Summary
Gangliosider er sialinsyrebærende glycosphingolipider, der er særligt rigelige i hjernen. Deres amfipatiske natur kræver organiske/vandige ekstraktions- og rensningsteknikker for at sikre optimal genvinding og nøjagtige analyser. Denne artikel indeholder oversigter over analytisk og præparativ skala gangliosidekstraktion, oprensning og tyndtlagskromatografianalyse.
Abstract
Gangliosider er glycosphingolipider, der indeholder en eller flere sialinsyrerester. De findes på alle hvirveldyrceller og væv, men er især rigelige i hjernen. Udtrykt primært på den ydre folder af plasmamembranerne i celler modulerer de aktiviteterne af celleoverfladeproteiner via lateral association, fungerer som receptorer i celle-celleinteraktioner og er mål for patogener og toksiner. Genetisk dysregulering af gangliosidbiosyntese hos mennesker resulterer i alvorlige medfødte nervesystemforstyrrelser. På grund af deres amfipatiske natur kræver ekstraktion, oprensning og analyse af gangliosider teknikker, der er blevet optimeret af mange efterforskere i de 80 år siden deres opdagelse. Her beskriver vi metoder på bænkniveau til ekstraktion, oprensning og foreløbige kvalitative og kvantitative analyser af større gangliosider fra væv og celler, der kan gennemføres på få timer. Vi beskriver også metoder til større skala isolering og oprensning af store gangliosidarter fra hjernen. Tilsammen giver disse metoder analytisk og præparativ skalaadgang til denne klasse af bioaktive molekyler.
Introduction
Gangliosider defineres som glycosphingolipider, der bærer en eller flere sialinsyrerester1. De udtrykkes primært på celleoverfladen med deres hydrofobe ceramidlipidmoiety indlejret i plasmamembranens ydre folder og deres hydrofile glycaner, der strækker sig ind i det ekstracellulære rum2. Selvom de er udbredt i hvirveldyrceller og væv, er de særligt rigelige i hvirveldyrshjernen3, hvor de først blev opdaget og navngivet4.
Strukturerne af gangliosidglycaner varierer og er grundlaget for deres nomenklatur (figur 1). Gangliosidglycaner består af en neutral sukkerkerne med forskellige tal og fordelinger af sialinsyrer. Det mindste gangliosid, GM4, har kun to sukkerarter (sialinsyre bundet til galactose)5. Større naturligt forekommende gangliosider kan indeholde langt over et dusin samlede sukkerarter6 eller op til syv sialinsyrer på en enkelt neutral kerne7. Deres ceramid lipid moieties varierer også, har forskellige sphingosin længder og en række fedtsyre amider. I hvirveldyrhjernen dominerer fire gangliosidarter, GM1, GD1a, GD1b og GT1b. Gangliosidekspression er udviklingsreguleret, vævsspecifik og celletypespecifik.
Figur 1: Større hjernegangliosider og deres biosyntetiske forstadier. Strukturer vises ved hjælp af symbolnomenklatur for glykaner11. Klik her for at se en større version af denne figur.
Gangliosider fungerer på molekylært niveau ved at engagere og modulere proteiner i deres egne membraner (cis-regulering) eller ved at engagere glycanbindende proteiner i det ekstracellulære miljø, herunder bakterielle toksiner og lektiner på andre celler (transgenkendelse)3. Specifik binding af gangliosider til regulatoriske proteiner og / eller selvforening med andre molekyler i lipidflåder resulterer i ændringer i celleadfærd, der påvirker nervesystemets struktur og funktion, kræftprogression, metabolisme, inflammation, neuronale proteinopatier og infektionssygdomme8. På grund af deres forskellige cellulære roller kan metoder til deres isolering og analyse give forbedret indsigt i reguleringen af fysiologiske og patologiske processer. Her tilvejebringes validerede metoder til hurtig ekstraktion og analyse i lille skala og præparativ skalaisolering af gangliosider fra hjernen. Muligheder og udfordringer for anvendelse på andre væv diskuteres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vævsindsamling blev udført under betingelser, der var godkendt af Johns Hopkins Animal Care and Use Committee.
