Summary
Gangliosiden zijn siaalzuurhoudende glycosfingolipiden die bijzonder overvloedig aanwezig zijn in de hersenen. Hun amfipathische aard vereist organische /waterige extractie- en zuiveringstechnieken om optimaal herstel en nauwkeurige analyses te garanderen. Dit artikel biedt een overzicht van analytische en preparatieve schaal ganglioside extractie, zuivering en dunne laag chromatografie analyse.
Abstract
Gangliosiden zijn glycosfingolipiden die een of meer siaalzuurresiduen bevatten. Ze zijn te vinden op alle gewervelde cellen en weefsels, maar zijn vooral overvloedig aanwezig in de hersenen. Voornamelijk uitgedrukt op de buitenste folder van de plasmamembranen van cellen, moduleren ze de activiteiten van celoppervlakeiwitten via laterale associatie, fungeren ze als receptoren in cel-celinteracties en zijn ze doelwitten voor pathogenen en toxines. Genetische ontregeling van ganglioside biosynthese bij de mens resulteert in ernstige aangeboren aandoeningen van het zenuwstelsel. Vanwege hun amfipathische aard vereisen extractie, zuivering en analyse van gangliosiden technieken die door veel onderzoekers in de 80 jaar sinds hun ontdekking zijn geoptimaliseerd. Hier beschrijven we bench-level methoden voor de extractie, zuivering en voorlopige kwalitatieve en kwantitatieve analyses van belangrijke gangliosiden uit weefsels en cellen die in een paar uur kunnen worden voltooid. We beschrijven ook methoden voor grootschalige isolatie en zuivering van belangrijke ganglioside soorten uit de hersenen. Samen bieden deze methoden analytische en preparatieve schaaltoegang tot deze klasse van bioactieve moleculen.
Introduction
Gangliosiden worden gedefinieerd als glycosfingolipiden met een of meer siaalzuurresiduen1. Ze komen voornamelijk tot expressie aan het celoppervlak met hun hydrofobe ceramide lipidegroep ingebed in de buitenste klep van het plasmamembraan en hun hydrofiele glycanen die zich uitstrekken tot in de extracellulaire ruimte2. Hoewel ze wijd verspreid zijn in gewervelde cellen en weefsels, zijn ze vooral overvloedig aanwezig in de hersenen van gewervelde dieren3, waar ze voor het eerst werden ontdekt en benoemd4.
De structuren van ganglioside glycanen variëren en vormen de basis voor hun nomenclatuur (figuur 1). Ganglioside glycanen bestaan uit een neutrale suikerkern met verschillende nummers en verdelingen van siaalzuren. Het kleinste ganglioside, GM4, heeft slechts twee suikers (siaalzuur gebonden aan galactose)5. Grotere natuurlijk voorkomende gangliosiden kunnen meer dan een dozijn totale suikers6 of maximaal zeven siaalzuren bevatten op een enkele neutrale kern7. Hun ceramide lipide moieties variëren ook, met verschillende sfingosine lengtes en een verscheidenheid aan vetzuuramiden. In de hersenen van gewervelde dieren overheersen vier ganglioside-soorten, GM1, GD1a, GD1b en GT1b. Ganglioside-expressie is ontwikkelingsreguleerd, weefselspecifiek en celtypespecifiek.
Figuur 1: Belangrijke hersengangliosiden en hun biosynthetische voorlopers. Structuren worden weergegeven met behulp van symboolnomenclatuur voor glycanen11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Gangliosiden functioneren op moleculair niveau door eiwitten in hun eigen membranen te betrekken en te moduleren (cis-regulatie) of door glycaanbindende eiwitten in het extracellulaire milieu te betrekken, inclusief bacteriële toxines en lectines op andere cellen (transherkenning)3. Specifieke binding van gangliosiden aan regulerende eiwitten en / of zelfassociatie met andere moleculen in lipidevlotten resulteert in veranderingen in celgedrag die van invloed zijn op de structuur en functie van het zenuwstelsel, kankerprogressie, metabolisme, ontsteking, neuronale proteïnopathieën en infectieziekten8. Vanwege hun diverse cellulaire rollen kunnen methoden voor hun isolatie en analyse verbeterde inzichten bieden in de regulatie van fysiologische en pathologische processen. Hier worden gevalideerde methoden voor snelle kleinschalige extractie en analyse en preparatieve schaalisolatie van gangliosiden uit de hersenen verstrekt. Kansen en uitdagingen voor toepassing op andere weefsels worden besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Weefselverzameling werd uitgevoerd onder omstandigheden die zijn geautoriseerd door het Johns Hopkins Animal Care and Use Committee.
