Summary
Gangliosider er sialinsyrebærende glykosfetolipider som er spesielt rikelig i hjernen. Deres amfipatiske natur krever organisk/vandige ekstraksjons- og renseteknikker for å sikre optimal utvinning og nøyaktige analyser. Denne artikkelen gir oversikt over analytisk og forberedende skala ganglioside ekstraksjon, rensing og tynn lag kromatografi analyse.
Abstract
Gangliosider er glykosfatolipider som inneholder en eller flere sialsyrerester. De finnes på alle virveldyrceller og vev, men er spesielt rikelig i hjernen. Uttrykt primært på det ytre pakningsvedlegget av plasmamembranene til celler, modulerer de aktivitetene til celleoverflateproteiner via lateral assosiasjon, fungerer som reseptorer i cellecelleinteraksjoner og er mål for patogener og giftstoffer. Genetisk dysregulering av ganglioside biosyntese hos mennesker resulterer i alvorlige medfødte nervesystemforstyrrelser. På grunn av deres amfipatiske natur krever utvinning, rensing og analyse av gangliosider teknikker som har blitt optimalisert av mange etterforskere i de 80 årene siden oppdagelsen. Her beskriver vi metoder på benknivå for utvinning, rensing og foreløpige kvalitative og kvantitative analyser av store gangliosider fra vev og celler som kan fullføres om noen timer. Vi beskriver også metoder for større isolasjon og rensing av store ganglioside arter fra hjernen. Sammen gir disse metodene analytisk og forberedende skalatilgang til denne klassen av bioaktive molekyler.
Introduction
Gangliosider er definert som glykosfatolipider som bærer en eller flere sialsyrerester1. De uttrykkes hovedsakelig på celleoverflaten med deres hydrofobe ceramid lipidmoiety innebygd i plasmamembranens ytre brosjyre og deres hydrofile glykaner som strekker seg inn i det ekstracellulære rommet2. Selv om de distribueres mye i virveldyrceller og vev, er de spesielt rikelig i virveldyrhjernen3, hvor de først ble oppdaget og navngitt4.
Strukturene til ganglioside glykaner varierer og er grunnlaget for deres nomenklatur (figur 1). Ganglioside glykaner består av en nøytral sukkerkjerne som bærer forskjellige tall og fordelinger av sialsyrer. Den minste ganglioside, GM4, har bare to sukkerarter (sialsyre bundet til galaktose)5. Større naturlig forekommende gangliosider kan inneholde godt over et dusin totale sukkerarter6 eller opptil syv sialsyrer på en enkelt nøytral kjerne7. Deres ceramid lipid moieties varierer også, har forskjellige sphingosine lengder og en rekke fettsyre amider. I virveldyrhjernen dominerer fire gangliosidearter, GM1, GD1a, GD1b og GT1b. Ganglioside-uttrykk er utviklingsregulert, vevsspesifikk og celletypespesifikk.
Figur 1: Store hjerne gangliosider og deres biosyntetiske forløpere. Strukturer vises ved hjelp av Symbol Nomenclature for Glycans11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Gangliosider fungerer på molekylært nivå ved å engasjere og modulere proteiner i sine egne membraner (cis regulering) eller ved å engasjere glykanbindende proteiner i det ekstracellulære miljøet, inkludert bakterielle toksiner og lectins på andre celler (transgjenkjenning)3. Spesifikk binding av gangliosider til regulatoriske proteiner og / eller selvtilknytning med andre molekyler i lipidflåter resulterer i endringer i celleadferd som påvirker nervesystemstrukturen og funksjonen, kreftprogresjon, metabolisme, betennelse, nevronale proteinopatier og smittsomme sykdommer8. På grunn av deres ulike cellulære roller kan metoder for isolasjon og analyse gi økt innsikt i regulering av fysiologiske og patologiske prosesser. Her er validerte metoder for rask småskala ekstraksjon og analyse, og forberedende skalaisolasjon av gangliosider fra hjernen gitt. Muligheter og utfordringer for anvendelse på andre vev diskuteres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vevsinnsamling ble utført under forhold autorisert av Johns Hopkins Animal Care and Use Committee.
