Summary
Les gangliosides sont des glycosphingolipides porteurs d’acide sialique qui sont particulièrement abondants dans le cerveau. Leur nature amphipathique nécessite des techniques d’extraction et de purification organiques/aqueuses pour assurer une récupération optimale et des analyses précises. Cet article fournit des aperçus de l’extraction, de la purification et de l’analyse par chromatographie sur couche mince à l’échelle analytique et préparative.
Abstract
Les gangliosides sont des glycosphingolipides qui contiennent un ou plusieurs résidus d’acide sialique. Ils se trouvent sur toutes les cellules et tissus des vertébrés, mais sont particulièrement abondants dans le cerveau. Exprimés principalement sur la feuillet externe des membranes plasmiques des cellules, ils modulent les activités des protéines de surface cellulaire par association latérale, agissent comme récepteurs dans les interactions cellule-cellule et sont des cibles pour les agents pathogènes et les toxines. La dérégulation génétique de la biosynthèse des gangliosides chez l’homme entraîne de graves troubles congénitaux du système nerveux. En raison de leur nature amphipathique, l’extraction, la purification et l’analyse des gangliosides nécessitent des techniques qui ont été optimisées par de nombreux chercheurs au cours des 80 années qui ont suivi leur découverte. Nous décrivons ici des méthodes au niveau du banc pour l’extraction, la purification et les analyses qualitatives et quantitatives préliminaires des principaux gangliosides de tissus et de cellules qui peuvent être complétées en quelques heures. Nous décrivons également des méthodes d’isolement et de purification à plus grande échelle des principales espèces de gangliosides du cerveau. Ensemble, ces méthodes fournissent un accès à l’échelle analytique et préparative à cette classe de molécules bioactives.
Introduction
Les gangliosides sont définis comme des glycosphingolipides portant un ou plusieurs résidus d’acide sialique1. Ils sont exprimés principalement à la surface de la cellule avec leur fraction lipidique céramide hydrophobe intégrée dans la feuillet externe de la membrane plasmique et leurs glycanes hydrophiles s’étendant dans l’espace extracellulaire2. Bien que largement distribués dans les cellules et les tissus des vertébrés, ils sont particulièrement abondants dans le cerveau des vertébrés3, où ils ont été découverts et nommés pour la première fois4.
Les structures des glycanes gangliosides varient et constituent la base de leur nomenclature (Figure 1). Les glycanes gangliosides sont constitués d’un noyau de sucre neutre portant différents nombres et distributions d’acides sialiques. Le plus petit ganglioside, GM4, ne contient que deux sucres (acide sialique lié au galactose)5. Les gangliosides naturels plus gros peuvent contenir plus d’une douzaine de sucres totaux6 ou jusqu’à sept acides sialiques sur un seul noyau neutre7. Leurs fractions lipidiques céramides varient également, ayant différentes longueurs de sphingosine et une variété d’amides d’acides gras. Dans le cerveau des vertébrés, quatre espèces de gangliosides, GM1, GD1a, GD1b et GT1b prédominent. L’expression du ganglioside est régulée par le développement, spécifique au tissu et spécifique au type de cellule.
Figure 1 : Principaux gangliosides cérébraux et leurs précurseurs biosynthétiques. Les structures sont présentées à l’aide de la nomenclature des symboles pour les glycanes11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les gangliosides fonctionnent au niveau moléculaire en engageant et en modulant les protéines dans leurs propres membranes (régulation cis) ou en engageant les protéines de liaison aux glycanes dans le milieu extracellulaire, y compris les toxines bactériennes et les lectines sur d’autres cellules (trans reconnaissance)3. La liaison spécifique des gangliosides aux protéines régulatrices et/ou l’auto-association avec d’autres molécules dans des radeaux lipidiques entraîne des changements dans le comportement cellulaire qui ont un impact sur la structure et la fonction du système nerveux, la progression du cancer, le métabolisme, l’inflammation, les protéinopathies neuronales et les maladies infectieuses8. En raison de leurs divers rôles cellulaires, les méthodes d’isolement et d’analyse peuvent fournir des informations améliorées sur la régulation des processus physiologiques et pathologiques. Ici, des méthodes validées pour l’extraction et l’analyse rapides à petite échelle, et l’isolement à l’échelle préparative des gangliosides du cerveau sont fournis. Les possibilités et les défis liés à l’application à d’autres tissus sont discutés.
