gP2S, et informasjonsstyringssystem for CryoEM-eksperimenter

Summary

gP2S er et webprogram for sporing av cryoEM-eksperimenter. Hovedfunksjonene er beskrevet, og det samme er trinnene som kreves for å installere og konfigurere applikasjonen. Når den er konfigurert, lar applikasjonen en nøyaktig registrere metadata knyttet til negative flekk- og kryoEM-eksperimenter.

Abstract

Kryogene elektronmikroskopi (cryoEM) har blitt en integrert del av mange narkotikaoppdagelsesprosjekter fordi krystallografi av proteinmålet ikke alltid er oppnåelig, og kryoEM gir et alternativt middel for å støtte strukturbasert liganddesign. Når du arbeider med et stort antall forskjellige prosjekter, og i hvert prosjekt et potensielt stort antall ligandprotein-kostrukturer, blir nøyaktig journalføring raskt utfordrende. Mange eksperimentelle parametere er justert for hvert mål, inkludert ved prøvepreparering, rutenettforberedelse og mikroskopistadier. Derfor kan nøyaktig journalføring være avgjørende for å muliggjøre langsiktig reproduserbarhet, og for å lette effektivt teamarbeid, spesielt når trinn i cryoEM-arbeidsflyten utføres av forskjellige operatører. For å hjelpe til med å håndtere denne utfordringen utviklet vi et nettbasert informasjonsstyringssystem for cryoEM, kalt gP2S.

Applikasjonen holder oversikt over hvert eksperiment, fra prøve til endelig atommodell, i sammenheng med prosjekter, en liste som vedlikeholdes i applikasjonen, eller eksternt i et eget system. Brukerdefinerte kontrollerte ordforråd av forbruksvarer, utstyr, protokoller og programvare bidrar til å beskrive hvert trinn i cryoEM-arbeidsflyten på en strukturert måte. gP2S er mye konfigurerbar og, avhengig av teamets behov, kan eksistere som et frittstående produkt eller være en del av et bredere økosystem av vitenskapelige applikasjoner, integrere via REST API-er med prosjektstyringsverktøy, applikasjoner som sporer produksjon av proteiner eller små molekyler ligander, eller applikasjoner som automatiserer datainnsamling og lagring. Brukere kan registrere detaljer om hvert rutenett og mikroskopiøkt, inkludert viktige eksperimentelle metadata og parameterverdier, og slektslinjen til hver eksperimentelle artefakt (prøve, rutenett, mikroskopiøkt, kart, etc.) registreres. gP2S fungerer som en kryoEM eksperimentell arbeidsflytarrangør som muliggjør nøyaktig registrering for team, og er tilgjengelig under en åpen kildekode-lisens.

Introduction

Informasjonshåndtering ved cryoEM-anlegg
Fra og med 2014 har antallet kryogene elektronmikroskopi (cryoEM)^1-anlegg vokst eksplosivt, med minst 300 avanserte systemer installert over hele verden², inkludert hos en rekke farmasøytiske selskaper, noe som gjenspeiler en voksende rolle for kryoEM i legemiddeloppdagelse³. Oppdragene til disse fasilitetene, og deres krav til datasporing og ledelse, varierer⁴. Noen, for eksempel nasjonale cryoEM-sentre, er tiltalt for å motta EM-rutenett, samle inn datasett og returnere data til brukerne for strukturbestemmelse, kanskje etter automatisert bildebehandling. I slike anlegg er sporing av opprinnelsen til nettet, dets tilknytning til et brukerforslag eller tilskudd, og avstamningen fra rutenett til datasett avgjørende, men andre faktorer, for eksempel metoden for rensing av proteinprøven eller den endelige strukturbestemmelsesprosessen, er mindre, eller ikke i det hele tatt, relevante. I andre anlegg, som lokale akademiske anlegg, er hver sluttbruker ansvarlig for å forberede sine egne prøver og nett, gjennomføre mikroskopi, administrere rådataene og dens behandling og publisering av resultatene. Det er ikke noe strengt behov for metadatasporing fra en slik fasilitet fordi denne rollen er oppfylt av sluttbrukeren eller deres hovedetterforsker.

I vårt cryoEM-anlegg sentraliseres håndtering og optimalisering av prøver, rutenett, datainnsamlings- og prosesseringsprotokoller og resultater (kart, modeller) på tvers av mange prosjekter til en liten gruppe utøvere. Dette byr på utfordringer innen eksperimentell (meta)datahåndtering. Den eksperimentelle avstamningen av strukturer, fra atommodell helt tilbake til den eksakte identiteten til proteiner og ligander, via nettforberedelsesparametere og datainnsamlingsprotokoller, må fanges nøyaktig og bevares. Disse metadataene må gjøres tilgjengelig for en rekke menneskelige operatører. For eksempel kan det hende at en person som utfører bildebehandling, må vite hvilken konstruksjon av et protein som ble brukt og hva bildeparametrene var, selv om de verken renset proteinet eller samlet inn cryoEM-dataene selv; informatikksystemer som automatiserte daemoner for databehandling må identifisere prosjektet som et mikroskop for tiden samler inn data for å kunne tilordne katalognavn på riktig og systematisk måte.

Flere informasjonsstyringssystemer er tilgjengelige for å støtte cryoEM-anlegg. Kanskje mest komplett blant dem er EMEN2⁵, som kombinerer funksjoner i en elektronisk lab bærbar PC, et informasjonsstyringssystem og noen elementer i et forretningsprosessadministrasjonsverktøy. ISPyB⁶brukes på mange synkrotroner, opprinnelig bygget for å støtte røntgenstrålene for krystallografi, og støtter nå også cryoEM-datainnsamling. Scipion⁷ er en rik og kraftig wrapper rundt bildebehandlingspakker, som lar brukerne registrere arbeidsflyter for bildebehandling og dele dem, for eksempel via det offentlige repositoriet EMPIAR^8,9, og er også integrert med ISPyB for å muliggjøre kryoem-databehandling på farten.