1. Småskala ganglioside ekstraksjon og delvis rensing
FORSIKTIG: Bruk passende ventilasjon når du arbeider med flyktige og giftige løsemidler. Unngå plast gjennom hele; løsemidler vil trekke ut kjemiske komponenter fra mange plastmaterialer som forstyrrer påfølgende analyser. Polytetrafluoretylen (PTFE) er et unntak. PTFE-foret lukking bør brukes til å hette glasslagringshetteglass.
- Utvinning
- Vei en enkelt frisk eller tint musehjerne (eller sagittal halvhjerne, ~ 0,2-0,5 g) og plasser i en Potter-Elvehjem homogenisator prechilled i en bøtte med is.
MERK: Tidligere frosne hjerner kan brukes etter opptining ved 0-4 °C. - Tilsett 4,1 ml per g vev våtvekt av vann og homogeniser med 10 slag.
MERK: Nøyaktige løsningsmiddelforhold er nøkkelen til optimal ekstraksjon og partisjon, målet er kloroform-metanol-vandig (4:8:3) forutsatt at hjernevev er 80% vandig. - Tilsett 13 ml per g vev våtvekt av metanol, skift til omgivelsestemperatur (22 °C) og bland.
MERK: Løsningen ser overskyet ut. Tilsetning av metanol på dette trinnet, uten kloroform, optimaliserer proteinutfelling. Alle etterfølgende trinn er ved omgivelsestemperatur (22 °C). - Overfør til et tykkvegget glassskruehette med en PTFE-foret skruehett ved omgivelsestemperatur (22 °C) og bland grundig. Tilsett 6,5 ml per g vev våt vekt av kloroform, hette og bland grundig. Sentrifuge ved 450 x g i 15 min. Overfør den klare supernatanten til et friskt skruehett rør og mål volumet, "gjenvunnet ekstraktvolum".
- Vei en enkelt frisk eller tint musehjerne (eller sagittal halvhjerne, ~ 0,2-0,5 g) og plasser i en Potter-Elvehjem homogenisator prechilled i en bøtte med is.
- Deling
- Tilsett 0,173x "gjenvunnet ekstraktvolum" av vann til den klare supernatanten, hetten, virvelen kraftig og sentrifugen som beskrevet i trinn 1.1.4.
MERK: Målet er å ha kloroform-metanol-vandig i forholdet 4:8:5.6. Blandingen vil være overskyet og løses i to faser: en øvre vandig rik fase og en lavere kloroformrik fase ved ~ 4: 1-forholdet. Vent i 60 min eller sentrifuge ved 450 x g i 15 min for fullstendig faseseparasjon. - Overfør den øvre fasen, som inneholder gangliosidene, til et friskt glassrør med en PTFE-foret skruehett.
- Tilsett 0,173x "gjenvunnet ekstraktvolum" av vann til den klare supernatanten, hetten, virvelen kraftig og sentrifugen som beskrevet i trinn 1.1.4.
- Omvendt fasepatronkromatografi
- Bruk en 5 ml glasssprøyte og vask en tC18 fastfase ekstraksjonspatron (400 mg) med 3 ml metanol, deretter 3 ml kloroform-metanolvann (2:43:55). Legg den øvre fasen fra trinn 1.2.2 på tC18-patronen ved hjelp av samme glasssprøyte, samle gjennomstrømningen og last den inn på kolonnen igjen for å optimalisere adsorpsjonen.
- Bruk glasssprøyten til å vaske sylinderampullen med 3 ml kloroform-metanolvann (2:43:55) og deretter 3 ml metanolvann (1:1).
- Elute gangliosides med 3 ml metanol i et friskt skrue-capped rør. Fordamp til tørrhet under en mild strøm av nitrogen ved ≤ 45 °C. Oppløsning i metanol ved 1 ml per g originalt vev våtvekt.
