Summary
Ганглиозиды представляют собой гликосфинголипиды, несущие сиаловую кислоту, которые особенно распространены в головном мозге. Их амфипатическая природа требует органической / водной экстракции и методов очистки для обеспечения оптимального восстановления и точного анализа. В данной статье представлены обзоры аналитической и препаративной ганглиозидной экстракции, очистки и тонкослойного хроматографического анализа.
Abstract
Ганглиозиды представляют собой гликосфинголипиды, которые содержат один или несколько остатков сиаловой кислоты. Они встречаются на всех клетках и тканях позвоночных, но особенно распространены в мозге. Экспрессируемые преимущественно на внешнем листочке плазматических мембран клеток, они модулируют активность белков клеточной поверхности через латеральную ассоциацию, действуют как рецепторы в клеточно-клеточных взаимодействиях и являются мишенями для патогенов и токсинов. Генетическая дисрегуляция биосинтеза ганглиозидов у человека приводит к тяжелым врожденным расстройствам нервной системы. Из-за их амфипатической природы извлечение, очистка и анализ ганглиозидов требуют методов, которые были оптимизированы многими исследователями за 80 лет с момента их открытия. Здесь мы описываем настольные методы экстракции, очистки и предварительного качественного и количественного анализа основных ганглиозидов из тканей и клеток, которые могут быть завершены за несколько часов. Мы также описываем методы более масштабного выделения и очистки основных видов ганглиозидов из мозга. Вместе эти методы обеспечивают аналитический и препаративный доступ к этому классу биологически активных молекул.
Introduction
Ганглиозиды определяются как гликосфинголипиды, несущие один или несколько остатков сиаловой кислоты1. Они экспрессируются главным образом на поверхности клетки с их гидрофобным церамидным липидным фрагментом, встроенным во внешний листок плазматической мембраны, и их гидрофильными гликанами, простирающимися во внеклеточное пространство2. Хотя они широко распространены в клетках и тканях позвоночных, они особенно распространены в мозге позвоночных3, где они были впервые обнаружены и названы4.
Структуры ганглиозидных гликанов различаются и являются основой для их номенклатуры (рисунок 1). Ганглиозидные гликаны состоят из нейтрального сахарного ядра, несущего различное количество и распределение сиаловых кислот. Самый маленький ганглиозид, GM4, имеет только два сахара (сиаловая кислота, связанная с галактозой)5. Более крупные природные ганглиозиды могут содержать более десятка общих сахаров6 или до семи сиаловых кислот на одном нейтральном ядре7. Их керамидные липидные фрагменты также различаются, имея различную длину сфингозина и различные амиды жирных кислот. В мозге позвоночных преобладают четыре вида ганглиозидов, GM1, GD1a, GD1b и GT1b. Экспрессия ганглиозидов регулируется развитием, специфична для тканей и специфична для типа клеток.
Рисунок 1: Основные ганглиозиды мозга и их биосинтетические предшественники. Структуры показаны с использованием номенклатуры символов для гликанов11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Ганглиозиды функционируют на молекулярном уровне, вовлекая и модулируя белки в своих собственных мембранах (цис-регуляция) или вовлекая гликансвязывающие белки во внеклеточную среду, включая бактериальные токсины и лектины на других клетках (транс-распознавание)3. Специфическое связывание ганглиозидов с регуляторными белками и/или самоассоциация с другими молекулами в липидные рафты приводит к изменениям в поведении клеток, которые влияют на структуру и функцию нервной системы, прогрессирование рака, метаболизм, воспаление, протеинопатии нейронов и инфекционные заболевания8. Из-за их разнообразных клеточных ролей методы их изоляции и анализа могут обеспечить более глубокое понимание регуляции физиологических и патологических процессов. Здесь представлены проверенные методы быстрой мелкомасштабной экстракции и анализа, а также экстрактивного масштабирования ганглиозидов из мозга. Обсуждаются возможности и проблемы для применения к другим тканям.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Сбор тканей проводился в условиях, разрешенных Комитетом по уходу и использованию животных Джона Хопкинса.
