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Biochemistry

गैंग्लियोसाइड निष्कर्षण, शुद्धिकरण और प्रोफाइलिंग

Published: March 12, 2021 doi: 10.3791/62385
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Pharmacology and Molecular Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

गैंग्लियोसाइड्स सियालिक एसिड-असर वाले ग्लाइकोस्फिंगोलिपिड्स हैं जो मस्तिष्क में विशेष रूप से प्रचुर मात्रा में होते हैं। उनकी एम्फीपैथिक प्रकृति को इष्टतम वसूली और सटीक विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए कार्बनिक / जलीय निष्कर्षण और शुद्धिकरण तकनीकों की आवश्यकता होती है। यह लेख विश्लेषणात्मक और पूर्ववर्ती पैमाने पर गैंग्लियोसाइड निष्कर्षण, शुद्धिकरण, और पतली परत क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण का अवलोकन प्रदान करता है।

Abstract

गैंग्लियोसाइड्स ग्लाइकोस्फिंगोलिपिड्स होते हैं जिनमें एक या अधिक सियालिक एसिड अवशेष होते हैं। वे सभी कशेरुक कोशिकाओं और ऊतकों पर पाए जाते हैं लेकिन मस्तिष्क में विशेष रूप से प्रचुर मात्रा में होते हैं। मुख्य रूप से कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली के बाहरी पत्रक पर व्यक्त किया जाता है, वे पार्श्व संघ के माध्यम से सेल सतह प्रोटीन की गतिविधियों को संशोधित करते हैं, सेल-सेल इंटरैक्शन में रिसेप्टर्स के रूप में कार्य करते हैं और रोगजनकों और विषाक्त पदार्थों के लिए लक्ष्य हैं। मनुष्यों में गैंग्लियोसाइड जैवसंश्लेषण के आनुवांशिक विकृति के परिणामस्वरूप गंभीर जन्मजात तंत्रिका तंत्र विकार होते हैं। उनकी एम्फीपैथिक प्रकृति के कारण, निष्कर्षण, शुद्धिकरण और गैंग्लियोसाइड्स के विश्लेषण के लिए उन तकनीकों की आवश्यकता होती है जिन्हें उनकी खोज के बाद से 80 वर्षों में कई जांचकर्ताओं द्वारा अनुकूलित किया गया है। यहां, हम निष्कर्षण, शुद्धिकरण, और ऊतकों और कोशिकाओं से प्रमुख गैंग्लियोसाइड्स के प्रारंभिक गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए बेंच-स्तर के तरीकों का वर्णन करते हैं जिन्हें कुछ घंटों में पूरा किया जा सकता है। हम मस्तिष्क से बड़े पैमाने पर अलगाव और प्रमुख गैंग्लियोसाइड प्रजातियों के शुद्धिकरण के तरीकों का भी वर्णन करते हैं। साथ में, ये विधियां बायोएक्टिव अणुओं के इस वर्ग के लिए विश्लेषणात्मक और पूर्ववर्ती पैमाने पर पहुंच प्रदान करती हैं।

Introduction

गैंग्लियोसाइड्स को ग्लाइकोस्फिंगोलिपिड्स के रूप में परिभाषित किया गया है जो एक या अधिक सियालिक एसिड अवशेषों को सहन करते हैं1। वे मुख्य रूप से कोशिका की सतह पर व्यक्त किए जाते हैं, जिसमें उनके हाइड्रोफोबिक सेरामाइड लिपिड समूह प्लाज्मा झिल्ली के बाहरी पत्रक में एम्बेडेड होते हैं और उनके हाइड्रोफिलिक ग्लाइकन बाहरी स्पेस 2 में विस्तारित होते हैं। यद्यपि कशेरुक कोशिकाओं और ऊतकों में व्यापक रूप से वितरित किया जाता है, वे विशेष रूप से कशेरुकी मस्तिष्क 3 में प्रचुर मात्रा में होते हैं, जहां उन्हें पहली बार खोजा गया था और नामित किया गया था4।

गैंग्लियोसाइड ग्लाइकन की संरचनाएं अलग-अलग होती हैं और उनके नामकरण का आधार होती हैं (चित्रा 1)। गैंग्लियोसाइड ग्लाइकन में एक तटस्थ चीनी कोर शामिल होता है जो विभिन्न संख्याओं और सियालिक एसिड के वितरण को सहन करता है। सबसे छोटे गैंग्लियोसाइड, जीएम 4 में केवल दो शर्करा (गैलेक्टोज से बंधे सियालिक एसिड) होते हैं। बड़े स्वाभाविक रूप से होने वाले गैंग्लियोसाइड्स में एक दर्जन से अधिक कुल शर्करा 6 या एक एकल तटस्थ कोर 7 पर सात सियालिक एसिड तक हो सकते हैं। उनके सेरामाइड लिपिड moieties भी भिन्न होते हैं, जिसमें विभिन्न स्फिंगोसिन लंबाई और विभिन्न प्रकार के फैटी एसिड एमाइड्स होते हैं। कशेरुक मस्तिष्क में चार गैंग्लियोसाइड प्रजातियां, GM1, GD1a, GD1b और GT1b प्रबल हैं। गैंग्लियोसाइड अभिव्यक्ति विकासात्मक रूप से विनियमित, ऊतक विशिष्ट और सेल प्रकार विशिष्ट है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रमुख मस्तिष्क गैंग्लियोसाइड्स और उनके बायोसिंथेटिक अग्रदूत। संरचनाओं को ग्लाइकन 11 के लिए प्रतीक नामकरण का उपयोग करके दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Gangliosides अपने स्वयं के झिल्ली (सीआईएस विनियमन) में प्रोटीन को उलझाने और मॉड्यूलेट करके या अन्य कोशिकाओं (ट्रांस मान्यता) पर बैक्टीरिया विषाक्त पदार्थों और लेक्टिन सहित बाहरी परिवेश में ग्लाइकन बाध्यकारी प्रोटीन को शामिल करके आणविक स्तर पर कार्य करते हैं। नियामक प्रोटीन के लिए गैंग्लियोसाइड्स के विशिष्ट बंधन और / या लिपिड राफ्ट में अन्य अणुओं के साथ आत्म-सहयोग के परिणामस्वरूप सेल व्यवहार में परिवर्तन होता है जो तंत्रिका तंत्र की संरचना और कार्य, कैंसर की प्रगति, चयापचय, सूजन, न्यूरोनल प्रोटीनोपैथी और संक्रामक रोगों को प्रभावित करता है। उनकी विविध सेलुलर भूमिकाओं के कारण, उनके अलगाव और विश्लेषण के लिए तरीके शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं के विनियमन में बढ़ी हुई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। यहां, तेजी से छोटे पैमाने पर निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए मान्य तरीके, और मस्तिष्क से गैंग्लियोसाइड्स के पूर्ववर्ती पैमाने पर अलगाव प्रदान किए जाते हैं। अन्य ऊतकों के लिए आवेदन के लिए अवसरों और चुनौतियों पर चर्चा की जाती है।