2. Storskala ganglioside ekstraksjon og rensing
FORSIKTIG: Når du arbeider med flyktige løsemidler, bruk eksplosjonsbestandige blendere. Ikke bruk plast unntatt PTFE. Tetrahydrofuran, kloroform og etyleter er giftige flyktige organiske forbindelser. Arbeid i en avtrekkshette med vernehansker og vernebriller.
- Utvinning
- Tine frossen storfehjerne ved 4 °C i flere timer. Disseker den grå materie fra meninger og hvitt materiale.
MERK: Følgende prosedyre er beskrevet for 100 ± 20 g isolert hjernegrå materie og er skalerbar. - Legg 100 g hjernegrå materie i en blender og tilsett 1 ml per g hjernens våte vekt på 10 mM kaliumfosfatbuffer pH 6,8. Homogeniser lavt i 20 s. Tilsett 8 ml tetrahydrofuran per g hjernens våte vekt og homogeniser lavt i 10 s. Dekanterer du i glasssentrifugeflasker og sentrifugerer ved 5000 x g i 15 minutter ved omgivelsestemperatur (22 °C).
- Samle supernatanten, mål volumet og overfør til en glassseparatortrakt. Tilsett 0,3 ml etyleter per ml av supernatanten. Rist kraftig, la det sitte uforstyrret i 30 minutter der to faser, en øvre eterfase og en lavere vandig fase, separat. Samle den nedre fasen, som inneholder gangliosidene, i en glassflaske med en PTFE-foret hette.
- Til den øvre (eter) fasen som gjenstår i separatorytrakten, tilsett 0,1 ml vann per ml original supernatant (trinn 2.1.3). Rist kraftig, la faser skille seg, samle den nedre (vandige) fasen og kombiner med forrige nedre fase. Fordamp de kombinerte nedre fasene til et tørt pulver og vei.
- Tine frossen storfehjerne ved 4 °C i flere timer. Disseker den grå materie fra meninger og hvitt materiale.
- Saponering
- Tilsett 10 ml 100 mM vandig NaOH per g pulver i et forseglet rør. Bland og inkuber ved 37 °C i 3 timer. La det avkjøles og justeres til pH 4.5 ved dropwise addisjon av 100 mM vandig HCl. Mål volumet og overfør til en glassseparatortrakt.
MERK: Sialsyrer er syre labile; unngå forsuring under pH 4.5. - Basert på vandig volum, tilsett 2,67 volumer metanol, bland forsiktig, og tilsett deretter 1,33 bind kloroform for å skape en enfaset løsning av kloroform-metanol-vandig (4:8:3). Bland godt.
- Basert på det opprinnelige vandige volumet, tilsett 2,6 mengder vann for å bringe blandingen til kloroform-metanol-vandig til et forhold på 4:8:5.6. Rist kraftig, la det sitte uforstyrret for å skille to faser, en polar øvre fase som inneholder gangliosidene og en ikke-polar nedre fase. Samle den øvre fasen i en glassflaske med en PTFE-foret hette.
MERK: Ikke-sialylerte lipider vises ikke på TLC-plater (thin layer chromatography) farget med resorcinol, men vises når du bruker en p-anisaldehydflekk. Formålet med denne saponifiseringen er å fjerne O-acetylerte forbindelser som fosfolipider.
- Tilsett 10 ml 100 mM vandig NaOH per g pulver i et forseglet rør. Bland og inkuber ved 37 °C i 3 timer. La det avkjøles og justeres til pH 4.5 ved dropwise addisjon av 100 mM vandig HCl. Mål volumet og overfør til en glassseparatortrakt.
- Omvendt fasekromatografi
- Forvask en stor skala (10 g) tC18 solid fase ekstraksjonspatron ved å passere 50 ml av hver av de følgende tre løsningsmidlene gjennom kolonnen ved hjelp av vakuum eller trykk (<1 min hver vask): metanol, metanolvann (1:1), deretter kloroform-metanol-vann (2:43:55). Last den øvre fasen fra trinn 2.2.3 på kolonnen med vakuum eller trykk, samle gjennom strømmen, last inn og samle gjennom gjennomstrømningen.