1. Мелкомасштабная экстракция ганглиозидов и частичная очистка
ВНИМАНИЕ: Используйте соответствующую вентиляцию при работе с летучими и токсичными растворителями. Избегайте пластика во всем; растворители будут извлекать химические компоненты из многих пластмасс, которые мешают последующим анализам. Политетрафторэтилен (PTFE) является исключением; Укупорочные средства из PTFE следует использовать для закрытия стеклянных флаконов для хранения.
- Извлечение
- Взвесьте один свежий или размороженный мозг мыши (или сагиттальный полумозгойник, ~0,2-0,5 г) и поместите в гомогенизатор Potter-Elvehjem, предварительно охлажденный в ведре со льдом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ранее замороженные мозги можно использовать после размораживания при 0-4 °C. - Добавляют 4,1 мл на г ткани влажной массы воды и гомогенизируют 10 ударами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точные соотношения растворителей являются ключом к оптимальной экстракции и разделению, целью является хлороформ-метанол-водный (4: 8: 3), предполагая, что ткань мозга на 80% состоит из водных ресурсов. - Добавьте 13 мл на г влажной массы метанола, переведите к температуре окружающей среды (22 °C) и перемешайте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Решение будет выглядеть облачным. Добавление метанола на этом этапе, без хлороформа, оптимизирует осаждение белка. Все последующие этапы проходят при температуре окружающей среды (22 °C). - При температуре окружающей среды (22 °C) переложить на толстостенную стеклянную завинчивающуюся трубку с завинчивающейся крышкой из PTFE и тщательно перемешать. Добавьте 6,5 мл на г влажной массы хлороформа, колпачка и тщательно перемешайте. Центрифуга при 450 х г в течение 15 мин. Перенесите прозрачный супернатант в свежую завинчивающуюся трубку и измерьте объем, «восстановленный объем экстракта».
- Взвесьте один свежий или размороженный мозг мыши (или сагиттальный полумозгойник, ~0,2-0,5 г) и поместите в гомогенизатор Potter-Elvehjem, предварительно охлажденный в ведре со льдом.
- Раздел
- Добавить 0,173x "объем восстановленного экстракта" воды к прозрачному супернатанту, колпачку, вихрю энергично и центрифуге, как описано на этапе 1.1.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы хлороформ-метанол-водный в соотношении 4:8:5,6. Смесь будет мутной и распадется на две фазы: верхнюю фазу, богатую водой, и нижнюю фазу, богатую хлороформом, в соотношении ~ 4:1. Подождите 60 мин или центрифуга при 450 х г в течение 15 мин для полного разделения фаз. - Переместите верхнюю фазу, которая содержит ганглиозиды, в свежую стеклянную трубку с винтовой крышкой из PTFE.
- Добавить 0,173x "объем восстановленного экстракта" воды к прозрачному супернатанту, колпачку, вихрю энергично и центрифуге, как описано на этапе 1.1.4.
- Хроматография картриджа обратной фазы
- Используя стеклянный шприц объемом 5 мл, промыть твердофазный экстракционный картридж tC18 (400 мг) 3 мл метанола, затем 3 мл хлороформа-метанола-воды (2:43:55). Загрузите верхнюю фазу с шага 1.2.2 на картридж tC18 с помощью того же стеклянного шприца, соберите сквозной поток и перезагрузите его на колонну для оптимизации адсорбции.
- Используя стеклянный шприц, промыть картридж 3 мл хлороформ-метанол-воды (2:43:55), затем 3 мл метанол-воды (1:1).
- Элюируйте ганглиозиды 3 мл метанола в свежую завинчивающуюся трубку. Испаряется до сухости под мягким потоком азота при ≤ 45 °C. Растворяют в метаноле по 1 мл на г исходной ткани влажной массы.
2. Крупномасштабная экстракция и очистка ганглиозидов
ВНИМАНИЕ: При работе с летучими растворителями используйте взрывозащищенные блендеры. Не используйте пластмассы, кроме PTFE. Тетрагидрофуран, хлороформ и этиловый эфир являются токсичными летучими органическими соединениями. Работайте в вытяжном капюшоне с защитными перчатками и защитными очками.
