Protocol

1. Opsætning af gP2S til arbejde

1. Log på gP2S. Efter vellykket login vises hovedskærmen.
   BEMÆRK: I øverste højre hjørne vises brugernavnet - klik på dette for at logge ud. Navigationslinjen i venstre side består af en projektvælger (øverst), et sæt navigationselementer, der viser de eksperimentelle enhedstyper, der definerer cryoEM-arbejdsprocessen (Eksempler, Gitre, mikroskopsessioner, behandlingssessioner, kort og modeller) og et link til afsnittet Indstillinger i programmet.
2. Før der kan logføres eksperimenter, skal du udfylde afsnittet Indstillinger med oplysninger om de projekter, udstyr, forbrugsvarer, software og protokoller, der er i brug på cryoEM-faciliteten. Indstillinger kan opdateres når som helst ved at tilføje nye værktøjer og projekter og ved at redigere de eksisterende poster. Men ligesom alle objekter i gP2S kan indstillingsenheder ikke slettes, når de er oprettet.

2. Konfigurer mindst ét projekt

1. Gå til Indstillinger > projekter.
2. Klik på Opret nyt projekt.
3. Skriv en Projektetiket.
4. Klik på Gem.

3. Konfigurer mindst én overfladebehandlingsmaskine.

BEMÆRK: Overfladebehandlingsmaskiner bruges til at ændre overfladeegenskaberne for EM-net - oftest er de glødudladnings- eller plasmarensere.

1. Vælg Overfladebehandlingsmaskinei afsnittet Udstyr .
2. Klik på Opret ny computer.
3. Angiv en etiket, som skal bruges til at identificere maskinen senere.
4. Angiv producent, model og placering.
5. Klik på Gem.

4. Registrer mindst én gittertype.

BEMÆRK: Gittertyper er beregnet til at identificere modeller af gitre (f.eks. "2-μm holey carbonfilm på 300-mesh kobbernet"), ikke specifikke partier eller masser af net

1. Vælg Gittertypei sektionen Forbrugsvarer .
2. Klik på Opret ny gittertype.
3. Angiv en gittertypeetiket, producent og beskrivelse.
4. Klik på Gem.

5. Registrer mindst én vitrifikationsmaskine

1. Vælg Vitrifikationsmaskinei sektionen Udstyr .
2. Klik på Opret ny maskine.
3. Angiv producent, model og placering.
4. Klik på Gem.

6. Registrer mindst ét blotting-papir

1. Vælg Blotting Paperi sektionen Forbrugsvarer .
2. Klik på Opret nyt blottingpapir.
3. Indtast en blotting-papiretiket, producent og model.
4. Klik på Gem.

7. Registrer mindst én Cryo-lagerenhed

1. Vælg Cryo Storage Devicei sektionen Udstyr .
2. Klik på Opret ny lagerenhed.
3. Angiv enhedens producent, model og placering.
4. Indstil til/fra-parametrene for at angive, om den ekstra lagerenhed har cylindre, rør og/eller bokse.
   BEMÆRK: Hvis det sker, vil gP2S lade brugerne angive relevante cylinder-, rør- og/eller kasse-identifikatorer senere, når brugerne logger lagerplaceringerne for de enkelte net. Med ovenstående stykker udstyr og forbrugsvarer oprettet, er det muligt at oprette tre typer protokoller - overfladebehandling, negativ plet og vitrificering.

8. Registrer mindst én overfladebehandlingsprotokol

1. Vælg Overfladebehandlingi sektionen Protokoller .
2. Klik på Opret ny protokol.
3. Angiv en etiket, der identificerer protokollen.
4. Vælg en af overfladebehandlingsmaskinerne.
5. Angiv indstillinger, der bruges i denne protokol: varighed, strøm og polaritet af udledningen og tryk samt eventuelle tilsætningsstoffer i atmosfæren.
6. Klik på Gem.