1. Gangliosidekstraktion i lille skala og delvis rensning
FORSIGTIG: Brug passende ventilation, når du arbejder med flygtige og giftige opløsningsmidler. Undgå plastik hele vejen igennem; opløsningsmidler vil udvinde kemiske komponenter fra mange plastmaterialer, der forstyrrer efterfølgende analyser. Polytetrafluorethylen (PTFE) er en undtagelse; PTFE-forede lukninger bør bruges til at dække hætteglas til opbevaring af glas.
- Ekstraktion
- Vej en enkelt frisk eller optøet musehjerne (eller sagittal halvhjerne, ~ 0,2-0,5 g) og læg den i en Potter-Elvehjem homogenisator forkølet i en spand is.
BEMÆRK: Tidligere frosne hjerner kan bruges efter optøning ved 0-4 °C. - G væv våd vægt af vand og homogeniser med 10 slag.
BEMÆRK: Nøjagtige opløsningsmiddelforhold er nøglen til optimal ekstraktion og partitionering, målet er chloroform-methanol-vandig (4: 8: 3), forudsat at hjernevæv er 80% vandigt. - Der tilsættes 13 ml pr. g vævsfugtig vægt af methanol, skiftes til omgivelsestemperatur (22 °C) og blandes.
BEMÆRK: Løsningen vil fremstå overskyet. Tilsætning af methanol på dette trin, uden chloroform, optimerer proteinudfældning. Alle efterfølgende trin er ved omgivelsestemperatur (22 °C). - Overfør til et tykvægget glasskruedæksel med et PTFE-foret skruelåg ved omgivelsestemperatur (22 °C) og bland grundigt. G væv våd vægt af chloroform, hætte og bland grundigt. Centrifuge ved 450 x g i 15 min. Overfør den klare supernatant til et frisk skruelåget rør og mål volumenet, "genvundet ekstraktvolumen".
- Vej en enkelt frisk eller optøet musehjerne (eller sagittal halvhjerne, ~ 0,2-0,5 g) og læg den i en Potter-Elvehjem homogenisator forkølet i en spand is.
- Partition
- Tilsæt 0,173x "genvundet ekstraktvolumen" vand til den klare supernatant, hætte, hvirvel kraftigt og centrifuge som beskrevet i trin 1.1.4.
BEMÆRK: Målet er at have chloroform-methanol-vandig i forholdet 4:8:5.6. Blandingen vil være overskyet og opløses i to faser: en øvre vandig fase og en lavere chloroformrig fase i ~ 4: 1-forholdet. Vent i 60 min eller centrifuge ved 450 x g i 15 min for fuldstændig faseadskillelse. - Overfør den øverste fase, som indeholder gangliosiderne, til et frisk glasrør med et PTFE-foret skruelåg.
- Tilsæt 0,173x "genvundet ekstraktvolumen" vand til den klare supernatant, hætte, hvirvel kraftigt og centrifuge som beskrevet i trin 1.1.4.
- Omvendt fase patron kromatografi
- Brug en 5 ml glassprøjte til at vaske en tC18 fastfaseekstraktionspatron (400 mg) med 3 ml methanol og derefter 3 ml chloroform-methanol-vand (2:43:55). Læg den øverste fase fra trin 1.2.2 på tC18-patronen ved hjælp af den samme glassprøjte, opsaml gennemstrømningen og læg den på søjlen igen for at optimere adsorptionen.
- Brug glassprøjten til at vaske patronen med 3 ml chloroform-methanol-vand (2:43:55) og derefter 3 ml methanol-vand (1:1).
- Elute gangliosiderne med 3 ml methanol i et frisk skruelågt rør. Fordamp til tørhed under en skånsom strøm af nitrogen ved ≤ 45 °C. Opløs i methanol ved 1 ml pr. g af det oprindelige vævs våde vægt.
2. Storskala gangliosidekstraktion og -rensning
FORSIGTIG: Når du arbejder med flygtige opløsningsmidler, skal du bruge eksplosionsbestandige blendere. Brug ikke plast undtagen PTFE. Tetrahydrofuran, chloroform og ethylether er giftige flygtige organiske forbindelser. Arbejd i en stinkhætte med beskyttelseshandsker og sikkerhedsbriller.