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Protocol
Le prélèvement de tissus a été effectué dans les conditions autorisées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de Johns Hopkins.
1. Extraction de gangliosides à petite échelle et purification partielle
ATTENTION : Utilisez une ventilation appropriée lorsque vous travaillez avec des solvants volatils et toxiques. Évitez le plastique partout; les solvants extraient les composants chimiques de nombreux plastiques qui interfèrent avec les analyses ultérieures. Le polytétrafluoroéthylène (PTFE) est une exception; Des fermetures revêtues de PTFE doivent être utilisées pour boucher les flacons de stockage en verre.
- Extraction
- Peser un seul cerveau de souris frais ou décongelé (ou demi-cerveau sagittal, ~ 0,2-0,5 g) et placer dans un homogénéisateur Potter-Elvehjem pré-refroidi dans un seau de glace.
REMARQUE: Les cerveaux précédemment congelés peuvent être utilisés après décongélation à 0-4 ° C. - Ajouter 4,1 mL par g de poids d’eau humide et homogénéiser à 10 coups.
REMARQUE: Des rapports de solvants précis sont la clé d’une extraction et d’une partition optimales, l’objectif est chloroforme-méthanol-aqueux (4: 8: 3) en supposant que le tissu cérébral est aqueux à 80%. - Ajouter 13 mL par g de poids humide tissulaire de méthanol, passer à la température ambiante (22 °C) et mélanger.
REMARQUE: La solution apparaîtra trouble. L’ajout de méthanol à cette étape, sans chloroforme, optimise la précipitation des protéines. Toutes les étapes suivantes sont à température ambiante (22 °C). - Transférer dans un tube à vis en verre à paroi épaisse avec un bouchon à vis doublé de PTFE à température ambiante (22 °C) et bien mélanger. Ajouter 6,5 mL par g de poids humide de chloroforme, de capuchon et bien mélanger. Centrifuger à 450 x g pendant 15 min. Transférer le surnageant transparent dans un tube frais bouché à vis et mesurer le volume, « volume d’extrait récupéré ».
- Peser un seul cerveau de souris frais ou décongelé (ou demi-cerveau sagittal, ~ 0,2-0,5 g) et placer dans un homogénéisateur Potter-Elvehjem pré-refroidi dans un seau de glace.
- Partition
- Ajouter 0,173 fois le « volume d’extrait récupéré » d’eau au surnageant clair, au bouchon, au vortex vigoureusement et à la centrifugeuse comme décrit à l’étape 1.1.4.
NOTE: L’objectif est d’avoir du chloroforme-méthanol-aqueux dans le rapport 4: 8: 5,6. Le mélange sera trouble et se résoudra en deux phases: une phase supérieure riche en aqueux et une phase inférieure riche en chloroforme à un rapport ~ 4: 1. Attendez 60 min ou centrifugez à 450 x g pendant 15 min pour une séparation de phase complète. - Transférez la phase supérieure, qui contient les gangliosides, dans un tube en verre frais avec un bouchon à vis doublé de PTFE.
- Ajouter 0,173 fois le « volume d’extrait récupéré » d’eau au surnageant clair, au bouchon, au vortex vigoureusement et à la centrifugeuse comme décrit à l’étape 1.1.4.
- Chromatographie sur cartouche en phase inverse
- À l’aide d’une seringue en verre de 5 mL, laver une cartouche d’extraction en phase solide tC18 (400 mg) avec 3 mL de méthanol, puis 3 mL de chloroforme-méthanol-eau (2:43:55). Chargez la phase supérieure de l’étape 1.2.2 sur la cartouche tC18 à l’aide de la même seringue en verre, collectez le flux et rechargez-le sur la colonne pour optimiser l’adsorption.
- À l’aide de la seringue en verre, laver la cartouche avec 3 mL de chloroforme-méthanol-eau (2:43:55) puis 3 mL de méthanol-eau (1:1).
- Éluez les gangliosides avec 3 mL de méthanol dans un tube frais à bouchon vissé. Évaporer à sec sous un doux jet d’azote à ≤ 45 °C. Dissoudre dans le méthanol à 1 mL par g de poids humide des tissus d’origine.
