Summary
Los gangliósidos son glicoesfingolípidos portadores de ácido siálico que son particularmente abundantes en el cerebro. Su naturaleza anfipática requiere técnicas de extracción y purificación orgánicas / acuosas para garantizar una recuperación óptima y análisis precisos. Este artículo proporciona información general sobre la extracción de gangliósidos a escala analítica y preparativa, la purificación y el análisis de cromatografía de capa delgada.
Abstract
Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que contienen uno o más residuos de ácido siálico. Se encuentran en todas las células y tejidos de vertebrados, pero son especialmente abundantes en el cerebro. Expresados principalmente en la valva externa de las membranas plasmáticas de las células, modulan las actividades de las proteínas de la superficie celular a través de la asociación lateral, actúan como receptores en las interacciones célula-célula y son objetivos para patógenos y toxinas. La desregulación genética de la biosíntesis de gangliósidos en humanos da como resultado trastornos congénitos graves del sistema nervioso. Debido a su naturaleza anfipática, la extracción, purificación y análisis de gangliósidos requieren técnicas que han sido optimizadas por muchos investigadores en los 80 años transcurridos desde su descubrimiento. Aquí, describimos métodos a nivel de banco para la extracción, purificación y análisis cualitativos y cuantitativos preliminares de los principales gangliósidos de tejidos y células que se pueden completar en unas pocas horas. También describimos métodos para el aislamiento y purificación a mayor escala de las principales especies de gangliósidos del cerebro. Juntos, estos métodos proporcionan acceso a escala analítica y preparativa a esta clase de moléculas bioactivas.
Introduction
Los gangliósidos se definen como glicoesfingolípidos que contienen uno o más residuos de ácido siálico1. Se expresan principalmente en la superficie celular con su fracción lipídica de ceramida hidrofóbica incrustada en la valva externa de la membrana plasmática y sus glicanos hidrófilos que se extienden hacia el espacio extracelular2. Aunque se distribuyen ampliamente en las células y tejidos de los vertebrados, son particularmente abundantes en el cerebro de los vertebrados3, donde fueron descubiertos y nombrados por primera vez4.
Las estructuras de los glicanos gangliósidos varían y son la base de su nomenclatura (Figura 1). Los glicanos gangliósidos se componen de un núcleo de azúcar neutro que contiene diferentes números y distribuciones de ácidos siálicos. El gangliósido más pequeño, GM4, tiene sólo dos azúcares (ácido siálico unido a la galactosa)5. Los gangliósidos naturales más grandes pueden contener más de una docena de azúcares totales6 o hasta siete ácidos siálicos en un solo núcleo neutro7. Sus fracciones lipídicas de ceramida también varían, teniendo diferentes longitudes de esfingosina y una variedad de amidas de ácidos grasos. En el cerebro de los vertebrados predominan cuatro especies de gangliósidos, GM1, GD1a, GD1b y GT1b. La expresión gangliósida está regulada por el desarrollo, específica del tejido y específica del tipo de célula.
Figura 1: Principales gangliósidos cerebrales y sus precursores biosintéticos. Las estructuras se muestran utilizando la nomenclatura de símbolos para glicanos11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los gangliósidos funcionan a nivel molecular al involucrar y modular proteínas en sus propias membranas (regulación cis) o al involucrar proteínas de unión a glicanos en el medio extracelular, incluidas las toxinas bacterianas y las lectinas en otras células (reconocimiento trans)3. La unión específica de gangliósidos a proteínas reguladoras y/o la autoasociación con otras moléculas en balsas lipídicas da como resultado cambios en el comportamiento celular que afectan la estructura y función del sistema nervioso, la progresión del cáncer, el metabolismo, la inflamación, las proteinopatías neuronales y las enfermedades infecciosas8. Debido a sus diversas funciones celulares, los métodos para su aislamiento y análisis pueden proporcionar una mayor comprensión de la regulación de los procesos fisiológicos y patológicos. Aquí, se proporcionan métodos validados para la extracción y el análisis rápidos a pequeña escala, y el aislamiento a escala preparativa de gangliósidos del cerebro. Se discuten las oportunidades y desafíos para la aplicación a otros tejidos.