9. Opret mindst én negativ plet protokol

1. Vælg Negativ pleti sektionen Protokoller .
2. Klik på Opret ny protokol.
3. Angiv en protokoletiket.
4. Beskriv pletten ved at give værdier for sit navn, pH og koncentration af heavy metal-salt.
5. Angiv inkubationstiden for pletten før blotting.
6. Angiv en fritekstbeskrivelse af protokollen.
7. Klik på Gem.

10. Registrer mindst én gitterfrysningsprotokol

1. Vælg Vitrifikationi sektionen Protokoller .
2. Klik på Opret ny protokol.
3. Angiv en protokoletiket.
4. Vælg den relevante vitrifikationsmaskine på rullelisten.
5. Vælg det blottingpapir, der bruges i denne protokol.
6. Derefter giver de resterende eksperimentelle oplysninger: relativ luftfugtighed, temperatur, skampletkraft, antal pletter, skamplet tid, ventetid, dræningstid, antal prøveapplikationer.
7. Angiv en fritekstbeskrivelse.
8. Klik på Gem.
   BEMÆRK: Når protokollerne er konfigureret, er det muligt at oprette både kryo- og negative pletgitter. Hvis du vil bruge gP2S til at registrere de næste trin i arbejdsprocessen, startende fra mikroskopsessioner, er det nødvendigt at konfigurere et mikroskop, en elektrondetektor og en prøveholder.

11. Registrer mindst ét mikroskop

1. Vælg Mikroskopi sektionen Udstyr .
2. Klik på Opret nyt mikroskop.
3. Skriv en mikroskopetiket.
4. Angiv producent, model og placering.
5. Vælg, hvilke accelerationsspændinger der er konfigureret og brugbare på dette mikroskop, ud af den forudindstillede liste på 80, 120, 200 og 300 kV.
6. Angiv listen over installerede kondensator ("C2") og objektive åbninger. BEMÆRK: For hver type kan der konfigureres op til 4 blændepladser, hvoraf den ene er angivet som standardåbning for dette mikroskop. For de objektive åbninger anføres det, at en eller flere af åbningerne tages op af en faseplade, i hvilket tilfælde diameterparameteren er deaktiveret.
7. Angiv, om dette mikroskop er udstyret med en autoloader eller kræver en sideindgangsholder.
8. Angiv, om mikroskopet er udstyret med et energifilter.
9. Angiv standardværdier for ekstraktionsspænding, indstilling af kanonlinser, staffagestørrelse og energifilterspaltebredde (hvis relevant). De angivne værdier bruges, når brugerne opretter mikroskopisessioner.

12. Registrer mindst én elektrondetektor

1. Vælg Elektrondetektori afsnittet Udstyr .
2. Klik på Opret ny elektrondetektor.
3. Angiv en etiket, producent og model.
4. Vælg det mikroskop, som denne detektor er monteret på, på en rulleliste.
5. Tilføj mindst én forstørrelse, der er kalibreret til denne kombination af mikroskopdetektorer:
   1. Vælg Tilføj nyunder forstørrelser.
   2. Angiv både nominelle og kalibrerede forstørrelsesværdier.
   3. Gentag disse trin for alle forventede forstørrelsesindstillinger. Disse forstørrelsesindstillinger vil senere være tilgængelige i en rullevælger for brugere, der logger mikroskopsessioner.
6. Brug afkrydsningsfelter til at angive, om detektoren er i stand til elektrontælling, dosisfraktionering og superopløsning.
7. Endelig skal du angive yderligere specifikationer for detektoren: tælle-per-elektronfaktor (det gennemsnitlige antal optællinger registreret ved hændelseselektron), den lineære dimension af hver pixel (i μm) og antallet af rækker og kolonner af pixel.
8. Klik på Gem

13. Hvis der er et eller flere mikroskoper, der kræver sideindtastningsprøveholdere, skal de tilgængelige prøvetagere registreres i gP2S.