2. Extraction et purification des gangliosides à grande échelle
ATTENTION : Lorsque vous travaillez avec des solvants volatils, utilisez des mélangeurs antidéflagrants. N’utilisez pas de plastique à l’exception du PTFE. Le tétrahydrofurane, le chloroforme et l’éther éthylique sont des composés organiques volatils toxiques. Travaillez dans une hotte avec des gants de protection et des lunettes de sécurité.
- Extraction
- Décongeler le cerveau de bovin congelé à 4 °C pendant plusieurs heures. Disséquez la matière grise des méninges et de la substance blanche.
REMARQUE: La procédure suivante est décrite pour 100 ± 20 g de matière grise cérébrale isolée et est évolutive. - Placer 100 g de matière grise cérébrale dans un mélangeur et ajouter 1 mL par g de poids humide cérébral de 10 mM réfrigéré tampon de phosphate de potassium pH 6,8. Homogénéiser à basse température pendant 20 s. Ajouter 8 mL de tétrahydrofurane par g de poids humide du cerveau et homogénéiser à faible intensité pendant 10 s. Décanter dans des bouteilles de centrifugeuse en verre et centrifuger à 5 000 x g pendant 15 min à température ambiante (22 °C).
- Collectez le surnageant, mesurez son volume et transférez-le dans un entonnoir de séparation de verre. Ajouter 0,3 mL d’éther éthylique par mL du surnageant. Agiter vigoureusement, puis laisser reposer sans être dérangé pendant 30 min au cours desquelles deux phases, une phase éther supérieure et une phase aqueuse inférieure, se séparent. Recueillir la phase inférieure, qui contient les gangliosides, dans une bouteille en verre avec un bouchon doublé de PTFE.
- À la phase supérieure (éther) restant dans l’entonnoir de séparation, ajouter 0,1 mL d’eau par mL de surnageant d’origine (étape 2.1.3). Agiter vigoureusement, laisser les phases se séparer, recueillir la phase inférieure (aqueuse) et combiner avec la phase inférieure précédente. Évaporer les phases inférieures combinées en une poudre sèche et peser.
- Décongeler le cerveau de bovin congelé à 4 °C pendant plusieurs heures. Disséquez la matière grise des méninges et de la substance blanche.
- Saponification
- Ajouter 10 mL de NaOH aqueux de 100 mM par g de poudre dans un tube scellé. Mélanger et incuber à 37 °C pendant 3 h. Laisser refroidir et ajuster à pH 4,5 par addition goutte à goutte de 100 mM de HCl aqueux. Mesurer le volume et transférer dans un entonnoir séparateur de verre.
REMARQUE: Les acides sialiques sont labiles acides; éviter l’acidification en dessous de pH 4,5. - Sur la base du volume aqueux, ajouter 2,67 volumes de méthanol, mélanger doucement, puis ajouter 1,33 volume de chloroforme pour créer une solution monophasée de chloroforme-méthanol-aqueux (4:8:3). Bien mélanger.
- Sur la base du volume aqueux d’origine, ajouter 2,6 volumes d’eau pour amener le mélange au chloroforme-méthanol-aqueux dans un rapport de 4:8:5,6. Agiter vigoureusement, puis laisser reposer sans être dérangé pour séparer deux phases, une phase supérieure polaire contenant les gangliosides et une phase inférieure non polaire. Recueillir la phase supérieure dans une bouteille en verre avec un bouchon doublé de PTFE.
REMARQUE: Les lipides non sialylés n’apparaîtront pas sur les plaques de chromatographie sur couche mince (TLC) colorées à l’aide de résorcinol, mais apparaîtront lors de l’utilisation d’une coloration p-anisaldéhyde. Le but de cette saponification est d’éliminer les composés O-acétylés tels que les phospholipides.
- Ajouter 10 mL de NaOH aqueux de 100 mM par g de poudre dans un tube scellé. Mélanger et incuber à 37 °C pendant 3 h. Laisser refroidir et ajuster à pH 4,5 par addition goutte à goutte de 100 mM de HCl aqueux. Mesurer le volume et transférer dans un entonnoir séparateur de verre.