Her beskriver vi gP2S (for Genentech Protein to Structure), et moderne og lett kryoEM informasjonsstyringssystem bygget for å støtte arbeidsflyten fra renset protein og lite molekylligand til den endelige atommodellen.

Oversikt over gP2S
gP2S er et brukervennlig nettbasert kryoEM informasjonsstyringssystem som letter nøyaktig journalføring for cryoEM-laboratorier og flerbrukerfasiliteter med flere prosjekter. Følgende enheter, deres relasjoner og tilknyttede metadata spores: prosjekter, utstyr, forbruksvarer, protokoller, prøver, rutenett, mikroskopiøkter, bildebehandlingsøkter, kart og atommodeller. Brukere kan også legge til fritekstkommentarer, eventuelt inkludert filvedlegg, noe som gir rik merknad om en hvilken som helst enhet som er registrert i gP2S. Fronten er designet for å lette bruken med berøringsskjermenheter og testet grundig på 12,9" iPad Pros, noe som gjør det mulig å bruke gP2S på laboratoriebenken mens du forbereder prøver og rutenett (figur 1), samt på datamaskinen når du bruker mikroskopet, behandler bilder eller deponerer modeller. Hver side i fronten tar sikte på å redusere manuell dataregistrering ved å forhåndsinnstille parametere til fornuftige standardverdier når det er mulig.

Backend av gP2S har en rekke REST API (REpresentational State Transfer Application Programming Interface) endepunkter, noe som gjør det mulig å integrere gP2S i eksisterende arbeidsflyter og skript. Datamodellen ble utformet for å tillate nøyaktig registrering av negative flekk- og kryoem-arbeidsflyter, inkludert forgrening, for eksempel med ett utvalg som brukes på flere rutenett, data fra flere mikroskopiøkter som slås sammen til en enkelt databehandlingsøkt, eller en databehandlingsøkt som gir flere kart.

Systemarkitektur
gP2S er et klassisk trelags program (figur 2). I denne modulære arkitekturen er systemet delt inn i tre separate lag, som hver er ansvarlige for å utføre distinkte oppgaver, og hver utskiftbar eller modifiserbar uavhengig av de andre. (1) Presentasjonslaget (eller frontend) gir brukertilgang via nettleser (grundig testet med Chrome og Safari), gjør det mulig å opprette og endre arbeidsflytelementer (inkludert datavalidering), og viser eksperimentelle data som individuelle enheter, prosjektbaserte lister og fulle arbeidsflytrapporter. (2) Tjenestelaget (eller backend) fungerer som et mellomliggende lag mellom brukergrensesnittet og lagringssystemet - det har kjerne forretningslogikk, eksponerer tjeneste-API-en som brukes av frontend, integreres med datalagring og LDAP (Lightweight Directory Access Protocol) system for brukerautentisering, og gir grunnlag for ytterligere integrasjon med eksterne systemer. (3) Utholdenhetslaget (datatilgang) er ansvarlig for lagring av eksperimentelle data, brukerkommentarer og filvedlegg.

Viktige teknologier og rammeverk
For å legge til rette for utvikling, bygging og vedlikehold av gP2S-applikasjonen ble det brukt flere teknologier og rammeverk i prosjektet. De viktigste er: Vue.js 2.4.2¹⁰ for frontend og SpringBoot 1.3¹¹ med innebygd Tomcat 8-server for backend. Programmet bruker MySQL 5.7- og MongoDB 4.0.6-databaser for lagring og LDAP¹² for godkjenning. Som standard leveres og distribueres alle disse komponentdelene som ett program.

Totalt bruker applikasjonen hundrevis av forskjellige biblioteker enten direkte eller indirekte. De mest fremtredende er oppført i Tabell 1.

Datamodell
Tre typer enheter kan skilles fra gP2S-datamodellen (figur 3): arbeidsflytenheter relatert til data som samles inn under eksperimenter (f.eks. prøver eller mikroskopiøkter); utstyrs- og protokollenheter som beskriver data som er vanlige på tvers av alle prosjekter (f.eks. mikroskoper eller vitrifiseringsprotokoller); andre enheter som spiller støttende eller tekniske roller i systemet (f.eks. kommentarer eller standardverdier).

Roten til arbeidsflytdatatreet er Prosjekt-enheten. Hvert prosjekt består av en rekke proteiner og/eller ligander som er byggesteiner for oppretting av utvalgsenheter. Hver prøve kan brukes til å lage flere rutenett som igjen brukes i mikroskopiøkter (ett rutenett per mikroskopiøkt). Sistnevnte tilordnes behandlingsøkter som kan gi én eller flere kart. Den siste enheten i treet er atommodellen, opprettet ved hjelp av ett eller flere kart. Følgelig er hver arbeidsflytrelatert enhet, fra Protein til Modell, alltid bundet til et bestemt prosjekt via sine forfedre. Slik design skaper datamengder som er enkle å behandle enten av frontend-modulen eller av eksterne systemer som bruker API-en.

I tillegg til arbeidsflytdata finnes det enheter som beskriver utstyr som brukes i eksperimenter eller protokoller som ble fulgt under klargjøring av rutenett. Definering av disse enhetene er en forutsetning for å opprette eksperimentelle arbeidsflytenheter som Rutenett, Mikroskopi og Prosesseringsøkter.

Den siste typen dataenhet, samlet kalt "Annet", brukes til tekniske formål (f.eks. filvedlegg eller standardverdier). Denne kategorien inneholder kommentarenheter som kan kobles til alle arbeidsflyt- eller utstyrs-/protokollenheter.

Tilgjengelighet av programvare
Åpen kildekode-versjonen av gP2S er tilgjengelig under en Apache-lisensversjon 2.0²⁶, fra https://github.com/arohou/gP2S. Et Docker-bilde for å kjøre gP2S er tilgjengelig fra https://hub.docker.com/r/arohou/gp2s. En lukket kildegren av gP2S er under fortsatt utvikling hos Roche &Genentech.

