Summary
강글리오사이드는 시알산 함유 글리코스핑고지질로서 뇌에 특히 풍부하다. 양친매성 성질은 최적의 회수와 정확한 분석을 보장하기 위해 유기/수성 추출 및 정제 기술을 필요로 합니다. 이 기사에서는 분석 및 분취 스케일 강글리오사이드 추출, 정제 및 박층 크로마토그래피 분석에 대한 개요를 제공합니다.
Abstract
강글리오시드는 하나 이상의 시알산 잔기를 함유하는 글리코스핑고지질이다. 그들은 모든 척추 동물 세포와 조직에서 발견되지만 특히 뇌에 풍부합니다. 주로 세포의 원형질막의 외부 전단지에서 발현되며, 측면 연결을 통해 세포 표면 단백질의 활동을 조절하고 세포 - 세포 상호 작용에서 수용체 역할을하며 병원균 및 독소의 표적입니다. 인간에서 강글리오사이드 생합성의 유전적 조절은 심각한 선천성 신경계 장애를 초래한다. 양친매성 특성으로 인해 강글리오사이드의 추출, 정제 및 분석에는 발견 이후 80 년 동안 많은 연구자가 최적화 한 기술이 필요합니다. 여기에서는 몇 시간 안에 완료 할 수있는 조직 및 세포에서 주요 강글리오사이드의 추출, 정제 및 예비 정성 및 정량 분석을위한 벤치 수준의 방법을 설명합니다. 우리는 또한 뇌에서 주요 강글리오사이드 종의 대규모 분리 및 정제를위한 방법을 설명합니다. 함께, 이러한 방법은 생리 활성 분자의이 클래스에 대한 분석 및 준비 규모 액세스를 제공합니다.
Introduction
강글리오시드는 하나 이상의 시알산 잔기를 보유하는 글리코스핑고지질1로 정의된다. 이들은 주로 원형질막의 외부 전단지에 매립된 그들의 소수성 세라미드 지질 모이어티와 세포외 공간으로 연장되는 그들의 친수성 글리칸과 함께 세포 표면에서 발현된다2. 척추 동물 세포와 조직에 널리 분포되어 있지만, 척추 동물의 뇌3에 특히 풍부하며, 처음 발견되어 명명되었습니다4.
강글리오사이드 글리칸의 구조는 다양하며 그 명명법의 기초가 됩니다(그림 1). Ganglioside 글리칸은 시알산의 다른 수와 분포를 지닌 중성 설탕 코어로 구성됩니다. 가장 작은 강글리오사이드인 GM4는 단 두 개의 설탕(갈락토오스에 결합된 시알산)5만을 가지고 있다. 더 큰 자연 발생 신경절은 단일 중성 코어에 수십 개의 총 설탕6 또는 최대 일곱 개의 시알산을 함유할 수 있습니다7. 이들의 세라미드 지질 모이어티는 또한 다양하며, 상이한 스핑고신 길이 및 다양한 지방산 아미드를 갖는다. 척추 동물의 뇌에서 네 개의 강글리오사이드 종, GM1, GD1a, GD1b 및 GT1b가 우세하다. 강글리오시드 발현은 발달적으로 조절되고, 조직 특이적이며, 세포 유형 특이적이다.
그림 1: 주요 뇌 신경절과 그들의 생합성 전구체. 구조는 Glycans11에 대한 기호 명명법을 사용하여 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
강글리오시드는 자신의 막에 단백질을 결합시키고 조절함으로써(시스 조절) 또는 다른 세포 상의 박테리아 독소 및 렉틴을 포함하는 세포외 환경에서 글리칸 결합 단백질을 결합시킴으로써(트랜스 인식)3 분자 수준에서 기능한다. 조절 단백질에 대한 강글리오사이드의 특이적 결합 및/또는 지질 뗏목으로의 다른 분자와의 자기 연관성은 신경계 구조 및 기능, 암 진행, 신진대사, 염증, 신경 단백질 병증 및 감염성 질환에 영향을 미치는 세포 행동의 변화를 초래한다8. 그들의 다양한 세포 역할 때문에, 그들의 분리 및 분석을위한 방법은 생리 학적 및 병리학 적 과정의 조절에 대한 향상된 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 여기에서는 신속한 소규모 추출 및 분석을위한 검증 된 방법과 뇌에서 강글리오사이드의 준비 규모 분리가 제공됩니다. 다른 조직에 적용 할 수있는 기회와 도전이 논의됩니다.