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Protocol
La recolección de tejidos se realizó en condiciones autorizadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Johns Hopkins.
1. Extracción de gangliósidos a pequeña escala y purificación parcial
PRECAUCIÓN: Use ventilación adecuada cuando trabaje con solventes volátiles y tóxicos. Evite el plástico en todas partes; los disolventes extraerán componentes químicos de muchos plásticos que interfieren con los análisis posteriores. El politetrafluoroetileno (PTFE) es una excepción; Se deben usar cierres revestidos de PTFE para tapar los viales de almacenamiento de vidrio.
- Extracción
- Pesar un solo cerebro de ratón fresco o descongelado (o medio cerebro sagital, ~ 0.2-0.5 g) y colocarlo en un homogeneizador Potter-Elvehjem prechillado en un cubo de hielo.
NOTA: Los cerebros previamente congelados se pueden usar después de la descongelación a 0-4 ° C. - Añadir 4,1 mL por g de peso de agua húmeda de tejido y homogeneizar con 10 golpes.
NOTA: Las proporciones precisas de disolventes son clave para una extracción y partición óptimas, el objetivo es cloroformo-metanol-acuoso (4: 8: 3) asumiendo que el tejido cerebral es 80% acuoso. - Añadir 13 ml por g de peso húmedo tisular de metanol, cambiar a temperatura ambiente (22 °C) y mezclar.
NOTA: La solución aparecerá nublada. La adición de metanol en este paso, sin cloroformo, optimiza la precipitación de proteínas. Todos los pasos posteriores son a temperatura ambiente (22 °C). - Transfiera a un tubo de vidrio de paredes gruesas con tapón de rosca con una tapa de rosca forrada de PTFE a temperatura ambiente (22 ° C) y mezcle bien. Agregue 6.5 ml por g de peso húmedo tisular de cloroformo, tapa y mezcle bien. Centrifugadora a 450 x g durante 15 min. Transfiera el sobrenadante transparente a un tubo fresco con tapa de rosca y mida el volumen, "volumen de extracto recuperado".
- Pesar un solo cerebro de ratón fresco o descongelado (o medio cerebro sagital, ~ 0.2-0.5 g) y colocarlo en un homogeneizador Potter-Elvehjem prechillado en un cubo de hielo.
- Partición
- Agregue 0.173x "volumen de extracto recuperado" de agua al sobrenadante transparente, la tapa, el vórtice y la centrífuga como se describe en el paso 1.1.4.
NOTA: El objetivo es tener cloroformo-metanol-acuoso en la proporción 4:8:5.6. La mezcla estará turbia y se resolverá en dos fases: una fase superior rica en acuoso y una fase inferior rica en cloroformo en una proporción de ~ 4: 1. Espere 60 minutos o centrífuga a 450 x g durante 15 minutos para una separación de fase completa. - Transfiera la fase superior, que contiene los gangliósidos, a un tubo de vidrio fresco con una tapa de rosca forrada de PTFE.
- Agregue 0.173x "volumen de extracto recuperado" de agua al sobrenadante transparente, la tapa, el vórtice y la centrífuga como se describe en el paso 1.1.4.
- Cromatografía de cartucho de fase inversa
- Con una jeringa de vidrio de 5 ml, lave un cartucho de extracción en fase sólida tC18 (400 mg) con 3 ml de metanol, luego 3 ml de cloroformo-metanol-agua (2:43:55). Cargue la fase superior del paso 1.2.2 en el cartucho tC18 con la misma jeringa de vidrio, recoja el flujo y vuelva a cargarlo en la columna para optimizar la adsorción.
- Con la jeringa de vidrio, lave el cartucho con 3 ml de cloroformo-metanol-agua (2:43:55) y luego 3 ml de metanol-agua (1:1).
- Eluya los gangliósidos con 3 ml de metanol en un tubo fresco con tapa de rosca. Evaporar hasta la sequedad bajo una suave corriente de nitrógeno a ≤ 45 °C. Disolver en metanol a 1 mL por g de peso húmedo del tejido original.