Kjøre gP2S-programmet
Det er to måter å kjøre gP2S på: som en dockerbeholder eller som et frittstående Java-program. Det optimale valget avhenger av måldistribusjonsmiljøet. Hvis for eksempel muligheten til å tilpasse eller forbedre koden som passer til spesifikke behov for brukerne, er ønsket, må hele applikasjonen bygges på nytt først. I dette tilfellet kan det anbefales å kjøre gP2S som et frittstående program.

Docker-beholder
Den enkleste måten å begynne å jobbe med gP2S-programmet på, er å kjøre det som en Docker-tjeneste. Til dette formålet er et dedikert Docker-bilde utarbeidet og publisert i Docker Hub-repositoriet ("https://hub.docker.com/r/arohou/gp2s"). Kjøring av gP2S-bildet avhenger av tilgang til MySQL- og MongoDB-databaser, og til en LDAP-server. For ikke-produksjonsmiljø anbefales det å kjøre alle disse avhengighetene som Docker-programmer med flere beholdere sammen med gP2S-programmet. For å gjøre dette sømløst er det utarbeidet og levert en docker-komponeringsfil (https://github.com/arohou/gP2S/blob/master/docker-compose.yml) som inkluderer alle nødvendige konfigurasjoner av det endelige miljøet, og som finnes i gP2S GitHub-repositoriet (https://github.com/arohou/gP2S). Følgende docker-bilder er avhengigheter: mysql²⁷, mongodb²⁸, apacheds²⁹.

I standardkonfigurasjonen slettes alle lagrede data, både enheter og filvedlegg ved fjerning av dockerbeholderne. For å beholde dataene, bør enten dockervolumer brukes, eller gP2S-applikasjonen skal være koblet til dedikerte databaseforekomster (MySQL og MongoDB). ApacheDS LDAP-serverbeholderen leveres med en forhåndskonfigurert administratorbruker (passord: hemmelig). Disse legitimasjonsbeskrivelsene bør brukes til å logge på gP2S-programmet når det kjøres som en Docker-tjeneste. For produksjonsmiljøer kan den samme docker-komponeringsfilen brukes til å distribuere gP2S (og andre beholdere om nødvendig) som tjenester til en Docker Swarm container orkestreringsplattform.

Hele prosessen med å kjøre gP2S som en Docker-beholder, inkludert alle detaljer om riktig konfigurasjon, er beskrevet i gP2S GitHub-repositoriet og dekker følgende emner:

• Kjøre det dokkingprogrammet gP2S med alle avhengigheter.
• Tilgang til gP2S-applikasjonen, databasen og LDAP.
• Oppdaterer gP2S-tjenesten med en ny versjon.
• Fjerne gP2S-programmet.
• Konfigurere vedvarende data.
• Koble det dockeriserte gP2S-programmet til dedikerte databaser eller en LDAP-server.
• Konfigurasjonsdetaljer

Frittstående Java-program
Et annet alternativ for å kjøre gP2S-applikasjonen er å bygge en selvstendig Java-pakke. Denne tilnærmingen bør tas hvis det ikke er mulig å kjøre Docker-beholdere. Å bygge gP2S-applikasjonen krever installasjon av en Java Development Kit versjon 8 eller nyere. Hele byggeprosessen administreres av Maven-verktøyet, som leveres i kodebasen i GitHub-repositoriet. Byggekonfigurasjonen er forberedt på å bygge frontdelen først, deretter kopiere den til bakkilder og deretter bygge den som et endelig program. På denne måten er det ikke nødvendig å installere andre verktøy eller biblioteker for å forberede en fullt fungerende gP2S-pakke. Som standard er resultatet av builden en JAR-pakke (lagret lokalt) og Docker-bilde (sendt til depotet som er konfigurert i Maven pom.xml-filen). Det er viktig å huske at informasjon som kreves for å koble til eksterne systemer (databaser og LDAP-server), må finnes i en riktig konfigurasjonsfil før pakken bygges.

Når gP2S JAR-pakken er opprettet, inneholder den alle avhengigheter og konfigurasjonsinformasjon som trengs for å kjøre programmet, inkludert Tomcat-programserveren som er vert for systemet. Hvis pakken ble bygget med flere konfigurasjonsfiler, kan den kjøres i forskjellige modi uten å gjenoppbygge.

gP2S GitHub-repositoriet inneholder en fullstendig beskrivelse av prosessen med å bygge og kjøre gP2S som et frittstående program og dekker følgende emner:

• Bygge gP2S ved hjelp av Maven-verktøyet
• Bygge og kjøre med innebygde databaser
• Bygge og kjøre med avhengigheter utplassert som dockerbeholdere
• Bygge og kjøre med dedikerte databaser
• Konfigurere godkjenning

Protocol

1. Sette opp gP2S for arbeid

1. Logg på gP2S. Ved vellykket pålogging vises hovedskjermen.
   MERK: Øverst til høyre vises brukernavnet - klikk på dette for å logge ut. Navigasjonsfeltet til venstre består av en prosjektvelger (øverst), et sett med navigasjonselementer som viser de eksperimentelle enhetstypene som definerer cryoEM-arbeidsflyten (Eksempler, Rutenett, Mikroskopiøkter, Prosesseringsøkter, Kart og Modeller), og en kobling til Innstillinger-delen av programmet.
2. Før eksperimenter kan logges, fyller du ut Innstillinger-delen med informasjon om prosjekter, utstyr, forbruksvarer, programvare og protokoller som er i bruk på cryoEM-anlegget. Innstillinger kan oppdateres når som helst ved å legge til nye verktøy og prosjekter og ved å redigere de eksisterende oppføringene. På samme måte som alle enheter i gP2S, kan imidlertid ikke Innstillinger-enheter slettes når de er opprettet.

2. Konfigurer minst ett prosjekt

1. Gå til Innstillinger > prosjekter.
2. Klikk Opprett nytt prosjekt.
3. Skriv inn en prosjektetikett.
4. Klikk Lagre.

3. Konfigurer minst én overflatebehandlingsmaskin.

MERK: Overflatebehandlingsmaskiner brukes til å endre overflateegenskapene til EM-gitter - oftest er de glødeutladninger eller plasmarensere.