1. Kleinschalige ganglioside extractie en gedeeltelijke zuivering
LET OP: Gebruik de juiste ventilatie bij het werken met vluchtige en giftige oplosmiddelen. Vermijd plastic overal; oplosmiddelen zullen chemische componenten uit veel kunststoffen halen die de daaropvolgende analyses verstoren. Polytetrafluorethyleen (PTFE) is een uitzondering; Ptfe-gevoerde sluitingen moeten worden gebruikt om glazen opslagflacons af te sluiten.
- Extractie
- Weeg een enkel vers of ontdooid muizenbrein (of sagittale halve hersenen, ~ 0,2-0,5 g) en plaats in een Potter-Elvehjem homogenisator voorgekookt in een emmer ijs.
OPMERKING: Eerder bevroren hersenen kunnen worden gebruikt na ontdooien bij 0-4 °C. - Voeg 4,1 ml per g weefsel nat gewicht water toe en homogeniseren met 10 slagen.
OPMERKING: Nauwkeurige oplosmiddelverhoudingen zijn de sleutel tot optimale extractie en verdeling, het doel is chloroform-methanol-waterig (4: 8: 3) ervan uitgaande dat hersenweefsel 80% waterig is. - Voeg 13 ml per g weefsel nat gewicht van methanol toe, verschuif naar omgevingstemperatuur (22 °C) en meng.
OPMERKING: De oplossing ziet er troebel uit. Toevoeging van methanol in deze stap, zonder chloroform, optimaliseert eiwitprecipitatie. Alle volgende stappen zijn bij omgevingstemperatuur (22 °C). - Breng over op een dikwandige glazen buis met schroefdeksel met een PTFE-gevoerde schroefdop bij omgevingstemperatuur (22 °C) en meng grondig. Voeg 6,5 ml per g weefsel nat gewicht chloroform, dop toe en meng grondig. Centrifugeer bij 450 x g gedurende 15 min. Breng het heldere supernatant over op een verse buis met schroefdeksel en meet het volume,"recovered extract volume".
- Weeg een enkel vers of ontdooid muizenbrein (of sagittale halve hersenen, ~ 0,2-0,5 g) en plaats in een Potter-Elvehjem homogenisator voorgekookt in een emmer ijs.
- Verdelen
- Voeg 0,173x "teruggewonnen extractvolume" water toe aan het heldere supernatant, de dop, de vortex krachtig en de centrifuge zoals beschreven in stap 1.1.4.
OPMERKING: Het doel is om chloroform-methanol-waterig te hebben in de verhouding 4: 8: 5,6. Het mengsel zal troebel zijn en oplossen in twee fasen: een bovenste waterrijke fase en een lagere chloroformrijke fase met een verhouding van ~ 4: 1. Wacht 60 minuten of centrifugeer 15 minuten bij 450 x g voor volledige fasescheiding. - Breng de bovenste fase, die de gangliosiden bevat, over in een verse glazen buis met een ptfe-gevoerde schroefdop.
- Voeg 0,173x "teruggewonnen extractvolume" water toe aan het heldere supernatant, de dop, de vortex krachtig en de centrifuge zoals beschreven in stap 1.1.4.
- Reverse phase cartridge chromatografie
- Was met een glazen spuit van 5 ml een tC18 vaste fase extractiepatroon (400 mg) met 3 ml methanol en vervolgens 3 ml chloroform-methanol-water (2:43:55). Laad de bovenste fase vanaf stap 1.2.2 op de tC18-patroon met dezelfde glazen spuit, verzamel de doorstroom en herlaad deze op de kolom om de adsorptie te optimaliseren.
- Was de patroon met behulp van de glazen spuit met 3 ml chloroform-methanol-water (2:43:55) en vervolgens 3 ml methanol-water (1:1).
- Elueer de gangliosiden met 3 ml methanol in een verse buis met schroefdeksel. Verdamp tot de droogte onder een zachte stikstofstroom bij ≤ 45 °C. Los op in methanol bij 1 ml per g oorspronkelijk weefsel nat gewicht.
2. Grootschalige ganglioside extractie en zuivering
LET OP: Gebruik bij het werken met vluchtige oplosmiddelen explosiebestendige blenders. Gebruik geen kunststoffen behalve PTFE. Tetrahydrofuran, chloroform en ethylether zijn giftige vluchtige organische stoffen. Werk in een zuurkast met beschermende handschoenen en veiligheidsbril.