- Извлечение
- Разморозить замороженный бычий мозг при 4 °C в течение нескольких часов. Рассекайте серое вещество от мозговых оболочек и белого вещества.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура описана для 100 ± 20 г изолированного серого вещества мозга и является масштабируемой. - Поместите 100 г серого вещества мозга в блендер и добавьте 1 мл на г влажной массы мозга охлажденного 10 мМ буфера фосфата калия pH 6,8. Гомогенизировать на низком уровне в течение 20 с. Добавьте 8 мл тетрагидрофурана на г живого веса мозга и гомогенизируйте на низком уровне в течение 10 с. Декантировать в стеклянные бутылки-центрифуги и центрифугу при 5 000 х г в течение 15 мин при температуре окружающей среды (22 °C).
- Соберите супернатант, измерьте его объем и переложите в стеклянную сепараторную воронку. Добавьте 0,3 мл этилового эфира на мл надосадочного вещества. Энергично встряхните, затем дайте спокойно постоять в течение 30 минут, в течение которых две фазы, верхняя эфирная фаза и нижняя водная фаза, разделяются. Соберите нижнюю фазу, которая содержит ганглиозиды, в стеклянную бутылку с крышкой из PTFE.
- К верхней (эфирной) фазе, остающейся в сепараторной воронке, добавляют 0,1 мл воды на мл исходного супернатанта (этап 2.1.3). Энергично встряхните, дайте фазам разделиться, соберите нижнюю (водную) фазу и соедините с предыдущей нижней фазой. Испарите комбинированные нижние фазы в сухой порошок и взвесьте.
- Разморозить замороженный бычий мозг при 4 °C в течение нескольких часов. Рассекайте серое вещество от мозговых оболочек и белого вещества.
- Омыление
- Добавить 10 мл 100 мМ водного NaOH на г порошка в герметичный тюбик. Перемешать и инкубировать при 37 °C в течение 3 ч. Дайте остыть и отрегулировать до рН 4,5 путем по каплего добавления 100 мМ водного раствора HCl. Измерьте объем и перенесите в стеклянную сепарационную воронку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сиаловые кислоты являются кислотными лабильными; избегать подкисления ниже рН 4,5. - Исходя из водного объема, добавьте 2,67 объема метанола, аккуратно перемешайте, затем добавьте 1,33 объема хлороформа для создания однофазного раствора хлороформ-метанол-водный (4:8:3). Хорошо перемешать.
- Исходя из исходного водного объема, добавьте 2,6 объема воды, чтобы довести смесь до хлороформ-метанол-водного раствора в соотношении 4:8:5,6. Энергично встряхните, затем дайте спокойно сесть, чтобы разделить две фазы, полярную верхнюю фазу, содержащую ганглиозиды, и неполярную нижнюю фазу. Соберите верхнюю фазу в стеклянную бутылку с крышкой из PTFE.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несиалилированные липиды не будут появляться на тонкослойных хроматографических пластинах (TLC), окрашенных с использованием резорцина, но будут появляться при использовании пятна p-анизальдегида. Целью этого омыления является удаление О-ацетилированных соединений, таких как фосфолипиды.
- Добавить 10 мл 100 мМ водного NaOH на г порошка в герметичный тюбик. Перемешать и инкубировать при 37 °C в течение 3 ч. Дайте остыть и отрегулировать до рН 4,5 путем по каплего добавления 100 мМ водного раствора HCl. Измерьте объем и перенесите в стеклянную сепарационную воронку.
- Обратная фазовая хроматография
- Предварительно промыть крупномасштабную (10 г) твердофазную экстракционную картридж tC18 путем пропускания 50 мл каждого из следующих трех растворителей через колонну с использованием вакуума или давления (<1 мин каждая промывка): метанол, метанол-вода (1:1), затем хлороформ-метанол-вода (2:43:55). Загрузите верхнюю фазу с шага 2.2.3 на колонну вакуумом или давлением, соберите поток, перезагрузите и соберите поток.