1. Velg Surface Treatment Machineunder Utstyr .
2. Klikk Opprett ny maskin.
3. Skriv inn en etikett, som vil tjene til å identifisere maskinen senere.
4. Levere produsent, modell og plassering.
5. Klikk Lagre.

4. Registrer minst én rutenetttype.

MERK: Rutenetttyper er ment å identifisere modeller av rutenett (f.eks. "2-μm hullete karbonfilm på 300-mesh kobbergitter"), ikke spesifikke partier eller mange rutenett

1. Velg Rutenetttypeunder Forbruksvarer .
2. Klikk Opprett ny rutenetttype.
3. Angi en etikett for rutenetttype, produsent og beskrivelse.
4. Klikk Lagre.

5. Registrer minst en Vitrification Machine

1. Velg Vitrification Machineunder Utstyr .
2. Klikk Opprett ny maskin.
3. Levere produsent, modell og plassering.
4. Klikk Lagre.

6. Registrer minst ett blottingspapir

1. Velg Blotting Paperunder Forbruksvarer .
2. Klikk Opprett nytt blottingspapir.
3. Skriv inn en Blotting Paper-etikett, produsent og modell.
4. Klikk Lagre.

7. Registrer minst én Cryo-lagringsenhet

1. Velg Cryo Storage Deviceunder Utstyr .
2. Klikk Opprett ny lagringsenhet.
3. Angi enhetens produsent, modell og plassering.
4. Still inn vekslebryterne for å angi om den ekstra lagringsenheten har sylindere, rør og/eller bokser.
   MERK: Hvis den gjør det, lar gP2S brukere spesifisere relevante sylinder-, rør- og/eller boksidentifikatorer senere når brukere logger lagringsstedene for individuelle rutenett. Med de ovennevnte delene av utstyr og forbruksvarer satt opp, er det mulig å lage tre typer protokoller - overflatebehandling, negativ flekk og vitrifisering.

8. Registrer minst én Surface Treatment Protocol

1. Velg Overflatebehandlingunder Protokoller .
2. Klikk Opprett ny protokoll.
3. Angi en etikett for å identifisere protokollen.
4. Velg en av overflatebehandlingsmaskinene.
5. Angi innstillinger som brukes i denne protokollen: varighet, strøm og polaritet av utslippet, og trykk samt eventuelle tilsetningsstoffer i atmosfæren.
6. Klikk Lagre.

9. Lag minst én negativ flekkprotokoll

1. Velg Negativ flekkunder Protokoller .
2. Klikk Opprett ny protokoll.
3. Angi en protokolletikett.
4. Beskriv flekken ved å gi verdier for navn, pH og konsentrasjon av tungmetallsalt.
5. Angi inkubasjonstiden for flekk før blotting.
6. Angi fritekstbeskrivelse av protokollen.
7. Klikk Lagre.

10. Registrer minst én protokoll for frysing av rutenett

1. Velg Vitrificationunder Protokoller .
2. Klikk Opprett ny protokoll.
3. Angi en protokolletikett.
4. Velg den aktuelle Vitrification Machine fra rullegardinlisten.
5. Velg Blotting Paper som brukes i denne protokollen.
6. Gi deretter den gjenværende eksperimentelle informasjonen: relativ fuktighet, temperatur, blotterkraft, antall flekker, blotttid, ventetid, dreneringstid, antall prøveapplikasjoner.
7. Skriv inn en fritekstbeskrivelse.
8. Klikk Lagre.
   MERK: Etter at protokollene er konfigurert, er det mulig å lage både kryo- og minusflekkegitter. For å bruke gP2S til å registrere de neste trinnene i arbeidsflyten, fra mikroskopiøkter, er det nødvendig å konfigurere et mikroskop, en elektrondetektor og en prøveholder.

11. Registrer minst ett mikroskop

1. Velg Mikroskopunder Utstyr .
2. Klikk Opprett nytt mikroskop.
3. Skriv inn en mikroskopetikett.
4. Levere produsent, modell og plassering.
5. Velg hvilke akselerasjonsspenninger som er konfigurert og brukbare på dette mikroskopet, ut av den forhåndsinnstilte listen over 80, 120, 200 og 300 kV.
6. Angi listen over kondensator (C2) og objektive blenderåpninger som er installert. MERK: For hver type kan opptil 4 blenderåpningsspor konfigureres, hvorav den ene er angitt som standard blenderåpning for dette mikroskopet. Når det gjelder objektive blenderåpninger, indikerer at ett eller flere av sporene tas opp av en faseplate, i så fall er diameterparameteren deaktivert.
7. Angi om dette mikroskopet er utstyrt med en autoloader eller krever en sideoppføringsholder.
8. Angi om mikroskopet er utstyrt med et energifilter.
9. Angi standardverdier for avtrekksspenning, pistollinseinnstilling, spotstørrelse og energifilterspaltebredde (hvis relevant). De angitte verdiene brukes når brukere oppretter mikroskopiøkter.

12. Registrer minst én elektrondetektor

1. Velg Elektrondetektorunder Utstyr .
2. Klikk på Opprett ny elektrondetektor.
3. Angi etikett, produsent og modell.
4. Velg fra en rullegardinliste mikroskopet som denne detektoren er montert på.
5. Legg til minst én forstørrelse som er kalibrert for denne mikroskopdetektorkombinasjonen:
   1. Velg Legg til nyunder forstørrelser.
   2. Angi både nominelle og kalibrerte forstørrelsesverdier.
   3. Gjenta disse trinnene for alle forventede forstørrelsesinnstillinger. Disse forstørrelsesinnstillingene vil senere være tilgjengelige i en rullegardinvelger for brukere som logger mikroskopiøkter.
6. Bruk avmerkingsbokser til å angi om detektoren er i stand til elektrontelling, dosefraksjonering og superoppløsning.
7. Til slutt, gi ytterligere spesifikasjoner av detektoren: teller per elektronfaktor (gjennomsnittlig antall tellinger registrert av hendelseselektron), den lineære dimensjonen til hver piksel (i μm), og antall rader og kolonner med piksler.
8. Klikk Lagre

13. Hvis det er ett eller flere mikroskoper som krever side-entry prøveholdere, registrer tilgjengelige prøveholdere i gP2S.