- Chromatographie en phase inverse
- Prélavez une cartouche d’extraction en phase solide tC18 à grande échelle (10 g) en faisant passer 50 mL de chacun des trois solvants suivants à travers la colonne sous vide ou sous pression (<1 min par lavage) : méthanol, méthanol-eau (1:1), puis chloroforme-méthanol-eau (2:43:55). Chargez la phase supérieure de l’étape 2.2.3 sur la colonne par vide ou pression, collectez le flux, rechargez et collectez le flux.
- Laver la colonne avec 30 mL de chloroforme-méthanol-eau (2:43:55), puis 30 mL de méthanol-eau (1:1), puis éluer les gangliosides avec 50 mL de méthanol, et de nouveau avec 10 mL de méthanol, en recueillant chaque lavage et chaque élution séparément. En utilisant TLC (ci-dessous), confirmer que le ganglioside est absent de l’écoulement et se lave et élue lors de la première élution (50 mL de méthanol). Évaporer les gangliosides élués en une poudre sèche et peser.
REMARQUE: Le but de la chromatographie tC18 est de séparer les gangliosides de moins en plus de contaminants polaires. Le rendement en ganglioside cérébral mixte après saponification est d’environ 120 mg par g d’extrait de cerveau sec (étape 2.1.4). L’apparition de gangliosides par TLC dans l’écoulement ou les lavages indique que la colonne d’extraction en phase solide était saturée. Après l’élution du méthanol, la colonne peut être éluée avec du chloroforme-méthanol (1:1) pour capturer moins de lipides polaires.
- Purification HPLC de gangliosides individuels
- Préparer le solvant CLHP A : tampon aqueux de phosphate de sodium acétonitrile-5 mM pH 5,6 (83:17) et solvant B : tampon phosphate de sodium acétonitrile-20 mM, pH 5,6 (1:1). Dégazez les deux solvants pendant 5 min.
- Pré-équilibrant une colonne HPLC (colonne de 20 x 250 mm remplie de sphères de silice liées aux amines (NH2), diamètre 5 μm, taille des pores 100 Å) avec 100% de solvant A pendant 20 min à 5 mL/min. Réglez un détecteur d’effluents à colonne HPLC UV à 215 nm.
- Dissoudre la poudre de ganglioside de la phase inverse éluer dans l’eau à 5 mg/mL. Injecter 0,5 mL du mélange de ganglioside sur la CLHP et exécuter le gradient de solvant (tableau 1) à 5 mL/min, en recueillant les fractions. Les gangliosides apparaîtront comme des pics A215 avec des temps de rétention (gangliosides cérébraux majeurs) de 25-70 min: GM1 ≈ 28 min; GD1a ≈ 38 min; GD1b ≈ 46 min; GT1b ≈ 65 min. Rééquilibrer 20 min avec le solvant A après chaque exécution. Analyser les fractions par chromatographie sur couche mince.
| Temps (min) | %A | %B |
| 0 | 100 | 0 |
| 7 | 100 | 0 |
| 12 | 63 | 37 |
| 82 | 54 | 46 |
| 82.01 | 0 | 100 |
| 92 | 0 | 100 |
Tableau 1 : Gradient de solvant pour la CLHP.
3. Analyse par chromatographie sur couche mince (TLC) des gangliosides
ATTENTION : Le chloroforme est un composé organique volatil toxique. Travaillez dans une hotte avec des gants de protection et des lunettes de sécurité.
- Préparation de solvant et de plaque TLC en cours d’exécution
- Préparer un solvant courant de chloroforme-méthanol-aqueux à 0,25 % KCl (60:35:8 en volume). Versez dans une chambre TLC en verre de 10 cm x 10 cm avec un couvercle en acier inoxydable de sorte que la profondeur du solvant soit d’environ 0,5 cm. Couvrir et laisser s’équilibrer dans une zone exempte de courants d’air pendant >10 min.