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Protocol

ऊतक संग्रह जॉन्स हॉपकिन्स पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अधिकृत शर्तों के तहत किया गया था।

1. छोटे पैमाने पर गैंग्लियोसाइड निष्कर्षण और आंशिक शुद्धिकरण

सावधानी: वाष्पशील और विषाक्त सॉल्वैंट्स के साथ काम करते समय उचित वेंटिलेशन का उपयोग करें। पूरे प्लास्टिक से बचें; सॉल्वैंट्स कई प्लास्टिक से रासायनिक घटकों को निकालेंगे जो बाद के विश्लेषणों में हस्तक्षेप करते हैं। Polytetrafluoroethylene (PTFE) एक अपवाद है; PTFE-पंक्तिबद्ध closures कांच भंडारण शीशियों टोपी के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

  1. कुल
    1. एक एकल ताजा या पिघले हुए माउस मस्तिष्क (या सैगिटल आधे मस्तिष्क, ~ 0.2-0.5 ग्राम) का वजन करें और एक पॉटर-एल्वेहम होमोजेनाइज़र में जगह बर्फ की एक बाल्टी में प्रीचिल्ड।
      नोट: पहले जमे हुए दिमाग का उपयोग 0-4 डिग्री सेल्सियस पर पिघलने के बाद किया जा सकता है।
    2. पानी के गीले वजन और 10 स्ट्रोक के साथ homogenize प्रति जी ऊतक 4.1 मिलीलीटर जोड़ें।
      नोट: सटीक विलायक अनुपात इष्टतम निष्कर्षण और विभाजन के लिए महत्वपूर्ण हैं, लक्ष्य क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल-जलीय (4: 8: 3) है, यह मानते हुए कि मस्तिष्क ऊतक 80% जलीय है।
    3. मेथनॉल के प्रति जी ऊतक गीला वजन 13 एमएल जोड़ें, परिवेश के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) में बदलाव करें और मिश्रण करें।
      नोट:: समाधान बादल दिखाई देगा। इस चरण में मेथनॉल के अलावा, क्लोरोफॉर्म के बिना, प्रोटीन वर्षा को अनुकूलित करता है। बाद के सभी चरण परिवेश के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर हैं।
    4. परिवेश के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर एक PTFE-पंक्तिबद्ध पेंच टोपी के साथ एक मोटी दीवारों वाले ग्लास स्क्रू-कैप्ड ट्यूब में स्थानांतरित करें और अच्छी तरह से मिश्रण करें। क्लोरोफॉर्म, कैप के 6.5 मिलीलीटर प्रति जी ऊतक गीला वजन जोड़ें, और अच्छी तरह से मिलाएं। 15 मिनट के लिए 450 x g पर सेंट्रीफ्यूज। एक ताजा पेंच-कैप्ड ट्यूब के लिए स्पष्ट supernatant स्थानांतरण और मात्रा को मापने, "बरामद निकालने की मात्रा".
  2. विभाजन
    1. 0.173x जोड़ें "बरामद निकालने की मात्रा" पानी के लिए स्पष्ट supernatant, टोपी, भंवर सख्ती से, और सेंट्रीफ्यूज के रूप में चरण 1.1.4 में वर्णित है.
      नोट: लक्ष्य 4: 8: 5.6 के अनुपात में क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल-जलीय होना है। मिश्रण बादल होगा और दो चरणों में हल होगा: एक ऊपरी जलीय समृद्ध चरण और ~ 4: 1 अनुपात पर एक निचला क्लोरोफॉर्म-समृद्ध चरण। पूर्ण चरण पृथक्करण के लिए 15 मिनट के लिए 450 x g पर 60 मिनट या सेंट्रीफ्यूज के लिए प्रतीक्षा करें।
    2. ऊपरी चरण, जिसमें गैंग्लियोसाइड्स शामिल हैं, को एक PTFE-पंक्तिबद्ध पेंच टोपी के साथ एक ताजा ग्लास ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. रिवर्स चरण कारतूस क्रोमैटोग्राफी
    1. एक 5 एमएल ग्लास सिरिंज का उपयोग करते हुए, मेथनॉल के 3 एमएल के साथ एक टीसी 18 ठोस चरण निष्कर्षण कारतूस (400 मिलीग्राम) धोएं, फिर क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल-पानी के 3 एमएल (2: 43: 55)। एक ही ग्लास सिरिंज का उपयोग करके tC18 कारतूस पर चरण 1.2.2 से ऊपरी चरण लोड करें, प्रवाह-माध्यम से एकत्र करें और सोखना को अनुकूलित करने के लिए इसे कॉलम पर पुन: लोड करें।
    2. ग्लास सिरिंज का उपयोग करते हुए, कारतूस को क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल-पानी (2: 43: 55) के 3 मिलीलीटर के साथ धोएं, फिर मेथनॉल-पानी के 3 मिलीलीटर (1: 1)।
    3. एक ताजा पेंच-कैप्ड ट्यूब में मेथनॉल के 3 एमएल के साथ गैंग्लियोसाइड्स को एल्यूट करें। नाइट्रोजन की एक कोमल धारा के तहत 45 डिग्री सेल्सियस ≤ पर सूखापन के लिए वाष्पित करें। मूल ऊतक गीले वजन के प्रति ग्राम 1 मिलीलीटर पर मेथनॉल में भंग करें।