1. Velg Prøveholderunder Utstyr .
2. Klikk Opprett ny holder.
3. Angi etikett, produsent, modell og sted.
4. Angi maksimal helling (i grader) for prøveholderen.
5. Bruk avmerkingsboksene til å angi om de er i stand til å holde kryogeniske EM-rutenett, og om de er i stand til å vippe med to akser.
6. Fra en rullegardinliste velger du alle mikroskoper som denne holderen kan brukes med.
   MERK: Dette vil sikre at bare relevante innehavere er oppført når brukere registrerer mikroskopiøkter ved hjelp av mikroskoper for sideinnføring.
7. Klikk Lagre.

14. Angi mønsteret som gP2S skal følge når du angir katalognavnet som er knyttet til hver mikrokopiøkt.

MERK: Det kan være veldig nyttig å få gP2S automatisk til å generere et katalognavn for lagring av bildedata som er registrert under en mikroskopiøkt. Dette sikrer systematisk, informasjonsrik navngivning av lagringsmapper. Angi mønsteret som gP2S skal følge når du angir katalognavnet som er knyttet til hver mikroskopiøkt.

1. Velg Innstillingerunder Administrator .
2. Rediger mønsterstrengen for mappenavn.
   MERK: Denne strengen kan inneholde følgende variabler: prosjektetikett, rutenett-ID, rutenettetikett, mikroskopiøktetikett, mikroskopiøkt-ID, startdato for mikroskopiøkt, starttidspunkt for mikroskopøkt og mikroskopetikett, avgrenset med ${}. Bortsett fra disse variablene, kan katalognavnmønstre inneholde de fleste tegn. Standard katalognavnmønster er for eksempel ${GridLabel}_${MicroscopyStartDate}_${ProjectLabel}_${MicroscopeLabel}_grid_${GridID}_session_${MicroscopySessionID}. Nå er tilstrekkelige innstillinger konfigurert for å muliggjøre registrering av eksperimentelle enheter til og med mikroskopiøkter.

15. Registrer programvare for bildebehandling som er tilgjengelig for brukerne.

MERK: Dette aktiverer registrering av prosesseringsøkter og senere enhetstyper (Kart og modeller).

1. Velg Bildebehandling.
2. Klikk Opprett ny programvare for bildebehandling.
3. Skriv inn navnet på programvaren
4. Vis alle versjoner som er tilgjengelige for brukere:
   1. Velg Legg til nyunder programvareversjon(er).
   2. Angi programvareversjonen.
      MERK: Dette vil gjøre det mulig for brukere å spesifisere nøyaktig hvilken versjon av programvaren de brukte for å nå resultatene når de registrerte bildebehandlingsøkter. Dette fullfører den nødvendige konfigurasjonen av gP2S. Brukere skal nå kunne fange opp viktige metadata som beskriver deres elektronmikroskopieksperimenter nøyaktig, som beskrevet i følgende avsnitt.

Representative Results

Overordnet design og navigasjonsmønster
gP2S-applikasjonen er prosjektorientert, slik at en enhet bare kan opprettes i sammenheng med et prosjekt. Det aktuelle prosjektet velges først fra rullegardinmenyen som ligger nær øverste venstre hjørne av søknaden. For enkelhets skyld er listen over prosjekter filtrerbar, og den er sortert med de nylig brukte prosjektene som vises øverst. Når du velger et prosjekt, vises antall enheter av hver type som er knyttet til dette prosjektet, i arbeidsflytdelen i navigasjonsfeltet til venstre. Brukeren kan deretter klikke en av enhetstypene for arbeidsflyt (for eksempel Mikroskopiøkter) for å vise en liste over disse enhetene i det valgte prosjektet (figur 4). Denne listen består for hver enhet av en etikett, dato og klokkeslett for opprettelse, navnet på brukeren som opprettet den, en indikasjon på om det er kommet kommentarer om denne enheten, og opptil seks viktige metadatafelt (for eksempel for hver mikroskopiøkt: Rutenett, antall bilder, start- og sluttidspunkt og hva mikroskop og detektor ble brukt). Hvis du velger en av de oppførte enhetene, åpnes en detaljside som viser all informasjonen som er tilgjengelig for dette elementet, inkludert en sammendragsliste over alle overordnede enheter (for eksempel for en mikroskopiøkt vises det overordnede rutenettet og eksemplet). Dette gjør det mulig å navigere veldig raskt gjennom "slektslinjen" til en enhet, for eksempel aktivere enkeltklikksnavigasjon fra en atommodell til detaljene i prøven (figur 5). I tillegg kan enhver enhet i gP2S kommenteres, ved å velge "Kommentarer" øverst til høyre på detaljsiden, skrive inn en fritekstkommentar og eventuelt legge ved en eller flere filer.

Prøvepreparering
I det første trinnet i arbeidsflyten beskrives eksemplet. For å gjøre dette må du først definere minst én komponent: Protein eller Ligand.

Å legge til et nytt protein krever bare en proteinetikett, men for å hjelpe til med å bedre beskrive proteinet, legg til en PUR ID (for rensingsidentifikator). Dette feltet godtar all tekst og kan for eksempel inneholde et parti-/partinummer eller fungere som et sted for en strekkodeetikett. Hvis gP2S er tilpasset for å integreres med et proteinregistreringssystem (se Diskusjon), kan PUR-IDen valideres automatisk og brukes til å hente og vise detaljert informasjon om dette proteinet. For Ligands er en etikett og lagerkonsentrasjon obligatorisk informasjon. Alle andre felt er valgfrie, og inkluderer: konsept (strekkode, vanlig navn eller annen ligandidentifikator) og parti-/partiidentifikator. Igjen, hvis gP2S er konfigurert til å integreres med et ligandregistreringssystem, kan konseptet og partiidentifikatorene brukes til å hente og vise eksternt lagrede data som beskriver liganden (f.eks. den kjemiske strukturen, analyseresultatene).

