Gangliosidextraktion, -reinigung und -profilierung

Summary

Ganglioside sind Sialinsäure-tragende Glykosphingolipide, die im Gehirn besonders häufig vorkommen. Ihre amphipathische Natur erfordert organische/wässrige Extraktions- und Reinigungstechniken, um eine optimale Erholung und genaue Analysen zu gewährleisten. Dieser Artikel bietet einen Überblick über die analytische und präparative Gangliosidextraktion, -reinigung und -chromatographie-Analyse.

Abstract

Ganglioside sind Glykosphingolipide, die einen oder mehrere Sialinsäurereste enthalten. Sie kommen auf allen Wirbeltierzellen und -geweben vor, sind aber im Gehirn besonders häufig. Sie werden hauptsächlich auf dem äußeren Blatt der Plasmamembranen von Zellen exprimiert, modulieren die Aktivitäten von Zelloberflächenproteinen durch laterale Assoziation, fungieren als Rezeptoren in Zell-Zell-Interaktionen und sind Ziele für Krankheitserreger und Toxine. Genetische Dysregulation der Gangliosid-Biosynthese beim Menschen führt zu schweren angeborenen Erkrankungen des Nervensystems. Aufgrund ihrer amphipathischen Natur erfordern die Extraktion, Reinigung und Analyse von Gangliosiden Techniken, die von vielen Forschern in den 80 Jahren seit ihrer Entdeckung optimiert wurden. Hier beschreiben wir Methoden auf Laborebene für die Extraktion, Reinigung und vorläufige qualitative und quantitative Analysen der wichtigsten Ganglioside aus Geweben und Zellen, die in wenigen Stunden abgeschlossen werden können. Wir beschreiben auch Methoden zur großflächigen Isolierung und Reinigung der wichtigsten Gangliosidspezies aus dem Gehirn. Zusammen bieten diese Methoden analytischen und präparativen Zugang zu dieser Klasse bioaktiver Moleküle.

Introduction

Ganglioside sind definiert als Glykosphingolipide, die einen oder mehrere Sialinsäurereste ^enthalten1. Sie werden hauptsächlich an der Zelloberfläche exprimiert, wobei ihr hydrophober Ceramidlipidanteil in das äußere Blatt der Plasmamembran eingebettet ist und ihre hydrophilen Glykane sich in den extrazellulären Raum ^erstrecken2. Obwohl sie in Wirbeltierzellen und -geweben weit verbreitet sind, sind sie besonders häufig im Wirbeltiergehirn3^, wo sie zuerst entdeckt und benannt ^wurden4.

Die Strukturen der Gangliosidglykane variieren und bilden die Grundlage für ihre Nomenklatur (Abbildung 1). Gangliosidglykane bestehen aus einem neutralen Zuckerkern, der unterschiedliche Anzahlen und Verteilungen von Sialinsäuren trägt. Das kleinste Gangliosid, GM4, hat nur zwei Zucker (Sialinsäure, die an Galaktose gebunden ist⁾⁵. Größere natürlich vorkommende Ganglioside können weit über ein Dutzend Gesamtzucker ^enthalten6 oder bis zu sieben Sialinsäuren auf einem einzigen neutralen ^Kern7. Ihre Ceramidlipidanteile variieren ebenfalls und haben unterschiedliche Sphingosinlängen und eine Vielzahl von Fettsäureamiden. Im Wirbeltiergehirn dominieren vier Gangliosidspezies, GM1, GD1a, GD1b und GT1b. Die Gangliosidexpression ist entwicklungsreguliert, gewebespezifisch und zelltypspezifisch.

Abbildung 1: Wichtige Hirnganglioside und ihre biosynthetischen Vorläufer. Strukturen werden mit der Symbolnomenklatur für ^{Glykane angezeigt11}. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ganglioside wirken auf molekularer Ebene, indem sie Proteine in ihren eigenen Membranen einbinden und modulieren (cis-Regulation) oder indem sie Glykan-bindende Proteine im extrazellulären Milieu, einschließlich bakterieller Toxine und Lektine auf anderen Zellen (Trans-Erkennung^{), einsetzen3.} Die spezifische Bindung von Gangliosiden an regulatorische Proteine und/oder die Selbstassoziation mit anderen Molekülen zu Lipidflößen führt zu Veränderungen des Zellverhaltens, die sich auf die Struktur und Funktion des Nervensystems, das Fortschreiten von Krebs, den Stoffwechsel, Entzündungen, neuronale Proteinopathien und Infektionskrankheiten ^auswirken8. Aufgrund ihrer vielfältigen zellulären Rollen können Methoden zu ihrer Isolierung und Analyse verbesserte Einblicke in die Regulation physiologischer und pathologischer Prozesse liefern. Hier werden validierte Methoden für die schnelle Extraktion und Analyse im kleinen Maßstab und die präparative Isolierung von Gangliosiden aus dem Gehirn bereitgestellt. Chancen und Herausforderungen für die Anwendung auf andere Gewebe werden diskutiert.