2. बड़े पैमाने पर ganglioside निष्कर्षण और शुद्धिकरण

चेतावनी: वाष्पशील सॉल्वैंट्स के साथ काम करते समय, विस्फोट प्रतिरोधी ब्लेंडर का उपयोग करें। PTFE को छोड़कर प्लास्टिक का उपयोग न करें। टेट्राहाइड्रोफ्यूरान, क्लोरोफॉर्म और एथिल ईथर विषाक्त वाष्पशील कार्बनिक यौगिक हैं। सुरक्षात्मक दस्ताने और सुरक्षा चश्मे के साथ एक धुएं हुड में काम करते हैं।

  1. कुल
    1. कई घंटों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए गोजातीय मस्तिष्क को पिघलाएं। मेनिन्जेस और सफेद पदार्थ से ग्रे पदार्थ को विच्छेदित करें।
      नोट:: निम्नलिखित प्रक्रिया पृथक मस्तिष्क ग्रे पदार्थ के 100 ± 20 ग्राम के लिए वर्णित है और स्केलेबल है।
    2. एक ब्लेंडर में मस्तिष्क ग्रे पदार्थ के 100 ग्राम जगह और ठंडा 10 mM पोटेशियम फॉस्फेट बफर पीएच 6.8 के गीले वजन प्रति जी मस्तिष्क गीला वजन 1 एमएल जोड़ें। 20 s के लिए कम पर homogenize. 8 एमएल tetrahydrofuran प्रति जी मस्तिष्क गीला वजन जोड़ें और 10 s के लिए कम पर homogenize. कांच के सेंट्रीफ्यूज बोतलों में decant और परिवेश के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर 15 मिनट के लिए 5,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    3. Supernatant ले लीजिए, इसकी मात्रा को मापने, और एक ग्लास विभाजक फ़नल करने के लिए स्थानांतरण। supernatant के प्रति mL एथिल ईथर के 0.3 mL जोड़ें। जोर से हिलाएं, फिर 30 मिनट के लिए निर्बाध रूप से बैठने की अनुमति दें, जिसके दौरान दो चरण, एक ऊपरी ईथर चरण और एक निचला जलीय चरण, अलग हो जाता है। निचले चरण, जिसमें गैंग्लियोसाइड्स शामिल हैं, को एक पीटीएफई-पंक्तिबद्ध टोपी के साथ एक कांच की बोतल में इकट्ठा करें।
    4. विभाजक फ़नल में शेष ऊपरी (ईथर) चरण के लिए, मूल supernatant (चरण 2.1.3) के प्रति mL 0.1 mL पानी जोड़ें। जोर से हिलाएं, चरणों को अलग करने की अनुमति दें, निचले (जलीय) चरण को इकट्ठा करें और पिछले निचले चरण के साथ गठबंधन करें। एक सूखे पाउडर और वजन करने के लिए संयुक्त निचले चरणों वाष्पित।
  2. सैपोनीकरण
    1. एक सील ट्यूब में प्रति जी पाउडर के 100 mM जलीय NaOH के 10 mL जोड़ें। मिश्रण और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए incubate. ठंडा करने के लिए और 100 mM जलीय HCl के dropwise इसके अलावा द्वारा पीएच 4.5 करने के लिए समायोजित करने की अनुमति दें मात्रा को मापने और एक कांच विभाजक फ़नल के लिए स्थानांतरण.
      नोट: सियालिक एसिड एसिड labile हैं; पीएच 4.5 के नीचे अम्लीकरण से बचें।
    2. जलीय आयतन के आधार पर, मेथनॉल के 2.67 संस्करणों को जोड़ें, धीरे से मिलाएं, फिर क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल-जलीय (4: 8: 3) का एक एकल-चरण समाधान बनाने के लिए क्लोरोफॉर्म के 1.33 वॉल्यूम जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं।
    3. मूल जलीय आयतन के आधार पर, मिश्रण को क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल-जलीय में 4: 8: 5.6 के अनुपात में लाने के लिए पानी के 2.6 संस्करणों को जोड़ें। जोर से हिलाएं, फिर दो चरणों को अलग करने के लिए अबाधित बैठने की अनुमति दें, एक ध्रुवीय ऊपरी चरण जिसमें गैंग्लियोसाइड्स और एक गैर-ध्रुवीय निचले चरण होते हैं। एक PTFE-पंक्तिबद्ध टोपी के साथ एक कांच की बोतल में ऊपरी चरण ले लीजिए.
      नोट: गैर-sialylated लिपिड पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) प्लेटों resorcinol का उपयोग कर दाग पर दिखाई नहीं देगा, लेकिन एक पी-anisaldehyde दाग का उपयोग करते समय दिखाई देगा। इस सैपोनिफिकेशन का उद्देश्य फॉस्फोलिपिड्स जैसे ओ-एसिटाइलेटेड यौगिकों को हटाना है।