2. Extracción y purificación de gangliósidos a gran escala
PRECAUCIÓN: Cuando trabaje con disolventes volátiles, use licuadoras resistentes a explosiones. No utilice plásticos excepto PTFE. El tetrahidrofurano, el cloroformo y el éter etílico son compuestos orgánicos volátiles tóxicos. Trabaje en una campana extractora con guantes protectores y gafas de seguridad.
- Extracción
- Descongelar el cerebro bovino congelado a 4 °C durante varias horas. Diseccionar la materia gris de las meninges y la materia blanca.
NOTA: El siguiente procedimiento se describe para 100 ± 20 g de materia gris cerebral aislada y es escalable. - Coloque 100 g de materia gris cerebral en una licuadora y agregue 1 ml por g de peso húmedo cerebral de 10 mM de tampón de fosfato de potasio refrigerado pH 6.8. Homogeneizar en bajo durante 20 s. Añadir 8 mL de tetrahidrofurano por g de peso húmedo cerebral y homogeneizar en bajo durante 10 s. Decantar en botellas centrífugas de vidrio y centrifugar a 5.000 x g durante 15 min a temperatura ambiente (22 °C).
- Recoja el sobrenadante, mida su volumen y transfiéralo a un embudo separador de vidrio. Añadir 0,3 ml de éter etílico por ml del sobrenadante. Agite vigorosamente, luego deje reposar sin ser molestado durante 30 minutos durante los cuales se separan dos fases, una fase superior de éter y una fase acuosa inferior. Recoja la fase inferior, que contiene los gangliósidos, en una botella de vidrio con una tapa forrada de PTFE.
- A la fase superior (éter) que queda en el embudo separador, agregue 0,1 ml de agua por ml de sobrenadante original (paso 2.1.3). Agitar vigorosamente, dejar que las fases se separen, recoger la fase inferior (acuosa) y combinar con la fase inferior anterior. Evaporar las fases inferiores combinadas a un polvo seco y pesar.
- Descongelar el cerebro bovino congelado a 4 °C durante varias horas. Diseccionar la materia gris de las meninges y la materia blanca.
- Saponificación
- Añadir 10 mL de NaOH acuoso de 100 mM por g de polvo en un tubo sellado. Mezclar e incubar a 37 °C durante 3 h. Deje enfriar y ajustar a pH 4.5 mediante la adición en gota de HCl acuoso de 100 mM. Mida el volumen y transfiéralo a un embudo separador de vidrio.
NOTA: Los ácidos siálicos son ácido lábil; evitar la acidificación por debajo de pH 4.5. - Sobre la base del volumen acuoso, agregue 2.67 volúmenes de metanol, mezcle suavemente, luego agregue 1.33 volúmenes de cloroformo para crear una solución monofásica de cloroformo-metanol-acuoso (4: 8: 3). Mezclar bien.
- Sobre la base del volumen acuoso original, agregue 2.6 volúmenes de agua para llevar la mezcla a cloroformo-metanol-acuoso a una proporción de 4: 8: 5.6. Agite vigorosamente, luego deje reposar sin ser molestado para separar dos fases, una fase superior polar que contiene los gangliósidos y una fase inferior no polar. Recoge la fase superior en una botella de vidrio con una tapa forrada de PTFE.
NOTA: Los lípidos no sialados no aparecerán en las placas de cromatografía de capa delgada (TLC) teñidas con resorcinol, pero aparecerán cuando se use una tinción de p-anisaldehído. El propósito de esta saponificación es eliminar los compuestos O-acetilados como los fosfolípidos.
- Añadir 10 mL de NaOH acuoso de 100 mM por g de polvo en un tubo sellado. Mezclar e incubar a 37 °C durante 3 h. Deje enfriar y ajustar a pH 4.5 mediante la adición en gota de HCl acuoso de 100 mM. Mida el volumen y transfiéralo a un embudo separador de vidrio.