Protocol

Die Gewebeentnahme erfolgte unter Bedingungen, die vom Johns Hopkins Animal Care and Use Committee genehmigt wurden.

1. Grubengangliosidextraktion in kleinem Maßstab und teilweise Reinigung

ACHTUNG: Verwenden Sie eine angemessene Belüftung, wenn Sie mit flüchtigen und toxischen Lösungsmitteln arbeiten. Vermeiden Sie durchgehend Plastik; Lösungsmittel extrahieren chemische Komponenten aus vielen Kunststoffen, die nachfolgende Analysen stören. Polytetrafluorethylen (PTFE) ist eine Ausnahme; PTFE-ausgekleidete Verschlüsse sollten verwendet werden, um Glasaufbewahrungsfläschchen zu verschließen.

1. Extraktion
   1. Wiegen Sie ein einzelnes frisches oder aufgetautes Mäusegehirn (oder ein sagittales Halbgehirn, ~ 0,2-0,5 g) und legen Sie es in einen Potter-Elvehjem-Homogenisator, der in einem Eimer Eis vorgekühlt ist.
      HINWEIS: Zuvor gefrorene Gehirne können nach dem Auftauen bei 0-4 ° C verwendet werden.
   2. Fügen Sie 4,1 ml pro g Gewebe Nassgewicht Wasser hinzu und homogenisieren Sie mit 10 Hüben.
      HINWEIS: Genaue Lösungsmittelverhältnisse sind der Schlüssel zu einer optimalen Extraktion und Partition, das Ziel ist Chloroform-Methanol-wässrig (4: 8: 3), vorausgesetzt, Gehirngewebe ist zu 80% wässrig.
   3. Fügen Sie 13 ml Gewebenassgewicht Methanol hinzu, wechseln Sie auf Umgebungstemperatur (22 ° C) und mischen Sie.
      HINWEIS: Die Lösung wird bewölkt angezeigt. Die Zugabe von Methanol in diesem Schritt, ohne Chloroform, optimiert die Proteinausscheidung. Alle nachfolgenden Schritte erfolgen bei Umgebungstemperatur (22 °C).
   4. Auf ein dickwandiges Glasrohr mit Schraubverschluss mit PTFE-Schraubverschluss bei Umgebungstemperatur (22 °C) geben und gründlich mischen. Fügen Sie 6,5 ml pro g Gewebe Nassgewicht von Chloroform, Kappe hinzu und mischen Sie gründlich. Zentrifuge bei 450 x g für 15 min. Übertragen Sie den klaren Überstand auf ein frisches, verschraubtes Rohr und messen Sie das Volumen, "zurückgewonnenes Extraktvolumen".
2. Trennwand
   1. Geben Sie 0,173x "zurückgewonnenes Extraktvolumen" Wasser kräftig in den klaren Überstand, die Kappe, den Wirbel und die Zentrifuge, wie in Schritt 1.1.4 beschrieben.
      HINWEIS: Das Ziel ist es, Chloroform-Methanol-wässrig im Verhältnis 4:8:5,6 zu haben. Die Mischung wird trüb sein und sich in zwei Phasen auflösen: eine obere wässrige Phase und eine niedrigere chloroformreiche Phase im Verhältnis ~ 4: 1. Warten Sie 60 min oder zentrifugieren Sie bei 450 x g für 15 min für eine vollständige Phasentrennung.
   2. Die obere Phase, die die Gangliside enthält, wird in ein frisches Glasrohr mit einem mit PTFE ausgekleideten Schraubverschluss überführt.
3. Umkehrphasen-Kartuschenchromatographie
   1. Mit einer 5 ml Glasspritze waschen Sie eine tC18-Festphasenextraktionskartusche (400 mg) mit 3 ml Methanol, dann 3 ml Chloroform-Methanol-Wasser (2:43:55). Laden Sie die obere Phase aus Schritt 1.2.2 mit derselben Glasspritze auf die tC18-Kartusche, sammeln Sie den Durchfluss und laden Sie ihn erneut auf die Säule, um die Adsorption zu optimieren.
   2. Mit der Glasspritze die Kartusche mit 3 ml Chloroform-Methanol-Wasser (2:43:55) und dann 3 ml Methanol-Wasser (1:1) waschen.
   3. Die Ganglioside mit 3 ml Methanol in ein frisches, verschraubtes Rohr eluieren. Unter einem sanften Stickstoffstrom bei ≤ 45 °C bis zur Trocknung verdampfen. In Methanol bei 1 ml pro g Nassgewicht des ursprünglichen Gewebes auflösen.