- Ekstraktion
- Optø frossen kvæghjerne ved 4 °C i flere timer. Dissekere den grå substans fra meninges og hvid substans.
BEMÆRK: Følgende fremgangsmåde er beskrevet for 100 ± 20 g isoleret hjernegråt stof og er skalerbar. - Læg 100 g hjernegrå substans i en blender, og tilsæt 1 ml pr. g hjernevådvægt af kølet 10 mM kaliumphosphatbuffer pH 6,8. Homogeniser på lavt i 20 s. Tilsæt 8 ml tetrahydrofuran pr. g hjerne våd vægt og homogeniser på lav i 10 s. Dekanter i glascentrifugeflasker og centrifuge ved 5.000 x g i 15 minutter ved omgivelsestemperatur (22 °C).
- Saml supernatanten, mål dens volumen og overfør til en glasseparatortragt. Der tilsættes 0,3 ml ethylether pr. ml supernatant. Ryst kraftigt, og lad det derefter sidde uforstyrret i 30 minutter, hvor to faser, en øvre etherfase og en nedre vandig fase, adskilles. Saml den nederste fase, som indeholder gangliosiderne, i en glasflaske med en PTFE-foret hætte.
- Til den øvre fase (ether), der er tilbage i separationstragten, tilsættes 0,1 ml vand pr. ml originalt supernatant (trin 2.1.3). Ryst kraftigt, lad faser adskille, saml den nedre (vandige) fase og kombiner med den foregående nedre fase. Fordamp de kombinerede nedre faser til et tørt pulver og vej.
- Optø frossen kvæghjerne ved 4 °C i flere timer. Dissekere den grå substans fra meninges og hvid substans.
- Forsæbning
- Tilsæt 10 ml 100 mM vandig NaOH pr. g pulver i et forseglet rør. Bland og inkuber ved 37 °C i 3 timer. Lad afkøle og juster til pH 4,5 ved dråbevis tilsætning af 100 mM vandig HCL. Mål lydstyrken og overfør til en glasseparatortragt.
BEMÆRK: Sialinsyrer er sure labile; undgå forsuring under pH 4,5. - Baseret på det vandige volumen tilsættes 2,67 volumener methanol, blandes forsigtigt, og derefter tilsættes 1,33 volumener chloroform for at skabe en enfaset opløsning af chloroform-methanol-vandig (4:8:3). Bland godt.
- Baseret på det oprindelige vandige volumen tilsættes 2,6 volumener vand for at bringe blandingen til chloroform-methanol-vandig i et forhold på 4:8:5,6. Ryst kraftigt, og lad det derefter sidde uforstyrret for at adskille to faser, en polær øvre fase, der indeholder gangliosiderne og en ikke-polær nedre fase. Saml den øverste fase i en glasflaske med en PTFE-foret hætte.
BEMÆRK: Ikke-sialylerede lipider vises ikke på tyndtlagskromatografi (TLC) plader farvet ved hjælp af resorcinol, men vises, når du bruger en p-anisaldehydplet. Formålet med denne forsæbning er at fjerne de O-acetylerede forbindelser, såsom phospholipider.
- Tilsæt 10 ml 100 mM vandig NaOH pr. g pulver i et forseglet rør. Bland og inkuber ved 37 °C i 3 timer. Lad afkøle og juster til pH 4,5 ved dråbevis tilsætning af 100 mM vandig HCL. Mål lydstyrken og overfør til en glasseparatortragt.
- Omvendt fase kromatografi
- Forvask en storskala (10 g) tC18 fastfaseekstraktionspatron ved at føre 50 ml af hvert af følgende tre opløsningsmidler gennem søjlen ved hjælp af vakuum eller tryk (<1 minut hver vask): methanol, methanol-vand (1:1), derefter chloroform-methanol-vand (2:43:55). Læg den øverste fase fra trin 2.2.3 på søjlen ved vakuum eller tryk, opsaml strømmen igennem, genindlæs og opsaml strømmen igennem.