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Protocol
조직 수집은 존스 홉킨스 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인된 조건 하에서 수행되었다.
1. 소규모 강글리오사이드 추출 및 부분 정제
주의: 휘발성 및 독성 용매로 작업할 때는 적절한 환기를 사용하십시오. 플라스틱을 전체적으로 피하십시오. 용매는 후속 분석을 방해하는 많은 플라스틱에서 화학 성분을 추출합니다. 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)은 예외이고; PTFE 라인 클로저는 유리 저장 바이알을 캡핑하는 데 사용해야합니다.
- 추출
- 신선하거나 해동된 단일 마우스 뇌(또는 시상 반뇌, ~0.2-0.5 g)를 칭량하고 얼음 양동이에 미리 냉각된 포터-엘베젬 균질기에 넣는다.
참고 : 이전에 냉동 된 뇌는 0-4 °C에서 해동 한 후에 사용할 수 있습니다. - 젖은 물 중량 g 당 4.1 mL의 조직을 넣고 10 스트로크로 균질화하십시오.
참고 : 정확한 용매 비율은 최적의 추출 및 분할의 핵심이며, 뇌 조직이 80 % 수성이라고 가정하면 클로로포름 - 메탄올 - 수성 (4 : 8 : 3)이 목표입니다. - 조직 g 당 13 mL의 습윤 중량의 메탄올을 첨가하고, 주위 온도 (22°C)로 이동시키고, 혼합한다.
참고: 솔루션이 흐리게 나타납니다. 이 단계에서 메탄올을 클로로포름 없이 첨가하면 단백질 침전이 최적화됩니다. 모든 후속 단계는 주변 온도 (22 °C)에 있습니다. - 주변 온도 (22 °C)에서 PTFE 라이닝 스크류 캡이있는 두꺼운 벽 유리 스크류 캡 튜브로 옮기고 완전히 혼합하십시오. 젖은 중량의 조직 g 당 6.5 mL의 클로로포름, 뚜껑을 넣고 완전히 섞는다. 450 x g 에서 15분 동안 원심분리한다. 맑은 상청액을 신선한 스크류 캡핑 튜브로 옮기고 부피를 측정하여 "회수 된 추출물 부피"를 측정하십시오.
- 신선하거나 해동된 단일 마우스 뇌(또는 시상 반뇌, ~0.2-0.5 g)를 칭량하고 얼음 양동이에 미리 냉각된 포터-엘베젬 균질기에 넣는다.
- 파티션
- 단계 1.1.4에 기재된 바와 같이 0.173x "회수된 추출물 부피"의 물을 맑은 상청액, 캡, 와류에 격렬하게 첨가하고, 원심분리한다.
참고 : 목표는 클로로포름 - 메탄올 - 수성 비율을 4 : 8 : 5.6으로 갖는 것입니다. 혼합물은 흐려지고 두 단계로 분해됩니다 : 상부 수성-풍부 상과 ~ 4:1 비율의 하부 클로로포름 풍부 상. 완전한 상 분리를 위해 450 x g에서 60분 또는 원심분리기를 15분 동안 기다리십시오. - 강글리오사이드가 들어있는 상층을 PTFE가 늘어선 스크류 캡이있는 신선한 유리 튜브로 옮깁니다.
- 단계 1.1.4에 기재된 바와 같이 0.173x "회수된 추출물 부피"의 물을 맑은 상청액, 캡, 와류에 격렬하게 첨가하고, 원심분리한다.
- 역상 카트리지 크로마토그래피
- 5 mL 유리 주사기를 사용하여, tC18 고체상 추출 카트리지 (400 mg)를 3 mL의 메탄올로 세척한 다음, 3 mL의 클로로포름-메탄올-물 (2:43:55)로 세척하였다. 동일한 유리 주사기를 사용하여 단계 1.2.2의 상부 상을 tC18 카트리지 상에 로드하고, 유동 스루를 수집하고, 컬럼 상에 재로드하여 흡착을 최적화하십시오.
- 유리 주사기를 사용하여 카트리지를 3 mL의 클로로포름-메탄올-물(2:43:55)로 세척한 다음, 3 mL의 메탄올-물(1:1)로 세척한다.
- 강글리오사이드를 메탄올 3 mL로 신선한 스크류 캡핑된 튜브에 녹인다. ≤ 45°C에서 질소의 부드러운 스트림 하에서 건조로 증발시킨다. 원래 조직 습윤 중량의 g 당 1 mL의 메탄올에 용해시킨다.