- Cromatografía en fase inversa
- Prelavado de un cartucho de extracción en fase sólida tC18 a gran escala (10 g) pasando 50 ml de cada uno de los siguientes tres disolventes a través de la columna utilizando vacío o presión (<1 min cada lavado): metanol, metanol-agua (1:1), luego cloroformo-metanol-agua (2:43:55). Cargue la fase superior del paso 2.2.3 en la columna por vacío o presión, recoja el flujo, recargue y recoja el flujo a través.
- Lave la columna con 30 ml de cloroformo-metanol-agua (2:43:55), luego 30 ml de metanol-agua (1:1), luego eluya los gangliósidos con 50 ml de metanol, y nuevamente con 10 ml de metanol, recogiendo cada lavado y cada elución por separado. Usando TLC (abajo) confirme que el gangliósido está ausente del flujo a través y se lava y eluye en la primera elución (50 ml de metanol). Evaporar los gangliósidos eluidos a un polvo seco y pesar.
NOTA: El propósito de la cromatografía tC18 es separar los gangliósidos de menos y más contaminantes polares. El rendimiento mixto de gangliósidos cerebrales después de la saponificación es de ~ 120 mg por g de extracto de cerebro seco (paso 2.1.4). La aparición de gangliósidos por TLC en el flujo a través o lavados indica que la columna de extracción en fase sólida estaba saturada. Después de la elución del metanol, la columna puede ser eluida con cloroformo-metanol (1:1) para capturar menos lípidos polares.
- Purificación por HPLC de gangliósidos individuales
- Preparar el disolvente HPLC A: tampón de fosfato de sodio acuoso de acetonitrilo-5 mM pH 5.6 (83:17) y el disolvente B: tampón de fosfato de sodio acetonitrilo-20 mM, pH 5.6 (1:1). Desgasificar ambos disolventes durante 5 min.
- Preequilibre una columna de HPLC (columna de 20 x 250 mm empaquetada con esferas de sílice unidas amina (NH2), diámetro de 5 μm, tamaño de poro de 100 Å) con 100% disolvente A durante 20 min a 5 ml / min. Ajuste un detector de efluentes de columna UV HPLC a 215 nm.
- Disolver el polvo gangliósido de la fase inversa eluido en agua a 5 mg/ml. Inyectar 0,5 ml de la mezcla gangliósida sobre el HPLC y ejecutar el gradiente de disolvente (Tabla 1) a 5 ml/min, recogiendo fracciones. Los gangliósidos aparecerán como picos de A215 con tiempos de retención (gangliósidos cerebrales mayores) de 25-70 min: GM1 ≈ 28 min; GD1a ≈ 38 min; GD1b ≈ 46 min; GT1b ≈ 65 min. Reequilibrar 20 min con disolvente A después de cada carrera. Analizar fracciones por cromatografía de capa fina.
| Tiempo (min) | %A | %B |
| 0 | 100 | 0 |
| 7 | 100 | 0 |
| 12 | 63 | 37 |
| 82 | 54 | 46 |
| 82.01 | 0 | 100 |
| 92 | 0 | 100 |
Tabla 1: Gradiente de disolvente para HPLC.
3. Análisis de cromatografía en capa fina (TLC) de gangliósidos
PRECAUCIÓN: El cloroformo es un compuesto orgánico volátil tóxico. Trabaje en una campana extractora con guantes protectores y gafas de seguridad.
- Preparación de disolventes y placas TLC
- Prepare un disolvente corriente de cloroformo-metanol-acuoso 0.25% KCl (60:35:8 por volumen). Vierta en una cámara TLC de vidrio de 10 cm x 10 cm con una cubierta de acero inoxidable para que la profundidad del disolvente sea de ~ 0,5 cm. Cubra y deje equilibrar en un área libre de corrientes de aire durante >10 min.
NOTA: Para aislar la cámara TLC de las corrientes de aire, se puede construir o comprar una caja acrílica de 5 lados (Figura 2). No utilice papel de filtro saturado de disolvente dentro de la cámara. - Coloque una placa TLC de alto rendimiento con respaldo de vidrio recubierta de gel de sílice de 10 cm x 10 cm o 5 cm x 10 cm en un horno de secado a 125 °C durante 10 min. Dejar enfriar. Use un lápiz #2 opaco para dibujar líneas de manchado de 5 mm con separaciones de 2 mm a lo largo de una línea 1 cm por encima de la parte inferior de la placa y al menos 1 cm desde cada lado (Figura 3). Evite perturbar la capa de sílice mientras marca.