- Vask søjlen med 30 ml chloroform-methanol-vand (2:43:55), derefter 30 ml methanol-vand (1:1), eluer derefter gangliosiderne med 50 ml methanol og igen med 10 ml methanol, opsaml hver vask og hver eluering separat. Brug af TLC (nedenfor) bekræfter, at gangliosid er fraværende fra gennemstrømningen og vaskes og elueres i den første eluering (50 ml methanol). Fordamp de eluerede gangliosider til et tørt pulver og vej.
BEMÆRK: Formålet med tC18-kromatografi er at adskille gangliosider fra både mindre og flere polære forurenende stoffer. Blandet hjernegangliosidudbytte efter forsæbning er ~ 120 mg pr. G tør hjerneekstrakt (trin 2.1.4). Udseende af gangliosider ved TLC i gennemstrømningen eller vasken indikerer, at fastfaseekstraktionskolonnen var mættet. Efter methanolelutning kan kolonnen elueres yderligere med chloroform-methanol (1:1) for at fange mindre polære lipider.
- HPLC-rensning af individuelle gangliosider
- Forbered HPLC-opløsningsmiddel A: acetonitril-5 mM vandig natriumphosphatbuffer pH 5,6 (83:17) og opløsningsmiddel B: acetonitril-20 mM natriumphosphatbuffer, pH 5,6 (1:1). Afgas begge opløsningsmidler i 5 min.
- Forligelig en HPLC-søjle (20 x 250 mm søjle pakket med aminbundne (NH2) silicakugler, 5 μm diameter, 100 Å porestørrelse) med 100% opløsningsmiddel A i 20 minutter ved 5 ml/min. Indstil en UV HPLC-søjlespildestrømsdetektor til 215 nm.
- Gangliosidpulveret opløses fra det omvendte faseeluat i vand ved 5 mg/ml. 0,5 ml gangliosidblandingen injiceres på HPLC'en, og opløsningsmiddelgradienten (tabel 1) køres ved 5 ml/min. opsamling af fraktioner. Gangliosider vil fremstå som A215-toppe med retentionstider (større hjernegangliosider) på 25-70 min: GM1 ≈ 28 min; GD1a ≈ 38 min; GD1b ≈ 46 min; GT1b ≈ 65 min. Re-ligevægt 20 min med opløsningsmiddel A efter hver kørsel. Analyser fraktioner ved tyndtlagskromatografi.
| Tidspunkt (min) | %A | %B |
| 0 | 100 | 0 |
| 7 | 100 | 0 |
| 12 | 63 | 37 |
| 82 | 54 | 46 |
| 82.01 | 0 | 100 |
| 92 | 0 | 100 |
Tabel 1: Opløsningsmiddelgradient for HPLC.
3. Tyndtlagskromatografi (TLC) analyse af gangliosider
FORSIGTIG: Chloroform er en giftig flygtig organisk forbindelse. Arbejd i en stinkhætte med beskyttelseshandsker og sikkerhedsbriller.
- Løbende opløsningsmiddel og TLC-pladeforberedelse
- Der fremstilles et løbende opløsningsmiddel af chloroform-methanol-vandig 0,25% KCl (60:35:8 i volumen). Hæld i et 10 cm x 10 cm glas TLC-kammer med et rustfrit ståldæksel, så opløsningsmiddeldybden er ~ 0,5 cm. Dæk til og lad det ligestille i et område uden luftstrømme i >10 minutter.
BEMÆRK: For at isolere TLC-kammeret fra luftstrømme kan en akryl 5-sidet kasse konstrueres eller købes (figur 2). Brug ikke opløsningsmiddelmættet filterpapir inde i kammeret. - Anbring en 10 cm x 10 cm eller 5 cm x 10 cm silicagelbelagt højtydende TLC-plade med glasstøtte i en tørreovn ved 125 °C i 10 minutter. Lad afkøle. Brug en sløvet #2 blyant til at tegne 5 mm spotting linjer med 2 mm adskillelser langs en linje 1 cm over bunden af pladen og mindst 1 cm fra hver side (figur 3). Undgå at forstyrre silicalaget under mærkning.