2. Extraktion und Reinigung von Gangliosid in großem Maßstab

ACHTUNG: Verwenden Sie bei der Arbeit mit flüchtigen Lösungsmitteln explosionsgeschützte Mixer. Verwenden Sie keine Kunststoffe außer PTFE. Tetrahydrofuran, Chloroform und Ethylether sind giftige flüchtige organische Verbindungen. Arbeiten Sie in einem Abzug mit Schutzhandschuhen und Schutzbrille.

1. Extraktion
   1. Tauen Sie gefrorenes Rindergehirn bei 4 °C für mehrere Stunden auf. Sezieren Sie die graue Substanz aus Hirnhäuten und weißer Substanz.
      HINWEIS: Das folgende Verfahren wird für 100 ± 20 g isolierte graue Hirnsubstanz beschrieben und ist skalierbar.
   2. Geben Sie 100 g graue Substanz des Gehirns in einen Mixer und fügen Sie 1 ml pro g Gehirnnassgewicht von gekühltem 10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 6,8 hinzu. Auf niedrigem Niveau für 20 s homogenisieren. 8 ml Tetrahydrofuran pro g Hirnnassgewicht zugeben und 10 s auf niedrigem Niveau homogenisieren. Dekantieren Sie in Glaszentrifugenflaschen und zentrifugieren Sie bei 5.000 x g für 15 min bei Umgebungstemperatur (22 °C).
   3. Sammeln Sie den Überstand, messen Sie sein Volumen und übertragen Sie ihn in einen Glastrichter. Fügen Sie 0,3 ml Ethylether pro ml des Überstands hinzu. Kräftig schütteln, dann 30 min ungestört sitzen lassen, in denen sich zwei Phasen, eine obere Ätherphase und eine untere wässrige Phase, trennen. Sammeln Sie die untere Phase, die die Ganglioside enthält, in eine Glasflasche mit einem mit PTFE ausgekleideten Verschluss.
   4. Zu der oberen (Äther-)Phase, die im Separatorentrichter verbleibt, werden 0,1 ml Wasser pro ml ursprünglichem Überstand zugegeben (Schritt 2.1.3). Kräftig schütteln, Phasen trennen lassen, die untere (wässrige) Phase sammeln und mit der vorherigen unteren Phase kombinieren. Die kombinierten unteren Phasen zu einem trockenen Pulver verdampfen und wiegen.
2. Verseifung
   1. Fügen Sie 10 ml 100 mM wässriges NaOH pro g Pulver in ein versiegeltes Röhrchen hinzu. 3 h bei 37 °C mischen und inkubieren. Abkühlen lassen und durch tropfenweise Zugabe von 100 mM wässrigem HCl auf pH 4,5 einstellen. Messen Sie das Volumen und geben Sie es in einen Glastrichter.
      HINWEIS: Sialinsäuren sind säurelabil; Vermeiden Sie eine Versauerung unter pH-Wert 4,5.
   2. Basierend auf dem wässrigen Volumen fügen Sie 2,67 Volumina Methanol hinzu, mischen Sie vorsichtig und fügen Sie dann 1,33 Volumina Chloroform hinzu, um eine einphasige Lösung von Chloroform-Methanol-wässrig (4:8:3) zu erhalten. Gut mischen.
   3. Basierend auf dem ursprünglichen wässrigen Volumen fügen Sie 2,6 Volumen Wasser hinzu, um das Gemisch zu Chloroform-Methanol-wässrig auf ein Verhältnis von 4:8:5,6 zu bringen. Kräftig schütteln, dann ungestört sitzen lassen, um zwei Phasen zu trennen, eine polare obere Phase, die die Ganglioside enthält, und eine unpolare untere Phase. Sammeln Sie die obere Phase in einer Glasflasche mit einem mit PTFE ausgekleideten Verschluss.