- Extractie
- Ontdooi bevroren runderhersenen bij 4 °C gedurende enkele uren. Ontleed de grijze stof uit hersenvliezen en witte stof.
OPMERKING: De volgende procedure wordt beschreven voor 100 ± 20 g geïsoleerde grijze stof in de hersenen en is schaalbaar. - Doe 100 g grijze stof in de hersenen in een blender en voeg 1 ml per g hersenvochtig gewicht van gekoelde 10 mM kaliumfosfaatbuffer pH 6,8 toe. Homogeniseer op laag gedurende 20 s. Voeg 8 ml tetrahydrofuraan per g nat gewicht van de hersenen toe en homogeniseer op laag gedurende 10 s. Decanteer in glazen centrifugeflessen en centrifugeer bij 5.000 x g gedurende 15 minuten bij omgevingstemperatuur (22 °C).
- Verzamel het supernatant, meet het volume en breng het over naar een glazen scheidingstrechter. Voeg 0,3 ml ethylether per ml van het supernatant toe. Schud krachtig en laat dan 30 minuten ongestoord zitten, waarbij twee fasen, een bovenste etherfase en een lagere waterige fase, zich scheiden. Verzamel de onderste fase, die de gangliosiden bevat, in een glazen fles met een ptfe-gevoerde dop.
- Voeg aan de bovenste (ether)fase die overblijft in de separatortrechter 0,1 ml water per ml oorspronkelijk supernatant toe (stap 2.1.3). Schud krachtig, laat fasen scheiden, verzamel de onderste (waterige) fase en combineer met de vorige lagere fase. Verdamp de gecombineerde lagere fasen tot een droog poeder en weeg.
- Ontdooi bevroren runderhersenen bij 4 °C gedurende enkele uren. Ontleed de grijze stof uit hersenvliezen en witte stof.
- Verzeping
- Voeg 10 ml van 100 mM waterige NaOH per g poeder toe in een afgesloten buis. Meng en incubeer bij 37 °C gedurende 3 uur. Laat afkoelen en stel de pH 4,5 in door druppelsgewijs 100 mM waterig HCl. Meet het volume en breng over naar een glazen scheidingstrechter.
OPMERKING: Siaalzuren zijn zuur labiel; vermijd verzuring onder pH 4,5. - Voeg op basis van het waterige volume 2,67 volumes methanol toe, meng voorzichtig en voeg vervolgens 1,33 volumes chloroform toe om een eenfasige oplossing van chloroform-methanol-waterig (4:8:3) te creëren. Meng goed.
- Voeg op basis van het oorspronkelijke waterige volume 2,6 volumes water toe om het mengsel tot chloroform-methanol-waterig te brengen in een verhouding van 4:8:5,6. Schud krachtig en laat dan ongestoord zitten om twee fasen te scheiden, een polaire bovenste fase met de gangliosiden en een niet-polaire onderste fase. Verzamel de bovenste fase in een glazen fles met een ptfe-gevoerde dop.
OPMERKING: Niet-gesialyleerde lipiden verschijnen niet op dunnelaagchromatografie (TLC) platen gekleurd met resorcinol, maar verschijnen bij gebruik van een p-anisaldehydekleuring. Het doel van deze verzeping is om de O-geacetyleerde verbindingen zoals fosfolipiden te verwijderen.
- Voeg 10 ml van 100 mM waterige NaOH per g poeder toe in een afgesloten buis. Meng en incubeer bij 37 °C gedurende 3 uur. Laat afkoelen en stel de pH 4,5 in door druppelsgewijs 100 mM waterig HCl. Meet het volume en breng over naar een glazen scheidingstrechter.
- Omgekeerde fase chromatografie
- Was een grootschalige (10 g) tC18 vaste fase extractiepatroon voor door 50 ml van elk van de volgende drie oplosmiddelen door de kolom te laten gaan met behulp van vacuüm of druk (<1 min elke wasbeurt): methanol, methanol-water (1:1) en vervolgens chloroform-methanol-water (2:43:55). Laad de bovenste fase vanaf stap 2.2.3 op de kolom door vacuüm of druk, verzamel de stroom door, herlaad en verzamel de doorstroom.