2. 대규모 강글리오사이드 추출 및 정제
주의: 휘발성 용제로 작업할 때는 폭발 방지 블렌더를 사용하십시오. PTFE를 제외한 플라스틱은 사용하지 마십시오. 테트라하이드로퓨란, 클로로포름 및 에틸 에테르는 독성 휘발성 유기 화합물입니다. 보호 장갑과 안전 고글로 흄 후드에서 작업하십시오.
- 추출
- 소 뇌를 4°C에서 몇 시간 동안 해동시켰다. 수막과 백색 물질에서 회색 물질을 해부하십시오.
참고 : 다음 절차는 100 ± 20g의 분리 된 뇌 회색 물질에 대해 설명되며 확장 가능합니다. - 블렌더에 뇌 회색 물질 100g을 넣고 냉각된 10mM 인산칼륨 완충액 pH 6.8의 뇌 습윤 중량 g 당 1 mL를 첨가한다. 20 초 동안 낮게 균질화하십시오. 뇌 습윤 중량 g 당 8 mL의 테트라 하이드로 퓨란을 첨가하고 10 초 동안 낮게 균질화하십시오. 데칸트 유리 원심분리 병에 넣고 주변 온도 (22°C)에서 15분 동안 5,000 x g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 수집하고, 부피를 측정하고, 유리 분리 깔때기로 옮깁니다. 상청액의 mL당 0.3 mL의 에틸 에테르를 첨가한다. 격렬하게 흔들어 준 다음 30 분 동안 방해받지 않고 앉아있을 수 있도록 두 단계, 즉 상부 에테르 상과 하부 수성 상이 분리됩니다. 강글리오사이드가 들어있는 하부 상을 PTFE가 늘어선 캡이있는 유리 병에 넣으십시오.
- 분리 깔때기에 남아있는 상부 (에테르) 상에 원래 상청액 mL 당 0.1 mL의 물을 첨가한다 (단계 2.1.3). 격렬하게 흔들고, 위상을 분리하고, 하부 (수성) 상을 수집하고, 이전의 하부 단계와 결합하십시오. 결합 된 하부 상을 건조 분말로 증발시키고 무게를 측정하십시오.
- 소 뇌를 4°C에서 몇 시간 동안 해동시켰다. 수막과 백색 물질에서 회색 물질을 해부하십시오.
- 비누화
- 분말 g 당 100 mM 수성 NaOH 10 mL를 밀봉된 튜브에 첨가한다. 혼합하고 37°C에서 3시간 동안 인큐베이션한다. 냉각시키고 100 mM 수성 HCl을 적가하여 pH 4.5로 조정한다. 부피를 측정하고 유리 분리 깔때기로 옮긴다.
참고: 시알산은 산성 불안정성이다; pH 4.5 이하의 산성화를 피하십시오. - 수성 부피를 기준으로 2.67 부피의 메탄올을 첨가하고 부드럽게 혼합 한 다음 1.33 부피의 클로로포름을 첨가하여 클로로포름 - 메탄올 - 수성 (4 : 8 : 3)의 단상 용액을 만듭니다. 잘 섞는다.
- 원래의 수성 부피를 기준으로, 2.6 부피의 물을 첨가하여 혼합물을 클로로포름-메탄올-수성으로 4:8:5.6의 비율로 가져온다. 격렬하게 흔들어 놓은 다음 방해받지 않고 앉아서 두 개의 상, 즉 강글리오사이드를 포함하는 극성 상상과 비극성 하부 상을 분리하십시오. PTFE가 늘어선 캡이있는 유리 병에 상층을 수집하십시오.
참고: 비시알릴화 지질은 레조르시놀을 사용하여 염색된 박층 크로마토그래피(TLC) 플레이트에는 나타나지 않지만 p-아니스알데히드 염색을 사용할 때 나타납니다. 이러한 비누화의 목적은 인지질과 같은 O-아세틸화 화합물을 제거하는 것이다.
- 분말 g 당 100 mM 수성 NaOH 10 mL를 밀봉된 튜브에 첨가한다. 혼합하고 37°C에서 3시간 동안 인큐베이션한다. 냉각시키고 100 mM 수성 HCl을 적가하여 pH 4.5로 조정한다. 부피를 측정하고 유리 분리 깔때기로 옮긴다.
