Summary
I gangliosidi sono glicosfingolipidi contenenti acido sialico che sono particolarmente abbondanti nel cervello. La loro natura anfipatica richiede tecniche di estrazione e purificazione organiche/acquose per garantire un recupero ottimale e analisi accurate. Questo articolo fornisce una panoramica dell'estrazione, della purificazione e dell'analisi della cromatografia su ganglioside su scala analitica e preparativa.
Abstract
I gangliosidi sono glicosfingolipidi che contengono uno o più residui di acido sialico. Si trovano su tutte le cellule e i tessuti dei vertebrati, ma sono particolarmente abbondanti nel cervello. Espressi principalmente sul foglietto esterno delle membrane plasmatiche delle cellule, modulano le attività delle proteine di superficie cellulare tramite associazione laterale, agiscono come recettori nelle interazioni cellula-cellula e sono bersagli per agenti patogeni e tossine. La disregolazione genetica della biosintesi dei gangliosidi nell'uomo provoca gravi disturbi congeniti del sistema nervoso. A causa della loro natura anfipatica, l'estrazione, la purificazione e l'analisi dei gangliosidi richiedono tecniche che sono state ottimizzate da molti ricercatori negli 80 anni dalla loro scoperta. Qui descriviamo i metodi a livello di banco per l'estrazione, la purificazione e le analisi qualitative e quantitative preliminari dei principali gangliosidi da tessuti e cellule che possono essere completati in poche ore. Descriviamo anche metodi per l'isolamento e la purificazione su larga scala delle principali specie di ganglioside dal cervello. Insieme, questi metodi forniscono accesso analitico e su scala preparativa a questa classe di molecole bioattive.
Introduction
I gangliosidi sono definiti come glicosfingolipidi portatori di uno o più residui di acido sialico1. Sono espressi principalmente sulla superficie cellulare con la loro porzione lipidica idrofobica ceramide incorporata nel foglietto esterno della membrana plasmatica e i loro glicani idrofili che si estendono nello spazio extracellulare2. Sebbene ampiamente distribuiti nelle cellule e nei tessuti dei vertebrati, sono particolarmente abbondanti nel cervello dei vertebrati3, dove sono stati scoperti e nominati per la prima volta4.
Le strutture dei gangliosidi glicani variano e sono alla base della loro nomenclatura (Figura 1). I glicani gangliosidici sono costituiti da un nucleo di zucchero neutro con diversi numeri e distribuzioni di acidi sialici. Il ganglioside più piccolo, GM4, ha solo due zuccheri (acido sialico legato al galattosio)5. I gangliosidi naturali più grandi possono contenere ben oltre una dozzina di zuccheri totali6 o fino a sette acidi sialici su un singolo nucleo neutro7. Anche le loro parti lipidiche di ceramide variano, avendo diverse lunghezze di sfingosina e una varietà di ammidi di acidi grassi. Nel cervello dei vertebrati predominano quattro specie di gangliosidi, GM1, GD1a, GD1b e GT1b. L'espressione del ganglioside è regolata dallo sviluppo, specifica del tessuto e specifica del tipo cellulare.
Figura 1: Principali gangliosidi cerebrali e loro precursori biosintetici. Le strutture sono mostrate usando la nomenclatura dei simboli per Glycans11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
I gangliosidi funzionano a livello molecolare coinvolgendo e modulando le proteine nelle proprie membrane (regolazione cis) o coinvolgendo le proteine leganti i glicani nell'ambiente extracellulare, comprese le tossine batteriche e le lectine su altre cellule (trans riconoscimento)3. Il legame specifico dei gangliosidi alle proteine regolatrici e/o l'autoassociazione con altre molecole in zattere lipidiche provoca cambiamenti nel comportamento cellulare che influiscono sulla struttura e sulla funzione del sistema nervoso, sulla progressione del cancro, sul metabolismo, sull'infiammazione, sulle proteinopatie neuronali e sulle malattie infettive8. A causa dei loro diversi ruoli cellulari, i metodi per il loro isolamento e analisi possono fornire maggiori informazioni sulla regolazione dei processi fisiologici e patologici. Qui vengono forniti metodi convalidati per l'estrazione e l'analisi rapide su piccola scala e l'isolamento su scala preparativa dei gangliosidi dal cervello. Vengono discusse le opportunità e le sfide per l'applicazione ad altri tessuti.