- Der fremstilles en standardblanding af rene gangliosider i methanol indeholdende 100 μM GM1, 50 μM hver af GD1a og GD1b og 33 μM GT1b.
BEMÆRK: Denne blanding indeholder 100 pmol gangliosidialinsyre pr. μL for hver af de fire gangliosider, en mængde, der giver et stærkt kolorimetrisk signal ved resorcinolfarvning, som er sialinsyreafhængig.
- Der fremstilles et løbende opløsningsmiddel af chloroform-methanol-vandig 0,25% KCl (60:35:8 i volumen). Hæld i et 10 cm x 10 cm glas TLC-kammer med et rustfrit ståldæksel, så opløsningsmiddeldybden er ~ 0,5 cm. Dæk til og lad det ligestille i et område uden luftstrømme i >10 minutter.
- Ganglioside opløsning
- Vask en 10-μL Hamilton-sprøjte med en skrå nål med methanol. Der trækkes 1 μL methanol i en glassprøjte for at fylde nålens dødvolumen og derefter 1 μL prøve eller standard. Prøven spotes jævnt på de 5 mm præmærkede linjer, indtil der er < 1 μL opløsningsmiddel (methanol) tilbage i sprøjten. Pladen tørres ved omgivelsestemperatur (22 °C), efter at alle prøver er blevet opdaget.
BEMÆRK: Vask sprøjten med methanol mellem prøvepåfyldningen. En uopvarmet luftblæser, der er indstillet til lavt, kan bruges til at fremskynde tørringen. - Anbring den plettede og tørrede plade i det forædlede TLC-kammer med bundkanten nedsænket i det løbende opløsningsmiddel, og dæk til og beskyt mod luftstrømme (figur 2). Lad det kørende opløsningsmiddel gå fremad op ad pladen ved kapillær virkning, indtil opløsningsmiddelfronten når inden for 1 cm fra toppen af pladen. Fjern og markér opløsningsmiddelfronten ved kanten af pladen med en blyant. Lad opløsningsmidlerne fordampe helt enten uforstyrret eller under mild luftstrøm.
- Vask en 10-μL Hamilton-sprøjte med en skrå nål med methanol. Der trækkes 1 μL methanol i en glassprøjte for at fylde nålens dødvolumen og derefter 1 μL prøve eller standard. Prøven spotes jævnt på de 5 mm præmærkede linjer, indtil der er < 1 μL opløsningsmiddel (methanol) tilbage i sprøjten. Pladen tørres ved omgivelsestemperatur (22 °C), efter at alle prøver er blevet opdaget.
Figur 2: Ganglioside TLC udstyr og opsætning. Et dobbelt trugkammer er fyldt til ≈ 0,5 cm på begge sider med løbende opløsningsmiddel. Pladen placeres mod den ene side med oprindelsesenden nedsænket i den løbende buffer. Kammeret er dækket af en akrylkasse for at undgå luftstrømme. Panel A, set fra siden før pladeindsættelse. Opløsningsmiddelniveauet er synligt et par mm over kammerets bund; Panel B, set forfra under udvikling. Opløsningsmiddelfronten er synlig ca. 40% af vejen op ad pladen. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Gangliosid farvning
FORSIGTIG: Reagenspletter er giftige. Saltsyre er ætsende og giftig. Forbered og sprøjt reagenser i en stinkhætte med beskyttelseshandsker og sikkerhedsbriller.
BEMÆRK: Pladen kan afbildes til kvalitativ billedanalyse eller opbevares ved at fjerne klemmerne og fastgøre dækpladen på plads med klar tape. Kvantitativ analyse kan udføres ved at måle densitometri af gangliosidstandarder spottet i tilstødende baner.- Forbered resorcinol sprayreagens til påvisning af gangliosider baseret på deres sialinsyrer. Opløs 6 g resorcinol i 100 ml vand til en 6% resorcinol bestand. Opløs 1 g CuSO4 i 100 ml vand for at lave en 1% bestand. Til 64,7 ml vand tilsættes 5 ml af 6% resorcinolbestanden, 0,31 ml af 1% CuSO4-bestanden, tilsæt derefter langsomt 30 ml koncentreret HCi og rør forsigtigt. Kan opbevares ved 4 °C i en måned.