- Промыть колонну 30 мл хлороформ-метанол-воды (2:43:55), затем 30 мл метанол-воды (1:1), затем элюировать ганглиозиды 50 мл метанола и снова 10 мл метанола, собирая каждую промывку и каждое элюирование отдельно. Использование TLC (ниже) подтверждает, что ганглиозид отсутствует в потоке и промывается и элюируется при первом элюировании (50 мл метанола). Выпаривают элюированные ганглиозиды в сухой порошок и взвешивают.
ПРИМЕЧАНИЕ: Целью хроматографии tC18 является отделение ганглиозидов как от меньшего, так и от большего количества полярных загрязнителей. Смешанный выход ганглиозидов головного мозга после омыления составляет ~ 120 мг на г сухого экстракта мозга (этап 2.1.4). Появление ганглиозидов TLC в потоке или промывках указывает на то, что твердофазная экстракционная колонна была насыщена. После элюирования метанола колонку можно дополнительно элюировать хлороформом-метанолом (1:1) для захвата меньшего количества полярных липидов.
- ВЭЖХ очистка отдельных ганглиозидов
- Получают ВЭЖХ растворитель А: ацетонитрил-5 мМ водный натрийфосфатный буфер рН 5,6 (83:17) и растворитель В: ацетонитрил-20 мМ натриефосфатный буфер, рН 5,6 (1:1). Дегазировать оба растворителя в течение 5 мин.
- Предварительно уравновешивайте колонну ВЭЖХ (колонна размером 20 x 250 мм, заполненная амино-связанными (NH2) кремнеземными сферами, диаметром 5 мкм, размером пор 100 Å) со 100% растворителем А в течение 20 мин при 5 мл/мин. Установите столбчатый детектор сточных вод УФ-ВЭЖХ на 215 нм.
- Растворить ганглиозидный порошок из элюата обратной фазы в воде по 5 мг/мл. Вводят 0,5 мл ганглиозидной смеси на ВЭЖХ и запускают градиент растворителя (таблица 1) со скоростью 5 мл/мин, собирая фракции. Ганглиозиды будут появляться в виде пиков A215 со временем удержания (основные ганглиозиды мозга) 25-70 мин: GM1 ≈ 28 мин; GD1a ≈ 38 мин; GD1b ≈ 46 мин; GT1b ≈ 65 мин. Повторно уравновешивайте 20 мин растворителем А после каждого прогона. Анализ фракций методом тонкослойной хроматографии.
| Время (мин) | %А | %В |
| 0 | 100 | 0 |
| 7 | 100 | 0 |
| 12 | 63 | 37 |
| 82 | 54 | 46 |
| 82.01 | 0 | 100 |
| 92 | 0 | 100 |
Таблица 1: Градиент растворителя для ВЭЖХ.
3. Тонкослойный хроматографический (TLC) анализ ганглиозидов
ВНИМАНИЕ: Хлороформ является токсичным летучим органическим соединением. Работайте в вытяжном капюшоне с защитными перчатками и защитными очками.
- Запуск растворителя и подготовки пластин TLC
- Готовят работающий растворитель хлороформ-метанол-водный 0,25% KCl (60:35:8 по объему). Перелейте в стеклянную камеру TLC размером 10 см х 10 см с крышкой из нержавеющей стали так, чтобы глубина растворителя составляла ~ 0,5 см. Накройте крышкой и дайте уравновеситься в зоне, свободной от воздушных потоков в течение >10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы изолировать камеру TLC от воздушных потоков, можно построить или приобрести акриловую 5-стороннюю коробку (рисунок 2). Не используйте фильтровальную бумагу, насыщенную растворителем, внутри камеры. - Поместите в сушильную печь со стеклянной пластиной TLC размером 10 см x 10 см или 5 см x 10 см со стеклянной подложкой в сушильную печь при 125 °C в течение 10 минут. Дать остыть. Используйте притупленный карандаш No 2, чтобы нарисовать 5-миллиметровые пятнистые линии с разделением 2 мм вдоль линии на 1 см выше нижней части пластины и не менее 1 см с обеих сторон (рисунок 3). Избегайте нарушения слоя кремнезема во время маркировки.