1. Vælg Prøveholderi sektionen Udstyr .
2. Klik på Opret ny holder.
3. Angiv en etiket, producent, model og placering.
4. Angiv den maksimale hældning (i grader) for prøveholderen.
5. Brug afkrydsningsfelterne til at angive, om det er i stand til at holde kryogene EM-gitre, og om det er i stand til toakse vippe.
6. Vælg alle de mikroskoper, som holderen kan bruges til, på en rulleliste.
   BEMÆRK: Dette vil sikre, at kun relevante indehavere er opført, når brugerne registrerer mikroskopsessioner ved hjælp af sideindgangsmikroskoper.
7. Klik på Gem.

14. Angiv det mønster, som gP2S skal følge ved angivelse af det mappenavn, der er knyttet til hver mikroskopisession.

BEMÆRK: Det kan være meget nyttigt at have gP2S automatisk generere en mappe navn til lagring af billeddata optaget under en mikroskopi Session. Dette sikrer systematisk, informationsrig navngivning af lagermapper. Angiv det mønster, som gP2S skal følge ved angivelse af det mappenavn, der er knyttet til hver mikroskopisession.

1. Vælg Indstillingeri sektionen Administrator .
2. Rediger mappenavnmønsterstrengen.
   BEMÆRK: Denne streng kan indeholde følgende variabler: projektetiket, gitter-id, gitteretiket, mikroskopisessionsetiket, mikroskopsessions-id, startdato for mikroskopsession, mikroskopetiket, afgrænset af ${}. Bortset fra disse variabler kan mappenavnemønstre indeholde de fleste tegn. Standardmappenavnet er f.eks. Nu er der konfigureret tilstrækkelige indstillinger til at muliggøre registrering af eksperimentelle enheder til og med mikroskopisessioner.

15. Registrer billedbehandlingssoftware, der er tilgængelig for brugerne.

BEMÆRK: Dette vil gøre det muligt at registrere behandlingssessioner og senere enhedstyper (Kort og modeller).

1. Vælg Billedbehandling.
2. Klik på Opret ny billedbehandlingssoftware.
3. Skriv navnet på softwaren
4. Vis alle versioner, der er tilgængelige for brugerne:
   1. Vælg Tilføj nyunder softwareversion(er).
   2. Angiv softwareversionen.
      BEMÆRK: Dette giver brugerne mulighed for at angive nøjagtigt, hvilken version af softwaren de brugte til at nå deres resultater, når de registrerede billedbehandlingssessioner. Dette fuldfører den nødvendige konfiguration af gP2S. Brugerne bør nu være i stand til præcist at registrere nøglemetadata, der beskriver deres elektronmikroskopieksperimenter, som beskrevet i følgende afsnit.

Representative Results

Overordnet design- og navigationsmønster
GP2S-applikationen er projektorienteret, således at en enhed kun kan oprettes i forbindelse med et projekt. Det relevante projekt vælges først fra rullelisten i nærheden af programmets øverste venstre hjørne. For nemheds skyld kan listen over projekter filtreres, og den sorteres med de senest anvendte projekter, der vises øverst. Når du vælger et projekt, vises antallet af enheder af hver type, der er tilknyttet dette projekt, i arbejdsgangsafsnittet på navigationslinjen i venstre side. Brugeren kan derefter klikke på en af typerne af arbejdsgangsobjekter (f.eks. mikroskopisessioner) for at få vist en liste over disse objekter i det valgte projekt (Figur 4). Denne liste består for hvert objekt af en etiket, dato og klokkeslæt for oprettelsen, navnet på den bruger, der har oprettet den, en angivelse af, om der er fremsat kommentarer om dette objekt, og op til seks vigtige metadatafelter (f.eks. for hver mikroskopsession: Gitter, antal billeder, start- og sluttidspunkter, og hvilket mikroskop og detektor der blev brugt). Hvis du vælger et af de viste objekter, åbnes en detaljeside med alle de oplysninger, der er tilgængelige for dette element, herunder en oversigtsliste over alle overordnede objekter (f.eks. vises det overordnede gitter og eksempel for en mikroskopisession). Dette giver mulighed for meget hurtig navigation gennem en enheds "afstamning", f.eks. Derudover kan ethvert objekt i gP2S kommenteres ved at vælge "Kommentarer" øverst til højre på dens detaljeside, indtaste en fritekstkommentar og eventuelt vedhæfte en eller flere filer.