      HINWEIS: Nicht-sialylierte Lipide erscheinen nicht auf dünnschichtigen Chromatographieplatten (TLC), die mit Resorcin gefärbt sind, sondern erscheinen bei Verwendung einer p-Anisaldehyd-Färbung. Der Zweck dieser Verseifung besteht darin, die O-acetylierten Verbindungen wie Phospholipide zu entfernen.
3. Umkehrphasenchromatographie
   1. Eine großflächige (10 g) tC18-Festphasen-Extraktionskartusche wird vorgewaschen, indem 50 ml jedes der folgenden drei Lösungsmittel mit Vakuum oder Druck (<1 min pro Wäsche) durch die Säule geleitet werden: Methanol, Methanol-Wasser (1:1), dann Chloroform-Methanol-Wasser (2:43:55). Laden Sie die obere Phase ab Schritt 2.2.3 durch Vakuum oder Druck auf die Säule, sammeln Sie die Strömung durch, laden Sie sie neu und sammeln Sie die Strömung durch.
   2. Waschen Sie die Säule mit 30 mL Chloroform-Methanol-Wasser (2:43:55), dann 30 mL Methanol-Wasser (1:1), dann eluieren Sie die Ganglioside mit 50 mL Methanol und erneut mit 10 mL Methanol, wobei Sie jede Wäsche und jede Elution separat sammeln. Bestätigen Sie mit TLC (unten), dass Gangliosid im Durchfluss fehlt und in der ersten Elution (50 ml Methanol) gewaschen und eluiert wird. Die eluierten Ganglioside zu einem trockenen Pulver verdampfen und wiegen.
      HINWEIS: Der Zweck der tC18-Chromatographie besteht darin, Ganglioside von weniger und mehr polaren Verunreinigungen zu trennen. Die Mischhirngangliosidausbeute nach Verseifung beträgt ~ 120 mg pro g trockener Hirnextrakt (Schritt 2.1.4). Das Auftreten von Gangliosiden durch TLC im Durchfluss oder in den Waschungen weist darauf hin, dass die Festphasenextraktionssäule gesättigt war. Nach der Methanolelution kann die Säule weiter mit Chloroform-Methanol (1:1) eluiert werden, um weniger polare Lipide einzufangen.
4. HPLC-Aufreinigung einzelner Ganglioside
   1. Bereiten Sie HPLC-Lösungsmittel A vor: Acetonitril-5 mM wässriger Natriumphosphatpuffer pH 5,6 (83:17) und Lösungsmittel B: Acetonitril-20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,6 (1:1). Entgasen Sie beide Lösungsmittel für 5 min.
   2. Voräquilibrierung einer HPLC-Säule (20 x 250 mm Säule gepackt mit amingebundenen (_NH2) Kieselsäurekugeln, 5 μm Durchmesser, 100 Å Porengröße) mit 100% Lösungsmittel A für 20 min bei 5 ml/min. Stellen Sie einen UV-HPLC-Säulenablaufdetektor auf 215 nm ein.
   3. Das Gangliosidpulver aus dem Umkehrphaseneluat wird in Wasser bei 5 mg/ml gelöst. Injizieren Sie 0,5 ml der Gangliosidmischung in die HPLC und lassen Sie den Lösungsmittelgradienten (Tabelle 1) mit 5 ml/min laufen und sammeln Sie Fraktionen. Ganglioside erscheinen als _A215-Peaks mit Retentionszeiten (Major Brain Ganglioside) von 25-70 min: GM1 ≈ 28 min; GD1a ≈ 38 min; GD1b ≈ 46 min; GT1b ≈ 65 Min. Nach jedem Durchlauf 20 min mit Lösungsmittel A ausgleichen. Analysieren Sie Fraktionen durch Dünnschichtchromatographie.