- Приготовьте стандартную смесь чистых ганглиозидов в метаноле, содержащую 100 мкМ GM1, 50 мкМ GD1a и GD1b и 33 мкМ GT1b.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта смесь содержит 100 пмоль ганглиозидной сиаловой кислоты на мкл для каждого из четырех ганглиозидов, количество, которое обеспечивает сильный колориметрический сигнал путем окрашивания резорцином, которое зависит от сиаловой кислоты.
- Готовят работающий растворитель хлороформ-метанол-водный 0,25% KCl (60:35:8 по объему). Перелейте в стеклянную камеру TLC размером 10 см х 10 см с крышкой из нержавеющей стали так, чтобы глубина растворителя составляла ~ 0,5 см. Накройте крышкой и дайте уравновеситься в зоне, свободной от воздушных потоков в течение >10 мин.
- Ганглиозидное разрешение
- Промыть 10-мкл шприц Гамильтона скошенной иглой с метанолом. Втяните 1 мкл метанола в стеклянный шприц, чтобы заполнить мертвый объем иглы, а затем 1 мкл образца или стандарта. Равномерно нанесите образец на 5-миллиметровые предварительно маркированные линии до тех пор, пока в шприце не останется <1 мкл растворителя (метанола). Дайте пластине высохнуть при температуре окружающей среды (22 °C) после обнаружения всех образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Промывайте шприц метанолом между загрузками образца. Ненагретый воздуходувка, установленная на низком уровне, может использоваться для ускорения сушки. - Поместите пятнистую и высушенную пластину в предварительно уравновешенную камеру TLC с нижним краем, погруженным в работающий растворитель, и накройте крышкой и защитите от воздушных потоков (рисунок 2). Позвольте работающему растворителю продвинуться вверх по пластине капиллярным действием до тех пор, пока передняя часть растворителя не достигнет в пределах 1 см от верхней части пластины. Снимите и пометьте карандашом переднюю часть растворителя по краю пластины. Позвольте растворителям полностью испаряться либо без помех, либо под мягким потоком воздуха.
- Промыть 10-мкл шприц Гамильтона скошенной иглой с метанолом. Втяните 1 мкл метанола в стеклянный шприц, чтобы заполнить мертвый объем иглы, а затем 1 мкл образца или стандарта. Равномерно нанесите образец на 5-миллиметровые предварительно маркированные линии до тех пор, пока в шприце не останется <1 мкл растворителя (метанола). Дайте пластине высохнуть при температуре окружающей среды (22 °C) после обнаружения всех образцов.
Рисунок 2: Оборудование и настройка ганглиозида TLC. Двойная желобная камера заполняется до ≈ 0,5 см с обеих сторон бегущим растворителем. Пластина размещается с одной стороны, а исходный конец погружен в работающий буфер. Камера покрыта акриловой коробкой, чтобы избежать воздушных потоков. Панель A, вид сбоку перед установкой пластины. Уровень растворителя виден на несколько мм выше дна камеры; Панель B, вид спереди во время разработки. Передняя часть растворителя видна примерно на 40% пути вверх по пластине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Окрашивание ганглиозидами
ВНИМАНИЕ: Реагентные пятна токсичны. Соляная кислота коррозионна и токсична. Подготовьте и распылите реагенты в вытяжной капюшон с защитными перчатками и защитными очками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина может быть отображена для качественного анализа изображения или сохранена путем снятия зажимов и закрепления крышки на месте с помощью прозрачной ленты. Количественный анализ может быть выполнен путем измерения денситометрии стандартов ганглиозидов, обнаруженных в соседних полосах.- Приготовьте реагент спрей реагента для обнаружения ганглиозидов на основе их сиаловых кислот. Растворите 6 г резорцина в воде объемом 100 мл для получения 6% запаса резорцина. Растворите 1 г CuSO4 в 100 мл воды, чтобы получить 1% запаса. К 64,7 мл воды добавляют 5 мл из 6% запаса резорцина, 0,31 мл из 1% запаса CuSO4 , затем медленно добавляют 30 мл концентрированного HCl и осторожно перемешивают. Можно хранить при температуре 4 °C в течение месяца.