Prøveforberedelse
I det første trin i arbejdsprocessen beskrives eksemplet. For at gøre dette skal du først definere mindst én komponent: Protein eller Ligand.

Tilføjelse af et nyt protein kræver kun en proteinetiket, men for at hjælpe med bedre at beskrive proteinet skal du tilføje et PUR ID (til rensningsidentifikator). Dette felt accepterer tekst og kan f.eks. Hvis gP2S er blevet tilpasset til at integrere med et proteinregistreringssystem (se Diskussion), kan PUR ID valideres automatisk og bruges til at hente og vise detaljerede oplysninger om dette parti protein. For Ligands er en etiket og lagerkoncentration obligatoriske oplysninger. Alle andre felter er valgfrie og omfatter: koncept (stregkode, fælles navn eller andet ligand-id) og batch-/lot-id. Igen, hvis gP2S er konfigureret til at integrere med et ligand registreringssystem, kan konceptet og partiidentifikatorer bruges til at hente og vise eksternt lagrede data, der beskriver ligand (f.eks. dens kemiske struktur, analyseresultater).

En prøve defineres ved enhver kombination af proteiner og ligands og deres endelige koncentrationer. Du kan også angive andre eksperimentelle detaljer i stikprøven, f.eks.

Forberedelse af gitter
Når eksemplet er klar, skal du gå til Gitre. På listen finder du under hvert gitters etiket en eller to farvede koder, der angiver gittertypen (kryo eller plet), og om gitteret er tilgængeligt til brug. Hvis du vil oprette et nyt gitter, skal du vælge Opret nyt gitter. Skriv en etiket, vælg den anvendte gittertype og overfladebehandlingsprotokollen (f.eks. glødafladning). Angiv derefter, om du vil forberede et kryogitter eller et negativt pletgitter, og vælg en af de forudkonfigurerede forberedelsesprotokoller på rullelisten, som udfyldes med Negative Stain Protocols eller Vitrification Protocols, afhængigt af den gitterforberedelsestype, der er valgt tidligere. Vælg derefter det relevante eksempel på rullelisten, og brug en til/fra-parameter til at angive, om eksemplet forbliver tilgængeligt (beskrevet mere detaljeret nedenfor). Hvis du vælger at fortynde eller koncentrere den valgte prøve, anføres dette ved hjælp af den "fortyndede/koncentrerede?" til/fra-knap, og den relevante fortyndings- eller koncentrationsfaktor angives. Angiv den diskenhed, der anvendes på gitteret (i μL), og kan eventuelt også registrere en inkubationstid. Endelig skal du definere gitterets lagerplacering. I tilfælde af negative pletgitter skal du registrere lagringsboksens etiket/nummer og gitterets placering i boksen. I forbindelse med kryogitter skal du først vælge en lagerenhed på listen og derefter angive oplysninger om de tilgængelige og relevante felter (cylinder, rør og/eller boks, afhængigt af de egenskaber for Cryo Storage Device, der tidligere er defineret i indstillingerne).

De dele af arbejdsprocessen, der blev beskrevet ovenfor, Eksempler og Gitre, er en del af et lagerstyringssystem. Denne funktion holder styr på, om komponenterne stadig er tilgængelige til brug.