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Protocol
La raccolta dei tessuti è stata eseguita alle condizioni autorizzate dal Johns Hopkins Animal Care and Use Committee.
1. Estrazione del ganglioside su piccola scala e purificazione parziale
ATTENZIONE: Utilizzare un'adeguata ventilazione quando si lavora con solventi volatili e tossici. Evitare la plastica in tutto; i solventi estrarranno componenti chimici da molte materie plastiche che interferiscono con le analisi successive. Il politetrafluoroetilene (PTFE) è un'eccezione; Le chiusure rivestite in PTFE devono essere utilizzate per tappare i flaconcini di stoccaggio in vetro.
- Estrazione
- Pesare un singolo cervello di topo fresco o scongelato (o mezzo cervello sagittale, ~ 0,2-0,5 g) e metterlo in un omogeneizzatore Potter-Elvehjem prechilled in un secchio di ghiaccio.
NOTA: cervelli precedentemente congelati possono essere utilizzati dopo lo scongelamento a 0-4 °C. - Aggiungere 4,1 ml per g di tessuto peso umido di acqua e omogeneizzare con 10 colpi.
NOTA: rapporti solventi accurati sono fondamentali per l'estrazione e la partizione ottimali, l'obiettivo è cloroformio-metanolo-acquoso (4: 8: 3) supponendo che il tessuto cerebrale sia acquoso all'80%. - Aggiungere 13 ml per g di peso umido di metanolo, passare alla temperatura ambiente (22 °C) e mescolare.
NOTA: la soluzione apparirà torbida. L'aggiunta di metanolo in questa fase, senza cloroformio, ottimizza la precipitazione delle proteine. Tutti i passaggi successivi sono a temperatura ambiente (22 °C). - Trasferire in un tubo di vetro a vite a parete spessa con tappo a vite rivestito in PTFE a temperatura ambiente (22 °C) e mescolare accuratamente. Aggiungere 6,5 ml per g di tessuto peso umido di cloroformio, cappuccio e mescolare accuratamente. Centrifuga a 450 x g per 15 min. Trasferire il surnatante trasparente in un nuovo tubo con tappo a vite e misurare il volume, "volume di estratto recuperato".
- Pesare un singolo cervello di topo fresco o scongelato (o mezzo cervello sagittale, ~ 0,2-0,5 g) e metterlo in un omogeneizzatore Potter-Elvehjem prechilled in un secchio di ghiaccio.
- Partizione
- Aggiungere 0,173 volte il "volume di estratto recuperato" di acqua al surnatante trasparente, al cappuccio, al vortice vigorosamente e alla centrifuga come descritto al punto 1.1.4.
NOTA: L'obiettivo è quello di avere cloroformio-metanolo-acquoso nel rapporto 4:8:5.6. La miscela sarà torbida e si risolverà in due fasi: una fase superiore ricca di acqua e una fase inferiore ricca di cloroformio con un rapporto ~ 4: 1. Attendere 60 minuti o centrifugare a 450 x g per 15 minuti per la completa separazione di fase. - Trasferire la fase superiore, che contiene i gangliosidi, in un tubo di vetro fresco con un tappo a vite rivestito in PTFE.
- Aggiungere 0,173 volte il "volume di estratto recuperato" di acqua al surnatante trasparente, al cappuccio, al vortice vigorosamente e alla centrifuga come descritto al punto 1.1.4.
- Cromatografia a cartuccia in fase inversa
- Utilizzando una siringa di vetro da 5 ml, lavare una cartuccia di estrazione in fase solida tC18 (400 mg) con 3 ml di metanolo, quindi 3 ml di cloroformio-metanolo-acqua (2:43:55). Caricare la fase superiore dal passaggio 1.2.2 sulla cartuccia tC18 utilizzando la stessa siringa di vetro, raccogliere il flusso passante e ricaricarlo sulla colonna per ottimizzare l'adsorbimento.
- Utilizzando la siringa di vetro, lavare la cartuccia con 3 mL di cloroformio-metanolo-acqua (2:43:55), quindi 3 ml di metanolo-acqua (1:1).