- Was de kolom met 30 ml chloroform-methanol-water (2:43:55), vervolgens 30 ml methanol-water (1:1), eluleer vervolgens de gangliosiden met 50 ml methanol en nogmaals met 10 ml methanol, waarbij elke wasbeurt en elke elutie afzonderlijk worden verzameld. Het gebruik van TLC (hieronder) bevestigt dat ganglioside afwezig is in de doorstroom en wast en geëlueerd in de eerste elutie (50 ml methanol). Verdamp de geëlueerde gangliosiden tot een droog poeder en weeg.
OPMERKING: Het doel van tC18 chromatografie is om gangliosiden te scheiden van zowel minder als meer polaire verontreinigingen. Gemengde hersen ganglioside opbrengst na verzeping is ~ 120 mg per g droog hersenextract (stap 2.1.4). Verschijning van gangliosiden door TLC in de doorstroming of wasbeurten geeft aan dat de vaste fase extractiekolom verzadigd was. Na methanolelutie kan de kolom verder worden geëlueerd met chloroform-methanol (1:1) om minder polaire lipiden op te vangen.
- HPLC-zuivering van individuele gangliosiden
- Bereid HPLC-oplosmiddel A voor: acetonitril-5 mM waterige natriumfosfaatbuffer pH 5,6 (83:17) en oplosmiddel B: acetonitril-20 mM natriumfosfaatbuffer, pH 5,6 (1:1). Ontgas beide oplosmiddelen gedurende 5 min.
- Breng een HPLC-kolom (kolom van 20 x 250 mm verpakt met amine gebonden (NH2) silicabolletjes, 5 μm diameter, poriegrootte van 100 Å) vooraf in evenwicht met 100% oplosmiddel A gedurende 20 minuten bij 5 ml/min. Stel een UV HPLC-kolom effluentdetector in op 215 nm.
- Los het gangliosidepoeder uit de omgekeerde fase eluaat op in water bij 5 mg / ml. Injecteer 0,5 ml van het gangliosidemengsel op het HPLC en laat de oplosmiddelgradiënt (tabel 1) met 5 ml/min lopen en verzamel fracties. Gangliosiden verschijnen als A215-pieken met retentietijden (grote hersengangliosiden) van 25-70 min: GM1 ≈ 28 min; GD1a ≈ 38 min; GD1b ≈ 46 min; GT1b ≈ 65 min. Breng na elke run 20 minuten opnieuw in evenwicht met oplosmiddel A. Analyseer fracties door dunnelaagchromatografie.
| Tijd (min) | %A | %B |
| 0 | 100 | 0 |
| 7 | 100 | 0 |
| 12 | 63 | 37 |
| 82 | 54 | 46 |
| 82.01 | 0 | 100 |
| 92 | 0 | 100 |
Tabel 1: Oplosmiddelgradiënt voor HPLC.
3. Dunnelaagchromatografie (TLC) analyse van gangliosiden
LET OP: Chloroform is een giftige vluchtige organische stof. Werk in een zuurkast met beschermende handschoenen en veiligheidsbril.
- Oplosmiddel- en TLC-plaatbereiding
- Bereid een lopend oplosmiddel van chloroform-methanol-waterig 0,25% KCl (60:35:8 van volume). Giet in een glazen TLC-kamer van 10 cm x 10 cm met een roestvrijstalen deksel, zodat de oplosmiddeldiepte ~ 0,5 cm is. Dek af en laat gedurende >10 minuten in een gebied zonder luchtstromen balanceren.
OPMERKING:Om de TLC-kamer te isoleren van luchtstromen, kan een acryl 5-zijdige doos worden geconstrueerd of gekocht (figuur 2). Gebruik geen met oplosmiddelen verzadigd filtreerpapier in de kamer. - Plaats een 10 cm x 10 cm of 5 cm x 10 cm silicagel gecoate high performance TLC-plaat met glazen achterkant gedurende 10 minuten in een droogoven bij 125 °C. Laat afkoelen. Gebruik een afgestompt #2 potlood om spotlijnen van 5 mm te tekenen met scheidingen van 2 mm langs een lijn 1 cm boven de onderkant van de plaat en ten minste 1 cm van beide zijden (figuur 3). Vermijd het verstoren van de silicalaag tijdens het markeren.
- Bereid een standaardmengsel van zuivere gangliosiden in methanol met 100 μM GM1, 50 μM elk van GD1a en GD1b en 33 μM GT1b.
OPMERKING: Dit mengsel bevat 100 pmol ganglioside siaalzuur per μL voor elk van de vier gangliosiden, een hoeveelheid die een sterk colorimetrisch signaal geeft door resorcinolkleuring, die afhankelijk is van siaalzuur.