1. Et protein eller Ligand kan gøres utilgængeligt fra prøveniveau. Når du opretter et eksempel, markerer du ved at vælge "sidste dråbe" for en af eksemplernes komponenter disse komponenter som utilgængelige til fremtidig brug: De vil ikke længere være tilgængelige på rullelisten, når der oprettes Eksempel, og de markeres ikke af koden "Tilgængelig" i listevisningen.
2. Et markeret eksempel kan markeres som utilgængeligt ved hjælp af en af de to til/fra-parametre - "Tilgængelig til gitterfremstilling?" (under Prøver) eller "Prøven kan anvendes yderligere?" (under Gitre).
3. Hvis du vil administrere gitterets tilgængelighed, skal du bruge til/fra-knappen "Gitter returneret til lager?" (under Mikroskopisessioner). Denne værdi er som standard angivet til "Ja" for alle negative pletgitre og til "Nej" for cryoEM-gitre.

dataindsamling
Når gitrene er registreret, skal du registrere dataindsamlingseksperimenter ved at oprette mikroskopisessioner i gP2S. Mikroskopisession er den mest komplekse eksperimentelle enhed, der spores af applikationen, og den er organiseret i fire sektioner: grundlæggende oplysninger, mikroskopindstillinger, eksponeringsindstillinger og mikroskopkontrol.

Det første afsnit indeholder grundlæggende oplysninger: en mikroskopi session etiket, dens start-og slutdatoer og tidspunkter, hvad Grid blev afbildet, som Mikroskop, detektor og prøveholder (hvis relevant) blev brugt, og hvor mange billeder blev indsamlet. Når du opretter en ny mikroskopisession, udfylder systemet automatisk startdatoen og -klokkeslættet. Slutdato og -klokkeslæt er valgfrit. Dette skyldes, at en session kan registreres i systemet, mens eksperimentet stadig er i gang, og derfor ville dets sluttidspunkt ikke være nøjagtigt kendt. Hvis slutdatoen og -klokkeslættet ikke kendes, skal du indtaste det manuelt eller bruge knappen "nu" til at angive dags dato og det aktuelle klokkeslæt. En anden måde er at drage fordel af det faktum, at gP2S ikke tillader mere end en ufærdige mikroskop sessioner på et givet mikroskop. Hvis du starter en ny mikroskopsession på det samme mikroskop, markeres alle tidligere startede sessioner automatisk som fuldførte.

Vælg Gitter i næste trin. Rullelisten indeholder alle tilgængelige gitre i det aktuelle projekt. Når du har valgt et gitter, vil nogle af dets grundlæggende oplysninger blive set: hvem der oprettede det og hvornår, og hvilket eksempel der blev anvendt på det. Afhængigt af hvilken type gitter der er valgt, markeres mikroskopsessionen som "plet" eller "kryo" i listevisningen.

Som standard er det mikroskop, der senest er brugt i det aktuelle projekt, forudvalgt. Hvis et bestemt mikroskop har en prøveindsætningsmekanisme defineret som en autoloader, vises disse oplysninger som prøveholderen. Hvis det valgte mikroskop kræver brug af sideindgangsholdere, skal du dog vælge den holder, der bruges, på listen over prøveholdere, der er konfigureret til at arbejde med dette mikroskop (hvis det valgte gitter er et kryogitter, vises kun kryokompenserede holdere).

Det andet afsnit af en mikroskopi Session form indeholder oplysninger om mikroskop indstillinger såsom udvinding og acceleration spændinger, pistol linse, diameter af C2 blænde, objektiv blænde og energifilter slids bredde. Under rutinemæssig brug ændres disse indstillinger sjældent, fordi brugerne normalt ikke behøver at afvige fra standardværdier.

Tredje afsnit af mikroskopisessionen indeholder oplysninger om eksponeringsindstillinger. I dette afsnit registreres følgende metadata: forstørrelse (pixelstørrelse), staffagestørrelse, diameter af belyst område, eksponeringsvarighed, og om nanoprobe, optællingstilstand, dosisfraktionering og superopløsning blev brugt (optællingstilstand, dosisfraktionering og indstillinger for superopløsning er kun aktiveret, hvis den valgte detektor har disse funktioner). Hvis der blev anvendt dosisfraktionering, registreres antallet af rammer og eksponeringshastigheden også.