- Preparar una mezcla estándar de gangliósidos puros en metanol que contenga 100 μM GM1, 50 μM cada uno de GD1a y GD1b y 33 μM de GT1b.
NOTA: Esta mezcla contiene 100 pmol de ácido siálico gangliósido por μL para cada uno de los cuatro gangliósidos, una cantidad que proporciona una fuerte señal colorimétrica por tinción de resorcinol, que depende del ácido siálico.
- Prepare un disolvente corriente de cloroformo-metanol-acuoso 0.25% KCl (60:35:8 por volumen). Vierta en una cámara TLC de vidrio de 10 cm x 10 cm con una cubierta de acero inoxidable para que la profundidad del disolvente sea de ~ 0,5 cm. Cubra y deje equilibrar en un área libre de corrientes de aire durante >10 min.
- Resolución gangliosa
- Lave una jeringa Hamilton de 10 μL con una aguja biselada con metanol. Extraiga 1 μL de metanol en una jeringa de vidrio para llenar el volumen muerto de la aguja y luego 1 μL de muestra o estándar. Coloque la muestra uniformemente en las líneas premarcadas de 5 mm hasta que quede <1 μL de disolvente (metanol) en la jeringa. Deje que la placa se seque a temperatura ambiente (22 °C) después de que se detecten todas las muestras.
NOTA: Lave la jeringa con metanol entre la carga de la muestra. Se puede usar un soplador de aire sin calefacción a baja altura para acelerar el secado. - Coloque la placa manchada y seca en la cámara TLC preequilibrada con el borde inferior sumergido en el disolvente en funcionamiento y cubra y proteja de las corrientes de aire (Figura 2). Permita que el disolvente en funcionamiento avance hacia arriba de la placa por acción capilar hasta que el frente del disolvente alcance dentro de 1 cm de la parte superior de la placa. Retire y marque el frente del disolvente en el borde de la placa con un lápiz. Permita que los disolventes se evaporen completamente, ya sea sin perturbaciones o bajo un flujo de aire suave.
- Lave una jeringa Hamilton de 10 μL con una aguja biselada con metanol. Extraiga 1 μL de metanol en una jeringa de vidrio para llenar el volumen muerto de la aguja y luego 1 μL de muestra o estándar. Coloque la muestra uniformemente en las líneas premarcadas de 5 mm hasta que quede <1 μL de disolvente (metanol) en la jeringa. Deje que la placa se seque a temperatura ambiente (22 °C) después de que se detecten todas las muestras.
Figura 2: Equipo y configuración de Ganglioside TLC. Una cámara de doble canal se llena para ≈ 0,5 cm en ambos lados con disolvente de funcionamiento. La placa se coloca contra un lado con el extremo de origen sumergido en el búfer de funcionamiento. La cámara está cubierta con una caja de acrílico para evitar corrientes de aire. Panel A, vista lateral antes de la inserción de la placa. El nivel de disolvente es visible unos pocos mm por encima del fondo de la cámara; Panel B, vista frontal durante el desarrollo. El frente del disolvente es visible en aproximadamente el 40% del camino hacia arriba de la placa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Tinción gangliosa
PRECAUCIÓN: Las manchas de reactivo son tóxicas. El ácido clorhídrico es corrosivo y tóxico. Prepare y rocíe los reactivos en una campana extractora con guantes protectores y gafas de seguridad.
NOTA: La placa se puede obtener una imagen para un análisis cualitativo de la imagen o almacenarse quitando las abrazaderas y asegurando la placa de la cubierta en su lugar con cinta transparente. El análisis cuantitativo se puede realizar midiendo la densitometría de los estándares gangliósidos detectados en carriles adyacentes.- Preparar reactivo en spray de resorcinol para la detección de gangliósidos en función de sus ácidos siálicos. Disolver 6 g de resorcinol en 100 ml de agua para obtener un stock de resorcinol al 6%. Disolver 1 g de CuSO4 en 100 ml de agua para hacer un stock del 1%. A 64.7 ml de agua, agregue 5 ml del stock de resorcinol al 6%, 0.31 ml del stock de CuSO4 al 1%, luego agregue lentamente 30 ml de HCl concentrado y revuelva suavemente. Puede almacenarse a 4 °C durante un mes.