- Eluire i gangliosidi con 3 ml di metanolo in un nuovo tubo tappo a vite. Evaporare a secco sotto un leggero flusso di azoto a ≤ 45 °C. Sciogliere in metanolo a 1 ml per g di peso umido del tessuto originale.
2. Estrazione e purificazione del ganglioside su larga scala
ATTENZIONE: Quando si lavora con solventi volatili, utilizzare frullatori resistenti alle esplosioni. Non utilizzare materie plastiche ad eccezione del PTFE. Tetraidrofurano, cloroformio ed etere etilico sono composti organici volatili tossici. Lavora in una cappa aspirante con guanti protettivi e occhiali di sicurezza.
- Estrazione
- Scongelare il cervello bovino congelato a 4 °C per diverse ore. Seziona la materia grigia dalle meningi e dalla sostanza bianca.
NOTA: La seguente procedura è descritta per 100 ± 20 g di materia grigia cerebrale isolata ed è scalabile. - Mettere 100 g di materia grigia cerebrale in un frullatore e aggiungere 1 mL per g di peso cerebrale bagnato di tampone di fosfato di potassio refrigerato da 10 mM pH 6,8. Omogeneizzare su basso per 20 s. Aggiungere 8 ml di tetraidrofurano per g di peso umido cerebrale e omogeneizzare sul basso per 10 s. Decantare in bottiglie di centrifuga di vetro e centrifugare a 5.000 x g per 15 minuti a temperatura ambiente (22 °C).
- Raccogliere il surnatante, misurarne il volume e trasferirlo in un imbuto separatore di vetro. Aggiungere 0,3 mL di etere etilico per mL del surnatante. Agitare vigorosamente, quindi lasciare riposare indisturbati per 30 minuti durante i quali due fasi, una fase etere superiore e una fase acquosa inferiore, si separano. Raccogliere la fase inferiore, che contiene i gangliosidi, in una bottiglia di vetro con un tappo rivestito in PTFE.
- Alla fase superiore (etere) che rimane nell'imbuto separatore, aggiungere 0,1 ml di acqua per mL di surnatante originale (passaggio 2.1.3). Agitare vigorosamente, lasciare che le fasi si separino, raccogliere la fase inferiore (acquosa) e combinarla con la fase inferiore precedente. Evaporare le fasi inferiori combinate in polvere secca e pesare.
- Scongelare il cervello bovino congelato a 4 °C per diverse ore. Seziona la materia grigia dalle meningi e dalla sostanza bianca.
- Saponificazione
- Aggiungere 10 mL di 100 mM di NaOH acquoso per g di polvere in un tubo sigillato. Mescolare e incubare a 37 °C per 3 h. Lasciare raffreddare e regolare a pH 4,5 con l'aggiunta a goccia di 100 mM di HCl acquoso. Misurare il volume e trasferirlo in un imbuto separatore di vetro.
NOTA: Gli acidi sialici sono acido labile; evitare l'acidificazione al di sotto del pH 4,5. - In base al volume acquoso, aggiungere 2,67 volumi di metanolo, mescolare delicatamente, quindi aggiungere 1,33 volumi di cloroformio per creare una soluzione monofase di cloroformio-metanolo-acquoso (4:8:3). Mescolare bene.
- Sulla base del volume acquoso originale, aggiungere 2,6 volumi di acqua per portare la miscela a cloroformio-metanolo-acquoso in un rapporto di 4:8:5,6. Agitare vigorosamente, quindi lasciare riposare indisturbati per separare due fasi, una fase superiore polare contenente i gangliosidi e una fase inferiore non polare. Raccogliere la fase superiore in una bottiglia di vetro con un tappo rivestito in PTFE.
NOTA: I lipidi non sialilati non appariranno su lastre di cromatografia a strato sottile (TLC) colorate con resorcinolo, ma appariranno quando si utilizza una colorazione di p-anisaldeide. Lo scopo di questa saponificazione è quello di rimuovere i composti O-acetilati come i fosfolipidi.
- Aggiungere 10 mL di 100 mM di NaOH acquoso per g di polvere in un tubo sigillato. Mescolare e incubare a 37 °C per 3 h. Lasciare raffreddare e regolare a pH 4,5 con l'aggiunta a goccia di 100 mM di HCl acquoso. Misurare il volume e trasferirlo in un imbuto separatore di vetro.