  3. रिवर्स चरण क्रोमैटोग्राफी
    1. वैक्यूम या दबाव (<1 मिनट प्रत्येक धोने): मेथनॉल, मेथनॉल-पानी (1: 1 मिनट), फिर क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल-पानी (2:43:55) का उपयोग करके कॉलम के माध्यम से निम्नलिखित तीन सॉल्वैंट्स में से प्रत्येक के 50 मिलीलीटर को पारित करके एक बड़े पैमाने पर (10 ग्राम) tC18 ठोस चरण निष्कर्षण कारतूस को पूर्व-धोएं। निर्वात या दबाव द्वारा स्तंभ पर चरण 2.2.3 से ऊपरी चरण लोड करें, प्रवाह को इकट्ठा करें, पुनः लोड करें, और प्रवाह को इकट्ठा करें।
    2. क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल-पानी (2: 43: 55) के 30 मिलीलीटर के साथ कॉलम को धोएं, फिर 30 एमएल मेथनॉल-पानी (1: 1), फिर 50 एमएल मेथनॉल के साथ गैंग्लियोसाइड्स को दूर करें, और फिर 10 एमएल मेथनॉल के साथ, प्रत्येक धोने और प्रत्येक क्षालन को अलग से इकट्ठा करें। टीएलसी (नीचे) का उपयोग करके पुष्टि करें कि गैंग्लियोसाइड प्रवाह से अनुपस्थित है और पहले क्षालन (50 एमएल मेथनॉल) में धोता है और बाहर निकलता है। एक सूखे पाउडर और वजन करने के लिए eluted gangliosides वाष्पित.
      नोट: tC18 क्रोमैटोग्राफी का उद्देश्य कम और अधिक ध्रुवीय संदूषकों दोनों से गैंग्लियोसाइड्स को अलग करना है। saponification के बाद मिश्रित मस्तिष्क ganglioside उपज ~ 120 मिलीग्राम प्रति जी सूखी मस्तिष्क निकालने (चरण 2.1.4) है। के माध्यम से या washes के माध्यम से प्रवाह में टीएलसी द्वारा गैंग्लियोसाइड्स की उपस्थिति इंगित करता है कि ठोस चरण निष्कर्षण स्तंभ संतृप्त था। मेथनॉल क्षालन के बाद, स्तंभ को कम ध्रुवीय लिपिड पर कब्जा करने के लिए क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल (1: 1) के साथ आगे बढ़ाया जा सकता है।
  4. अलग-अलग गैंग्लियोसाइड्स का एचपीएलसी शुद्धिकरण
    1. HPLC विलायक ए तैयार करें: एसिटोनिट्राइल-5 mM जलीय सोडियम फॉस्फेट बफर पीएच 5.6 (83: 17) और विलायक बी: एसिटोनिट्राइल -20 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच 5.6 (1: 1)। 5 मिनट के लिए दोनों सॉल्वैंट्स degas.
    2. पूर्व-संतुलित एक HPLC स्तंभ (20 x 250 मिमी कॉलम अमाइन बंधुआ (NH2) सिलिका गोले, 5 μm व्यास, 100 Å ताकना आकार के साथ पैक) 100% विलायक A के साथ 5 mL / मिनट पर 20 मिनट के लिए। 215 एनएम के लिए एक यूवी HPLC कॉलम बहिस्त्राव डिटेक्टर सेट करें।
    3. 5 मिलीग्राम / एमएल पर पानी में रिवर्स फेज एल्यूएट से गैंग्लियोसाइड पाउडर को भंग करें। HPLC पर गैंग्लियोसाइड मिश्रण के 0.5 मिलीलीटर इंजेक्ट करें और 5 एमएल / मिनट पर विलायक ग्रेडिएंट (तालिका 1) चलाएं, अंश एकत्र करें। Gangliosides 25-70 मिनट के प्रतिधारण समय (प्रमुख मस्तिष्क गैंग्लियोसाइड्स) के साथ A215 चोटियों के रूप में दिखाई देगा: GM1 ≈ 28 मिनट; GD1a ≈ 38 मिनट; GD1b ≈ 46 मिनट; जीटी 1 बी ≈ 65 मिनट। प्रत्येक रन के बाद विलायक ए के साथ 20 मिनट को फिर से संतुलित करें। पतली परत क्रोमैटोग्राफी द्वारा अंशों का विश्लेषण करें।
समय (मिनट) %A %B
0 100 0
7 100 0
12 63 37
82 54 46
82.01 0 100
92 0 100

तालिका 1: HPLC के लिए विलायक ढाल.

3. पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) gangliosides के विश्लेषण

सावधानी: क्लोरोफॉर्म एक विषाक्त वाष्पशील कार्बनिक यौगिक है। सुरक्षात्मक दस्ताने और सुरक्षा चश्मे के साथ एक धुएं हुड में काम करते हैं।