REMARQUE:Pour isoler la chambre TLC des courants d’air, une boîte acrylique à 5 côtés peut être construite ou achetée (Figure 2). N’utilisez pas de papier filtre saturé de solvant à l’intérieur de la chambre. - Placez une plaque TLC haute performance enduite de gel de silice de 10 cm x 10 cm ou 5 cm x 10 cm dans un four de séchage à 125 °C pendant 10 min. Laisser refroidir. Utilisez un crayon #2 émoussé pour dessiner des lignes de repérage de 5 mm avec des séparations de 2 mm le long d’une ligne située à 1 cm au-dessus du fond de la plaque et à au moins 1 cm de chaque côté (Figure 3). Évitez de déranger la couche de silice lors du marquage.
- Préparer un mélange standard de gangliosides purs dans du méthanol contenant 100 μM GM1, 50 μM chacun de GD1a et GD1b et 33 μM de GT1b.
REMARQUE: Ce mélange contient 100 pmol d’acide sialique ganglioside par μL pour chacun des quatre gangliosides, une quantité qui fournit un signal colorimétrique fort par coloration au résorcinol, qui dépend de l’acide sialique.
- Préparer un solvant courant de chloroforme-méthanol-aqueux à 0,25 % KCl (60:35:8 en volume). Versez dans une chambre TLC en verre de 10 cm x 10 cm avec un couvercle en acier inoxydable de sorte que la profondeur du solvant soit d’environ 0,5 cm. Couvrir et laisser s’équilibrer dans une zone exempte de courants d’air pendant >10 min.
- Résolution ganglioside
- Lavez une seringue Hamilton de 10 μL avec une aiguille biseautée avec du méthanol. Aspirer 1 μL de méthanol dans une seringue en verre pour remplir le volume mort de l’aiguille, puis 1 μL d’échantillon ou d’étalon. Repérez l’échantillon uniformément sur les lignes prémarquées de 5 mm jusqu’à ce qu’il reste <1 μL de solvant (méthanol) dans la seringue. Laisser sécher la plaque à température ambiante (22 °C) après avoir repéré tous les échantillons.
REMARQUE: Lavez la seringue avec du méthanol entre le chargement de l’échantillon. Un ventilateur à air non chauffé réglé à basse température peut être utilisé pour accélérer le séchage. - Placez la plaque tachetée et séchée dans la chambre TLC prééquilibrée avec le bord inférieur immergé dans le solvant et le couvercle en cours d’exécution et protégez-le des courants d’air (Figure 2). Laissez le solvant en marche avancer vers le haut de la plaque par action capillaire jusqu’à ce que le front du solvant atteigne à moins de 1 cm du sommet de la plaque. Retirez et marquez le front du solvant sur le bord de la plaque avec un crayon. Laissez les solvants s’évaporer complètement sans être dérangés ou sous un flux d’air doux.
- Lavez une seringue Hamilton de 10 μL avec une aiguille biseautée avec du méthanol. Aspirer 1 μL de méthanol dans une seringue en verre pour remplir le volume mort de l’aiguille, puis 1 μL d’échantillon ou d’étalon. Repérez l’échantillon uniformément sur les lignes prémarquées de 5 mm jusqu’à ce qu’il reste <1 μL de solvant (méthanol) dans la seringue. Laisser sécher la plaque à température ambiante (22 °C) après avoir repéré tous les échantillons.
Figure 2 : Équipement et configuration du TLC ganglioside. Une chambre à double auge est remplie à ≈ 0,5 cm des deux côtés avec du solvant courant. La plaque est placée contre un côté avec l’extrémité d’origine immergée dans le tampon de course. La chambre est recouverte d’une boîte en acrylique pour éviter les courants d’air. Panneau A, vue latérale avant l’insertion de la plaque. Le niveau de solvant est visible à quelques mm au-dessus du fond de la chambre; Panneau B, vue de face pendant le développement. Le front de solvant est visible à environ 40% du chemin vers le haut de la plaque. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Coloration au ganglioside
ATTENTION : Les taches de réactif sont toxiques. L’acide chlorhydrique est corrosif et toxique. Préparez et vaporisez des réactifs dans une hotte avec des gants de protection et des lunettes de sécurité.