En prøve defineres av en hvilken som helst kombinasjon av proteiner og ligander og deres endelige konsentrasjoner. Du kan også angi andre eksperimentelle detaljer for eksemplet, for eksempel inkubasjonstid og -temperatur, buffer og en protokollbeskrivelse for fri tekst.

Klargjøring av rutenett
Når eksemplet er klart, går du til Rutenett. Finn én eller to fargede koder under etiketten til hvert rutenett i listen som angir rutenetttypen (kryo eller flekk) og om dette rutenettet er tilgjengelig for bruk. Hvis du vil opprette et nytt rutenett, velger du Opprett nytt rutenett. Skriv inn en etikett, velg Grid Type og Surface Treatment Protocol (f.eks. glødutladning) som brukes. Angi deretter om du vil klargjøre et kryo- eller negativt flekkrutenett, og velg en av de forhåndskonfigurerte forberedelsesprotokollene fra rullegardinlisten, som er fylt ut med Negative flekkprotokoller eller Vitrification Protocols, avhengig av rutenettforberedelsestypen som er valgt tidligere. Deretter velger du riktig eksempel fra rullegardinlisten og bruker en vekslebryter for å angi om eksemplet forblir tilgjengelig (beskrevet mer detaljert nedenfor). Hvis du velger å fortynne eller konsentrere den valgte prøven, må du angi dette ved hjelp av bryteren "fortynnet/konsentrert?" og angi relevant fortynning eller konsentrasjonsfaktor. Angi volumet som brukes på rutenettet (i μL), og eventuelt kan du også registrere en inkubasjonstid. Til slutt definerer du rutenettets lagringssted. Hvis du vil ha negative flekkrutenett, registrerer du etikett/nummer for lagringsboksen og rutenettets plassering i boksen. For cryo-rutenett velger du først en lagringsenhet fra listen og oppgir deretter informasjon for de tilgjengelige og aktuelle feltene (sylinder, rør og/eller boks, avhengig av egenskapene for Cryo Storage Device som tidligere er definert i Innstillinger).

Delene av arbeidsflyten som ble beskrevet ovenfor, Eksempler og rutenett, er en del av et lagerstyringssystem. Denne funksjonen holder rede på om komponentene fremdeles er tilgjengelige for bruk.

1. Et protein eller en ligand kan gjøres utilgjengelig fra prøvenivået. Når du oppretter et eksempel, merkes disse komponentene som utilgjengelige for fremtidig bruk når du velger "siste slipp" for noen av disse eksempelkomponentene: De vil ikke lenger være tilgjengelige i rullegardinlisten når du oppretter Eksempel, og de vil ikke bli merket med "Tilgjengelig"-koden i listevisningen.
2. Et valgt eksempel kan merkes som utilgjengelig ved hjelp av en av de to vekslebryterne - "Tilgjengelig for grid-making?" (under Eksempler) eller «Prøve er tilgjengelig for videre bruk?» (under Rutenett).
3. Hvis du vil administrere rutenettets tilgjengelighet, bruker du veksleknappen «Rutenett returnert til lagring?» (under Mikroskopiøkter). Som standard er denne verdien satt til "Ja" for alle negative flekkrutenett og til "Nei" for cryoEM-rutenett.

Datainnsamling
Når rutenettene er registrert, registrerer du datainnsamlingseksperimenter ved å opprette mikroskopiøkter i gP2S. Mikroskopi Session er den mest komplekse eksperimentelle enheten som spores av applikasjonen, og den er organisert i fire seksjoner: grunnleggende informasjon, mikroskopinnstillinger, eksponeringsinnstillinger og mikroskopkontroll.

Den første delen inneholder grunnleggende informasjon: en etikett for mikroskopiøkt, start- og sluttdatoer og -klokkeslett, hvilket rutenett som ble avbildet, hvilket mikroskop, detektor og prøveholder (hvis aktuelt) ble brukt, og hvor mange bilder som ble samlet inn. Når du oppretter en ny mikroskopiøkt, fyller systemet automatisk ut startdatoen og -klokkeslettet. Etterbehandlingsdato og -klokkeslett er valgfritt. Dette er fordi en økt kan registreres i systemet mens eksperimentet fortsatt pågår, og derfor vil sluttidspunktet ikke være nøyaktig kjent. Hvis sluttdatoen og -klokkeslettet ikke er kjent, skriver du det inn manuelt eller bruker "nå"-knappen til å angi gjeldende dato og klokkeslett. En annen måte er å dra nytte av det faktum at gP2S ikke tillater mer enn en uferdig mikroskopi økter på et gitt mikroskop. Hvis du starter en ny mikroskopøkt på samme mikroskop, merkes automatisk alle tidligere startet økter som fullført.

Velg Rutenett i neste trinn. Rullegardinlisten vil ha alle tilgjengelige rutenett i det gjeldende prosjektet. Etter å ha valgt et rutenett, vil noe av den grunnleggende informasjonen bli sett: hvem som opprettet den og når, og hvilken prøve som ble brukt på den. Avhengig av hvilken type rutenett som er valgt, merkes mikroskopiøkten som "flekk" eller "kryo" i listevisningen.

Som standard er mikroskopet som sist ble brukt i det gjeldende prosjektet, forhåndsvalgt. Hvis et bestemt mikroskop har en prøveinnsettingsmekanisme definert som en autoloader, er dette informasjonen som vises som prøveholder. Men hvis det valgte mikroskopet krever bruk av sideoppføringsholdere, velger du holderen som brukes fra listen over prøveholdere som er konfigurert til å fungere med dette mikroskopet (hvis det valgte rutenettet er et kryogitter, vises bare kryo-kompatible holdere).

Den andre delen av et mikroskopiøktskjema inneholder informasjon om mikroskopinnstillinger som ekstraksjons- og akselerasjonsspenninger, pistollinse, diameter på C2-blenderåpningen, objektiv blenderåpning og energifilterspaltebredde. Under rutinemessig bruk endres disse innstillingene sjelden fordi brukere vanligvis ikke trenger å avvike fra standardverdier.