- Vask søylen med 30 ml kloroform-metanol-vann (2:43:55), deretter 30 ml metanol-vann (1:1), elute gangliosidene med 50 ml metanol, og igjen med 10 ml metanol, samle hver vask og hver elution separat. Bruk av TLC (nedenfor) bekrefter at ganglioside er fraværende fra strømmen gjennom og vasker og eluted i den første elution (50 ml metanol). Fordamp de eluterte gangliosidene til et tørt pulver og vei.
MERK: Hensikten med tC18-kromatografi er å skille gangliosider fra både mindre og mer polare forurensninger. Blandet hjerne ganglioside utbytte etter saponering er ~ 120 mg per g tørr hjerneekstrakt (trinn 2.1.4). Utseendet til gangliosider av TLC i gjennomstrømningen eller vaskene indikerer at den faste faseekstraksjonskolonnen var mettet. Etter metanol elution, kolonnen kan videre eluted med kloroform-metanol (1:1) for å fange mindre polar lipider.
- HPLC rensing av individuelle gangliosider
- Klargjør HPLC-løsningsmiddel A: acetonitril-5 mM vandig natriumfosfatbuffer pH 5,6 (83:17) og løsningsmiddel B: acetonitril-20 mM natriumfosfatbuffer, pH 5,6 (1:1). Degas begge løsningsmidler i 5 min.
- Pre-likevekt en HPLC kolonne (20 x 250 mm kolonne fullpakket med amin limt (NH2) silika sfærer, 5 μm diameter, 100 Å pore størrelse) med 100% Løsningsmiddel A i 20 min ved 5 ml / min. Sett en UV HPLC-søyleavløpsdetektor til 215 nm.
- Løs opp gangliosidepulveret fra omvendt fase eluate i vann ved 5 mg / ml. Injiser 0,5 ml av gangliosideblandingen på HPLC og kjør løsningsmiddelgradienten (tabell 1) ved 5 ml/min, og samle opp brøker. Gangliosides vil vises som A215 topper med oppbevaringstider (store hjerne gangliosides) på 25-70 min: GM1 ≈ 28 min; GD1a ≈ 38 min; GD1b ≈ 46 min; GT1b ≈ 65 min. Re-likevekt 20 min med Løsningsmiddel A etter hver løpetur. Analyser brøker ved hjelp av tynnlagskromatografi.
| Tid (min) | %A | %B |
| 0 | 100 | 0 |
| 7 | 100 | 0 |
| 12 | 63 | 37 |
| 82 | 54 | 46 |
| 82.01 | 0 | 100 |
| 92 | 0 | 100 |
Tabell 1: Løsemiddelgradient for HPLC.
3. Tynn lagkromatografi (TLC) analyse av gangliosider
FORSIKTIG: Kloroform er en giftig flyktig organisk forbindelse. Arbeid i en avtrekkshette med vernehansker og vernebriller.
- Rennende løsningsmiddel og TLC-plateforberedelse
- Forbered et rennende løsningsmiddel av kloroform-metanol-vandig 0,25% KCl (60:35:8 etter volum). Hell i et TLC-kammer i glass 10 cm x 10 cm med et deksel i rustfritt stål, slik at løsemiddeldybden er ~ 0,5 cm. Dekk og la likevekt i et område fri for luftstrømmer i >10 min.
MERK:For å isolere TLC-kammeret fra luftstrømmer, kan en akryl 5-sidig boks konstrueres eller kjøpes (figur 2). Ikke bruk løsemiddelmettet filterpapir inne i kammeret. - Plasser en 10 cm x 10 cm eller 5 cm x 10 cm silikagelbelagt TLC-plate med glassstøtte i en tørkeovn ved 125 °C i 10 minutter. La det avkjøles. Bruk en kjedelig blyant #2 til å tegne 5 mm spottingslinjer med 2 mm separasjoner langs en linje 1 cm over bunnen av platen og minst 1 cm fra hver side (figur 3). Unngå å forstyrre silikalaget under merking.