Zeit (min)	%A	%B
0	100	0
7	100	0
12	63	37
82	54	46
82.01	0	100
92	0	100

Tabelle 1: Lösungsmittelgradient für HPLC.

3. Dünnschichtchromatographie (TLC) Analyse von Gangliosiden

ACHTUNG: Chloroform ist eine giftige flüchtige organische Verbindung. Arbeiten Sie in einem Abzug mit Schutzhandschuhen und Schutzbrille.

1. Laufende Lösungsmittel- und TLC-Plattenvorbereitung
   1. Es wird ein laufendes Lösungsmittel aus Chloroform-Methanol-wässrig 0,25% KCl (60:35:8 Vol.) hergestellt. Gießen Sie in eine 10 cm x 10 cm große Glas-TLC-Kammer mit einer Edelstahlabdeckung, so dass die Lösungsmitteltiefe ~ 0,5 cm beträgt. Abdecken und in einem Bereich ohne Luftströmungen für >10 min ausgleichen lassen.
      HINWEIS:Um die TLC-Kammer von Luftströmungen zu isolieren, kann eine 5-seitige Acrylbox konstruiert oder gekauft werden (Abbildung 2). Verwenden Sie in der Kammer kein lösemittelgesättigtes Filterpapier.
   2. Legen Sie eine 10 cm x 10 cm oder 5 cm x 10 cm große Kieselgel-beschichtete Hochleistungs-TLC-Platte mit Glasrücken für 10 min in einen Trockenschrank bei 125 °C. Abkühlen lassen. Verwenden Sie einen abgestumpften Bleistift #2, um 5-mm-Fleckenlinien mit 2-mm-Abständen entlang einer Linie 1 cm über dem Boden der Platte und mindestens 1 cm von beiden Seiten zu zeichnen (Abbildung 3). Vermeiden Sie es, die Kieselsäureschicht beim Markieren zu stören.
   3. Bereiten Sie eine Standardmischung aus reinen Gangliosiden in Methanol vor, die 100 μM GM1, je 50 μM GD1a und GD1b und 33 μM GT1b enthält.
      HINWEIS: Diese Mischung enthält 100 Pmol Gangliosidensialinsäure pro μL für jedes der vier Ganglioside, eine Menge, die durch Resorcinolfärbung ein starkes kolorimetrisches Signal liefert, das von Sialinsäure abhängig ist.
2. Gangliosid-Auflösung
   1. Waschen Sie eine 10-μL-Hamilton-Spritze mit einer abgeschrägten Nadel mit Methanol. Ziehen Sie 1 μL Methanol in eine Glasspritze, um das Nadeltotvolumen und dann 1 μL Probe oder Standard zu füllen. Platzieren Sie die Probe gleichmäßig auf den 5 mm vormarkierten Linien, bis <1 μL Lösungsmittel (Methanol) in der Spritze verbleiben. Lassen Sie die Platte bei Umgebungstemperatur (22 °C) trocknen, nachdem alle Proben entdeckt wurden.
      HINWEIS: Waschen Sie die Spritze zwischen dem Laden der Proben mit Methanol. Ein unbeheiztes Luftgebläse, das auf niedrig eingestellt ist, kann verwendet werden, um die Trocknung zu beschleunigen.
   2. Legen Sie die gefleckte und getrocknete Platte in die voräquilibrierte TLC-Kammer, wobei die Unterkante in das laufende Lösungsmittel eingetaucht ist, und decken Sie sie ab und schützen Sie sie vor Luftströmungen (Abbildung 2). Lassen Sie das laufende Lösungsmittel durch Kapillarwirkung die Platte hinauffahren, bis die Lösungsmittelfront innerhalb von 1 cm von der Oberseite der Platte reicht. Entfernen und markieren Sie die Lösungsmittelfront am Rand der Platte mit einem Bleistift. Lassen Sie die Lösungsmittel entweder ungestört oder unter milder Luftströmung vollständig verdampfen.

Abbildung 2: Ausrüstung und Einrichtung von Ganglioside TLC. Eine Doppeltrogkammer ist beidseitig auf ≈ 0,5 cm mit laufendem Lösungsmittel gefüllt. Die Platte wird gegen eine Seite gelegt, wobei das Ursprungsende in den laufenden Puffer eingetaucht ist. Die Kammer ist mit einer Acrylbox bedeckt, um Luftströmungen zu vermeiden. Panel A, Seitenansicht vor dem Einsetzen der Platte. Der Lösemittelstand ist einige mm über dem Kammerboden sichtbar; Panel B, Frontansicht während der Entwicklung. Die Lösemittelfront ist bei etwa 40% des Weges nach oben auf der Platte sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Gangliosid-Färbung
   ACHTUNG: Reagenzienflecken sind giftig. Salzsäure ist ätzend und giftig. Bereiten Sie Reagenzien mit Schutzhandschuhen und Schutzbrillen in einem Abzug vor und sprühen Sie sie ein.
   HINWEIS: Die Platte kann für die qualitative Bildanalyse abgebildet oder gespeichert werden, indem die Klemmen entfernt und die Abdeckplatte mit durchsichtigem Klebeband befestigt wird. Quantitative Analysen können durchgeführt werden, indem die Densitometrie von Gangliosidstandards gemessen wird, die in benachbarten Bahnen entdeckt wurden.
   1. Bereiten Sie Resorcin Spray Reagenz für den Nachweis von Gangliosiden basierend auf ihren Sialinsäuren vor. Lösen Sie 6 g Resorcin in 100 ml Wasser auf, um einen 6% igen Resorcin zu erhalten. Lösen Sie 1 g CuSO4 in 100 ml Wasser auf, um einen Vorrat von 1% zu erhalten. Zu 64,7 ml Wasser 5 ml des 6% igen Resorcinvorrats, 0,31 ml des 1% CuSO4-Bestands hinzufügen, dann langsam 30 ml konzentriertes HCl hinzufügen und vorsichtig umrühren. Kann bei 4 °C für einen Monat gelagert werden.
   2. Legen Sie in einem chemischen Abzug die TLC-Platte mit gelösten Gangliosiden, deren Ursprung endet, in einen abgeschnittenen Karton, um die Wände der Haube vor Säurespray zu schützen. Legen Sie das Resorcin-Sprühreagenz in ein TLC-Glassprühgerät, befestigen Sie es an einer Druckstickstoffquelle und sprühen Sie die Platte leicht diagonal in vertikaler und horizontaler Richtung. Besprühen Sie die TLC-Sorptionsoberfläche gleichmäßig, aber leicht.
   3. Decken Sie die Platte sofort mit einer sauberen, trockenen Glasabdeckplatte mit den gleichen Abmessungen ab und befestigen Sie die Abdeckplatte mit Bindemittelclips (Abbildung 3). Erhitzen Sie die abgedeckte Platte bei 125 °C für 20 min. Ganglioside erscheinen dunkelviolett vor weißem Hintergrund.
      HINWEIS: Die Platte sollte nicht nass erscheinen, wenn das Sprühen abgeschlossen ist. Abdeckplatten können hergestellt werden, indem das Sorptionsmittel von zuvor verwendeten TLC-Platten mit einer einschneidigen Rasierklinge abgekratzt wird.
      ACHTUNG: Kieselsäurepulver ist giftig für die Lunge. Verwenden Sie eine Maske und entsorgen Sie Kieselsäure in einem verschlossenen Behälter.