- En una campana de humos químicos, coloque la placa TLC con gangliósidos resueltos, origen final, en una caja de cartón cortada para proteger las paredes de la campana del aerosol ácido. Coloque el reactivo de pulverización de resorcinol en un pulverizador TLC de vidrio, conéctelo a una fuente de nitrógeno presurizado y rocíe ligeramente la placa en diagonal en las direcciones vertical y horizontal. Rocíe la superficie del sorbente TLC de manera uniforme, pero ligera.
- Cubra inmediatamente la placa con una placa de cubierta de vidrio seco limpio de las mismas dimensiones y asegure la placa de cubierta en su lugar con clips aglutinantes (Figura 3). Calentar la placa cubierta a 125 °C durante 20 min. Los gangliósidos aparecerán de color púrpura oscuro sobre un fondo blanco.
NOTA: La placa no debe aparecer húmeda cuando se complete la pulverización. Las placas de cubierta se pueden moldear raspando el sorbente de las placas TLC utilizadas anteriormente utilizando una cuchilla de afeitar de un solo filo.
PRECAUCIÓN: El polvo de sílice es tóxico para los pulmones. Use una máscara y deseche la sílice en un recipiente sellado.
Figura 3: Placa TLC de gangliósido mixto resuelto. Placa TLC de estándares gangliósidos mixtos resueltos (carril izquierdo) y gangliósidos de materia gris bovina mixta purificada (carril derecho) después de la tinción y calentamiento de resorcinol con placa de cubierta de vidrio recortada en su lugar. Los gangliósidos estándar (de arriba a abajo) son GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b, GT1b y GQ1b. Después del enfriamiento, la placa se puede tomar imágenes y / o la placa de cubierta se puede pegar con cinta adhesiva en su lugar para su almacenamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Tinción general de lípidos para gangliósidos y fosfolípidos.
PRECAUCIÓN: El ácido sulfúrico es tóxico y corrosivo. La adición de ácido concentrado al etanol es exotérmica y debe hacerse lentamente. Prepare el reactivo de tinción en una campana extractora con guantes protectores y gafas de seguridad.- Prepare la tinción de p-anisaldehído agregando lentamente 15 ml de ácido sulfúrico concentrado a 500 ml de etanol. Revuelva durante 30 minutos para permitir que la solución se enfríe antes de continuar. Agregue 15 ml de p-anisaldehído y revuelva suavemente. Esto puede almacenarse a temperatura ambiente (22 °C) hasta seis meses.
- En una campana de humos químicos, sumerja la placa TLC con gangliósidos resueltos, extremo de origen hacia abajo, en un vaso de precipitados que contenga la mancha de p-anisaldehído. Sumergirse en el frente de carrera durante ≥ 2 s. Retire el TLC de la mancha y deje que drene. Calentar la placa TLC en una placa caliente a baja temperatura para que se desarrolle.
NOTA: Los lípidos aparecerán oscuros sobre un fondo púrpura. La solución de tinción se puede recuperar para su uso repetido.
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Representative Results
Los métodos descritos en la sección 1 (pequeña escala) proporcionan gangliósidos en cantidad y pureza suficientes para la determinación cualitativa y cuantitativa de los principales gangliósidos cerebrales. La recuperación del cerebro del ratón es de ~ 1 μmol de gangliósido por g de peso húmedo cerebral (1 nmol / μL) cuando se prepara como se describe. La resolución TLC de 1 μL (1 nmol) utilizando la sección 3 proporciona un amplio material para la detección de resorcinol y resuelve todos los principales gangliósidos cerebrales como se muestra para ratones de tipo salvaje y genéticamente modificados en la Figura 4. Aunque los gangliósidos mixtos preparados con la sección 1 no están libres de otros lípidos importantes, los gangliósidos son de pureza suficiente para la determinación espectrométrica de masas (EM) como se muestra en la Figura 5, ya sea como gangliósidos purificados nativos en modo negativo o después de la permetilación en modo positivo9. Dado que la sección 1 evita la hidrólisis alcalina para eliminar los fosfolípidos, conserva las modificaciones naturales sensibles a los álcalis, como los ácidos siálicos O-acetilados (ver GT1b-OAc, Figura 4)9.