- Forbered en standard blanding av rene gangliosider i metanol som inneholder 100 μM GM1, 50 μM hver av GD1a og GD1b og 33 μM GT1b.
MERK: Denne blandingen inneholder 100 pmol av ganglioside sialinsyre per μL for hver av de fire gangliosidene, en mengde som gir et sterkt kolorimetrisk signal ved resorcinolfarging, som er sialsyreavhengig.
- Forbered et rennende løsningsmiddel av kloroform-metanol-vandig 0,25% KCl (60:35:8 etter volum). Hell i et TLC-kammer i glass 10 cm x 10 cm med et deksel i rustfritt stål, slik at løsemiddeldybden er ~ 0,5 cm. Dekk og la likevekt i et område fri for luftstrømmer i >10 min.
- Ganglioside-oppløsning
- Vask en 10-μL Hamilton sprøyte med en skrå nål med metanol. Trekk 1 μL metanol inn i en glasssprøyte for å fylle nålens døde volum og deretter 1 μL prøve eller standard. Se prøven jevnt på de 5 mm forhåndsmerkede linjene til <1 μL oppløsningsvæske (metanol) forblir i sprøyten. La platen tørke ved omgivelsestemperatur (22 °C) etter at alle prøvene er oppdaget.
MERK: Vask sprøyten med metanol mellom prøvelasting. En uoppvarmet luftblåser satt til lav kan brukes til å akselerere tørking. - Plasser den flekkete og tørkede platen i det forhåndsoverveide TLC-kammeret med bunnkanten nedsenket i det løpende løsningsmidlet og dekselet og beskytt mot luftstrømmer (figur 2). La det rennende løsningsmidlet føre opp platen ved kapillær virkning til løsningsmidlet foran når innen 1 cm fra toppen av platen. Fjern og merk løsningsmidlet foran på kanten av platen med en blyant. La løsningsmidlene fordampe helt uforstyrret eller under mild luftstrøm.
- Vask en 10-μL Hamilton sprøyte med en skrå nål med metanol. Trekk 1 μL metanol inn i en glasssprøyte for å fylle nålens døde volum og deretter 1 μL prøve eller standard. Se prøven jevnt på de 5 mm forhåndsmerkede linjene til <1 μL oppløsningsvæske (metanol) forblir i sprøyten. La platen tørke ved omgivelsestemperatur (22 °C) etter at alle prøvene er oppdaget.
Figur 2: Ganglioside TLC-utstyr og oppsett. Et twin trough kammer er fylt til ≈ 0,5 cm på begge sider med rennende løsningsmiddel. Platen er plassert mot den ene siden med opprinnelsesenden nedsenket i løpebufferen. Kammeret er dekket med en akrylboks for å unngå luftstrømmer. Panel A, sidevisning før plateinnsetting. Løsningsmiddelnivået er synlig noen få mm over kammerbunnen; Panel B, sett forfra under utvikling. Løsningsmiddelfronten er synlig på ca. 40% av veien opp platen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Ganglioside farging
FORSIKTIG: Reagensflekker er giftige. Saltsyre er etsende og giftig. Forbered og spray reagenser i en avtrekkshette med vernehansker og vernebriller.
MERK: Platen kan avbildes for kvalitativ bildeanalyse eller lagres ved å fjerne klemmene og feste dekkplaten på plass med klart tape. Kvantitativ analyse kan utføres ved å måle densitometri av ganglioside standarder oppdaget i tilstøtende baner.- Forbered resorcinol sprayreagens for påvisning av gangliosider basert på deres sialsyrer. Løs opp 6 g resorcinol i 100 ml vann for en 6% resorcinolbestand. Løs opp 1 g CuSO4 i 100 ml vann for å lage en 1% lager. Til 64,7 ml vann tilsett 5 ml av 6% resorcinolbestanden, 0,31 ml av 1% CuSO4-lageret tilsett deretter sakte 30 ml konsentrert HCl og rør forsiktig. Kan oppbevares ved 4 °C i en måned.