  1. विलायक और टीएलसी प्लेट तैयारी चल रहा है
    1. क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल-जलीय 0.25% KCl (मात्रा द्वारा 60:35:8) का एक चल रहा विलायक तैयार करें। एक स्टेनलेस स्टील कवर के साथ एक 10 सेमी x 10 सेमी ग्लास टीएलसी कक्ष में डालें ताकि विलायक की गहराई ~ 0.5 सेमी हो। कवर और >10 मिनट के लिए हवा की धाराओं से मुक्त एक क्षेत्र में संतुलित करने की अनुमति दें।
      नोट: हवा की धाराओं से टीएलसी कक्ष को अलग करने के लिए, एक ऐक्रेलिक 5-तरफा बॉक्स का निर्माण या खरीदा जा सकता है (चित्रा 2)। कक्ष के अंदर विलायक-संतृप्त फ़िल्टर पेपर का उपयोग न करें।
    2. 10 मिनट के लिए 125 डिग्री सेल्सियस पर एक सुखाने ओवन में एक 10 सेमी x 10 सेमी x 10 सेमी सिलिका जेल लेपित ग्लास-समर्थित उच्च प्रदर्शन टीएलसी प्लेट रखें। ठंडा होने दें। प्लेट के नीचे 1 सेमी ऊपर एक रेखा के साथ 2-मिमी पृथक्करण के साथ 5-मिमी स्पॉटिंग लाइनों को आकर्षित करने के लिए एक सुस्त # 2 पेंसिल का उपयोग करें और दोनों तरफ से कम से कम 1 सेमी (चित्रा 3)। अंकन करते समय सिलिका परत को परेशान करने से बचें।
    3. मेथनॉल में शुद्ध गैंग्लियोसाइड्स का एक मानक मिश्रण तैयार करें जिसमें 100 μM GM1, GD1a और GD1b के 50 μM और GT1b के 33 μM शामिल हैं।
      नोट: इस मिश्रण में चार गैंग्लियोसाइड्स में से प्रत्येक के लिए प्रति μL गैंग्लियोसाइड्स के 100 pmol होते हैं, एक मात्रा जो resorcinol धुंधला द्वारा एक मजबूत colorimetric संकेत प्रदान करती है, जो सियालिक एसिड निर्भर है।
  2. गैंग्लियोसाइड रिज़ॉल्यूशन
    1. मेथनॉल के साथ एक बेवेल सुई के साथ एक 10-μL हैमिल्टन सिरिंज धोएं। सुई मृत मात्रा को भरने के लिए एक ग्लास सिरिंज में 1 μL मेथनॉल ड्रा और फिर नमूना या मानक के 1 μL। नमूना समान रूप से 5-मिमी प्रीमार्क लाइनों पर स्पॉट करें जब तक कि विलायक (मेथनॉल) के <1 μL सिरिंज में नहीं रहता है। सभी नमूनों को देखे जाने के बाद प्लेट को परिवेश के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर सूखने की अनुमति दें।
      नोट: नमूना लोड िंग के बीच मेथनॉल के साथ सिरिंज धोएं। कम पर एक unheated हवा ब्लोअर सेट सूखने में तेजी लाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. स्पॉटेड और सूखे प्लेट को पूर्व-संतुलित टीएलसी कक्ष में रखें, जिसमें नीचे के किनारे को चल रहे विलायक और कवर में डुबोया जाता है और हवा की धाराओं से बचा जाता है (चित्रा 2)। चल रहे विलायक को केशिका कार्रवाई द्वारा प्लेट को आगे बढ़ाने की अनुमति दें जब तक कि विलायक सामने प्लेट के शीर्ष के 1 सेमी के भीतर नहीं पहुंच जाता। निकालें और एक पेंसिल के साथ प्लेट के किनारे पर विलायक सामने चिह्नित करें। सॉल्वैंट्स को पूरी तरह से या तो अबाधित या हल्के हवा के प्रवाह के तहत वाष्पित होने की अनुमति दें।

Figure 2
चित्रा 2: Ganglioside टीएलसी उपकरण और स्थापित करें। एक जुड़वां गर्त कक्ष चल रहे विलायक के साथ दोनों पक्षों पर 0.5 सेमी ≈ भर जाता है। प्लेट को चल रहे बफर में विसर्जित मूल अंत के साथ एक तरफ के खिलाफ रखा जाता है। कक्ष को हवा की धाराओं से बचने के लिए एक ऐक्रेलिक बॉक्स के साथ कवर किया गया है। प्लेट सम्मिलन से पहले पैनल ए, साइड व्यू। विलायक स्तर कक्ष तल के ऊपर कुछ मिमी दिखाई देता है; पैनल बी, विकास के दौरान सामने का दृश्य। विलायक सामने प्लेट के ऊपर रास्ते के बारे में 40% पर दिखाई देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. गैंग्लियोसाइड धुंधला
    सावधानी: अभिकर्मक दाग विषाक्त हैं। हाइड्रोक्लोरिक एसिड संक्षारक और विषाक्त है। तैयार करें और सुरक्षात्मक दस्ताने और सुरक्षा चश्मे के साथ एक धुएं हुड में अभिकर्मकों स्प्रे।
    नोट: प्लेट गुणात्मक छवि विश्लेषण के लिए imaged या clamps को हटाने और स्पष्ट टेप के साथ जगह में कवर प्लेट को सुरक्षित करके संग्रहीत किया जा सकता है। मात्रात्मक विश्लेषण आसन्न गलियों में देखे गए गैंग्लियोसाइड मानकों के घनत्वमिति को मापकर किया जा सकता है।
    1. उनके सियालिक एसिड के आधार पर गैंग्लियोसाइड्स का पता लगाने के लिए रेसोर्सिनोल स्प्रे अभिकर्मक तैयार करें। एक 6% resorcinol स्टॉक के लिए 100 मिलीलीटर पानी में resorcinol के 6 ग्राम भंग. एक 1% स्टॉक बनाने के लिए 100 मिलीलीटर पानी में CuSO4 के 1 ग्राम को भंग करें। पानी के 64.7 मिलीलीटर के लिए 6% resorcinol स्टॉक के 5 mL जोड़ें, 1% CuSO4 स्टॉक के 0.31 mL फिर धीरे-धीरे 30 mL केंद्रित HCl जोड़ें और धीरे से हलचल। एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. एक रासायनिक धुएं हुड में, टीएलसी प्लेट को हल किए गए गैंग्लियोसाइड्स के साथ रखें, मूल अंत में, एसिड स्प्रे से हुड की दीवारों की रक्षा के लिए एक कट-अवे कार्डबोर्ड बॉक्स में। एक ग्लास टीएलसी स्प्रेयर में रेसोर्सिनोल स्प्रे अभिकर्मक रखें, दबाव वाले नाइट्रोजन के स्रोत से जुड़ें, और हल्के से प्लेट को ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज दिशाओं में तिरछे स्प्रे करें। टीएलसी सॉर्बेंट सतह को समान रूप से स्प्रे करें, लेकिन हल्के से।
    3. तुरंत एक ही आयाम के एक साफ सूखे कांच कवर प्लेट के साथ प्लेट को कवर करें और बाइंडर क्लिप (चित्रा 3) के साथ जगह में कवर प्लेट को सुरक्षित करें। कवर की गई प्लेट को 20 मिनट के लिए 125 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें। Gangliosides एक सफेद पृष्ठभूमि के खिलाफ गहरे बैंगनी दिखाई देंगे।
      नोट: छिड़काव पूरा होने पर प्लेट को गीला नहीं दिखना चाहिए। कवर प्लेटों को एक एकल-किनारे रेजर ब्लेड का उपयोग करके पहले से उपयोग किए गए टीएलसी प्लेटों से सॉर्बेंट को स्क्रैप करके बनाया जा सकता है।
      सावधानी: सिलिका पाउडर फेफड़ों के लिए विषाक्त है। एक मुखौटा का उपयोग करें और एक सील कंटेनर में सिलिका का निपटान करें।