Figura 4: TLC de gangliósidos cerebrales de ratón. TLC de gangliósidos cerebrales de ratón de tipo salvaje (WT) y St3gal de ratones simples y dobles nulos purificados como en el Protocolo 1. Esta cifra ha sido modificada a partir de Sturgill et al, 20129. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: EM de gangliósidos cerebrales de ratón permetilados de tipo salvaje y St3gal2/3-doble-nulo purificados como en la sección 1. Tenga en cuenta que GD1a y GD1b se resuelven por TLC (Figura 4) pero tienen la misma masa, por lo que no se distinguen por MS unidimensional. Esta cifra ha sido modificada a partir de Sturgill et al, 20129. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La purificación a gran escala (sección 2) incluye la extracción, la saponificación (para eliminar fosfolípidos) y la resolución de HPLC para proporcionar gangliósidos cerebrales principales purificados GM1, GD1a, GD1b y GT1b adecuados para experimentos biológicos y para modificaciones químicas y enzimáticas adicionales. En la Figura 6 se muestra un perfil de HPLC ejemplar y el posterior análisis de TLC. El tratamiento alcalino (saponificación) es necesario en este protocolo para hidrolizar y eliminar fosfolípidos contaminantes (Figura 7) pero también hidrolizará las modificaciones naturales de los gangliósidos, como los ácidos siálicos O-acetilados, que pueden ser importantes en algunos contextos10. Para estas aplicaciones, se han publicado métodos alternativos efectivos para la eliminación de fosfolípidos de gangliósidos aislados6.
Figura 6: HPLC representativo de gangliósidos cerebrales bovinos. El gradiente de elución (%B, línea punteada) se superpone en la absorbancia (A215, línea sólida) durante los primeros 75 min del ciclo. Los picos (A215) se recogieron (números entre paréntesis) y se sometieron a TLC como en el Protocolo 3. Los números de carril se refieren a los números máximos en el cromatograma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Placa TLC de gangliósido mixto resuelto. Placa TLC de estándares de gangliósidos mixtos resueltos (carril 1) junto con gangliósidos particionados posteriores a la saponificación (carril 2) y ácidos grasos liberados (carril 3). Los lípidos, incluidos los gangliósidos, se detectan con la tinción de p-anisaldehído. Los gangliósidos estándar (de arriba a abajo) son GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b y GT1b. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los métodos para la extracción y el aislamiento de gangliósidos a pequeña y gran escala reportados aquí no son únicos: existen muchos enfoques diferentes de extracción y purificación con solventes que proporcionan excelentes resultados12. Los métodos reportados aquí para la purificación a pequeña escala del cerebro, de Fredman y Svennerholm13, demostraron optimizar la recuperación y han demostrado ser robustos y sencillos durante muchos años en nuestro laboratorio. El aislamiento y la purificación adecuados para TLC y MS se pueden completar fácilmente, desde tejido intacto hasta gangliósidos aislados, en unas pocas horas. La EM se puede realizar en gangliósidos purificados nativos en el modo negativo o después de la permetilación en el modo positivo (Figura 7, por ejemplo, ver Sturgill et al.9). El rendimiento es muy consistente, ≈ 1 μmol de gangliósido (≈ 2 μmol de ácido siálico unido a gangliósidos) por g de tejido cerebral fresco para la mayoría de los mamíferos. El método de extracción y partición a gran escala del cerebro aquí descrito, introducido por Tettamani et al.14, se selecciona para minimizar el volumen de disolvente que contiene gangliósidos en la primera partición (éter-tetrahidrofurano-agua). Esto simplifica los pasos posteriores que pueden llegar a ser engorrosos con técnicas que generan grandes volúmenes de gangliósidos particionados en los primeros pasos. El método de HPLC descrito, de Gazzotti et al.15, tiene una capacidad relativamente alta y una buena resolución de los principales gangliósidos cerebrales.