Den tredje delen av mikroskopiøkten inneholder informasjon om eksponeringsinnstillinger. I denne delen registreres følgende metadata: forstørrelse (pikselstørrelse), spotstørrelse, diameter på opplyst område, eksponeringsvarighet og om nanoprobe, tellemodus, dosefraksjonering og superoppløsning ble brukt (tellemodus, dosefraksjonering og superoppløsningsinnstillinger er bare aktivert hvis den valgte detektoren har disse funksjonene). Hvis dosefraksjonering ble brukt, registreres også antall rammer og eksponeringshastighet.

For enkelhets skyld beregnes en rekke eksperimentelt viktige parametere på farten og vises i skjemaet: den endelige bildepikselstørrelsen (Å), eksponeringshastigheten (elektroner / Ų/ s), total eksponering (elektroner / Ų), bildevarighet (er) og eksponering per ramme (elektron / Ų).

Den fjerde og siste delen av mikroskopiøkten kan brukes til å registrere minimum og maksimum målunderfokus, og antall eksponeringer per hull.

Mens mikroskopiøkter i gP2S kan brukes til å registrere alle typer mikroskopiarbeid, det være seg for screening- eller datainnsamlingsformål, har vi funnet ut at det er tilstrekkelig og mer effektivt å be brukerne om å fokusere på registrering av datainnsamlingsøkter, og at screeningøkter, der et rutenett bare er kort inspisert for kvalitetskontroll, ikke nødvendigvis trenger å registreres som Mikroskopiøkter.

Behandling av bilder
Bildebehandlingsarbeid registreres i gP2S som behandlingsøktenheter. Hver behandlingsøkt er relatert til én eller flere mikroskopiøkter, som må velges fra en rullegardinliste. Angi hvilke programvarepakker (programmer og versjoner) som ble brukt, antall mikrografer og antall partikler som ble plukket ut. Du kan eventuelt registrere navnet på katalogen for behandlingen.

Kartavsetning
Når en eller flere tredimensjonale rekonstruksjoner er oppnådd, kan kartene deponeres i gP2S. Hvert kart er knyttet til en behandlingsøkt, og består av den faktiske kartfilen (vanligvis en MRC-formatert fil, men gP2S tillater alle filtyper) og nøkkelmetadata: størrelsen på pikselen (Å), anbefalt isocontour-nivå for overflategjengivelse, hvilken symmetri som brukes, antall bilder som brukes til å lage kartet, og den estimerte oppløsningen : i sine beste og verste deler, så vel som den gjennomsnittlige globale oppløsningen. Kart kan knyttes til hverandre ved hjelp av følgende typer relasjoner: filtrerte, maskerte, omsamplede eller raffinerte versjoner. Når du registrerer en slik tilknytning, velger du relasjonstypen (f.eks. "er filtrert versjon av "" eller "har filtrert versjon").

Avsetning av modell
Når en atommodell er oppnådd, kan den deponeres i gP2S's Model-seksjon for det aktuelle prosjektet. Modellfunksjonen i den første versjonen av gP2S er barebones: annet enn den faktiske modellfilen (vanligvis en PDB- eller mmCIF-fil), er det bare oppløsningen (i Å) og kartet (eller listen over kart) som modellen ble avledet fra. I tillegg er det mulig å indikere at en modell er en raffinert versjon av en tidligere deponert modell. Tilleggsfunksjoner, inkludert modellvalidering, er under utvikling og kan legges til i åpen kildekode-versjonen av gP2S i fremtiden.

Rapporter
Det kan være nødvendig å generere sammendragsdokumenter som skal distribueres til samarbeidspartnere, som kanskje ikke har tilgang til gP2S, eller som skal arkiveres på et filsystem. gP2S har en rapportfunksjonalitet for dette formålet, som er tilgjengelig via et skriverikon øverst til høyre på hver visningsside for enhetsdetaljer. Dette genererer en utskrivbar PDF-fil som inneholder alle metadata som beskriver enheten og hver av de overordnede enhetene, inkludert alle kommentarer. Denne funksjonen er spesielt verdifull etter modellavsetning, siden alle data og metadata som sporer avstamningslinjen til den endelige atommodellen helt tilbake til spesifikke protein- og små molekylligandtomter via Microscopy Session(s) og Grid(s) vil være tilgjengelige i ett enkelt dokument.

Figur 1. gP2S kjører på en iPad på en vitrification lab benk. Brukergrensesnittet er designet for drift ved hjelp av berøringsskjermer, noe som letter bruk i laboratoriet og nøyaktig metadataoppføring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: gP2S-systemarkitektur. gP2S følger en klassisk trelags organisasjon og er avhengig av to databaseservere for datalagring og en LDAP-server for brukergodkjenning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: GP2S-datamodellen. Enheter vises som rektangler (mørk oransje for arbeidsflytenheter, oransje for utstyr og protokoller, gule for andre enhetstyper), og relasjonene deres er (en-til-en, en-til-mange, mange-til-mange) merket med kontinuerlige linjer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4. Listevisning for mikroskopiøkt. I denne visningen er alle mikroskopiøkter registrert under det valgte prosjektet ("CARD9" i dette skjermbildet) oppført. En grønn eller lilla tag skiller mellom romtemperatur (negativ flekk) og kryogeniske mikroskopiøkter, og noen få viktige metadata som beskriver hver økt er oppført (f.eks. brukeren som registrerte den, helt til høyre). Hvis du klikker navnet på en mikroskopiøkt, åpnes en detaljert visning av økten (en detaljert visning av en modell vises i figur 5). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5. Visning av modelldetaljer. Den øverste delen av siden viser tilgjengelige metadata for den valgte modellen. Kommentarruten til høyre kan skjules ved å klikke på korset (øverst til høyre) eller "Kommentarer (1)" til venstre. Nedenfor aktiverer et sett med ikoner genereringen av en PDF-rapport (skriverikon, se hovedtekst), redigering av oppføringen (blyantikon) eller duplisering av den (dobbelt rektangelikon). Den nedre delen av siden inneholder en strukturliste over alle enhetene som denne modellen er nedstammet fra, fra Eksempler til Kart. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Navn på biblioteket eller rammeverket	type	versjon
Apache-er	LDAP-server	0.7.0
havnearbeider	utviklingsverktøy	N/a
element	bibliotek	1.4.10
gå i hi	bibliotek	5.0.12
Java	programmeringsspråk	1.8+
JavaScript	programmeringsspråk	EcmaScript 2017
JEnhet	bibliotek	4.12
Karma	bibliotek	1.4.1
Maven	utviklingsverktøy	3+
MongoDB	DB-server	4.0.6
MySQL-database	DB-server	5.7
Node.js	rammeverk	6.9.1
SASS (node-sass)	bibliotek	4.5.3
SpringBoot	rammeverk	1.3
Brukergrensesnitt for Swagger	bibliotek	2.6.1
hannkatt	programserver	8.5.15
Vue.js	rammeverk	2.4.2
vue-cli	utviklingsverktøy	2.6.12