Figure 3
चित्रा 3: हल मिश्रित गैंग्लियोसाइड की टीएलसी प्लेट। हल मिश्रित ganglioside मानकों (बाएं लेन) की टीएलसी प्लेट और शुद्ध मिश्रित गोजातीय ग्रे मैटर गैंग्लियोसाइड्स (सही लेन) resorcinol धुंधला और कांच कवर प्लेट के साथ हीटिंग के बाद जगह में clipped. मानक गैंग्लियोसाइड्स (ऊपर से नीचे तक) GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b, GT1b और GQ1b हैं। ठंडा होने के बाद, प्लेट को चित्रित किया जा सकता है और / या भंडारण के लिए कवर प्लेट को जगह में टेप किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. गैंग्लियोसाइड्स और फॉस्फोलिपिड्स के लिए सामान्य लिपिड धुंधला।
    सावधानी: सल्फ्यूरिक एसिड विषाक्त और संक्षारक है। इथेनॉल में केंद्रित एसिड के अलावा exothermic है और धीरे-धीरे किया जाना चाहिए। सुरक्षात्मक दस्ताने और सुरक्षा चश्मे के साथ एक धुएं हुड में धुंधला अभिकर्मक तैयार करें।
    1. धीरे-धीरे इथेनॉल के 500 मिलीलीटर में 15 मिलीलीटर केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड जोड़कर पी-एनिसाल्डिहाइड दाग तैयार करें। आगे बढ़ने से पहले समाधान को ठंडा करने की अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए हिलाएं। 15 एमएल पी-एनिसाल्डिहाइड जोड़ें और धीरे से हिलाएं। यह छह महीने तक कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. एक रासायनिक धुएं हुड में, टीएलसी प्लेट को हल किए गए गैंग्लियोसाइड्स के साथ डुबोएं, मूल अंत में, पी-एनिसाल्डिहाइड दाग युक्त बीकर में। ≥ 2 s के लिए चल रहे सामने के लिए डूब. दाग से टीएलसी निकालें और नाली करने की अनुमति दें। विकसित करने के लिए कम तापमान पर एक गर्म प्लेट पर टीएलसी प्लेट गर्म करें।
      नोट: लिपिड एक बैंगनी पृष्ठभूमि के खिलाफ अंधेरे दिखाई देंगे। बार-बार उपयोग के लिए धुंधला समाधान पुनर्प्राप्त किया जा सकता है।

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Representative Results

खंड 1 (छोटे पैमाने) में वर्णित विधियां प्रमुख मस्तिष्क गैंग्लियोसाइड्स के गुणात्मक और मात्रात्मक निर्धारण के लिए पर्याप्त मात्रा और शुद्धता पर गैंग्लियोसाइड्स प्रदान करती हैं। माउस मस्तिष्क से वसूली ~ 1 μmol ganglioside प्रति जी मस्तिष्क गीला वजन (1 nmol / μL) है जब वर्णित के रूप में तैयार किया जाता है। अनुभाग 3 का उपयोग करके 1 μL (1 nmol) का टीएलसी रिज़ॉल्यूशन रेसोर्सिनोल का पता लगाने के लिए पर्याप्त सामग्री प्रदान करता है और सभी प्रमुख मस्तिष्क गैंग्लियोसाइड्स को हल करता है जैसा कि चित्र4 में जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के लिए दिखाया गया है। यद्यपि अनुभाग 1 का उपयोग करके तैयार किए गए मिश्रित गैंग्लियोसाइड्स अन्य प्रमुख लिपिड से मुक्त नहीं हैं, गैंग्लियोसाइड्स मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक (एमएस) निर्धारण के लिए पर्याप्त शुद्धता के हैं जैसा कि चित्रा 5 में दिखाया गया है, या तो नकारात्मक मोड में देशी शुद्ध गैंग्लियोसाइड्स के रूप में या सकारात्मक मोड 9 में परमेथिलिकरण के बाद। चूंकि अनुभाग 1 फॉस्फोलिपिड्स को हटाने के लिए क्षारीय हाइड्रोलिसिस से बचता है, इसलिए यह क्षार-संवेदनशील प्राकृतिक संशोधनों को बरकरार रखता है, जैसे कि ओ-एसिटाइलेटेड सियालिक एसिड (जीटी 1 बी-ओएसी, चित्रा 4) 9 देखें।