For nemheds skyld beregnes en række eksperimentelt vigtige parametre på fluen og vises i formularen: den endelige billedpixelstørrelse (Å), eksponeringshastighed (elektroner/Å^2/s),total eksponering (elektroner/Ų), rammevarighed (r) og eksponering pr. ramme (elektron/Ų).

Den fjerde og sidste del af mikroskopisessionen kan bruges til at registrere det minimale og maksimale målunderfokus og antallet af eksponeringer pr. hul.

Mens mikroskopi sessioner i gP2S kan bruges til at registrere enhver form for mikroskopi arbejde, det være sig til screening eller dataindsamling formål, har vi konstateret, at det er tilstrækkeligt og mere effektivt at bede brugerne om at fokusere på registrering dataindsamling sessioner, og at screening sessioner, hvori et gitter er kun kortvarigt inspiceret for kvalitetskontrol behøver ikke nødvendigvis at blive registreret som mikroskopi Sessioner.

billedbehandling
Billedbehandlingsarbejde registreres i gP2S som behandlingssessionsenheder. Hver behandlingssession er relateret til en eller flere mikroskopisessioner, som skal vælges på en rulleliste. Angiv, hvilke softwarepakker (programmer og versioner) der blev brugt, antallet af mikrografer og antallet af plukkede partikler. Du kan også registrere navnet på mappen til behandlingen.

Aflejring af kort
Når en eller flere tredimensionelle rekonstruktioner er opnået, kan kortene deponeres i gP2S. Hvert kort er knyttet til en behandlingssession og består af den faktiske kortfil (typisk en MRC-formateret fil, men gP2S tillader enhver filtype) og nøglemetadata: pixelstørrelsen (Å), det anbefalede isocontourniveau for overfladegengivelse, hvilken symmetri der anvendes, antallet af billeder, der bruges til at oprette kortet, og den anslåede opløsning : i sin bedste og værste dele samt den gennemsnitlige globale opløsning. Tilknytninger kan knyttes til hinanden ved hjælp af følgende typer relationer: filtrerede, maskerede, gensamplede eller raffinerede versioner. Når du registrerer en sådan tilknytning, skal du vælge relationstypen (f.eks. "er filtreret version af '' eller "har filtreret version").

Modelaflejring
Når en atommodel er opnået, kan den deponeres i gP2S's modelsektion for det relevante projekt. Modelfunktionen i den første version af gP2S er barebones: bortset fra den faktiske modelfil (typisk en PDB- eller mmCIF-fil), kræves kun opløsningen (i Å) og det kort (eller en liste over kort), som modellen stammer fra. Derudover er det muligt at angive, at en model er en raffineret version af en tidligere deponeret model. Yderligere funktioner, herunder modelvalidering, er under udvikling og kan føjes til open source-versionen af gP2S i fremtiden.

Rapporter
Det kan være nødvendigt at generere sammenfattende dokumenter, der skal distribueres til samarbejdspartnere, som måske ikke har adgang til gP2S, eller at blive arkiveret på et filsystem. gP2S indeholder en rapportfunktionalitet til dette formål, der er tilgængelig via et printerikon øverst til højre på hver side med oplysninger om enheder. Der dette genereres en PDF-fil, der kan udskrives, og som indeholder alle metadata, der beskriver objektet og hvert af dets overordnede objekter, herunder alle kommentarer. Denne funktion er især værdifuld efter Model deposition, da alle data og metadata spore afstamning af den endelige atomare model hele vejen tilbage til specifikke protein og små molekyle ligand partier via Mikroskopi Session (r) og Grid (r) vil være tilgængelig i et enkelt dokument.