- I en kjemisk avtrekkshette plasserer du TLC-platen med løste gangliosider, opprinnelse ender opp, i en avskåret pappkasse for å beskytte hettens vegger mot syrespray. Plasser resorcinol sprayreagens i en TLC-sprøyte i glass, fest til en kilde til trykksatt nitrogen, og spray platen lett diagonalt i vertikale og horisontale retninger. Spray TLC sorbent overflaten jevnt, men lett.
- Dekk platen umiddelbart med en ren, tørr glassdekselplate med samme dimensjoner og fest dekkplaten med bindebinderklemmer (figur 3). Varm opp den tildekkede platen ved 125 °C i 20 minutter. Gangliosides vil vises mørk lilla mot en hvit bakgrunn.
MERK: Platen skal ikke virke våt når sprøytingen er fullført. Dekkplater kan formet ved å skrape sorbenten fra tidligere brukte TLC-plater ved hjelp av et enkeltkantet barberblad.
FORSIKTIG: Silikapulver er giftig for lungene. Bruk en maske og kast silika i en forseglet beholder.
Figur 3: TLC-plate av løst blandet ganglioside. TLC plate av løst blandet ganglioside standarder (venstre kjørefelt) og renset blandet bovin grå materie gangliosides (høyre kjørefelt) etter resorcinol farging og oppvarming med glass dekk plate klippet på plass. Standard gangliosides (fra topp til bunn) er GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b, GT1b og GQ1b. Etter avkjøling kan platen avbildes og/eller dekkplaten teipes på plass for oppbevaring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Generell lipidfarging for gangliosider og fosfolipider.
FORSIKTIG: Svovelsyre er giftig og etsende. Tilsetning av konsentrert syre til etanol er eksotermisk og må gjøres sakte. Forbered fargingsreagens i en avtrekkshette med vernehansker og vernebriller.- Forbered p-anisaldehydflekk ved å sakte tilsette 15 ml konsentrert svovelsyre til 500 ml etanol. Rør i 30 min for å la oppløsningen avkjøles før du fortsetter. Tilsett 15 ml p-anisaldehyd og rør forsiktig. Dette kan oppbevares ved romtemperatur (22 °C) opptil seks måneder.
- I en kjemisk avtrekkshette dypper du TLC-platen med løste gangliosider, opprinnelsesende ned, i et beger som inneholder p-anisaldehydflekken. Senk ned til løpefronten i ≥ 2 s. Fjern TLC fra flekk og la det renne. Varm TLC-platen på en varm plate ved lav temperatur for å utvikle.
MERK: Lipider vil se mørke ut mot en lilla bakgrunn. Fargingsoppløsningen kan gjenvinnes ved gjentatt bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metodene beskrevet i § 1 (liten skala) gir gangliosider tilstrekkelig mengde og renhet for kvalitativ og kvantitativ bestemmelse av store hjerne gangliosider. Restitusjon fra musehjernen er ~ 1 μmol ganglioside per g hjernens våte vekt (1 nmol/μL) når den fremstilles som beskrevet. TLC-oppløsning på 1 μL (1 nmol) ved hjelp av seksjon 3 gir rikelig materiale for resorcinoldeteksjon og løser alle de store hjerne gangliosidene som vist for vill type og genetisk modifiserte mus i figur 4. Selv om blandede gangliosider fremstilt ved hjelp av seksjon 1 ikke er fri for andre store lipider, er gangliosider av tilstrekkelig renhet for massespektrometrisk (MS) bestemmelse som vist i figur 5, enten som innfødte rensede gangliosider i negativ modus eller etter permetylering i positiv modus9. Siden § 1 unngår alkalisk hydrolyse for å fjerne fosfolipider, beholder den alkalifølsomme naturlige modifikasjoner, som O-acetylerte sialsyrer (se GT1b-OAc, figur 4)9.