Tabell 1. Biblioteker og rammeverk som brukes av gP2S

Discussion

Når det brukes riktig og konsekvent, bidrar gP2S til å oppnå riktig registrering av metadata av høy kvalitet ved å håndheve registreringen av kritiske eksperimentelle metadata ved hjelp av strukturerte datamodeller og definerte ordforråd, men merverdien av dette er bare fullt realisert når et høyt samsvarsnivå oppnås i laboratoriet. Protokollen ovenfor dekker ikke hvordan du oppnår dette. Vi fant ut at en effektiv håndhevelsesteknikk var å få mikroskopoperatører til å nekte å samle inn data på rutenett som ikke er registrert i gP2S. Dette drev samsvaret opp veldig raskt og la grunnlaget for fremveksten, i løpet av de følgende månedene, av en stor mengde detaljerte og nøyaktige eksperimentelle detaljer og bedriftsminne. Etter noen måneders bruk ble verdien av korpuset av metadata lagret i gP2S så åpenbar for de fleste brukere at overholdelse forble høy uten eksplisitt inngrep.

Fullt utnytte dette kollektive minnet krever at metadataene som er lagret i gP2S være tilgjengelige for eksterne systemer og lett forbundet med eksperimentelle data (mikrografer) og resultater (kart og modeller). Protokollen ovenfor beskriver ikke hvordan du integrerer gP2S med andre informatikk- og databehandlingssystemer. Det mest enkle er potensielle integrasjoner via gP2S's backend REST API, som ikke krever noen modifikasjon av gP2S. Hver datamaskin som kontrollerer datainnsamlingsdetektorene våre, kjører for eksempel et skript som regelmessig spør gP2S's endepunkt "getItemByMicroscope" under REST-kontrolleren for behandling av mikroskopiøkter, for å sjekke om en mikroskopøkt pågår på mikroskopet. I så fall henter skriptet fra gP2S det riktige navnet på datalagringsmappen (som konfigurert på Innstillinger-siden, se ovenfor), og oppretter en mappe på den lokale datalagringsenheten ved hjelp av dette navnet. Dette sikrer systematisk navngivning av datalagringskataloger og reduserer risikoen for feil på grunn av skrivefeil.

Selv om de har blitt kommentert i kilden til den offentlige versjonen av gP2S, er det også mulig med ytterligere integrasjoner som involverer gP2S-forbruk av eksterne systemers data. I laboratoriet vårt integreres vår distribusjon av gP2S med (i) et prosjektstyringssystem, slik at hvert prosjekt som er konfigurert i gP2S, kan kobles til et porteføljeprosjekt for hele selskapet, og metadata fra porteføljen kan vises i gP2S; (ii) et proteinregistreringssystem, slik at hvert protein som legges til gP2S er koblet, via en identifikator lagret lokalt, til et komplett sett med poster som beskriver opprinnelsen til proteinet, inkluderer detaljer om relevant molekylærbiologi, uttrykkssystem og rensing; (iii) et lite molekyl sammensatt styringssystem, slik at gP2S kan vise nøkkelinformasjon om hver ligand, for eksempel den kjemiske strukturen. Kodeendringene som er nødvendige for å aktivere disse integreringene, er beskrevet i delen Integrasjon i README-BUILD.md dokumentet som er tilgjengelig fra gP2S-repositoriet (https://github.com/arohou/gP2S).

Den nåværende versjonen av gP2S har begrensninger, først blant annet den altfor forenklede datamodellen og frontend for struktur (modell) avsetning. Dette ble med vilje etterlatt i en "barebones" tilstand i den utgitte versjonen av gP2S fordi en fullverdig strukturavsetnings- og valideringsfunksjon for tiden er under utvikling sammen med støtte for røntgenkrystallografi. En annen utformingsavgjørelse var å ikke implementere noen privilegier eller tillatelsessystem: Alle brukere i gP2S har lik tilgang til funksjonene og dataene. Dette kan gjøre det til et dårlig valg for anlegg som betjener brukergrupper med konkurrerende interesser og konfidensialitetskrav, men som ikke var en bekymring for anlegget vårt.

Utviklingen av vår interne versjon av gP2S pågår, og det er vårt håp at åpen kildekode-versjonen som er beskrevet her, vil være nyttig for andre cryoEM-grupper, og at noen kan bidra med forslag, eller kodeforbedringer i fremtiden. Fremtidige utviklinger av høy verdi kan for eksempel fokusere på integrasjoner med laboratorieutstyr (vitrifiseringsroboter, elektronmikroskoper), programvare (f.eks. for å høste metadata for bildebehandling) og eksterne offentlige depoter (f.eks. for å lette strukturavsetninger).

Den systematiske innsamlingen av metadata av høy kvalitet som aktiveres ved rutinemessig bruk av gP2S i laboratoriet og cryoEM-anlegget, kan ha en betydelig, positiv innvirkning på evnen til å straffeforfølge flere prosjekter parallelt over en periode på flere år. Etter hvert som flere og flere delte og sentraliserte kryoEM-grupper og fasiliteter etableres, forventer vi at behovet for informasjonsstyringssystemer som gP2S vil fortsette å vokse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
n/a	n/a	n/a	n/a