- Cromatografia in fase inversa
- Prelavare una cartuccia di estrazione in fase solida tC18 su larga scala (10 g) facendo passare 50 ml di ciascuno dei seguenti tre solventi attraverso la colonna usando vuoto o pressione (<1 min ogni lavaggio): metanolo, metanolo-acqua (1:1), quindi cloroformio-metanolo-acqua (2:43:55). Caricare la fase superiore dal passaggio 2.2.3 sulla colonna mediante vuoto o pressione, raccogliere il flusso, ricaricare e raccogliere il flusso attraverso.
- Lavare la colonna con 30 ml di cloroformio-metanolo-acqua (2:43:55), quindi 30 ml di metanolo-acqua (1:1), quindi eluire i gangliosidi con 50 ml di metanolo e di nuovo con 10 ml di metanolo, raccogliendo ogni lavaggio e ogni eluizione separatamente. L'uso di TLC (sotto) conferma che il ganglioside è assente dal flusso attraverso e lava ed eluito nella prima eluizione (50 ml di metanolo). Evaporare i gangliosidi eluiti in polvere secca e pesare.
NOTA: Lo scopo della cromatografia tC18 è quello di separare i gangliosidi da un numero sempre minore di contaminanti polari. La resa mista di ganglioside cerebrale dopo saponificazione è di ~ 120 mg per g di estratto secco di cervello (fase 2.1.4). La comparsa di gangliosidi da parte di TLC nel flusso attraverso o lava indica che la colonna di estrazione in fase solida era satura. Dopo l'eluizione del metanolo, la colonna può essere ulteriormente eluita con cloroformio-metanolo (1:1) per catturare meno lipidi polari.
- Purificazione HPLC dei singoli gangliosidi
- Preparare il solvente HPLC A: tampone acquoso fosfato di sodio acetonitrile-5 mM pH 5,6 (83:17) e solvente B: tampone acetonitrile-20 mM fosfato di sodio, pH 5,6 (1:1). Degassare entrambi i solventi per 5 min.
- Pre-equilibrare una colonna HPLC (colonna 20 x 250 mm imballata con sfere di silice legate all'ammina (NH2), diametro 5 μm, dimensione dei pori 100 Å) con solvente A al 100% per 20 minuti a 5 ml / min. Impostare un rilevatore di effluenti a colonna UV HPLC su 215 nm.
- Sciogliere la polvere di ganglioside dall'eluato di fase inversa in acqua a 5 mg/ml. Iniettare 0,5 mL della miscela di gangliosidi sull'HPLC ed eseguire il gradiente del solvente (Tabella 1) a 5 ml/min, raccogliendo le frazioni. I gangliosidi appariranno come picchi A215 con tempi di ritenzione (gangliosidi cerebrali maggiori) di 25-70 min: GM1 ≈ 28 min; GD1a ≈ 38 min; GD1b ≈ 46 min; GT1b ≈ 65 min. Riequilibrare 20 minuti con solvente A dopo ogni corsa. Analizzare le frazioni mediante cromatografia a strato sottile.
| Tempo (min) | %A | %B |
| 0 | 100 | 0 |
| 7 | 100 | 0 |
| 12 | 63 | 37 |
| 82 | 54 | 46 |
| 82.01 | 0 | 100 |
| 92 | 0 | 100 |
Tabella 1: Gradiente del solvente per HPLC.
3. Analisi cromatografica su strato sottile (TLC) dei gangliosidi
ATTENZIONE: Il cloroformio è un composto organico volatile tossico. Lavora in una cappa aspirante con guanti protettivi e occhiali di sicurezza.
- Preparazione di solventi e piastre TLC in esecuzione
- Preparare un solvente corrente di cloroformio-metanolo-acquoso 0,25% KCl (60:35:8 in volume). Versare in una camera TLC di vetro di 10 cm x 10 cm con un coperchio in acciaio inossidabile in modo che la profondità del solvente sia di ~ 0,5 cm. Coprire e lasciare equilibrare in un'area priva di correnti d'aria per >10 min.