- 역상 크로마토그래피
- 대규모(10 g) tC18 고체상 추출 카트리지 50 mL를 진공 또는 압력을 사용하여 컬럼을 통해 다음 세 용매 각각을 통과시켜 예비세척(<1분): 메탄올, 메탄올-물(1:1), 이어서 클로로포름-메탄올-물(2:43:55). 단계 2.2.3에서 상부 상을 진공 또는 압력에 의해 컬럼 상에 로딩하고, 통과하는 흐름을 수집하고, 재장전하고, 통과하는 흐름을 수집한다.
- 컬럼을 30 mL의 클로로포름-메탄올-물 (2:43:55)로 세척한 다음, 30 mL의 메탄올-물 (1:1), 50 mL의 메탄올로 강글리오시드를 용출시킨 후, 다시 메탄올 10 mL로 세척하고, 각 세척을 수집하고, 각각 개별적으로 용출시켰다. TLC (이하)를 사용하여 강글리오시드가 유동으로부터 부재함을 확인하고 세척하고 첫 번째 용출 (50 mL 메탄올)에서 용출시켰다. 용출된 강글리오사이드를 건조 분말로 증발시키고 무게를 측정한다.
참고 : tC18 크로마토그래피의 목적은 점점 더 많은 극성 오염 물질로부터 강글리오시드를 분리하는 것입니다. 검화후 혼합 뇌 강글리오시드 수율은 건조 뇌 추출물 g 당 ~120 mg이다(단계 2.1.4). TLC에 의한 강글리오시드의 출현은 유동 또는 세척을 통해 고체상 추출 컬럼이 포화되었음을 나타낸다. 메탄올 용출 후, 컬럼은 적은 극성 지질을 포획하기 위해 클로로포름-메탄올 (1:1)로 더 용출될 수 있다.
- 개별 신경절의 HPLC 정제
- HPLC 용매 A: 아세토니트릴-5 mM 수성 인산나트륨 완충액 pH 5.6 (83:17) 및 용매 B: 아세토니트릴-20 mM 인산나트륨 완충액, pH 5.6 (1:1)을 준비한다. 두 용매를 모두 5분 동안 탈기한다.
- HPLC 컬럼 (아민 결합 (NH2) 실리카 구체로 포장 된 20 x 250 mm 컬럼, 직경 5 μm, 100 Å 기공 크기)를 5 mL / 분에서 20 분 동안 100 % 용매 A로 미리 평형화시킨다. UV HPLC 컬럼 유출물 검출기를 215 nm로 설정한다.
- 역상 용출액에서 나온 강글리오사이드 분말을 5mg/mL의 물에 녹인다. 강글리오시드 혼합물 0.5 mL를 HPLC에 주입하고 용매 구배(표 1)를 5 mL/분으로 실행하여 분획을 수집한다. 강글리오사이드는 25-70 분의 체류 시간 (주요 뇌 신경절 측)을 가진 A215 피크로 나타납니다 : GM1 ≈ 28 분; GD1a ≈ 38 분; GD1b ≈ 46 분; GT1b ≈ 65분 각 실행 후 20분간 솔벤트 A로 재평형화시킨다. 박층 크로마토그래피로 분획을 분석합니다.
| 시간(분) | %A | %B |
| 0 | 100 | 0 |
| 7 | 100 | 0 |
| 12 | 63 | 37 |
| 82 | 54 | 46 |
| 82.01 | 0 | 100 |
| 92 | 0 | 100 |
표 1: HPLC에 대한 용매 구배.
3. 강글리오사이드의 박층 크로마토그래피(TLC) 분석
주의: 클로로포름은 독성 휘발성 유기 화합물입니다. 보호 장갑과 안전 고글로 흄 후드에서 작업하십시오.
- 실행 용매 및 TLC 플레이트 준비
- 클로로포름-메탄올 수성 0.25% KCl (60:35:8 부피)의 실행 용매를 제조하였다. 용매 깊이가 ~ 0.5cm가 되도록 스테인리스 스틸 커버가 있는 10cm x 10cm 유리 TLC 챔버에 붓는다. >10 분 동안 기류가없는 지역에서 뚜껑을 덮고 평형을 유지하십시오.