Abbildung 3: TLC-Platte aus gelöstem Mischgangliosid. TLC-Platte mit aufgelösten gemischten Gangliosidstandards (linke Spur) und gereinigten gemischten Gangliosiden der grauen Substanz von Rindern (rechte Spur) nach Resorcinfärbung und Erwärmung mit eingeschnittener Glasabdeckplatte. Standardganglioside (von oben nach unten) sind GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b, GT1b und GQ1b. Nach dem Abkühlen kann die Platte abgebildet und/oder die Abdeckplatte zur Aufbewahrung aufgeklebt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

4. Allgemeine Lipidfärbung für Ganglioside und Phospholipide.
   ACHTUNG: Schwefelsäure ist giftig und ätzend. Die Zugabe von konzentrierter Säure zu Ethanol ist exotherm und muss langsam erfolgen. Bereiten Sie das Färbereagenz in einem Abzug mit Schutzhandschuhen und Schutzbrille vor.
   1. Bereiten Sie die p-Anisaldehyd-Färbung vor, indem Sie langsam 15 ml konzentrierte Schwefelsäure zu 500 ml Ethanol hinzufügen. Rühren Sie 30 Minuten um, damit die Lösung abkühlen kann, bevor Sie fortfahren. 15 ml p-Anisaldehyd hinzufügen und vorsichtig umrühren. Diese kann bei Raumtemperatur (22 °C) bis zu sechs Monaten gelagert werden.
   2. Tauchen Sie in einem chemischen Abzug die TLC-Platte mit gelösten Gangliosiden, Ursprungsende nach unten, in ein Becherglas mit dem p-Anisaldehyd-Fleck. Tauchen Sie für ≥ 2 s in die laufende Front ein. Entfernen Sie TLC von Flecken und lassen Sie es abtropfen. Erhitzen Sie die TLC-Platte auf einer heißen Platte bei niedriger Temperatur, um sich zu entwickeln.
      HINWEIS: Lipide erscheinen dunkel vor einem violetten Hintergrund. Färbelösung kann für den wiederholten Gebrauch wiederhergestellt werden.

Representative Results

Die in Abschnitt 1 beschriebenen Methoden (kleiner Maßstab) liefern Ganglioside in ausreichender Menge und Reinheit für die qualitative und quantitative Bestimmung der wichtigsten Hirnganglioside. Die Erholung aus dem Gehirn der Maus beträgt ~ 1 μmol Gangliosid pro g Nassgewicht des Gehirns (1 nmol / μL), wenn es wie beschrieben zubereitet wird. Die TLC-Auflösung von 1 μL (1 nmol) unter Verwendung von Abschnitt 3 liefert reichlich Material für den Nachweis von Resorcin und löst alle wichtigen Hirnganglioside auf, wie in Abbildung 4 für Wildtyp- und genetisch veränderte Mäuse gezeigt. Obwohl gemischte Ganglioside, die unter Verwendung von Abschnitt 1 hergestellt werden, nicht frei von anderen wichtigen Lipiden sind, sind Ganglioside von ausreichender Reinheit für die massenspektrometrische Bestimmung (MS), wie in Abbildung 5 gezeigt, entweder als native gereinigte Ganglioside im negativen Modus oder nach Permethylierung im positiven ^Modus9. Da Abschnitt 1 alkalische Hydrolyse zur Entfernung von Phospholipiden vermeidet, behält er alkalisensitive natürliche Modifikationen, wie O-acetylierte Sialinsäuren (siehe GT1b-OAc, Abbildung 4)⁹.