Figur 4: TLC av musehjerne gangliosider. TLC av mus hjerne gangliosides fra wild-type (WT) og St3gal single og dobbel-null mus renset som i Protokoll 1. Dette tallet er endret fra Sturgill et al, 20129. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: MS av permetylert villtype og St3gal2/3-dobbel-null mus hjerne gangliosides renset som i avsnitt 1. Vær oppmerksom på at GD1a og GD1b løses av TLC (figur 4), men har samme masse, slik at de ikke kan skilles fra endimensjonal MS. Dette tallet er endret fra Sturgill et al, 20129. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Storskala rensing (avsnitt 2) inkluderer ekstraksjon, saponering (for å fjerne fosfolipider) og HPLC-oppløsning for å gi rensede store hjerne gangliosider GM1, GD1a, GD1b og GT1b egnet for biologiske eksperimenter og for ytterligere kjemiske og enzymatiske modifikasjoner. En eksemplarisk HPLC-profil og påfølgende TLC-analyse er vist i figur 6. Alkalibehandling (saponering) er nødvendig i denne protokollen for å hydrolysere og fjerne forurensende fosfolipider (figur 7), men vil også hydrolysere naturlige modifikasjoner av gangliosider, for eksempel O-acetylerte sialsyrer, noe som kan være viktig i noen sammenhenger10. For disse bruksområdene er alternative effektive metoder for fjerning av fosfolipider fra isolerte gangliosider publisert6.
Figur 6: Representativ HPLC for bovin hjerne gangliosides. Elution gradient (%B, prikket linje) er lagt på absorbansen (A215, solid linje) for de første 75 min av syklusen. Topper (A215) ble samlet inn (tall i parentes) og utsatt for TLC som i protokoll 3. Lane tall refererer til topptallene på kromatogrammet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: TLC-plate av løst blandet ganglioside. TLC plate av løst blandet gangliosides standarder (lane 1) sammen med post-saponification partisjonert gangliosides (lane 2) og frigjort fettsyrer (lane 3). Lipider, inkludert gangliosider, oppdages med p-anisaldehydflekk. Standard gangliosides (fra topp til bunn) er GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b og GT1b. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metodene for liten og storskala ganglioside utvinning og isolasjon rapportert her er ikke unike - det er mange forskjellige løsningsmiddelutvinning og rensingsmetoder som gir gode resultater12. Metodene som rapporteres her for småskala rensing fra hjernen, fra Fredman og Svennerholm13, ble vist å optimalisere utvinningen og har vist seg å være robust og grei over mange år i vårt laboratorium. Isolasjon og rensing egnet for TLC og MS kan enkelt fullføres, fra intakt vev til isolerte gangliosider, om noen timer. MS kan utføres på innfødte rensede gangliosider i negativ modus eller etter permetylering i positiv modus (figur 7, se sturgill et al.9). Utbyttet er veldig konsistent, ≈ 1 μmol ganglioside (≈ 2 μmol ganglioside-bundet sialsyre) per g fersk hjernevev for de fleste pattedyr. Metoden for storskala ekstraksjon og partisjon fra hjernen rapportert her, introdusert av Tettamani et al.14, er valgt for å minimere volumet av gangliosideholdig løsningsmiddel ved den første partisjonen (eter-tetrahydrofuran-vann). Dette forenkler påfølgende trinn som kan bli tungvint med teknikker som genererer store mengder partisjonerte gangliosider ved de første trinnene. HPLC-metoden beskrevet, fra Gazzotti et al.15, har relativt høy kapasitet og god oppløsning av de store hjerne gangliosides.
De små protokollene som er beskrevet er godt egnet for både celler og vev og er skalerbare. Siden de siste trinnene er omvendt fasefangst, fordampning og redissolving i metanol, kan de brukes i vilkårlig skala til små prøver, for eksempel dyrkede nerveceller. I dette tilfellet skraper og homogeniserer vi celler i 1 ml vann for enkelhets skyld og fortsetter med metanol og kloroform tillegg for å generere de riktige forholdene for utvinning og deretter partisjon. De siste tørkede gangliosidene etter omvendt fase kan løses på nytt i bare noen få mikroliter og analyseres av TLC og MS.