참고: TLC 챔버를 기류로부터 분리하기 위해 아크릴 5면 박스를 구성하거나 구입할 수 있습니다(그림 2). 챔버 내부에 용매 포화 여과지를 사용하지 마십시오. - 10 cm x 10 cm 또는 5 cm x 10 cm 실리카 겔 코팅된 유리 뒷받침된 고성능 TLC 플레이트를 125°C의 건조 오븐에 10분 동안 놓는다. 식히십시오. 둔한 #2 연필을 사용하여 플레이트 바닥에서 1cm 위, 양쪽에서 최소 1cm 떨어진 선을 따라 2mm 분판이 있는 5mm 스포팅 선을 그립니다(그림 3). 마킹하는 동안 실리카 층을 방해하지 마십시오.
- 100 μM GM1, GT1b의 GD1a 및 GD1b 및 33 μM의 각각 50 μM을 함유하는 메탄올 중의 순수한 강글리오시드의 표준 혼합물을 제조하였다.
참고: 이 혼합물은 네 개의 강글리오시드 각각에 대해 μL 당 100 pmol의 강글리오시드 시알산을 함유하며, 이는 시알산 의존성인 레조르시놀 염색에 의해 강한 비색 신호를 제공하는 양이다.
- 클로로포름-메탄올 수성 0.25% KCl (60:35:8 부피)의 실행 용매를 제조하였다. 용매 깊이가 ~ 0.5cm가 되도록 스테인리스 스틸 커버가 있는 10cm x 10cm 유리 TLC 챔버에 붓는다. >10 분 동안 기류가없는 지역에서 뚜껑을 덮고 평형을 유지하십시오.
- 강글리오사이드 해상도
- 10-μL 해밀턴 주사기를 경사 바늘로 메탄올로 세척한다. 1 μL 메탄올을 유리 주사기에 넣어 바늘 죽은 부피를 채운 다음 1 μL의 샘플 또는 표준을 채운다. <1 μL의 용매(메탄올)가 주사기에 남아있을 때까지 샘플을 5-mm 미리 표시된 라인 상에 고르게 스팟팅한다. 모든 샘플이 발견된 후 플레이트를 주위 온도(22°C)에서 건조시키십시오.
참고: 시료 로딩 사이에 주사기를 메탄올로 세척하십시오. 낮게 설정된 가열되지 않은 공기 송풍기를 사용하여 건조를 가속화 할 수 있습니다. - 점박이 나고 건조된 플레이트를 실행 용매에 침지된 바닥 가장자리가 있는 미리 평형화된 TLC 챔버에 넣고 덮개를 덮고 기류로부터 보호하십시오(그림 2). 용매 전면이 플레이트 상단의 1cm 이내에 도달 할 때까지 실행 용매가 모세관 작용으로 플레이트를 전진 시키도록하십시오. 플레이트 가장자리의 솔벤트 앞면을 제거하고 연필로 표시하십시오. 용매가 방해받지 않거나 온화한 공기 흐름 하에서 완전히 증발하도록하십시오.
- 10-μL 해밀턴 주사기를 경사 바늘로 메탄올로 세척한다. 1 μL 메탄올을 유리 주사기에 넣어 바늘 죽은 부피를 채운 다음 1 μL의 샘플 또는 표준을 채운다. <1 μL의 용매(메탄올)가 주사기에 남아있을 때까지 샘플을 5-mm 미리 표시된 라인 상에 고르게 스팟팅한다. 모든 샘플이 발견된 후 플레이트를 주위 온도(22°C)에서 건조시키십시오.
그림 2: 강글리오사이드 TLC 장비 및 설치. 트윈 트로프 챔버는 양쪽에 0.5cm 이≈ 흐르는 용제로 채워져 있습니다. 플레이트는 원점 끝이 실행 버퍼에 잠겨 한쪽에 배치됩니다. 챔버는 기류를 피하기 위해 아크릴 상자로 덮여 있습니다. 패널 A, 플레이트 삽입 전의 측면도. 용매 수준은 챔버 바닥 위에서 몇 mm 위로 보인다; 패널 B, 개발 중 정면도. 용매 전면은 플레이트 위로 올라가는 길의 약 40%에서 볼 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 강글리오사이드 염색
주의: 시약 얼룩은 독성이 있습니다. 염산은 부식성이 있고 독성이 있습니다. 보호 장갑과 안전 고글이있는 흄 후드에 시약을 준비하고 스프레이하십시오.