- I en kemisk røghætte skal du placere TLC-pladen med opløste gangliosider, oprindelse ender i en afskåret papkasse for at beskytte emhættens vægge mod syrespray. Anbring resorcinolsprayreagens i en TLC-sprøjte af glas, fastgør den til en kilde til trykkvælstof, og sprøjt pladen let diagonalt i lodret og vandret retning. Sprøjt TLC-sorbentoverfladen ensartet, men let.
- Dæk straks pladen med en ren dækplade af tørt glas af samme dimensioner, og fastgør dækpladen på plads med bindemiddelclips (figur 3). Den overdækkede plade opvarmes ved 125 °C i 20 min. Gangliosider vises mørk lilla mod en hvid baggrund.
BEMÆRK: Pladen må ikke fremstå våd, når sprøjtningen er afsluttet. Dækplader kan formes ved at skrabe sorbenten fra tidligere anvendte TLC-plader ved hjælp af et enkeltkantet barberblad.
FORSIGTIG: Silicapulver er giftigt for lungerne. Brug en maske og bortskaf silica i en forseglet beholder.
Figur 3: TLC-plade af opløst blandet gangliosid. TLC-plade med løste blandede gangliosidstandarder (venstre bane) og rensede blandede kvæggrå stofgangliosider (højre bane) efter resorcinolfarvning og opvarmning med glasdækselplade klippet på plads. Standard gangliosider (top til bund) er GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b, GT1b og GQ1b. Efter afkøling kan pladen afbildes og/eller dækpladen tapes på plads til opbevaring. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Generel lipidfarvning for gangliosider og phospholipider.
FORSIGTIG: Svovlsyre er giftig og ætsende. Tilsætning af koncentreret syre til ethanol er eksoterm og skal udføres langsomt. Forbered farvningsreagens i en stinkhætte med beskyttelseshandsker og sikkerhedsbriller.- Forbered p-anisaldehydplet ved langsomt at tilsætte 15 ml koncentreret svovlsyre til 500 ml ethanol. Rør i 30 minutter for at lade opløsningen køle af, inden du fortsætter. Tilsæt 15 ml p-anisaldehyd og rør forsigtigt. Dette kan opbevares ved stuetemperatur (22 °C) i op til seks måneder.
- I en kemisk røghætte dyppes TLC-pladen med opløste gangliosider, oprindelsen ender ned, i et bægerglas, der indeholder p-anisaldehydpletten. Sænk ned til løbefronten i ≥ 2 s. Fjern TLC fra pletten og lad den dræne. Opvarm TLC-pladen på en kogeplade ved lav temperatur for at udvikle sig.
BEMÆRK: Lipider vises mørke mod en lilla baggrund. Farvningsopløsning kan genvindes ved gentagen brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De metoder, der er beskrevet i afsnit 1 (lille skala), tilvejebringer gangliosider i tilstrækkelig mængde og renhed til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af større hjernegangliosider. Genopretning fra musehjerne er ~ 1 μmol gangliosid pr. G hjernens våde vægt (1 nmol / μL), når den fremstilles som beskrevet. TLC-opløsning på 1 μL (1 nmol) ved hjælp af afsnit 3 giver rigeligt materiale til resorcinoldetektion og løser alle de store hjernegangliosider som vist for vildtypemus og genetisk modificerede mus i figur 4. Selv om blandede gangliosider fremstillet ved hjælp af afsnit 1 ikke er fri for andre vigtige lipider, er gangliosider af tilstrækkelig renhed til massespektrometrisk (MS) bestemmelse som vist i figur 5, enten som indfødte rensede gangliosider i negativ tilstand eller efter permethylering i positiv tilstand9. Da afsnit 1 undgår alkalisk hydrolyse for at fjerne phospholipider, bevarer det alkalifølsomme naturlige modifikationer, såsom O-acetylerede sialinsyrer (se GT1b-OAc, figur 4)9.