- Bereid een lopend oplosmiddel van chloroform-methanol-waterig 0,25% KCl (60:35:8 van volume). Giet in een glazen TLC-kamer van 10 cm x 10 cm met een roestvrijstalen deksel, zodat de oplosmiddeldiepte ~ 0,5 cm is. Dek af en laat gedurende >10 minuten in een gebied zonder luchtstromen balanceren.
- Ganglioside resolutie
- Was een Hamilton-spuit van 10 μL met een afgeschuinde naald met methanol. Zuig 1 μL methanol in een glazen spuit om het naalddoodvolume te vullen en vervolgens 1 μL monster of standaard. Plaats het monster gelijkmatig op de 5 mm voorgemarkeerde lijnen totdat <1 μL oplosmiddel (methanol) in de spuit achterblijft. Laat de plaat drogen bij omgevingstemperatuur (22 °C) nadat alle monsters zijn gespot.
OPMERKING: Was de spuit met methanol tussen het laden van het monster. Een onverwarmde luchtblazer die op laag is ingesteld, kan worden gebruikt om het drogen te versnellen. - Plaats de gevlekte en gedroogde plaat in de vooraf gebalanceerde TLC-kamer met de onderrand ondergedompeld in het oplosmiddel en dek af en bescherm tegen luchtstromen (figuur 2). Laat het oplosmiddel door capillaire werking de plaat opschuiven totdat de voorkant van het oplosmiddel binnen 1 cm van de bovenkant van de plaat komt. Verwijder en markeer de voorkant van het oplosmiddel aan de rand van de plaat met een potlood. Laat de oplosmiddelen volledig ongestoord of onder een milde luchtstroom verdampen.
- Was een Hamilton-spuit van 10 μL met een afgeschuinde naald met methanol. Zuig 1 μL methanol in een glazen spuit om het naalddoodvolume te vullen en vervolgens 1 μL monster of standaard. Plaats het monster gelijkmatig op de 5 mm voorgemarkeerde lijnen totdat <1 μL oplosmiddel (methanol) in de spuit achterblijft. Laat de plaat drogen bij omgevingstemperatuur (22 °C) nadat alle monsters zijn gespot.
Figuur 2: Ganglioside TLC-apparatuur en opstelling. Een dubbele trogkamer is aan beide zijden gevuld tot ≈ 0,5 cm met stromend oplosmiddel. De plaat wordt tegen één kant geplaatst met het oorsprongsuiteinde ondergedompeld in de lopende buffer. De kamer is bedekt met een acrylaatdoos om luchtstromen te voorkomen. Paneel A, zijaanzicht voorafgaand aan het inbrengen van de plaat. Het oplosmiddelgehalte is enkele mm boven de bodem van de kamer zichtbaar; Paneel B, vooraanzicht tijdens de ontwikkeling. Het oplosmiddelfront is zichtbaar op ongeveer 40% van de weg omhoog van de plaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Ganglioside kleuring
LET OP: Reagensvlekken zijn giftig. Zoutzuur is corrosief en giftig. Bereid en spuit reagentia in een zuurkast met beschermende handschoenen en veiligheidsbril.
OPMERKING: De plaat kan worden afgebeeld voor kwalitatieve beeldanalyse of worden opgeslagen door de klemmen te verwijderen en de afdekplaat op zijn plaats te bevestigen met doorzichtige tape. Kwantitatieve analyse kan worden uitgevoerd door densitometrie van ganglioside-normen te meten die in aangrenzende rijstroken zijn gespot.- Bereid resorcinol spray reagens voor de detectie van gangliosiden op basis van hun siaalzuren. Los 6 g resorcinol op in 100 ml water voor een 6% resorcinolvoorraad. Los 1 g CuSO4 op in 100 ml water om een bouillon van 1% te maken. Voeg aan 64,7 ml water 5 ml van de 6% resorcinolvoorraad, 0,31 ml van de 1% CuSO4-voorraad toe en voeg vervolgens langzaam 30 ml geconcentreerd hCl toe en roer voorzichtig. Mag gedurende een maand bij 4 °C worden bewaard.
- Plaats in een chemische zuurkast de TLC-plaat met opgeloste gangliosiden, oorsprong eindigend, in een weggesneden kartonnen doos om de wanden van de kap te beschermen tegen zure spray. Plaats resorcinol-sprayreagens in een glazen TLC-sproeier, bevestig aan een bron van stikstof onder druk en spuit de plaat licht diagonaal in de verticale en horizontale richting. Spuit het TLC-absorberende oppervlak gelijkmatig, maar licht.