Abbildung 4: TLC von Gangliosiden des Gehirns der Maus. TLC von Maus-Hirngangliosiden aus Wildtyp- (WT) und St3gal-Einzel- und Doppelnull-Mäusen, die wie in Protokoll 1 gereinigt wurden. Diese Zahl wurde von Sturgill et al., 20129 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: MS von permethylierten Wildtyp- und St3gal2/3-double-null-Maus-Hirngangliosiden, die wie in Abschnitt 1 gereinigt wurden. Beachten Sie, dass GD1a und GD1b durch TLC aufgelöst werden (Abbildung 4), aber die gleiche Masse haben und daher nicht durch eindimensionale MS unterscheidbar sind. Diese Zahl wurde von Sturgill et al., 20129 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die großflächige Reinigung (Abschnitt 2) umfasst die Extraktion, Verseifung (zur Entfernung von Phospholipiden) und die HPLC-Auflösung, um gereinigte Hauptganglioside des Gehirns GM1, GD1a, GD1b und GT1b bereitzustellen, die für biologische Experimente und für weitere chemische und enzymatische Modifikationen geeignet sind. Ein beispielhaftes HPLC-Profil und die anschließende TLC-Analyse sind in Abbildung 6 dargestellt. Die Alkalibehandlung (Verseifung) ist in diesem Protokoll notwendig, um kontaminierende Phospholipide zu hydrolysieren und zu entfernen (Abbildung 7), hydrolysiert aber auch natürliche Modifikationen von Gangliosiden, wie O-acetylierte Sialinsäuren, die in einigen Kontexten wichtig sein ^können10. Für diese Anwendungen wurden alternative wirksame Methoden zur Entfernung von Phospholipiden aus isolierten Gangliosiden ^{veröffentlicht6.}

Abbildung 6: Repräsentative HPLC von Rindergehirngangliosiden. Der Elutionsgradient (%B, gepunktete Linie) wird für die ersten 75 Minuten des Zyklus über die Absorption (_A215, durchgezogene Linie) gelegt. Peaks (_A215) wurden gesammelt (Zahlen in Klammern) und TLC wie in Protokoll 3 unterzogen. Spurnummern beziehen sich auf die Spitzenzahlen auf dem Chromatogramm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: TLC-Platte aus gelöstem Mischgangliosid. TLC-Platte mit aufgelösten gemischten Gangliosiden (Spur 1) zusammen mit nach der Verseifung unterteilten Gangliosiden (Spur 2) und freigesetzten Fettsäuren (Bahn 3). Lipide, einschließlich Ganglioside, werden mit p-Anisaldehyd-Färbung nachgewiesen. Standardganglioside (von oben nach unten) sind GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b und GT1b. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Die hier beschriebenen Methoden zur Extraktion und Isolierung von Gangliosid in kleinem und großem Maßstab sind nicht einzigartig - es gibt viele verschiedene Lösungsmittelextraktions- und Reinigungsansätze, die hervorragende Ergebnisse ^liefern12. Die hier berichteten Methoden zur Reinigung in kleinem Maßstab aus dem Gehirn, von Fredman und ^{Svennerholm13}, haben gezeigt, dass sie die Rückgewinnung optimieren und sich über viele Jahre in unserem Labor als robust und unkompliziert erwiesen haben. Die Isolierung und Reinigung, die für TLC und MS geeignet ist, kann von intaktem Gewebe bis hin zu isolierten Gangliosiden in wenigen Stunden problemlos abgeschlossen werden. MS kann an nativen gereinigten Gangliosiden im negativen Modus oder nach Permethylierung im positiven Modus durchgeführt werden (Abbildung 7, z. B. siehe Sturgill et ^al.9). Die Ausbeute ist sehr konstant, ≈ 1 μmol Gangliosid (≈ 2 μmol Gangliosid-gebundene Sialinsäure) pro g frisches Hirngewebe für die meisten Säugetiere. Die hier beschriebene Methode zur großflächigen Extraktion und Partitionierung aus dem Gehirn, die von Tettamani et ^al.14 eingeführt wurde, wurde ausgewählt, um das Volumen des gangliosidhaltigen Lösungsmittels an der ersten Partition (Ether-Tetrahydrofuran-Wasser) zu minimieren. Dies vereinfacht nachfolgende Schritte, die mit Techniken, die bei den ersten Schritten große Mengen an partitionierten Gangliosiden erzeugen, umständlich werden können. Die beschriebene HPLC-Methode von Gazzotti et ^al.15 hat eine relativ hohe Kapazität und eine gute Auflösung der wichtigsten Hirnganglioside.