Figur 4: TLC af musehjernens gangliosider. TLC af musehjernegangliosider fra vildtype (WT) og St3gal enkelt- og dobbeltnulmus renset som i protokol 1. Dette tal er blevet modificeret fra Sturgill et al,, 20129. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: MS af permethyleret vildtype og St3gal2/3-dobbelt-null musehjernegangliosider renset som i afsnit 1. Bemærk, at GD1a og GD1b løser sig ved TLC (figur 4), men har samme masse, så de kan ikke skelnes af endimensionel MS. Dette tal er blevet modificeret fra Sturgill et al,, 20129. Klik her for at se en større version af denne figur.
Oprensning i stor skala (afsnit 2) omfatter ekstraktion, forsæbning (for at fjerne phospholipider) og HPLC-opløsning for at tilvejebringe rensede større hjernegangliosider GM1, GD1a, GD1b og GT1b, der er egnede til biologiske forsøg og til yderligere kemiske og enzymatiske modifikationer. En eksemplarisk HPLC-profil og efterfølgende TLC-analyse er vist i figur 6. Alkalibehandling (forsæbning) er nødvendig i denne protokol for at hydrolysere og fjerne forurenende fosfolipider (figur 7), men vil også hydrolysere naturlige modifikationer af gangliosider, såsom O-acetylerede sialinsyrer, hvilket kan være vigtigt i nogle sammenhænge10. Til disse anvendelser er alternative effektive metoder til fjernelse af phospholipider fra isolerede gangliosider blevet offentliggjort6.
Figur 6: Repræsentativ HPLC for kvæghjernegangliosider. Elueringsgradienten (%B, prikket linje) er overlejret på absorbansen (A215, fast linje) i de første 75 minutter af cyklussen. Toppe (A215) blev indsamlet (tal i parentes) og underkastet TLC som i protokol 3. Vognbanenumre henviser til topnumrene på kromatogrammet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: TLC-plade af opløst blandet gangliosid. TLC-plade med løste blandede gangliosider (bane 1) sammen med postforsæbningsopdelte gangliosider (bane 2) og frigivne fedtsyrer (bane 3). Lipider, herunder gangliosider, detekteres med p-anisaldehydplet. Standard gangliosider (top til bund) er GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b og GT1b. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoderne til gangliosidekstraktion og isolering i lille og stor skala, der er rapporteret her, er ikke unikke - der er mange forskellige opløsningsmiddelekstraktions- og oprensningsmetoder, der giver fremragende resultater12. De metoder, der er rapporteret her til rensning i lille skala fra hjernen, fra Fredman og Svennerholm13, viste sig at optimere restitutionen og har vist sig at være robuste og ligetil gennem mange år i vores laboratorium. Isolering og oprensning egnet til TLC og MS kan let afsluttes, fra intakt væv til isolerede gangliosider, på få timer. MS kan udføres på indfødte rensede gangliosider i negativ tilstand eller efter permethylering i positiv tilstand (figur 7, se f.eks. Sturgill et al.9). Udbyttet er meget konsistent, ≈ 1 μmol gangliosid (≈ 2 μmol gangliosidbundet sialinsyre) pr. g frisk hjernevæv for de fleste pattedyr. Metoden til storskala ekstraktion og opdeling fra hjernen, der er rapporteret her, introduceret af Tettamani et al.14, er valgt for at minimere mængden af gangliosidholdigt opløsningsmiddel ved den første partition (ether-tetrahydrofuran-vand). Dette forenkler efterfølgende trin, der kan blive besværlige med teknikker, der genererer store mængder partitionerede gangliosider ved de første trin. HpLC-metoden beskrevet, fra Gazzotti et al.15, har relativt høj kapacitet og god opløsning af de store hjernegangliosider.
De beskrevne små protokoller er velegnede til både celler og væv og er skalerbare. Da de sidste trin er omvendt faseindfangning, fordampning og genopløsning i methanol, kan de anvendes i vilkårlig skala på små prøver, såsom dyrkede nerveceller. I dette tilfælde skraber og homogeniserer vi celler i 1 ml vand for nemheds skyld og fortsætter med methanol og chloroformtilsætning for at generere de passende forhold til ekstraktion og derefter partitionering. De endelige tørrede gangliosider efter omvendt fase kan genopløses i blot et par mikroliter og analyseres af TLC og MS.