- В вытяжку с химическим дымом поместите пластину TLC с разрешенными ганглиозидами, происхождение которых заканчивается, в вырезанную картонную коробку, чтобы защитить стенки вытяжки от кислотного распыления. Поместите реагент реагента с распылением резорцина в стеклянный распылитель TLC, прикрепите к источнику азота под давлением и слегка распылите пластину по диагонали в вертикальном и горизонтальном направлениях. Распылите поверхность сорбента TLC равномерно, но слегка.
- Сразу же накройте пластину чистой сухой стеклянной крышкой тех же размеров и закрепите крышку на месте связующими зажимами (рисунок 3). Нагревайте покрытую пластину при 125 °C в течение 20 мин. Ганглиозиды будут казаться темно-фиолетовыми на белом фоне.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина не должна быть влажной после завершения распыления. Накладные пластины могут быть изготовлены путем соскабливания сорбента с ранее использовавшихся пластин TLC с использованием лезвия бритвы с одним лезвием.
ВНИМАНИЕ: Порошок кремнезема токсичен для легких. Используйте маску и утилизируйте кремнезем в герметичный контейнер.
Рисунок 3: Пластина TLC из разрешенного смешанного ганглия. Пластина TLC из разрешенных смешанных стандартов ганглиозидов (левая полоса) и очищенных смешанных ганглиозидов серого вещества крупного рогатого скота (правая полоса) после окрашивания и нагрева резорцина стеклянной крышкой, обрезанной на месте. Стандартными ганглиозидами (сверху вниз) являются GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b, GT1b и GQ1b. После охлаждения пластина может быть изображена и/или крышка заклеена на месте для хранения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Общее окрашивание липидов для ганглиозидов и фосфолипидов.
ВНИМАНИЕ: Серная кислота токсична и коррозионна. Добавление концентрированной кислоты к этанолу является экзотермическим и должно осуществляться медленно. Подготовьте окрашивающий реагент в вытяжной капюшон с защитными перчатками и защитными очками.- Готовят р-анизальдегидное пятно, медленно добавляя 15 мл концентрированной серной кислоты к 500 мл этанола. Перемешивайте в течение 30 минут, чтобы дать раствору остыть, прежде чем продолжить. Добавить 15 мл п-анизальдегида и осторожно перемешать. Его можно хранить при комнатной температуре (22 °C) до шести месяцев.
- В химическом вытяжном шкафу опустите пластину TLC с разрешенными ганглиозидами, происхождение которых заканчивается вниз, в стакан, содержащий пятно p-анизальдегида. Погружайтесь в беговую переднюю часть на ≥ 2 с. Удалите TLC из пятна и дайте стекать. Нагревайте пластину TLC на конфорке при низкой температуре для развития.
ПРИМЕЧАНИЕ: Липиды будут казаться темными на фиолетовом фоне. Окрашивающий раствор может быть восстановлен для повторного использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Методы, описанные в разделе 1 (малый масштаб), обеспечивают ганглиозиды в достаточном количестве и чистоте для качественного и количественного определения основных ганглиозидов мозга. Восстановление из мозга мыши составляет ~ 1 мкмоль ганглиозида на г влажного веса мозга (1 нмоль / мкл) при приготовлении, как описано. Разрешение TLC 1 мкл (1 нмоль) с использованием раздела 3 обеспечивает достаточный материал для обнаружения резорцина и разрешает все основные ганглиозиды мозга, как показано для диких типов и генетически модифицированных мышей на рисунке 4. Хотя смешанные ганглиозиды, полученные с использованием раздела 1, не свободны от других основных липидов, ганглиозиды имеют достаточную чистоту для масс-спектрометрического (MS) определения, как показано на рисунке 5, либо в виде нативных очищенных ганглиозидов в отрицательном режиме, либо после перметилирования в положительном режиме9. Поскольку секция 1 избегает щелочного гидролиза для удаления фосфолипидов, она сохраняет щелочно-чувствительные природные модификации, такие как O-ацетилированные сиаловые кислоты (см. GT1b-OAc, рисунок 4)9.