참고: 플레이트는 정성적 이미지 분석을 위해 이미징하거나 클램프를 제거하고 커버 플레이트를 투명 테이프로 제자리에 고정하여 저장할 수 있습니다. 정량적 분석은 인접한 차선에서 발견되는 강글리오사이드 표준의 밀도를 측정함으로써 수행될 수 있다.- 시알산을 기반으로 강글리오사이드의 검출을 위해 레조르시놀 스프레이 시약을 준비하십시오. 6% 레조르시놀 스톡을 위해 물 100 mL에 레조르시놀 6 g을 녹인다. 1 g의 CuSO4를 물 100 mL에 녹여 1% 스톡을 만든다. 물 64.7 mL에 6% 레조르시놀 스톡 5 mL, 1% CuSO4 스톡 0.31 mL를 첨가한 다음, 진한 HCl 30 mL를 천천히 첨가하고 부드럽게 교반한다. 한 달 동안 4°C에서 보관할 수 있다.
- 화학 흄 후드에서 결산 된 강글리오 시드가있는 TLC 플레이트를 원산지가 끝나는 컷 아웃 골판지 상자에 넣어 후드의 벽을 산 스프레이로부터 보호하십시오. 레조르시놀 스프레이 시약을 유리 TLC 분무기에 넣고 가압 질소 공급원에 부착 한 다음 플레이트를 수직 및 수평 방향으로 대각선으로 가볍게 분무하십시오. TLC 흡착제 표면을 균일하지만 가볍게 분무하십시오.
- 동일한 치수의 깨끗한 건조 유리 커버 플레이트로 플레이트를 즉시 덮고 커버 플레이트를 바인더 클립으로 제자리에 고정하십시오(그림 3). 덮은 플레이트를 125°C에서 20분 동안 가열한다. Ganglioside는 흰색 배경에 대해 진한 보라색으로 나타납니다.
참고: 스프레이가 완료되면 플레이트가 젖은 것처럼 보이지 않아야 합니다. 커버 플레이트는 단일 에지 면도날을 사용하여 이전에 사용 된 TLC 플레이트의 흡착제를 긁어서 만들 수 있습니다.
주의: 실리카 분말은 폐에 독성이 있습니다. 마스크를 사용하고 실리카를 밀봉 된 용기에 버리십시오.
도 3: 분해된 혼합 강글리오사이드의 TLC 플레이트. TLC 플레이트는 혼합 강글리오시드 표준물질(왼쪽 레인)과 정제된 혼합 소 회색 물질 강글리오사이드(오른쪽 레인)의 레조르시놀 염색 후 유리 커버 플레이트로 가열하여 제자리에 클리핑하였다. 표준 강글리오사이드(위에서 아래로)는 GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b, GT1b 및 GQ1b이다. 냉각 후, 플레이트는 이미징 될 수 있고 / 또는 커버 플레이트는 저장을 위해 제자리에 테이핑될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 신경절 및 인지질에 대한 일반적인 지질 염색.
주의: 황산은 독성이 있고 부식성이 있습니다. 에탄올에 농축 된 산을 첨가하는 것은 발열이며 천천히해야합니다. 보호 장갑과 안전 고글이있는 흄 후드에 염색 시약을 준비하십시오.- 에탄올 500 mL에 진한 황산 15 mL를 천천히 가하여 p-anisaldehyde 염색을 준비한다. 진행하기 전에 용액을 식힐 수 있도록 30 분 동안 저어줍니다. 15 mL의 p-anisaldehyde를 첨가하고 부드럽게 저어줍니다. 이것은 실온 (22°C)에서 최대 육개월까지 저장될 수 있다.
- 화학 흄 후드에서, TLC 플레이트를 해결된 강글리오시드, 기원 말단으로 담그고, p-아니스알데히드 얼룩을 함유하는 비커에 담그십시오. ≥ 2 초 동안 달리기 전면에 잠기십시오. 얼룩에서 TLC를 제거하고 배수를 허용하십시오. TLC 플레이트를 저온에서 핫 플레이트에 가열하여 발전시킵니다.
참고: 지질은 보라색 배경에 대해 어둡게 보입니다. 염색 용액은 반복 사용을 위해 회수될 수 있다.