REMARQUE: La plaque peut être imagée pour une analyse qualitative de l’image ou stockée en retirant les pinces et en fixant la plaque de couverture en place avec du ruban adhésif transparent. L’analyse quantitative peut être effectuée en mesurant la densitométrie des étalons gangliosides repérés dans les voies adjacentes.- Préparer le réactif de pulvérisation de résorcinol pour la détection des gangliosides à base de leurs acides sialiques. Dissoudre 6 g de résorcinol dans 100 mL d’eau pour obtenir un stock de résorcinol à 6 %. Dissoudre 1 g de CuSO4 dans 100 mL d’eau pour obtenir un bouillon de 1 %. À 64,7 mL d’eau, ajouter 5 mL du stock de résorcinol à 6 %, 0,31 mL du stock de CuSO4 à 1 %, puis ajouter lentement 30 mL de HCl concentré et remuer doucement. Peut être conservé à 4 °C pendant un mois.
- Dans une hotte à fumée chimique, placez la plaque TLC avec des gangliosides résolus, origine finie, dans une boîte en carton découpée pour protéger les parois de la hotte des projections acides. Placez le réactif de pulvérisation de résorcinol dans un pulvérisateur TLC en verre, fixez-le à une source d’azote sous pression et vaporisez légèrement la plaque en diagonale dans les directions verticale et horizontale. Vaporisez la surface du sorbant TLC uniformément, mais légèrement.
- Recouvrez immédiatement la plaque avec une plaque de couverture en verre sec propre de mêmes dimensions et fixez la plaque de couverture en place à l’aide de clips de liant (Figure 3). Chauffer la plaque couverte à 125 °C pendant 20 min. Les gangliosides apparaîtront violet foncé sur un fond blanc.
REMARQUE: La plaque ne doit pas sembler humide lorsque la pulvérisation est terminée. Les plaques de couverture peuvent être façonnées en grattant le sorbant des plaques TLC précédemment utilisées à l’aide d’une lame de rasoir à un seul bord.
ATTENTION : La poudre de silice est toxique pour les poumons. Utilisez un masque et jetez la silice dans un récipient scellé.
Figure 3 : Plaque TLC de ganglioside mixte résolu. Plaque TLC de normes mixtes de ganglioside résolues (voie de gauche) et de gangliosides de matière grise bovine mélangée purifiée (voie de droite) après coloration et chauffage du résorcinol avec plaque de couverture en verre clipsée en place. Les gangliosides standard (de haut en bas) sont GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b, GT1b et GQ1b. Après refroidissement, la plaque peut être imagée et / ou la plaque de couverture scotchée en place pour le stockage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Coloration lipidique générale pour les gangliosides et les phospholipides.
ATTENTION : L’acide sulfurique est toxique et corrosif. L’ajout d’acide concentré à l’éthanol est exothermique et doit être fait lentement. Préparez le réactif de coloration dans une hotte avec des gants de protection et des lunettes de sécurité.- Préparer la coloration p-anisaldéhyde en ajoutant lentement 15 mL d’acide sulfurique concentré à 500 mL d’éthanol. Remuer pendant 30 min pour laisser refroidir la solution avant de continuer. Ajouter 15 mL de p-anisaldéhyde et remuer doucement. Celui-ci peut être conservé à température ambiante (22 °C) jusqu’à six mois.
- Dans une hotte à fumée chimique, trempez la plaque TLC avec des gangliosides résolus, extrémité d’origine vers le bas, dans un bécher contenant la tache de p-anisaldéhyde. Immergez-vous vers le front de course pendant ≥ 2 s. Enlever le TLC de la tache et laisser s’écouler. Chauffer la plaque TLC sur une plaque chauffante à basse température pour la développer.
REMARQUE: Les lipides apparaîtront sombres sur un fond violet. La solution de coloration peut être récupérée pour une utilisation répétée.
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Representative Results
Les méthodes décrites à la rubrique 1 (petite échelle) fournissent des gangliosides en quantité et en pureté suffisantes pour la détermination qualitative et quantitative des principaux gangliosides cérébraux. La récupération du cerveau de la souris est d’environ 1 μmol de ganglioside par g de poids humide du cerveau (1 nmol / μL) lorsqu’il est préparé comme décrit. La résolution TLC de 1 μL (1 nmol) à l’aide de la section 3 fournit suffisamment de matériel pour la détection du résorcinol et résout tous les principaux gangliosides cérébraux, comme le montrent les souris de type sauvage et les souris génétiquement modifiées à la figure 4. Bien que les gangliosides mélangés préparés à l’aide de la section 1 ne soient pas exempts d’autres lipides majeurs, les gangliosides sont d’une pureté suffisante pour la détermination par spectrométrie de masse (SEP) comme le montre la figure 5, soit sous forme de gangliosides purifiés natifs en mode négatif, soit après perméthylation en mode positif9. Étant donné que la rubrique 1 évite l’hydrolyse alcaline pour éliminer les phospholipides, elle conserve les modifications naturelles sensibles aux alcalis, telles que les acides sialiques O-acétylés (voir GT1b-OAc, Figure 4)9.