NOTA: per isolare la camera TLC dalle correnti d'aria, è possibile costruire o acquistare una scatola acrilica a 5 lati (Figura 2). Non utilizzare carta da filtro satura di solvente all'interno della camera. - Posizionare una piastra TLC ad alte prestazioni rivestita in gel di silice da 10 cm x 10 cm o 10 cm in un forno di essiccazione a 125 °C per 10 minuti. Lasciare raffreddare. Utilizzare una matita #2 opaca per disegnare linee di spotting da 5 mm con separazioni di 2 mm lungo una linea 1 cm sopra il fondo della piastra e almeno 1 cm da entrambi i lati (Figura 3). Evitare di disturbare lo strato di silice durante la marcatura.
- Preparare una miscela standard di gangliosidi puri in metanolo contenente 100 μM GM1, 50 μM ciascuno di GD1a e GD1b e 33 μM di GT1b.
NOTA: Questa miscela contiene 100 pmol di acido ganglioside sialico per μL per ciascuno dei quattro gangliosidi, una quantità che fornisce un forte segnale colorimetrico mediante colorazione del resorcinolo, che è dipendente dall'acido sialico.
- Preparare un solvente corrente di cloroformio-metanolo-acquoso 0,25% KCl (60:35:8 in volume). Versare in una camera TLC di vetro di 10 cm x 10 cm con un coperchio in acciaio inossidabile in modo che la profondità del solvente sia di ~ 0,5 cm. Coprire e lasciare equilibrare in un'area priva di correnti d'aria per >10 min.
- Risoluzione Ganglioside
- Lavare una siringa Hamilton da 10 μL con un ago smussato con metanolo. Aspirare 1 μL di metanolo in una siringa di vetro per riempire il volume morto dell'ago e quindi 1 μL di campione o standard. Posizionare il campione in modo uniforme sulle linee premarcate da 5 mm fino a quando <1 μL di solvente (metanolo) rimane nella siringa. Lasciare asciugare la piastra a temperatura ambiente (22 °C) dopo aver individuato tutti i campioni.
NOTA: Lavare la siringa con metanolo tra il carico del campione. Un soffiatore d'aria non riscaldato impostato a basso può essere utilizzato per accelerare l'essiccazione. - Posizionare la piastra maculata e asciugata nella camera TLC preequilibrata con il bordo inferiore immerso nel solvente in esecuzione e coprire e proteggere dalle correnti d'aria (Figura 2). Lasciare avanzare il solvente in esecuzione lungo la piastra per azione capillare fino a quando il fronte del solvente raggiunge entro 1 cm dalla parte superiore della piastra. Rimuovere e contrassegnare la parte anteriore del solvente sul bordo del piatto con una matita. Lasciare evaporare completamente i solventi indisturbati o sotto un flusso d'aria mite.
- Lavare una siringa Hamilton da 10 μL con un ago smussato con metanolo. Aspirare 1 μL di metanolo in una siringa di vetro per riempire il volume morto dell'ago e quindi 1 μL di campione o standard. Posizionare il campione in modo uniforme sulle linee premarcate da 5 mm fino a quando <1 μL di solvente (metanolo) rimane nella siringa. Lasciare asciugare la piastra a temperatura ambiente (22 °C) dopo aver individuato tutti i campioni.
Figura 2: Ganglioside TLC attrezzatura e configurazione. Una camera a doppio trogolo viene riempita per ≈ 0,5 cm su entrambi i lati con solvente corrente. La piastra è posizionata su un lato con l'estremità dell'origine immersa nel buffer di corsa. La camera è coperta da una scatola acrilica per evitare correnti d'aria. Pannello A, vista laterale prima dell'inserimento della piastra. Il livello del solvente è visibile a pochi mm sopra il fondo della camera; Pannello B, vista frontale durante lo sviluppo. Il fronte del solvente è visibile a circa il 40% della strada verso l'alto della piastra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Colorazione ganglioside
ATTENZIONE: Le macchie di reagenti sono tossiche. L'acido cloridrico è corrosivo e tossico. Preparare e spruzzare i reagenti in una cappa aspirante con guanti protettivi e occhiali di sicurezza.