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Representative Results
섹션 1 (소규모)에 설명 된 방법은 주요 뇌 신경절의 질적 및 양적 결정을 위해 충분한 양과 순도로 강글리오사이드를 제공합니다. 마우스 뇌로부터의 회복은 기재된 바와 같이 제조될 때 뇌 습윤 중량 g 당 ~1 μmol 강글리오시드 (1 nmol/μL)이다. 섹션 3을 이용한 1 μL(1 nmol)의 TLC 분해능은 레조르시놀 검출을 위한 충분한 물질을 제공하고, 도 4의 야생형 및 유전자 변형 마우스에 대해 나타낸 바와 같이 모든 주요 뇌 신경절을 해결한다. 섹션 1을 사용하여 제조된 혼합 강글리오시드는 다른 주요 지질이 없지는 않지만, 강글리오시드는 도 5에 도시된 바와 같이 질량 분광법(MS) 결정을 위해 충분한 순도를 가지며, 음성 모드에서 천연 정제된 강글리오시드로서 또는 양성 모드9에서 과메틸화 후에 존재한다. 섹션 1은 인지질을 제거하기 위해 알칼리성 가수분해를 피하기 때문에, O-아세틸화 시알산과 같은 알칼리 민감성 천연 변형을 유지한다(GT1b-OAc, 도 4 참조)9.
도 4: 마우스 뇌 신경절의 TLC. 야생형(WT) 및 St3gal 단일 및 이중-널 마우스로부터의 마우스 뇌 강글리오사이드의 TLC는 프로토콜 1에서와 같이 정제되었다. 이 수치는 Sturgill et al., 20129에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 섹션 1에서와 같이 정제된 퍼메틸화 야생형 및 St3gal2/3-double-null 마우스 뇌 강글리오시드의 MS. GD1a 및 GD1b는 TLC로 분해되지만(그림 4) 질량이 동일하므로 1차원 MS로 구분할 수 없습니다. 이 수치는 Sturgill et al., 20129에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
대규모 정제 (섹션 2)는 생물학적 실험 및 추가의 화학적 및 효소 변형에 적합한 정제된 주요 뇌 강글리오시드 GM1, GD1a, GD1b 및 GT1b를 제공하기 위해 추출, 비누화 (인지질을 제거하기 위해) 및 HPLC 분해능을 포함한다. 예시적인 HPLC 프로파일 및 후속 TLC 분석이 도 6에 도시되어 있다. 알칼리 처리(saponification)는 오염된 인지질을 가수분해하고 제거하기 위해 이 프로토콜에서 필요하지만(도 7), 또한 일부 맥락에서 중요할 수 있는 O-아세틸화 시알산과 같은 강글리오시드의 천연 변형을 가수분해할 것이다10. 이러한 적용을 위해, 분리된 강글리오시드로부터 인지질을 제거하기 위한 대안적인 효과적인 방법들이 발표되었다6.
도 6: 소 뇌 신경절의 대표적인 HPLC. 용출 구배(%B, 점선)는 사이클의 처음 75분 동안 흡광도(A215, 실선) 상에 오버레이된다. 피크(A215)를 수집하고(괄호 안의 숫자들) 프로토콜 3에서와 같이 TLC를 실시하였다. 레인 번호는 크로마토그램의 피크 번호를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: 혼합 강글리오시드의 분해된 TLC 플레이트. TLC 플레이트는 검화 후 분할된 강글리오시드(레인 2)와 함께 분해된 혼합 신경글리오시드 표준물질(레인 1)과 함께 지방산(레인 3)을 방출하였다. 강글리오시드를 포함한 지질은 p-아니살알데히드 염색으로 검출된다. 표준 신경절(위에서 아래로)은 GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b 및 GT1b 입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 보고된 소규모 및 대규모 강글리오시드 추출 및 단리를 위한 방법은 독특하지 않다-우수한 결과를 제공하는 많은 상이한 용매 추출 및 정제 접근법이 있다12. Fredman과 Svennerholm13의 뇌로부터의 소규모 정화를 위해 여기에 보고된 방법은 회복을 최적화하는 것으로 나타났으며 우리 실험실에서 수년 동안 견고하고 직접적인 것으로 입증되었습니다. TLC 및 MS에 적합한 단리 및 정제는 무손상 조직으로부터 단리된 강글리오시드까지, 수 시간 내에 용이하게 완료될 수 있다. MS는 음성 모드에서 또는 양성 모드에서 퍼메틸화 후 천연 정제된 강글리오시드 상에서 수행될 수 있다 (도 7, 예를 들어, Sturgill et al.9 참조). 수율은 대부분의 포유동물에 대해 신선한 뇌 조직 g 당 1 μmol 강글리오시드 (≈ 2 μmol 강글리오시드-결합된 시알산)를 ≈하여 매우 일관적이다. Tettamani et al.14에 의해 도입된 여기에 보고된 뇌로부터 대규모 추출 및 분할을 위한 방법은 첫 번째 분할(ether-tetrahydrofuran-water)에서 강글리오시드 함유 용매의 부피를 최소화하기 위해 선택된다. 이것은 첫 번째 단계에서 많은 양의 분할 된 신경절을 생성하는 기술로 번거로워 질 수있는 후속 단계를 단순화합니다. Gazzotti et al.15로부터 기술된 HPLC 방법은 주요 뇌 강글리오사이드의 비교적 높은 용량과 양호한 분해능을 갖는다.