Figur 1. gP2S kører på en iPad på en vitrifikation lab bænk. Brugergrænsefladen er designet til drift ved hjælp af berøringsskærme, hvilket letter brug i laboratoriet og nøjagtig metadataindtastning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: gP2S-systemarkitektur. gP2S følger en klassisk tredelt organisation og er afhængig af to databaseservere til datalagring og en LDAP-server til brugergodkendelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: GP2S-datamodellen. Objekter afbildes som rektangler (mørk orange for arbejdsprocesobjekter, orange for udstyr og protokoller, gul for andre objekttyper), og deres relationer er (en-til-en, en-til-mange, mange-til-mange) angivet med fortløbende linjer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Mikroskopi visning af sessionsliste. I denne visning vises alle mikroskopisessioner, der er registreret under det valgte projekt ("CARD9" i dette skærmbillede). Et grønt eller lilla mærke skelner mellem stuetemperatur (negativ plet) og kryogene mikroskopisessioner, og et par nøglemetadata, der beskriver hver session, er angivet (f.eks. den bruger, der registrerede den længst til højre). Hvis du klikker på navnet på en mikroskopisession, åbnes en detaljeret visning af sessionen (en detaljeret visning af en model vises i figur 5). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Visning af modeldetaljer. Den øverste del af siden viser tilgængelige metadata for den valgte model. Kommentarruden til højre kan skjules ved at klikke på korset (øverst til højre) eller "Kommentarer (1)" til venstre. Nedenfor gør et sæt ikoner det muligt at oprette en PDF-rapport (printerikon, se hovedtekst), redigering af posten (blyantikon) eller duplikering af den (dobbeltrektanglerikon). Den nederste del af siden indeholder en strukturliste over alle de objekter, som denne model nedstammer fra, fra Eksempler til Kort. Klik her for at se en større version af dette tal.

Navn på biblioteket eller strukturen	slags	version
Apacheds	LDAP-server	0.7.0
Havnearbejder	udviklingsværktøj	Nielsen
element	bibliotek	1.4.10
Dvale	bibliotek	5.0.12
Java	programmeringssprog	1.8+
JavaScript	programmeringssprog	EcmaScript 2017
JUnit	bibliotek	4.12
Karma	bibliotek	1.4.1
Maven	udviklingsværktøj	3+
Mongodb	DB-server	4.0.6
MySQL-database	DB-server	5.7
Node.js	ramme	6.9.1
SASS (node-sass)	bibliotek	4.5.3
SpringBoot	ramme	1.3
Swagger UI	bibliotek	2.6.1
Tomcat	programserver	8.5.15
Vue.js	ramme	2.4.2
vue-cli	udviklingsværktøj	2.6.12

Tabel 1. Biblioteker og rammer, der bruges af gP2S

Discussion

Når gP2S bruges korrekt og konsekvent, hjælper det med at opnå korrekt registrering af metadata af høj kvalitet ved at håndhæve registreringen af kritiske eksperimentelle metadata ved hjælp af strukturerede datamodeller og definerede ordforråd, men merværdien af dette realiseres kun fuldt ud, når der opnås en høj grad af overholdelse i laboratoriet. Ovenstående protokol dækker ikke, hvordan man opnår dette. Vi konstaterede, at en effektiv håndhævelsesteknik var at få mikroskopoperatører til at nægte at indsamle data om net, der ikke er registreret i gP2S. Dette drev overholdelse op meget hurtigt og lagde grunden til fremkomsten i løbet af de følgende måneder af en stor mængde detaljerede og nøjagtige eksperimentelle detaljer og virksomhedshukommelse. Efter et par måneders brug blev værdien af det korpus af metadata, der er gemt i gP2S, så indlysende for de fleste brugere, at overholdelse forblev høj uden eksplicit indgriben.