- Bedek de plaat onmiddellijk met een schone afdekplaat van droog glas van dezelfde afmetingen en bevestig de afdekplaat op zijn plaats met bindclips (figuur 3). Verwarm de afgedekte plaat gedurende 20 min op 125 °C. Gangliosiden zien er donkerpaars uit tegen een witte achtergrond.
OPMERKING: De plaat mag niet nat lijken wanneer het spuiten is voltooid. Afdekplaten kunnen worden gevormd door het sorptiemiddel van eerder gebruikte TLC-platen te schrapen met behulp van een scheermesje met één rand.
LET OP: Silicapoeder is giftig voor de longen. Gebruik een masker en gooi silica weg in een afgesloten container.
Figuur 3: TLC-plaat van opgelost gemengd ganglioside. TLC-plaat van opgeloste gemengde ganglioside-normen (linkerrijstrook) en gezuiverde gemengde rundergrijze stof gangliosiden (rechterrijstrook) na resorcinolkleuring en verwarming met glazen afdekplaat op zijn plaats geknipt. Standaard gangliosiden (van boven naar beneden) zijn GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b, GT1b en GQ1b. Na afkoeling kan de plaat in beeld worden gebracht en/of de afdekplaat op zijn plaats worden geplakt voor opslag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Algemene lipidekleuring voor gangliosiden en fosfolipiden.
LET OP: Zwavelzuur is giftig en corrosief. Toevoeging van geconcentreerd zuur aan ethanol is exotherm en moet langzaam gebeuren. Bereid kleuringsreagens voor in een zuurkast met beschermende handschoenen en een veiligheidsbril.- Bereid p-anisaldehydekleuring door langzaam 15 ml geconcentreerd zwavelzuur toe te voegen aan 500 ml ethanol. Roer gedurende 30 minuten om de oplossing te laten afkoelen voordat u verder gaat. Voeg 15 ml p-anisaldehyde toe en roer voorzichtig. Dit kan bij kamertemperatuur (22 °C) tot zes maanden worden bewaard.
- Dompel in een chemische zuurkast de TLC-plaat met opgeloste gangliosiden, oorsprong eindigend naar beneden, in een bekerglas met de p-anisaldehydevlek. Dompel onder naar het lopende front voor ≥ 2 s. Verwijder TLC uit de vlek en laat uitlekken. Verwarm de TLC-plaat op een hete plaat op lage temperatuur om te ontwikkelen.
OPMERKING: Lipiden verschijnen donker tegen een paarse achtergrond. Vlekkenoplossing kan worden teruggewonnen voor herhaald gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De in rubriek 1 (kleinschalig) beschreven methoden bieden gangliosiden in voldoende hoeveelheid en zuiverheid voor kwalitatieve en kwantitatieve bepaling van belangrijke hersengangliosiden. Herstel van muizenhersenen is ~ 1 μmol ganglioside per g nat gewicht in de hersenen (1 nmol / μL) wanneer bereid zoals beschreven. TLC-resolutie van 1 μL (1 nmol) met behulp van sectie 3 biedt voldoende materiaal voor resorcinoldetectie en lost alle belangrijke hersengangliosiden op zoals weergegeven voor wilde en genetisch gemodificeerde muizen in figuur 4. Hoewel gemengde gangliosiden bereid met behulp van rubriek 1 niet vrij zijn van andere belangrijke lipiden, zijn gangliosiden voldoende zuiver voor massaspectrometrische (MS) bepaling zoals weergegeven in figuur 5, hetzij als inheemse gezuiverde gangliosiden in negatieve modus of na permethylering in positieve modus9. Aangezien sectie 1 alkalische hydrolyse vermijdt om fosfolipiden te verwijderen, behoudt het alkaligevoelige natuurlijke modificaties, zoals O-geacetyleerde siaalzuren (zie GT1b-OAc, figuur 4)9.