Рисунок 4: TLC ганглиозидов мозга мыши. TLC ганглиозидов мозга мыши из дикого типа (WT) и St3gal одинарных и двойных нулевых мышей очищены, как в Протоколе 1. Эта цифра была изменена из Sturgill et al, 20129. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: МС перметилированных ганглиозидов мозга мыши дикого типа и St3gal2/3 с двойным нулем очищены, как в разделе 1. Обратите внимание, что GD1a и GD1b разрешаются TLC (рисунок 4), но имеют одинаковую массу, поэтому не различимы одномерным MS. Эта цифра была изменена из Sturgill et al, 20129. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Крупномасштабная очистка (раздел 2) включает экстракцию, омыление (для удаления фосфолипидов) и разрешение ВЭЖХ для обеспечения очищенных основных ганглиозидов мозга GM1, GD1a, GD1b и GT1b, пригодных для биологических экспериментов и для дальнейших химических и ферментативных модификаций. Примерный профиль ВЭЖХ и последующий анализ TLC показаны на рисунке 6. Щелочная обработка (омыление) необходима в этом протоколе для гидролиза и удаления загрязняющих фосфолипидов (рисунок 7), но также будет гидролизовать естественные модификации ганглиозидов, такие как O-ацетилированные сиаловые кислоты, которые могут быть важны в некоторых контекстах10. Для этих применений были опубликованы альтернативные эффективные методы удаления фосфолипидов из изолированных ганглиозидов6.
Рисунок 6: Репрезентативная ВЭЖХ ганглиозидов головного мозга крупного рогатого скота. Градиент элюирования (%B, пунктирная линия) накладывается на поглощение (A215, сплошная линия) в течение первых 75 минут цикла. Пики (A215) были собраны (числа в скобках) и подвергнуты TLC, как в Протоколе 3. Номера полос движения относятся к пиковым номерам на хроматограмме. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Пластина TLC из разрешенного смешанного ганглия. Пластина TLC разрешенных смешанных ганглиозидов стандартов (полоса 1) вместе с пост-омыления разделенными ганглиозидами (полоса 2) и высвобождаемыми жирными кислотами (полоса 3). Липиды, в том числе ганглиозиды, обнаруживаются с пятном п-анизальдегида. Стандартными ганглиозидами (сверху вниз) являются GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b и GT1b. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы мелкой и крупномасштабной экстракции и выделения ганглиозидов, о которых здесь сообщается, не являются уникальными - существует множество различных подходов к экстракции и очистке растворителем, которые обеспечивают отличные результаты12. Методы, описанные здесь для мелкомасштабной очистки мозга, от Fredman и Svennerholm13, показали оптимизацию восстановления и доказали свою надежность и простоту в течение многих лет в нашей лаборатории. Выделение и очистка, подходящие для TLC и MS, могут быть легко завершены, от неповрежденной ткани до изолированных ганглиозидов, за несколько часов. МС может быть выполнен на нативных очищенных ганглиозидах в отрицательном режиме или после перметилирования в положительном режиме (фиг.7, например, см. Sturgill et al.9). Выход очень стабилен, ≈ 1 мкмоль ганглиозида (≈ 2 мкмоль ганглиозид-связанной сиаловой кислоты) на г свежей ткани мозга для большинства млекопитающих. Способ крупномасштабной экстракции и разделения из мозга, представленный здесь, введенный Tettamani et al.14, выбран для минимизации объема ганглиозидсодержащего растворителя при первом разделе (эфир-тетрагидрофуран-вода). Это упрощает последующие шаги, которые могут стать громоздкими с методами, которые генерируют большие объемы разделенных ганглиозидов на первых шагах. Метод ВЭЖХ, описанный из Gazzotti et al.15, имеет относительно высокую емкость и хорошее разрешение основных ганглиозидов мозга.
Описанные мелкомасштабные протоколы хорошо подходят как для клеток, так и для тканей и являются масштабируемыми. Поскольку заключительными этапами являются обратный захват, испарение и повторное растворение в метаноле, они могут быть применены в произвольном масштабе к небольшим образцам, таким как культивируемые нервные клетки. В этом случае мы соскребаем и гомогенизируем клетки в 1 мл воды для удобства и приступаем к добавлению метанола и хлороформа для получения соответствующих соотношений для экстракции, а затем разделения. Окончательные высушенные ганглиозиды после обратной фазы могут быть повторно растворены всего за несколько микролитров и проанализированы С помощью TLC и MS.