Figure 4
चित्रा 4: माउस मस्तिष्क gangliosides के टीएलसी. माउस मस्तिष्क gangliosides के टीएलसी जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) और St3gal एकल और डबल नल चूहों प्रोटोकॉल 1 में के रूप में शुद्ध से. इस आंकड़े को Sturgill et al, 20129 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: permethylated जंगली प्रकार और St3gal2/ ध्यान दें कि GD1a और GD1b TLC (चित्रा 4) द्वारा हल करते हैं, लेकिन एक ही द्रव्यमान है, इसलिए एक आयामी एमएस द्वारा अलग नहीं किया जा सकता है। इस आंकड़े को Sturgill et al, 20129 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

बड़े पैमाने पर शुद्धिकरण (खंड 2) में निष्कर्षण, सैपोनिफिकेशन (फॉस्फोलिपिड्स को हटाने के लिए) और एचपीएलसी रिज़ॉल्यूशन शामिल हैं ताकि शुद्ध प्रमुख मस्तिष्क गैंग्लियोसाइड्स जीएम 1, जीडी 1 ए, जीडी 1 बी और जीटी 1 बी जैविक प्रयोगों के लिए उपयुक्त और आगे के रासायनिक और एंजाइमेटिक संशोधनों के लिए उपयुक्त प्रदान किया जा सके। एक अनुकरणीय HPLC प्रोफ़ाइल और बाद में TLC विश्लेषण चित्र 6 में दिखाया गया है। क्षारीय उपचार (सैपोनिफिकेशन) इस प्रोटोकॉल में दूषित फॉस्फोलिपिड्स (चित्रा 7) को हाइड्रोलाइज़ करने और हटाने के लिए आवश्यक है, लेकिन यह भी गैंग्लियोसाइड्स के प्राकृतिक संशोधनों को हाइड्रोलाइज़ करेगा, जैसे कि ओ-एसिटाइलेटेड सियालिक एसिड, जो कुछ संदर्भों में महत्वपूर्ण हो सकता है10। इन अनुप्रयोगों के लिए, अलग-थलग गैंग्लियोसाइड्स से फॉस्फोलिपिड्स को हटाने के लिए वैकल्पिक प्रभावी तरीके प्रकाशित किए गए हैं।

Figure 6
चित्रा 6: गोजातीय मस्तिष्क गैंग्लियोसाइड्स के प्रतिनिधि एचपीएलसी। क्षालन ढाल (%B, बिंदीदार रेखा) चक्र के पहले 75 मिनट के लिए absorbance (A215, ठोस रेखा) पर overlaid है। चोटियों (A215) एकत्र किए गए थे (कोष्ठक में संख्या) और प्रोटोकॉल 3 के रूप में टीएलसी के अधीन। लेन संख्याएं क्रोमैटोग्राम पर शिखर संख्याओं को संदर्भित करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: हल मिश्रित गैंग्लियोसाइड की टीएलसी प्लेट। हल मिश्रित गैंग्लियोसाइड्स मानकों (लेन 1) की टीएलसी प्लेट के साथ-साथ पोस्ट-सैपोनिफिकेशन विभाजित गैंग्लियोसाइड्स (लेन 2) और जारी फैटी एसिड (लेन 3) के साथ। गैंग्लियोसाइड्स सहित लिपिड, पी-एनिसाल्डिहाइड दाग के साथ पाए जाते हैं। मानक गैंग्लियोसाइड्स (ऊपर से नीचे तक) GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b और GT1b हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

छोटे और बड़े पैमाने पर गैंग्लियोसाइड निष्कर्षण और अलगाव के लिए विधियां यहां रिपोर्ट की गई अद्वितीय नहीं हैं - कई अलग-अलग विलायक निष्कर्षण और शुद्धिकरण दृष्टिकोण हैं जो उत्कृष्ट परिणाम प्रदान करते हैं12। मस्तिष्क से छोटे पैमाने पर शुद्धिकरण के लिए यहां रिपोर्ट किए गए तरीके, फ्रेडमैन और Svennerholm13 से, वसूली को अनुकूलित करने के लिए दिखाए गए थे और हमारी प्रयोगशाला में कई वर्षों में मजबूत और सीधा साबित हुए हैं। टीएलसी और एमएस के लिए उपयुक्त अलगाव और शुद्धिकरण को कुछ घंटों में बरकरार ऊतक से अलग-थलग गैंग्लियोसाइड्स तक आसानी से पूरा किया जा सकता है। एमएस नकारात्मक मोड में देशी शुद्ध गैंग्लियोसाइड्स पर या सकारात्मक मोड में permethylation के बाद किया जा सकता है (चित्रा 7, उदाहरण के लिए, Sturgill et al.9 देखें)। उपज बहुत सुसंगत है, ≈ 1 μmol ganglioside (≈ 2 μmol ganglioside-बाध्य sialic एसिड) प्रति जी ताजा मस्तिष्क ऊतक अधिकांश स्तनधारियों के लिए. मस्तिष्क से बड़े पैमाने पर निष्कर्षण और विभाजन के लिए विधि, टेटामानी एट अल.14 द्वारा पेश की गई, पहले विभाजन (ईथर-टेट्राहाइड्रोफुरान-पानी) पर गैंग्लियोसाइड-युक्त विलायक की मात्रा को कम करने के लिए चुना गया है। यह बाद के चरणों को सरल बनाता है जो उन तकनीकों के साथ बोझिल हो सकते हैं जो पहले चरणों में विभाजित गैंग्लियोसाइड्स की बड़ी मात्रा उत्पन्न करते हैं। एचपीएलसी विधि का वर्णन किया गया है, गज़ोटी एट अल.15 से, अपेक्षाकृत उच्च क्षमता और प्रमुख मस्तिष्क गैंग्लियोसाइड्स का अच्छा संकल्प है।