NOTA: la piastra può essere fotografata per un'analisi qualitativa dell'immagine o memorizzata rimuovendo i morsetti e fissando la piastra di copertura in posizione con nastro trasparente. L'analisi quantitativa può essere eseguita misurando la densitometria degli standard gangliosidici individuati nelle corsie adiacenti.- Preparare il reagente spray resorcinolo per la rilevazione dei gangliosidi in base ai loro acidi sialici. Sciogliere 6 g di resorcinolo in 100 ml di acqua per un brodo di resorcinolo al 6%. Sciogliere 1 g di CuSO4 in 100 ml di acqua per ottenere un brodo all'1%. A 64,7 mL di acqua aggiungere 5 mL del 6% di resorcinolo stock, 0,31 mL dello stock 1% CuSO4 quindi aggiungere lentamente 30 mL di HCl concentrato e mescolare delicatamente. Può essere conservato a 4 °C per un mese.
- In una cappa aspirante chimica, posizionare la piastra TLC con gangliosidi risolti, origine fine, in una scatola di cartone tagliata per proteggere le pareti della cappa dallo spruzzo acido. Posizionare il reagente spray resorcinolo in uno spruzzatore TLC di vetro, collegarlo a una fonte di azoto pressurizzato e spruzzare leggermente la piastra diagonalmente nelle direzioni verticale e orizzontale. Spruzzare la superficie assorbente TLC in modo uniforme, ma leggero.
- Coprire immediatamente la piastra con una piastra di copertura in vetro asciutta e pulita delle stesse dimensioni e fissare la piastra di copertura in posizione con clip leganti (Figura 3). Riscaldare la piastra coperta a 125 °C per 20 min. I gangliosidi appariranno viola scuro su uno sfondo bianco.
NOTA: la piastra non deve apparire bagnata al termine della spruzzatura. Le piastre di copertura possono essere modellate raschiando l'assorbente da piastre TLC precedentemente utilizzate utilizzando una lama di rasoio a bordo singolo.
ATTENZIONE: La polvere di silice è tossica per i polmoni. Utilizzare una maschera e smaltire la silice in un contenitore sigillato.
Figura 3: Piastra TLC di ganglioside misto risolto. Piastra TLC di standard di ganglioside misto risolto (corsia di sinistra) e gangliosidi misti di materia grigia bovina purificati (corsia di destra) dopo la colorazione e il riscaldamento del resorcinolo con piastra di copertura in vetro tagliata in posizione. I gangliosidi standard (dall'alto verso il basso) sono GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b, GT1b e GQ1b. Dopo il raffreddamento, la piastra può essere fotografata e/o la piastra di copertura fissata in posizione per la conservazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Colorazione lipidica generale per gangliosidi e fosfolipidi.
ATTENZIONE: l'acido solforico è tossico e corrosivo. L'aggiunta di acido concentrato all'etanolo è esotermica e deve essere fatta lentamente. Preparare il reagente colorante in una cappa aspirante con guanti protettivi e occhiali di sicurezza.- Preparare la colorazione di p-anisaldeide aggiungendo lentamente 15 ml di acido solforico concentrato a 500 ml di etanolo. Mescolare per 30 minuti per lasciare raffreddare la soluzione prima di procedere. Aggiungere 15 ml di p-anisaldeide e mescolare delicatamente. Questo può essere conservato a temperatura ambiente (22 °C) fino a sei mesi.
- In una cappa chimica, immergere la piastra TLC con gangliosidi risolti, estremità dell'origine verso il basso, in un becher contenente la macchia di p-anisaldeide. Immergiti nella parte anteriore di corsa per ≥ 2 s. Rimuovere TLC dalla macchia e lasciare scolare. Riscaldare la piastra TLC su una piastra calda a bassa temperatura per svilupparsi.
NOTA: i lipidi appariranno scuri su uno sfondo viola. La soluzione colorante può essere recuperata per un uso ripetuto.
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Representative Results
I metodi descritti nella sezione 1 (piccola scala) forniscono gangliosidi in quantità e purezza sufficienti per la determinazione qualitativa e quantitativa dei principali gangliosidi cerebrali. Il recupero dal cervello del topo è ~ 1 μmol ganglioside per g di peso cerebralmente bagnato (1 nmol / μL) quando preparato come descritto. La risoluzione TLC di 1 μL (1 nmol) utilizzando la sezione 3 fornisce ampio materiale per il rilevamento del resorcinolo e risolve tutti i principali gangliosidi cerebrali come mostrato per topi selvatici e geneticamente modificati nella Figura 4. Sebbene i gangliosidi misti preparati utilizzando la sezione 1 non siano privi di altri lipidi principali, i gangliosidi sono di purezza sufficiente per la determinazione spettrometrica di massa (SM), come mostrato nella Figura 5, sia come gangliosidi purificati nativi in modalità negativa che dopo permetilazione in modalità positiva9. Poiché il paragrafo 1 evita l'idrolisi alcalina per rimuovere i fosfolipidi, conserva le modificazioni naturali sensibili agli alcali, come gli acidi sialici O-acetilati (vedere GT1b-OAc, Figura 4)9.