Opmærksomhed på opløsningsmiddelforhold er afgørende for succes i ekstraktions- og opløsningsmiddelopdelingstrin til gangliosidisolering. Ved udvinding og opdeling i lille skala blev forskellige chloroform-methanol-vand-forhold testet, og dem, der genererede nær kvantitativ gangliosidisolering, rapporteres her13. Variationer fra de beskrevne forhold vil mindske genvinding og/eller oprensning. Ligeledes er opmærksomhed på opløsningsmiddelforhold i TLC-udviklende opløsningsmidler kritisk. De rapporterede chloroform-methanol-vand-forhold resulterer i en enkelt klar fase. Små variationer kan give overskyede udviklingsløsninger, som ikke bør anvendes, men som kan afklares ved dråbevis tilsætning af methanol med hvirvlende. Selv om forskellige ekstraktions- og skillevægsopløsningsmidler er almindelige, bør opløsningsmiddelforholdet følges nøje for hver variation12. Ændringer i TLC-opløsningsmidler er også almindelige for at optimere adskillelsen af specifikke gangliosider16. En relativt enkel måde at ændre TLC-migration af gangliosider på er at ændre den vandige fase af opløsningsmiddelblandingen. Anvendelse af vandig ammoniumhydroxid eller calciumchlorid i stedet for kaliumchlorid ændrer gangliosidsaltformen og den relative TLC-migration17.
Mens alle hvirveldyrceller og væv udtrykker gangliosider, er hjernen og nervecellerne usædvanlige i de store mængder, der udtrykkes. De protokoller, der er beskrevet her, gælder for andre væv og celler, men ændringer kan være nødvendige på grund af den lavere overflod og potentielle forurening med andre lipider. Disse metoder som anvendt på humane neutrofiler6 og musedipose18 giver eksempler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hævder ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) Common Fund for Glycoscience grant U01CA241953. MJP blev støttet af Chemistry-Biology Interface Program på Johns Hopkins (T32GM080189).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine brain, stripped | PelFreez | 57105-1 | |
| Ganglioside standards | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| Glass bottle with PTFE-lined cap | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| Glass centrifuge bottle | Fisher Scientific | 05-586B | |
| Glass culture tubes, 16 x 125 mm | VWR | 60825-430 | for collecting HPLC fractions |
| Glass separatory funnel (2 L) | Pyrex | 6400-2L | |
| Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 µl | Hamilton | 81265 | |
| p-Anisaldehyde, 98% | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Potter-Elvhjem Homogenizer | Fisher Scientific | 08-414-14A | Choose appropriate volume option |
| Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns | Analytics-Shop | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column | Analytics-Shop | custom packed | other sizes available |
| Resorcinol | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-300 | |
| Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml) | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) | Waters | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg | Waters | WAT036810 | |
| Spotting syringe - Hamilton 701N 10 µl | Hamilton | 80300 | |
| Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-933A | |
| Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-955-323 | For ganglioside storage |
| TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat | Fisher Scientific | M1056350001 | Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface |
| TLC reagent sprayer | Fisher Scientific | 05-723-26A | |
| TLC running chamber for 10 x 10 cm plates | Camag | 22.5155 | |
| Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender | Waring | E8520 |
References
- Schnaar, R. L.
- DeMarco, M. L., Woods, R. J. Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces. Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).
- Schnaar, R. L.
- Klenk, E. Über die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids]. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).
- Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells. Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).
- Nimrichter, L., et al.
- Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).
- Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).
- Sturgill, E. R., et al. Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b. Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).
- Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy. Cells. 9 (3), (2020).
- Varki, A., et al. Symbol nomenclature for graphical representations of glycans. Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).
- Schnaar, R. L.
- Svennerholm, L., Fredman, P. A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).
- Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).
- Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures. Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).
- Schnaar, R. L., Needham, L. K.
- Ledeen, R. W., Yu, R. K. Gangliosides: structure, isolation, and analysis. Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).
- Lopez, P. H., et al. Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance. Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).