Oppmerksomhet på løsningsmiddelforhold er avgjørende for å lykkes med ekstraksjons- og løsningsmiddelpartisjoneringstrinn for gangliosideisolasjon. For småskala ekstraksjon og partisjonering ble forskjellige kloroform-metanol-vannforhold testet og de som genererte nær kvantitativ ganglioside isolasjon rapporteres her13. Variasjoner fra de beskrevne forholdene vil redusere utvinning og/eller rensing. På samme måte er oppmerksomhet på løsningsmiddelforhold i TLC-utvikling av løsningsmidler kritisk. De rapporterte kloroform-metanolvannforholdene resulterer i en enkelt klar fase. Små variasjoner kan gi uklare utviklingsløsninger som ikke bør brukes, men som kan avklares ved dropwise tillegg av metanol med virvlende. Selv om forskjellige ekstraksjons- og partisjonsløsningsmidler er vanlige, bør løsningsmiddelforholdet følges nøye for hver variant12. Endringer i TLC-løsningsmidler er også vanlige for å optimalisere separasjon av spesifikke gangliosider16. En relativt enkel måte å endre TLC-migrasjon av gangliosider på er å endre den vandige fasen av løsningsmiddelblandingen. Bruk av vandig ammoniumhydroksid eller kalsiumklorid i stedet for kaliumklorid endrer ganglioside saltform og relativ TLC-migrasjon17.
Mens alle virveldyrceller og vev uttrykker gangliosider, er hjernen og nervecellene uvanlige i de høye mengdene uttrykt. Protokollene som er beskrevet her gjelder for andre vev og celler, men modifikasjoner kan være nødvendig på grunn av lavere overflod og potensiell forurensning med andre lipider. Disse metodene som brukes på menneskelige nøytrofiler6 og mus adipose18 gir eksempler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) Common Fund for Glycoscience grant U01CA241953. MJP ble støttet av Chemistry-Biology Interface Program ved Johns Hopkins (T32GM080189).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine brain, stripped | PelFreez | 57105-1 | |
| Ganglioside standards | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| Glass bottle with PTFE-lined cap | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| Glass centrifuge bottle | Fisher Scientific | 05-586B | |
| Glass culture tubes, 16 x 125 mm | VWR | 60825-430 | for collecting HPLC fractions |
| Glass separatory funnel (2 L) | Pyrex | 6400-2L | |
| Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 µl | Hamilton | 81265 | |
| p-Anisaldehyde, 98% | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Potter-Elvhjem Homogenizer | Fisher Scientific | 08-414-14A | Choose appropriate volume option |
| Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns | Analytics-Shop | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column | Analytics-Shop | custom packed | other sizes available |
| Resorcinol | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-300 | |
| Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml) | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) | Waters | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg | Waters | WAT036810 | |
| Spotting syringe - Hamilton 701N 10 µl | Hamilton | 80300 | |
| Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-933A | |
| Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-955-323 | For ganglioside storage |
| TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat | Fisher Scientific | M1056350001 | Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface |
| TLC reagent sprayer | Fisher Scientific | 05-723-26A | |
| TLC running chamber for 10 x 10 cm plates | Camag | 22.5155 | |
| Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender | Waring | E8520 |
References
- Schnaar, R. L.
- DeMarco, M. L., Woods, R. J. Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces. Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).
- Schnaar, R. L.
- Klenk, E. Über die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids]. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).
- Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells. Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).
- Nimrichter, L., et al.
- Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).
- Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).
- Sturgill, E. R., et al. Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b. Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).
- Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy. Cells. 9 (3), (2020).
- Varki, A., et al. Symbol nomenclature for graphical representations of glycans. Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).
- Schnaar, R. L.
- Svennerholm, L., Fredman, P. A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).
- Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).
- Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures. Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).
- Schnaar, R. L., Needham, L. K.
- Ledeen, R. W., Yu, R. K. Gangliosides: structure, isolation, and analysis. Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).
- Lopez, P. H., et al. Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance. Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).