설명된 소규모 프로토콜은 세포와 조직 모두에 매우 적합하며 확장 가능합니다. 최종 단계는 역상 포획, 증발 및 메탄올에 재용해되기 때문에, 이들은 배양된 신경 세포와 같은 작은 샘플에 임의의 규모로 적용될 수 있다. 이 경우, 우리는 편의를 위해 세포를 긁어 내고 균질화하고 메탄올과 클로로포름 첨가를 진행하여 추출에 적합한 비율을 생성 한 다음 분할합니다. 역상 후에 최종 건조된 강글리오시드는 단지 몇 마이크로리터에 재용해되고 TLC 및 MS에 의해 분석될 수 있다.
용매 비율에 대한 관심은 강글리오사이드 분리를 위한 추출 및 용매 분할 단계의 성공에 매우 중요합니다. 소규모 추출 및 분할을 위해, 상이한 클로로포름-메탄올-물 비율이 시험되었고, 정량적 강글리오시드 단리에 근접하여 생성된 것들이 여기13에 보고되었다. 기술된 비율로부터의 변형은 회복 및/또는 정제를 감소시킬 것이다. 마찬가지로, TLC 전개 용매의 용매 비율에 대한 주의가 중요하다. 보고된 클로로포름-메탄올-물 비율은 단일 투명 상을 초래한다. 작은 변형은 흐린 개발 용액을 산출 할 수 있으며, 이는 사용해서는 안되지만 소용돌이 치는 메탄올을 적가하여 명확히 할 수 있습니다. 상이한 추출 및 분할 용매가 일반적이지만, 용매 비율은 각 변형에 대해 신중하게 따라야 한다12. TLC 용매의 변경은 또한 특정 강글리오시드의 분리를 최적화하기 위해 일반적이다16. 강글리오시드의 TLC 이동을 변형시키는 비교적 간단한 방법은 용매 혼합물의 수성상을 변경하는 것이다. 염화칼륨 대신 수성 수산화암모늄 또는 염화칼슘을 사용하면 강글리오시드 염 형태 및 상대적 TLC 이동이 변경된다17.
모든 척추 동물의 세포와 조직이 강글리오사이드를 발현하는 반면, 뇌와 신경 세포는 다량 발현되는 것이 특이하다. 여기에 기술된 프로토콜은 다른 조직 및 세포에 적용 가능하지만, 다른 지질과의 낮은 풍부도 및 잠재적 오염으로 인해 변형이 필요할 수 있다. 인간 호중구6 및 마우스 adipose18에 적용되는 바와 같은 이들 방법은 예를 제공한다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 주장합니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 보건원 (NIH) 글리코 사이언스 보조금 U01CA241953을위한 공통 기금에 의해 지원되었습니다. MJP는 존스 홉킨스 (T32GM080189)의 화학 생물학 인터페이스 프로그램 (T32GM080189)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine brain, stripped | PelFreez | 57105-1 | |
| Ganglioside standards | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| Glass bottle with PTFE-lined cap | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| Glass centrifuge bottle | Fisher Scientific | 05-586B | |
| Glass culture tubes, 16 x 125 mm | VWR | 60825-430 | for collecting HPLC fractions |
| Glass separatory funnel (2 L) | Pyrex | 6400-2L | |
| Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 µl | Hamilton | 81265 | |
| p-Anisaldehyde, 98% | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Potter-Elvhjem Homogenizer | Fisher Scientific | 08-414-14A | Choose appropriate volume option |
| Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns | Analytics-Shop | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column | Analytics-Shop | custom packed | other sizes available |
| Resorcinol | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-300 | |
| Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml) | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) | Waters | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg | Waters | WAT036810 | |
| Spotting syringe - Hamilton 701N 10 µl | Hamilton | 80300 | |
| Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-933A | |
| Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-955-323 | For ganglioside storage |
| TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat | Fisher Scientific | M1056350001 | Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface |
| TLC reagent sprayer | Fisher Scientific | 05-723-26A | |
| TLC running chamber for 10 x 10 cm plates | Camag | 22.5155 | |
| Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender | Waring | E8520 |
References
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