Figuur 4: TLC van gangliosiden van muizenhersenen. TLC van muishersenen gangliosiden van wild-type (WT) en St3gal enkele en dubbele nul muizen gezuiverd zoals in Protocol 1. Dit cijfer is aangepast van Sturgill et al, 20129. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: MS van gepermethyleerde wild-type en St3gal2/3-double-null muis hersen gangliosiden gezuiverd zoals in sectie 1. Merk op dat GD1a en GD1b oplossen door TLC (figuur 4) maar dezelfde massa hebben en dus niet te onderscheiden zijn door eendimensionale MS. Dit cijfer is aangepast van Sturgill et al, 20129. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Grootschalige zuivering (sectie 2) omvat extractie, verzeping (om fosfolipiden te verwijderen) en HPLC-resolutie om gezuiverde belangrijke hersengangliosiden GM1, GD1a, GD1b en GT1b te bieden die geschikt zijn voor biologische experimenten en voor verdere chemische en enzymatische modificaties. Een voorbeeldig HPLC-profiel en de daaropvolgende TLC-analyse zijn weergegeven in figuur 6. Alkalibehandeling (verzeping) is in dit protocol noodzakelijk om verontreinigende fosfolipiden te hydrolyseren en te verwijderen (figuur 7), maar zal ook natuurlijke modificaties van gangliosiden hydrolysiden hydrolyseren, zoals O-geacetyleerde siaalzuren, die in sommige contexten belangrijk kunnen zijn10. Voor deze toepassingen zijn alternatieve effectieve methoden voor het verwijderen van fosfolipiden uit geïsoleerde gangliosiden gepubliceerd6.
Figuur 6: Representatieve HPLC van runderenhersenengangliosiden. De elutiegradiënt (%B, stippellijn) wordt gedurende de eerste 75 minuten van de cyclus over de absorptie (A215, ononderbroken lijn) gelegd. Pieken (A215) werden verzameld (nummers tussen haakjes) en onderworpen aan TLC zoals in Protocol 3. Rijstrooknummers verwijzen naar de piekgetallen op het chromatogram. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: TLC-plaat van opgelost gemengd ganglioside. TLC-plaat van opgeloste gemengde gangliosidenstandaarden (baan 1) samen met post-verzeping verdeelde gangliosiden (baan 2) en vrijgekomen vetzuren (baan 3). Lipiden, waaronder gangliosiden, worden gedetecteerd met p-anisaldehydekleuring. Standaard gangliosiden (van boven naar beneden) zijn GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b en GT1b. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methoden voor kleine en grootschalige ganglioside-extractie en -isolatie die hier worden gerapporteerd, zijn niet uniek - er zijn veel verschillende oplosmiddelextractie- en zuiveringsbenaderingen die uitstekende resultaten opleveren12. De hier gerapporteerde methoden voor kleinschalige zuivering uit de hersenen, van Fredman en Svennerholm13, bleken het herstel te optimaliseren en hebben gedurende vele jaren in ons laboratorium bewezen robuust en eenvoudig te zijn. Isolatie en zuivering geschikt voor TLC en MS kan gemakkelijk worden voltooid, van intact weefsel tot geïsoleerde gangliosiden, in een paar uur. MS kan worden uitgevoerd op inheemse gezuiverde gangliosiden in de negatieve modus of na permethylering in de positieve modus (figuur 7, zie bijvoorbeeld Sturgill et al.9). De opbrengst is zeer constant, ≈ 1 μmol ganglioside (≈ 2 μmol ganglioside-gebonden siaalzuur) per g vers hersenweefsel voor de meeste zoogdieren. De hier gerapporteerde methode voor grootschalige extractie en partitie uit de hersenen, geïntroduceerd door Tettamani et al.14, is geselecteerd om het volume ganglioside-bevattend oplosmiddel bij de eerste partitie (ether-tetrahydrofuraan-water) te minimaliseren. Dit vereenvoudigt volgende stappen die omslachtig kunnen worden met technieken die bij de eerste stappen grote hoeveelheden gepartitioneerde gangliosiden genereren. De beschreven HPLC-methode, van Gazzotti et al.15, heeft een relatief hoge capaciteit en goede resolutie van de belangrijkste hersengangliosiden.
De beschreven kleinschalige protocollen zijn zeer geschikt voor zowel cellen als weefsels en zijn schaalbaar. Omdat de laatste stappen omgekeerde fasevangst, verdamping en herverdeling in methanol zijn, kunnen ze op willekeurige schaal worden toegepast op kleine monsters, zoals gekweekte zenuwcellen. In dit geval schrapen en homogeniseren we cellen voor het gemak in 1 ml water en gaan we verder met methanol en chloroformtoevoeging om de juiste verhoudingen voor extractie en vervolgens verdeling te genereren. De laatste gedroogde gangliosiden na de omgekeerde fase kunnen in slechts enkele microliters opnieuw worden opgelost en geanalyseerd door TLC en MS.