Figure 4 : TLC des gangliosides cérébraux de souris. TLC de gangliosides cérébraux de souris de souris de souris de type sauvage (WT) et St3gal simples et doubles-nuls purifiés comme dans le protocole 1. Cette figure a été modifiée par rapport à Sturgill et al, 20129. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : SEP de gangliosides de cerveau de souris perméthylés de type sauvage et St3gal2/3-double-nul purifiés comme dans la section 1. Notez que GD1a et GD1b sont résolus par TLC (Figure 4) mais ont la même masse et ne sont donc pas distinguables par MS unidimensionnelle. Cette figure a été modifiée par rapport à Sturgill et al, 20129. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La purification à grande échelle (section 2) comprend l’extraction, la saponification (pour éliminer les phospholipides) et la résolution HPLC pour fournir des gangliosides cérébraux majeurs purifiés GM1, GD1a, GD1b et GT1b adaptés aux expériences biologiques et à d’autres modifications chimiques et enzymatiques. Un profil HPLC exemplaire et une analyse TLC ultérieure sont présentés à la figure 6. Le traitement alcalin (saponification) est nécessaire dans ce protocole pour hydrolyser et éliminer les phospholipides contaminants (Figure 7) mais va également hydrolyser les modifications naturelles des gangliosides, tels que les acides sialiques O-acétylés, qui peuvent être importants dans certains contextes10. Pour ces applications, d’autres méthodes efficaces pour éliminer les phospholipides des gangliosides isolés ont été publiées6.
Figure 6 : CLHP représentative des gangliosides cérébraux bovins. Le gradient d’élution (%B, ligne pointillée) est superposé sur l’absorbance (A215, ligne continue) pendant les 75 premières minutes du cycle. Les pics (A215) ont été collectés (nombres entre parenthèses) et soumis à la TLC comme dans le Protocole 3. Les numéros de voie font référence aux nombres de crête sur le chromatogramme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Plaque TLC de ganglioside mixte résolu. Plaque TLC des normes de gangliosides mixtes résolues (voie 1) ainsi que des gangliosides cloisonnés post-saponification (voie 2) et des acides gras libérés (voie 3). Les lipides, y compris les gangliosides, sont détectés avec une coloration p-anisaldéhyde. Les gangliosides standard (de haut en bas) sont GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b et GT1b. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les méthodes d’extraction et d’isolement des gangliosides à petite et à grande échelle décrites ici ne sont pas uniques - il existe de nombreuses approches différentes d’extraction et de purification par solvant qui donnent d’excellents résultats12. Les méthodes rapportées ici pour la purification à petite échelle du cerveau, de Fredman et Svennerholm13, ont été montrées pour optimiser la récupération et se sont avérées robustes et simples pendant de nombreuses années dans notre laboratoire. L’isolement et la purification adaptés à la TLC et à la SEP peuvent être facilement achevés, des tissus intacts aux gangliosides isolés, en quelques heures. La SEP peut être réalisée sur des gangliosides purifiés natifs en mode négatif ou après perméthylation en mode positif (Figure 7, par exemple, voir Sturgill et al.9). Le rendement est très constant, ≈ 1 μmol de ganglioside (≈ 2 μmol d’acide sialique lié au ganglioside) par g de tissu cérébral frais pour la plupart des mammifères. La méthode d’extraction et de partition à grande échelle du cerveau rapportée ici, introduite par Tettamani et al.14, est choisie pour minimiser le volume de solvant contenant du ganglioside à la première partition (éther-tétrahydrofurane-eau). Cela simplifie les étapes suivantes qui peuvent devenir fastidieuses avec des techniques qui génèrent de grands volumes de gangliosides partitionnés dès les premières étapes. La méthode HPLC décrite, à partir de Gazzotti et al.15, a une capacité relativement élevée et une bonne résolution des principaux gangliosides cérébraux.