Die beschriebenen kleinräumigen Protokolle eignen sich sowohl für Zellen als auch für Gewebe und sind skalierbar. Da die letzten Schritte die Rückphasenabscheidung, die Verdampfung und die Wiederauflösung in Methanol sind, können sie in einem beliebigen Maßstab auf kleine Proben wie kultivierte Nervenzellen angewendet werden. In diesem Fall kratzen und homogenisieren wir die Zellen der Einfachheit halber in 1 ml Wasser und fahren mit der Zugabe von Methanol und Chloroform fort, um die geeigneten Verhältnisse für die Extraktion und anschließende Partitionierung zu erzeugen. Die endgültigen getrockneten Ganglioside nach der Rückwärtsphase können in nur wenigen Mikrolitern wieder aufgelöst und mittels TLC und MS analysiert werden.

Die Beachtung der Lösungsmittelverhältnisse ist entscheidend für den Erfolg bei Extraktions- und Lösungsmittelpartitionierungsschritten zur Gangliosisolierung. Für die Extraktion und Partitionierung in kleinem Maßstab wurden verschiedene Chloroform-Methanol-Wasser-Verhältnisse getestet, und diejenigen, die eine nahezu quantitative Gangliosisolierung erzeugten, werden hier ^berichtet13. Abweichungen von den beschriebenen Verhältnissen verringern die Ausbeute und/oder Reinigung. Ebenso ist die Aufmerksamkeit auf die Lösungsmittelverhältnisse bei der TLC-Entwicklung von Lösungsmitteln von entscheidender Bedeutung. Die gemeldeten Chloroform-Methanol-Wasser-Verhältnisse ergeben eine einzige klare Phase. Kleine Variationen können zu trüben Entwicklungslösungen führen, die nicht verwendet werden sollten, aber durch tropfenweise Zugabe von Methanol mit Verwirbelung geklärt werden können. Obwohl unterschiedliche Extraktions- und Trennlösungsmittel üblich sind, sollten die Lösungsmittelverhältnisse für jede Variation sorgfältig befolgt ^werden12. Veränderungen in TLC-Lösungsmitteln sind ebenfalls üblich, um die Trennung bestimmter Ganglioside zu ^{optimieren16.} Eine relativ einfache Möglichkeit, die TLC-Migration von Gangliosiden zu modifizieren, besteht darin, die wässrige Phase der Lösungsmittelmischung zu ändern. Die Verwendung von wässrigem Ammoniumhydroxid oder Calciumchlorid anstelle von Kaliumchlorid verändert die Gangliosidsalzform und die relative ^{TLC-Migration17.}

Während alle Wirbeltierzellen und -gewebe Ganglioside exprimieren, sind die Gehirn- und Nervenzellen in den hohen exprimierten Mengen ungewöhnlich. Die hier beschriebenen Protokolle sind auf andere Gewebe und Zellen anwendbar, aber aufgrund der geringeren Häufigkeit und der möglichen Kontamination mit anderen Lipiden können Modifikationen erforderlich sein. Diese Methoden, wie sie bei menschlichen Neutrophilen6 und ^Mausfett18 angewendet werden, liefern Beispiele^.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine brain, stripped	PelFreez	57105-1
Ganglioside standards	Matreya	GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063
Glass bottle with PTFE-lined cap	Fisher Scientific	02-911-739
Glass centrifuge bottle	Fisher Scientific	05-586B
Glass culture tubes, 16 x 125 mm	VWR	60825-430	for collecting HPLC fractions
Glass separatory funnel (2 L)	Pyrex	6400-2L
Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 µl	Hamilton	81265
p-Anisaldehyde, 98%	Sigma-Aldrich	A88107
Potter-Elvhjem Homogenizer	Fisher Scientific	08-414-14A	Choose appropriate volume option
Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns	Analytics-Shop	AAVRS1N-100540-5
Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column	Analytics-Shop	custom packed	other sizes available
Resorcinol	Sigma-Aldrich	30752-1
Rotary evaporator	Buchi	R-300
Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml)	Sigma-Aldrich	57632
Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)	Waters	WAT043350
Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg	Waters	WAT036810
Spotting syringe - Hamilton 701N 10 µl	Hamilton	80300
Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps	Fisher Scientific	14-933A
Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps	Fisher Scientific	14-955-323	For ganglioside storage
TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat	Fisher Scientific	M1056350001	Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface
TLC reagent sprayer	Fisher Scientific	05-723-26A
TLC running chamber for 10 x 10 cm plates	Camag	22.5155
Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender	Waring	E8520