Aandacht voor oplosmiddelverhoudingen is van cruciaal belang voor succes bij extractie- en oplosmiddelverdelingsstappen voor ganglioside-isolatie. Voor kleinschalige extractie en partitionering werden verschillende chloroform-methanol-waterverhoudingen getest en degenen die bijna kwantitatieve ganglioside-isolatie genereerden, worden hier gerapporteerd13. Afwijkingen van de beschreven verhoudingen zullen het herstel en/of de zuivering verminderen. Evenzo is aandacht voor oplosmiddelverhoudingen in TLC-ontwikkelende oplosmiddelen van cruciaal belang. De gerapporteerde chloroform-methanol-waterverhoudingen resulteren in één heldere fase. Kleine variaties kunnen troebele ontwikkelingsoplossingen opleveren die niet mogen worden gebruikt, maar kunnen worden verduidelijkt door druppelsgewijs toevoeging van methanol met werveling. Hoewel verschillende extractie- en scheidingsoplosmiddelen gebruikelijk zijn, moeten de oplosmiddelverhoudingen voor elke variatie zorgvuldig worden gevolgd12. Veranderingen in TLC-oplosmiddelen komen ook vaak voor om de scheiding van specifieke gangliosiden te optimaliseren16. Een relatief eenvoudige manier om de TLC-migratie van gangliosiden te wijzigen, is door de waterige fase van het oplosmiddelmengsel te veranderen. Het gebruik van waterig ammoniumhydroxide of calciumchloride in plaats van kaliumchloride verandert de gangliosidezoutvorm en relatieve TLC-migratie17.
Terwijl alle gewervelde cellen en weefsels gangliosiden tot expressie brengen, zijn de hersenen en zenuwcellen ongebruikelijk in de grote hoeveelheden die tot expressie worden gebracht. De hier beschreven protocollen zijn van toepassing op andere weefsels en cellen, maar aanpassingen kunnen nodig zijn vanwege de lagere abundantie en mogelijke besmetting met andere lipiden. Deze methoden zoals toegepast op menselijke neutrofielen6 en muizenadipose18 geven voorbeelden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs stellen geen tegenstrijdige belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door national institutes of health (NIH) Common Fund for Glycoscience grant U01CA241953. MJP werd ondersteund door het Chemistry-Biology Interface Program van Johns Hopkins (T32GM080189).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine brain, stripped | PelFreez | 57105-1 | |
| Ganglioside standards | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| Glass bottle with PTFE-lined cap | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| Glass centrifuge bottle | Fisher Scientific | 05-586B | |
| Glass culture tubes, 16 x 125 mm | VWR | 60825-430 | for collecting HPLC fractions |
| Glass separatory funnel (2 L) | Pyrex | 6400-2L | |
| Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 µl | Hamilton | 81265 | |
| p-Anisaldehyde, 98% | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Potter-Elvhjem Homogenizer | Fisher Scientific | 08-414-14A | Choose appropriate volume option |
| Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns | Analytics-Shop | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column | Analytics-Shop | custom packed | other sizes available |
| Resorcinol | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-300 | |
| Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml) | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) | Waters | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg | Waters | WAT036810 | |
| Spotting syringe - Hamilton 701N 10 µl | Hamilton | 80300 | |
| Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-933A | |
| Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-955-323 | For ganglioside storage |
| TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat | Fisher Scientific | M1056350001 | Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface |
| TLC reagent sprayer | Fisher Scientific | 05-723-26A | |
| TLC running chamber for 10 x 10 cm plates | Camag | 22.5155 | |
| Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender | Waring | E8520 |
References
- Schnaar, R. L. The Biology of Gangliosides. Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).
- DeMarco, M. L., Woods, R. J. Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces. Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).
- Schnaar, R. L. Gangliosides of the vertebrate nervous system. Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).
- Klenk, E. Über die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids]. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).
- Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells. Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).
- Nimrichter, L., et al. E-selectin receptors on human leukocytes. Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).
- Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).
- Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).
- Sturgill, E. R., et al. Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b. Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).
- Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy. Cells. 9 (3), (2020).
- Varki, A., et al. Symbol nomenclature for graphical representations of glycans. Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).
- Schnaar, R. L. Isolation of glycosphingolipids. Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).
- Svennerholm, L., Fredman, P. A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).
- Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).
- Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures. Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).
- Schnaar, R. L., Needham, L. K. Thin-layer chromatography of glycosphingolipids. Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).
- Ledeen, R. W., Yu, R. K. Gangliosides: structure, isolation, and analysis. Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).
- Lopez, P. H., et al. Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance. Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).