Fuld udnyttelse af denne kollektive hukommelse kræver, at de metadata, der er gemt i gP2S, er tilgængelige for eksterne systemer og let forbundet med de eksperimentelle data (mikrografer) og resultater (kort og modeller). Ovenstående protokol beskriver ikke, hvordan man integrerer gP2S med andre informatik- og databehandlingssystemer. Mest ligetil er potentielle integrationer via gP2S's backend REST API, som ikke kræver nogen ændring af gP2S. For eksempel kører hver computer, der kontrollerer vores dataindsamlingsdetektorer, et script, der med jævne mellemrum forespørger gP2S's slutpunkt "getItemByMicroscope" under mikroskopsessionsstyring REST-controlleren for at kontrollere, om en mikroskopsession er i gang på sit mikroskop. Hvis det er tilfældet, henter scriptet fra gP2S det relevante datalagringsmappenavn (som konfigureret på siden Indstillinger, se ovenfor) og opretter en mappe på den lokale datalagringsenhed ved hjælp af dette navn. Dette sikrer systematisk navngivning af datalagringsmapper og reducerer risikoen for fejl på grund af slåfejl.

Selv om de er blevet kommenteret i kilden til den offentlige version af gP2S, er yderligere integrationer, der involverer gP2S, der forbruger eksterne systemers data, også mulige. I vores laboratorium integreres vores implementering af gP2S med (i) et projektstyringssystem, så hvert projekt, der er konfigureret i gP2S, kan knyttes til et porteføljeprojekt for hele virksomheden, og metadata fra porteføljen kan vises i gP2S; ii) et proteinregistreringssystem, således at hvert protein, der tilsættes gP2S, via en identifikator, der er lagret lokalt, er knyttet til et komplet sæt optegnelser, der beskriver proteinets herkomst, indeholder nærmere oplysninger om den relevante molekylærbiologi, ekspressionssystem og rensning (iii) et lille molekyle sammensatte styringssystem, så gP2S at vise vigtige oplysninger om hver ligand, såsom dens kemiske struktur. De kodeændringer, der er nødvendige for at muliggøre disse integrationer, er beskrevet i afsnittet "Integration" i det README-BUILD.md dokument, der er tilgængeligt fra gP2S-lageret (https://github.com/arohou/gP2S).

Den aktuelle version af gP2S har begrænsninger, hvoraf den første er den alt for forenklede datamodel og frontend for struktur (Model) deposition. Dette blev med vilje efterladt i en "barebones" tilstand i den frigivne version af gP2S, fordi en fuldt udbygget strukturaflejrings- og valideringsfunktion i øjeblikket er under udvikling sammen med støtte til røntgenkrystallografi. En anden designbeslutning var ikke at implementere nogen rettigheds- eller tilladelsessystem: Alle brugere i gP2S har lige adgang til dets funktioner og data. Dette kan gøre det til et dårligt valg for faciliteter, der betjener brugergrupper med konkurrerende interesser og fortrolighedskrav, men var ikke et problem for vores facilitet.

Udvikling af vores in-house version af gP2S er i gang, og det er vores håb, at open source-versionen beskrevet her vil være nyttig for andre cryoEM grupper, og at nogle kan bidrage med forslag, eller kode forbedringer i fremtiden. Fremtidige udviklinger af høj værdi kan f.eks. fokusere på integrationer med laboratorieudstyr (vitrificeringsrobotter, elektronmikroskoper), software (f.eks. til høst af billedbehandlingsmetadata) og eksterne offentlige depoter (f.eks. for at lette strukturaflejring).

Den systematiske indsamling af metadata af høj kvalitet, der aktiveres ved rutinemæssig brug af gP2S i laboratoriet og kryoEM-anlægget, kan have en betydelig, positiv indvirkning på evnen til at retsforfølge flere projekter parallelt over en årrække. Efterhånden som der etableres flere og flere fælles og centraliserede cryoEM-grupper og -faciliteter, forventer vi, at behovet for informationsstyringssystemer som f.eks.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
n/a	n/a	n/a	n/a