Les protocoles à petite échelle décrits sont bien adaptés aux cellules et aux tissus et sont évolutifs. Étant donné que les dernières étapes sont la capture en phase inverse, l’évaporation et la redissolution dans le méthanol, elles peuvent être appliquées à une échelle arbitraire sur de petits échantillons, tels que des cellules nerveuses cultivées. Dans ce cas, nous raclons et homogénéisons les cellules en 1 mL d’eau pour plus de commodité et procédons à l’ajout de méthanol et de chloroforme pour générer les rapports appropriés pour l’extraction puis la partition. Les gangliosides séchés finaux après phase inverse peuvent être redissolus en seulement quelques microlitres et analysés par TLC et MS.
L’attention portée aux ratios de solvants est essentielle au succès des étapes d’extraction et de répartition des solvants pour l’isolation des gangliosides. Pour l’extraction et le cloisonnement à petite échelle, différents rapports chloroforme-méthanol-eau ont été testés et ceux qui ont généré une isolation quasi quantitative des gangliosides sont rapportés ici13. Les variations par rapport aux ratios décrits diminueront la récupération et/ou la purification. De même, il est essentiel de prêter attention aux ratios de solvants dans le développement de solvants TLC. Les rapports chloroforme-méthanol-eau rapportés donnent lieu à une seule phase claire. De petites variations peuvent donner des solutions de développement troubles qui ne doivent pas être utilisées, mais peuvent être clarifiées par l’ajout goutte à goutte de méthanol avec tourbillonnement. Bien que différents solvants d’extraction et de séparation soient courants, les rapports de solvants doivent être soigneusement suivis pour chaque variation12. Les altérations des solvants TLC sont également courantes pour optimiser la séparation de gangliosides spécifiques16. Un moyen relativement simple de modifier la migration TLC des gangliosides est de changer la phase aqueuse du mélange de solvants. L’utilisation d’hydroxyde d’ammonium aqueux ou de chlorure de calcium au lieu de chlorure de potassium modifie la forme du sel de ganglioside et la migration relative du TLC17.
Alors que toutes les cellules et tous les tissus vertébrés expriment des gangliosides, les cellules cérébrales et nerveuses sont inhabituelles dans les quantités élevées exprimées. Les protocoles décrits ici sont applicables à d’autres tissus et cellules, mais des modifications peuvent être nécessaires en raison de la plus faible abondance et de la contamination potentielle par d’autres lipides. Ces méthodes appliquées aux neutrophiles humains6 et aux souris adipeuses18 en fournissent des exemples.
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Disclosures
Les auteurs ne revendiquent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention U01CA241953 du Fonds commun des National Institutes of Health (NIH) pour la glycoscience. MJP a été soutenu par le programme d’interface chimie-biologie de Johns Hopkins (T32GM080189).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine brain, stripped | PelFreez | 57105-1 | |
| Ganglioside standards | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| Glass bottle with PTFE-lined cap | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| Glass centrifuge bottle | Fisher Scientific | 05-586B | |
| Glass culture tubes, 16 x 125 mm | VWR | 60825-430 | for collecting HPLC fractions |
| Glass separatory funnel (2 L) | Pyrex | 6400-2L | |
| Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 µl | Hamilton | 81265 | |
| p-Anisaldehyde, 98% | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Potter-Elvhjem Homogenizer | Fisher Scientific | 08-414-14A | Choose appropriate volume option |
| Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns | Analytics-Shop | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column | Analytics-Shop | custom packed | other sizes available |
| Resorcinol | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-300 | |
| Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml) | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) | Waters | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg | Waters | WAT036810 | |
| Spotting syringe - Hamilton 701N 10 µl | Hamilton | 80300 | |
| Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-933A | |
| Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-955-323 | For ganglioside storage |
| TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat | Fisher Scientific | M1056350001 | Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface |
| TLC reagent sprayer | Fisher Scientific | 05-723-26A | |
| TLC running chamber for 10 x 10 cm plates | Camag | 22.5155 | |
| Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender | Waring | E8520 |
References
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