Figura 4: TLC di gangliosidi cerebrali di topo. TLC di gangliosidi cerebrali di topo da topi wild-type (WT) e St3gal single e double-null purificati come nel Protocollo 1. Questa cifra è stata modificata da Sturgill et al, 20129. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: SM di gangliosidi cerebrali di topo wild-type permetilati e St3gal2/3-double-null purificati come nella sezione 1. Si noti che GD1a e GD1b si risolvono per TLC (Figura 4) ma hanno la stessa massa, quindi non sono distinguibili da MS unidimensionale. Questa cifra è stata modificata da Sturgill et al, 20129. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La purificazione su larga scala (sezione 2) comprende l'estrazione, la saponificazione (per rimuovere i fosfolipidi) e la risoluzione HPLC per fornire gangliosidi cerebrali principali purificati GM1, GD1a, GD1b e GT1b adatti per esperimenti biologici e per ulteriori modifiche chimiche ed enzimatiche. Un profilo HPLC esemplare e la successiva analisi TLC sono mostrati nella Figura 6. Il trattamento alcalino (saponificazione) è necessario in questo protocollo per idrolizzare e rimuovere i fosfolipidi contaminanti (Figura 7) ma idrolizzerà anche le modificazioni naturali dei gangliosidi, come gli acidi sialici O-acetilati, che possono essere importanti in alcuni contesti10. Per queste applicazioni, sono stati pubblicati metodi alternativi efficaci per la rimozione dei fosfolipidi dai gangliosidi isolati6.
Figura 6: HPLC rappresentativo dei gangliosidi cerebrali bovini. Il gradiente di eluizione (%B, linea tratteggiata) è sovrapposto all'assorbanza (A215, linea continua) per i primi 75 minuti del ciclo. I picchi (A215) sono stati raccolti (numeri tra parentesi) e sottoposti a TLC come nel Protocollo 3. I numeri di corsia si riferiscono ai numeri di picco sul cromatogramma. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Piastra TLC di ganglioside misto risolto. Piastra TLC di standard di gangliosidi misti risolti (corsia 1) insieme a gangliosidi partizionati post-saponificazione (corsia 2) e acidi grassi rilasciati (corsia 3). I lipidi, compresi i gangliosidi, vengono rilevati con la colorazione di p-anisaldeide. I gangliosidi standard (dall'alto verso il basso) sono GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b e GT1b. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I metodi per l'estrazione e l'isolamento del ganglioside su piccola e grande scala qui riportati non sono unici: ci sono molti diversi approcci di estrazione e purificazione con solvente che forniscono risultati eccellenti12. I metodi riportati qui per la purificazione su piccola scala dal cervello, da Fredman e Svennerholm13, hanno dimostrato di ottimizzare il recupero e hanno dimostrato di essere robusti e diretti per molti anni nel nostro laboratorio. L'isolamento e la purificazione adatti a TLC e SM possono essere prontamente completati, dal tessuto intatto ai gangliosidi isolati, in poche ore. La SM può essere eseguita su gangliosidi purificati nativi in modalità negativa o dopo permetilazione in modalità positiva (Figura 7, ad esempio, vedi Sturgill et al.9). La resa è molto consistente, ≈ 1 μmol ganglioside (≈ 2 μmol ganglioside-bound acido sialico) per g di tessuto cerebrale fresco per la maggior parte dei mammiferi. Il metodo per l'estrazione su larga scala e la partizione dal cervello qui riportato, introdotto da Tettamani et al.14, è selezionato per ridurre al minimo il volume di solvente contenente ganglioside alla prima partizione (etere-tetraidrofurano-acqua). Ciò semplifica i passaggi successivi che possono diventare ingombranti con tecniche che generano grandi volumi di gangliosidi partizionati ai primi passi. Il metodo HPLC descritto, da Gazzotti et al.15, ha una capacità relativamente elevata e una buona risoluzione dei principali gangliosidi cerebrali.