Los protocolos a pequeña escala descritos son adecuados tanto para células como para tejidos y son escalables. Dado que los pasos finales son la captura de fase inversa, la evaporación y la redisolución en metanol, se pueden aplicar a una escala arbitraria a muestras pequeñas, como las células nerviosas cultivadas. En este caso, raspamos y homogeneizamos las células en 1 ml de agua para mayor comodidad y procedemos con la adición de metanol y cloroformo para generar las proporciones apropiadas para la extracción y luego la partición. Los gangliósidos secos finales después de la fase inversa se pueden redisuelve en solo unos pocos microlitros y se analizan por TLC y MS.
La atención a las proporciones de disolventes es fundamental para el éxito en los pasos de extracción y partición de disolventes para el aislamiento de gangliósidos. Para la extracción y partición a pequeña escala, se probaron diferentes proporciones de cloroformo-metanol-agua y aquí se reportan las que generaron un aislamiento casi cuantitativo de gangliósidos13. Las variaciones de las proporciones descritas disminuirán la recuperación y / o purificación. Del mismo modo, la atención a las proporciones de disolventes en el desarrollo de disolventes TLC es fundamental. Las proporciones cloroformo-metanol-agua reportadas dan como resultado una sola fase clara. Pequeñas variaciones pueden producir soluciones de desarrollo turbias que no deben usarse, pero que pueden aclararse mediante la adición de metanol con remolinos. Aunque son comunes los diferentes disolventes de extracción y partición, las proporciones de disolvente deben seguirse cuidadosamente para cada variación12. Las alteraciones en los disolventes TLC también son comunes para optimizar la separación de gangliósidos específicos16. Una forma relativamente sencilla de modificar la migración TLC de los gangliósidos es cambiar la fase acuosa de la mezcla de disolventes. El uso de hidróxido de amonio acuoso o cloruro de calcio en lugar de cloruro de potasio altera la forma de sal gangliósida y la migración relativa de TLC17.
Mientras que todas las células y tejidos vertebrados expresan gangliósidos, el cerebro y las células nerviosas son inusuales en las altas cantidades expresadas. Los protocolos descritos aquí son aplicables a otros tejidos y células, pero pueden ser necesarias modificaciones debido a la menor abundancia y la posible contaminación con otros lípidos. Estos métodos aplicados a neutrófilos humanos6 y adiposos de ratón18 proporcionan ejemplos.
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Disclosures
Los autores no alegan intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención U01CA241953 del Fondo Común para la Glicociencia de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). MJP fue apoyado por el Programa de Interfaz Química-Biología en Johns Hopkins (T32GM080189).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine brain, stripped | PelFreez | 57105-1 | |
| Ganglioside standards | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| Glass bottle with PTFE-lined cap | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| Glass centrifuge bottle | Fisher Scientific | 05-586B | |
| Glass culture tubes, 16 x 125 mm | VWR | 60825-430 | for collecting HPLC fractions |
| Glass separatory funnel (2 L) | Pyrex | 6400-2L | |
| Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 µl | Hamilton | 81265 | |
| p-Anisaldehyde, 98% | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Potter-Elvhjem Homogenizer | Fisher Scientific | 08-414-14A | Choose appropriate volume option |
| Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns | Analytics-Shop | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column | Analytics-Shop | custom packed | other sizes available |
| Resorcinol | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-300 | |
| Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml) | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) | Waters | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg | Waters | WAT036810 | |
| Spotting syringe - Hamilton 701N 10 µl | Hamilton | 80300 | |
| Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-933A | |
| Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-955-323 | For ganglioside storage |
| TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat | Fisher Scientific | M1056350001 | Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface |
| TLC reagent sprayer | Fisher Scientific | 05-723-26A | |
| TLC running chamber for 10 x 10 cm plates | Camag | 22.5155 | |
| Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender | Waring | E8520 |
References
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