वर्णित छोटे पैमाने पर प्रोटोकॉल कोशिकाओं और ऊतकों दोनों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं और स्केलेबल हैं। चूंकि अंतिम चरण मेथनॉल में रिवर्स-फेज कैप्चर, वाष्पीकरण और पुन: समाधान हैं, इसलिए उन्हें छोटे नमूनों जैसे सुसंस्कृत तंत्रिका कोशिकाओं के लिए मनमाने पैमाने पर लागू किया जा सकता है। इस मामले में, हम सुविधा के लिए 1 मिलीलीटर पानी में कोशिकाओं को स्क्रैप और होमोजेनाइज़ करते हैं और निष्कर्षण और फिर विभाजन के लिए उपयुक्त अनुपात उत्पन्न करने के लिए मेथनॉल और क्लोरोफॉर्म के साथ आगे बढ़ते हैं। रिवर्स चरण के बाद अंतिम सूखे गैंग्लियोसाइड्स को केवल कुछ माइक्रोलीटर में फिर से हल किया जा सकता है और टीएलसी और एमएस द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है।

विलायक अनुपात पर ध्यान निष्कर्षण और विलायक विभाजन में सफलता के लिए महत्वपूर्ण है ganglioside अलगाव के लिए कदम विभाजन. छोटे पैमाने पर निष्कर्षण और विभाजन के लिए, विभिन्न क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल-पानी के अनुपात का परीक्षण किया गया था और जो मात्रात्मक गैंग्लियोसाइड अलगाव के पास उत्पन्न हुए थे, उन्हें यहां 13 बताया गया है। वर्णित अनुपातों से भिन्नताएं वसूली और / या शुद्धिकरण को कम कर देंगी। इसी तरह, टीएलसी विकासशील सॉल्वैंट्स में विलायक अनुपात पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है। क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल-पानी के अनुपात ने एक एकल स्पष्ट चरण में परिणाम की सूचना दी। छोटी विविधताएं बादल विकासशील समाधान उत्पन्न कर सकती हैं जिनका उपयोग नहीं किया जाना चाहिए, लेकिन घूमते हुए मेथनॉल के ड्रॉपवाइज जोड़ द्वारा स्पष्ट किया जा सकता है। यद्यपि विभिन्न निष्कर्षण और विभाजन सॉल्वैंट्स आम हैं, विलायक अनुपात को प्रत्येक भिन्नता 12 के लिए सावधानीपूर्वक पालन किया जाना चाहिए। टीएलसी सॉल्वैंट्स में परिवर्तन भी विशिष्ट गैंग्लियोसाइड्स 16 के अलगाव को अनुकूलित करने के लिए आम हैं। गैंग्लियोसाइड्स के टीएलसी माइग्रेशन को संशोधित करने का एक अपेक्षाकृत सरल तरीका विलायक मिश्रण के जलीय चरण को बदलना है। पोटेशियम क्लोराइड के बजाय जलीय अमोनियम हाइड्रॉक्साइड या कैल्शियम क्लोराइड का उपयोग करने से गैंग्लियोसाइड नमक के रूप और सापेक्ष टीएलसी माइग्रेशन 17 बदल जाता है।

जबकि सभी कशेरुक कोशिकाएं और ऊतक गैंग्लियोसाइड्स को व्यक्त करते हैं, मस्तिष्क और तंत्रिका कोशिकाएं व्यक्त की गई उच्च मात्रा में असामान्य होती हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल अन्य ऊतकों और कोशिकाओं पर लागू होते हैं, लेकिन अन्य लिपिड के साथ कम बहुतायत और संभावित संदूषण के कारण संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है। मानव न्यूट्रोफिल 6 और माउस वसा 18 पर लागू इन विधियों के रूप में उदाहरण प्रदान करते हैं।

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Disclosures

लेखकों का दावा है कि कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) कॉमन फंड फॉर ग्लाइकोसाइंस अनुदान U01CA241953 द्वारा समर्थित किया गया था। एमजेपी को जॉन्स हॉपकिन्स (T32GM080189) में रसायन विज्ञान-जीव विज्ञान इंटरफ़ेस कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine brain, stripped PelFreez 57105-1
Ganglioside standards Matreya GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063
Glass bottle with PTFE-lined cap Fisher Scientific 02-911-739
Glass centrifuge bottle Fisher Scientific 05-586B
Glass culture tubes, 16 x 125 mm VWR 60825-430 for collecting HPLC fractions
Glass separatory funnel (2 L) Pyrex 6400-2L
Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 µl Hamilton 81265
p-Anisaldehyde, 98% Sigma-Aldrich  A88107
Potter-Elvhjem Homogenizer Fisher Scientific 08-414-14A Choose appropriate volume option
Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns Analytics-Shop AAVRS1N-100540-5
Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column Analytics-Shop custom packed other sizes available
Resorcinol Sigma-Aldrich 30752-1
Rotary evaporator Buchi R-300
Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml) Sigma-Aldrich 57632
Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) Waters WAT043350
Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg Waters WAT036810
Spotting syringe - Hamilton 701N 10 µl Hamilton 80300
Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps Fisher Scientific 14-933A
Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps Fisher Scientific 14-955-323 For ganglioside storage
TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat Fisher Scientific M1056350001 Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface
TLC reagent sprayer Fisher Scientific 05-723-26A
TLC running chamber for 10 x 10 cm plates Camag 22.5155
Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender Waring E8520

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References

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जैव रसायन अंक 169 ग्लाइकोलिपिड्स ग्लाइकोस्फिंगोलिपिड्स गैंग्लियोसाइड्स सियालिक एसिड मस्तिष्क पतली परत क्रोमैटोग्राफी उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी
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Porter, M. J., Zhang, G. L., Schnaar, R. L. Ganglioside Extraction, Purification and Profiling. J. Vis. Exp. (169), e62385, doi:10.3791/62385 (2021).

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