I protocolli su piccola scala descritti sono adatti sia per le cellule che per i tessuti e sono scalabili. Poiché le fasi finali sono la cattura in fase inversa, l'evaporazione e la ridissoluzione in metanolo, possono essere applicate su scala arbitraria a piccoli campioni, come le cellule nervose coltivate. In questo caso, raschiamo e omogeneizziamo le cellule in 1 mL di acqua per comodità e procediamo con l'aggiunta di metanolo e cloroformio per generare i rapporti appropriati per l'estrazione e quindi la partizione. I gangliosidi essiccati finali dopo fase inversa possono essere risolati in pochi microlitri e analizzati da TLC e MS.
L'attenzione ai rapporti di solvente è fondamentale per il successo nelle fasi di estrazione e partizionamento del solvente per l'isolamento del ganglioside. Per l'estrazione e la partizionamento su piccola scala, sono stati testati diversi rapporti cloroformio-metanolo-acqua e quelli che hanno generato un isolamento ganglioside quasi quantitativo sono riportati qui13. Variazioni rispetto ai rapporti descritti diminuiranno il recupero e/o la purificazione. Allo stesso modo, l'attenzione ai rapporti solventi nello sviluppo di solventi TLC è fondamentale. I rapporti cloroformio-metanolo-acqua riportati si traducono in un'unica fase chiara. Piccole variazioni possono produrre soluzioni di sviluppo torbide che non dovrebbero essere utilizzate, ma possono essere chiarite con l'aggiunta a goccia di metanolo con vortice. Sebbene siano comuni diversi solventi di estrazione e partizione, i rapporti di solvente devono essere attentamente seguiti per ogni variazione12. Alterazioni nei solventi TLC sono anche comuni per ottimizzare la separazione di gangliosidi specifici16. Un modo relativamente semplice per modificare la migrazione TLC dei gangliosidi è quello di cambiare la fase acquosa della miscela di solventi. L'uso di idrossido acquoso di ammonio o cloruro di calcio al posto del cloruro di potassio altera la forma del sale gangliosidico e la relativa migrazione di TLC17.
Mentre tutte le cellule e i tessuti vertebrati esprimono gangliosidi, il cervello e le cellule nervose sono insoliti nelle elevate quantità espresse. I protocolli qui descritti sono applicabili ad altri tessuti e cellule, ma possono essere necessarie modifiche a causa della minore abbondanza e della potenziale contaminazione con altri lipidi. Questi metodi applicati ai neutrofili umani6 e all'adiposo di topo18 forniscono esempi.
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Disclosures
Gli autori non rivendicano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione U01CA241953 del National Institutes of Health (NIH). MJP è stato supportato dal Chemistry-Biology Interface Program presso Johns Hopkins (T32GM080189).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine brain, stripped | PelFreez | 57105-1 | |
| Ganglioside standards | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| Glass bottle with PTFE-lined cap | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| Glass centrifuge bottle | Fisher Scientific | 05-586B | |
| Glass culture tubes, 16 x 125 mm | VWR | 60825-430 | for collecting HPLC fractions |
| Glass separatory funnel (2 L) | Pyrex | 6400-2L | |
| Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 µl | Hamilton | 81265 | |
| p-Anisaldehyde, 98% | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Potter-Elvhjem Homogenizer | Fisher Scientific | 08-414-14A | Choose appropriate volume option |
| Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns | Analytics-Shop | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column | Analytics-Shop | custom packed | other sizes available |
| Resorcinol | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-300 | |
| Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml) | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) | Waters | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg | Waters | WAT036810 | |
| Spotting syringe - Hamilton 701N 10 µl | Hamilton | 80300 | |
| Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-933A | |
| Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-955-323 | For ganglioside storage |
| TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat | Fisher Scientific | M1056350001 | Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface |
| TLC reagent sprayer | Fisher Scientific | 05-723-26A | |
| TLC running chamber for 10 x 10 cm plates | Camag | 22.5155 | |
| Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender | Waring | E8520 |
References
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