Внимание к соотношениям растворителей имеет решающее значение для успеха на этапах экстракции и разделения растворителя для выделения ганглиозидов. Для мелкомасштабной экстракции и разделения были протестированы различные соотношения хлороформ-метанол-вода, и здесь сообщается о тех, которые образуются вблизи количественной изоляции ганглиозидов13. Отклонения от описанных соотношений уменьшат восстановление и/или очистку. Аналогичным образом, внимание к соотношениям растворителей в растворителях, разрабатывающих TLC, имеет решающее значение. Сообщенное соотношение хлороформ-метанол-вода приводит к единой четкой фазе. Небольшие вариации могут привести к мутным развивающимся растворам, которые не следует использовать, но которые могут быть прояснены путем капельного добавления метанола с закручиванием. Хотя различные экстракционные и секционные растворители являются общими, для каждого варианта следует тщательно соблюдать соотношения растворителей12. Изменения в растворителях TLC также распространены для оптимизации разделения конкретных ганглиозидов16. Относительно простым способом модификации TLC-миграции ганглиозидов является изменение водной фазы смеси растворителей. Использование водного гидроксида аммония или хлорида кальция вместо хлорида калия изменяет форму ганглиозидной соли и относительную миграцию TLC17.
В то время как все клетки и ткани позвоночных экспрессируют ганглиозиды, мозг и нервные клетки необычны в больших количествах экспрессии. Протоколы, описанные здесь, применимы к другим тканям и клеткам, но могут потребоваться модификации из-за более низкого изобилия и потенциального загрязнения другими липидами. Эти методы применительно к нейтрофилам человека6 и жировикам мышей18 являются примерами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не претендуют на конкурирующие интересы.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Грантом Общего фонда национальных институтов здравоохранения (NIH) для гликонауки U01CA241953. MJP поддерживался программой химико-биологического интерфейса в Университете Джона Хопкинса (T32GM080189).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine brain, stripped | PelFreez | 57105-1 | |
| Ganglioside standards | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| Glass bottle with PTFE-lined cap | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| Glass centrifuge bottle | Fisher Scientific | 05-586B | |
| Glass culture tubes, 16 x 125 mm | VWR | 60825-430 | for collecting HPLC fractions |
| Glass separatory funnel (2 L) | Pyrex | 6400-2L | |
| Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 µl | Hamilton | 81265 | |
| p-Anisaldehyde, 98% | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Potter-Elvhjem Homogenizer | Fisher Scientific | 08-414-14A | Choose appropriate volume option |
| Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns | Analytics-Shop | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column | Analytics-Shop | custom packed | other sizes available |
| Resorcinol | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-300 | |
| Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml) | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) | Waters | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg | Waters | WAT036810 | |
| Spotting syringe - Hamilton 701N 10 µl | Hamilton | 80300 | |
| Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-933A | |
| Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-955-323 | For ganglioside storage |
| TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat | Fisher Scientific | M1056350001 | Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface |
| TLC reagent sprayer | Fisher Scientific | 05-723-26A | |
| TLC running chamber for 10 x 10 cm plates | Camag | 22.5155 | |
| Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender | Waring | E8520 |
References
- Schnaar, R. L.
- DeMarco, M. L., Woods, R. J. Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces. Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).
- Schnaar, R. L.
- Klenk, E. Über die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids]. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).
- Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells. Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).
- Nimrichter, L., et al.
- Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).
- Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).
- Sturgill, E. R., et al. Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b. Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).
- Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy. Cells. 9 (3), (2020).
- Varki, A., et al. Symbol nomenclature for graphical representations of glycans. Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).
- Schnaar, R. L.
- Svennerholm, L., Fredman, P. A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).
- Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).
- Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures. Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).
- Schnaar, R. L., Needham, L. K.
- Ledeen, R. W., Yu, R. K. Gangliosides: structure, isolation, and analysis. Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).
- Lopez, P. H., et al. Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance. Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).
