Summary
Gangliosider är sialinsyrabärande glykosfingolipider som är särskilt rikliga i hjärnan. Deras amfipatiska natur kräver organiska/vattenhaltiga extraktions- och reningstekniker för att säkerställa optimal återvinning och noggranna analyser. Den här artikeln innehåller översikter över analytisk och preparativ skala gangliosidextraktion, rening och tunnskiktskromatografianalys.
Abstract
Gangliosider är glykosfingolipider som innehåller en eller flera sialinsyrarester. De finns på alla ryggradsdjurs celler och vävnader men är särskilt rikliga i hjärnan. Uttryckt främst på den yttre bipacksedeln i cellernas plasmamembran modulerar de aktiviteterna hos cellytproteiner via lateral association, fungerar som receptorer i cell-cellinteraktioner och är mål för patogener och toxiner. Genetisk dysregulering av gangliosidbiosyntes hos människor resulterar i allvarliga medfödda nervsystemet. På grund av deras amfipatiska natur kräver extraktion, rening och analys av gangliosider tekniker som har optimerats av många utredare under de 80 åren sedan deras upptäckt. Här beskriver vi bänknivåmetoder för extraktion, rening och preliminära kvalitativa och kvantitativa analyser av större gangliosider från vävnader och celler som kan slutföras på några timmar. Vi beskriver också metoder för storskalig isolering och rening av större gangliosidarter från hjärnan. Tillsammans ger dessa metoder analytisk och preparativ skala tillgång till denna klass av bioaktiva molekyler.
Introduction
Gangliosider definieras som glykosfingolipider som bär på en eller flera sialinsyrarester1. De uttrycks främst vid cellytan med sin hydrofoba ceramidlipiddel inbäddad i plasmamembranets yttre bipacksedel och deras hydrofila glykaner som sträcker sig in i det extracellulära utrymmet2. Även om de förekommer i stor utsträckning i ryggradsdjurens celler och vävnader är de särskilt rikliga i ryggradsdjurens hjärna3, där de först upptäcktes och namngavs4.
Strukturerna hos gangliosidglykaner varierar och ligger till grund för deras nomenklatur (figur 1). Gangliosidglykaner består av en neutral sockerkärna som bär olika antal och fördelningar av sialinsyror. Den minsta gangliosiden, GM4, har endast två sockerarter (sialinsyra bunden till galaktos)5. Större naturligt förekommande gangliosider kan innehålla långt över ett dussin sockerarter totalt6 eller upp till sju sialinsyror på en enda neutral kärna7. Deras ceramidlipiddel varierar också, med olika sfingosinlängder och en mängd olika fettsyraamider. I ryggradsdjurens hjärna dominerar fyra gangliosidarter, GM1, GD1a, GD1b och GT1b. Gangliosiduttryck är utvecklingsreglerat, vävnadsspecifikt och celltypsspecifikt.
Figur 1: Stora hjärngangliosider och deras biosyntetiska prekursorer. Strukturer visas med symbolnomenklatur för glykaner11. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Gangliosider fungerar på molekylär nivå genom att engagera och modulera proteiner i sina egna membran (cis-reglering) eller genom att engagera glykanbindande proteiner i den extracellulära miljön, inklusive bakterietoxiner och lektiner på andra celler (transigenkänning)3. Specifik bindning av gangliosider till reglerande proteiner och/eller självassociation med andra molekyler i lipidflottar resulterar i förändringar i cellbeteende som påverkar nervsystemets struktur och funktion, cancerprogression, metabolism, inflammation, neuronala proteinopatier och infektionssjukdomar8. På grund av deras olika cellulära roller kan metoder för deras isolering och analys ge ökad insikt i regleringen av fysiologiska och patologiska processer. Här tillhandahålls validerade metoder för snabb småskalig extraktion och analys samt preparativ skalisolering av gangliosider från hjärnan. Möjligheter och utmaningar för applicering på andra vävnader diskuteras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vävnadsinsamling utfördes under förhållanden som godkänts av Johns Hopkins Animal Care and Use Committee.
1. Småskalig gangliosidutvinning och partiell rening
VARNING: Använd lämplig ventilation när du arbetar med flyktiga och giftiga lösningsmedel. Undvik plast hela tiden; lösningsmedel kommer att extrahera kemiska komponenter från många plaster som stör efterföljande analyser. Polytetrafluoretylen (PTFE) är ett undantag; PTFE-fodrade förslutningar bör användas för att täcka glasförvaringsflaskor.
- Extraktion
- Väg en enda färsk eller tinad mushjärna (eller sagittal halvhjärna, ~ 0,2-0,5 g) och placera i en Potter-Elvehjem homogenisator förklämd i en hink med is.
OBS: Tidigare frusna hjärnor kan användas efter upptining vid 0-4 ° C. - Tillsätt 4,1 ml per g vävnad våt vikt vatten och homogenisera med 10 slag.
OBS: Exakta lösningsmedelsförhållanden är nyckeln till optimal extraktion och partition, målet är kloroform-metanol-vattenhaltig (4: 8: 3) förutsatt att hjärnvävnaden är 80% vattenhaltig. - Tillsätt 13 ml per g vävnadsvåtvikt av metanol, skift till omgivningstemperatur (22 °C) och blanda.
OBS: Lösningen kommer att se grumlig ut. Tillsats av metanol i detta steg, utan kloroform, optimerar proteinutfällning. Alla efterföljande steg är vid omgivningstemperatur (22 °C). - Överför till ett tjockväggigt skruvtäckt glasrör med PTFE-fodrat skruvlock vid omgivningstemperatur (22 °C) och blanda noggrant. Tillsätt 6,5 ml per g vävnads våtvikt av kloroform, lock och blanda noggrant. Centrifug vid 450 x g i 15 min. Överför den klara supernatanten till ett nytt skruvtäckt rör och mät volymen, "återvunnen extraktvolym".
- Väg en enda färsk eller tinad mushjärna (eller sagittal halvhjärna, ~ 0,2-0,5 g) och placera i en Potter-Elvehjem homogenisator förklämd i en hink med is.
- Skifte
- Tillsätt 0,173x "återvunnen extraktvolym" vatten till den klara supernatanten, locket, virveln kraftigt och centrifugen enligt beskrivningen i steg 1.1.4.
OBS: Målet är att ha kloroform-metanol-vattenhaltig i förhållandet 4:8:5.6. Blandningen kommer att vara grumlig och lösa sig i två faser: en övre vattenrik fas och en lägre kloroformrik fas vid ~ 4: 1-förhållandet. Vänta i 60 min eller centrifug vid 450 x g i 15 min för fullständig fasseparation. - Överför den övre fasen, som innehåller gangliosiderna, till ett nytt glasrör med ett PTFE-fodrat skruvlock.
- Tillsätt 0,173x "återvunnen extraktvolym" vatten till den klara supernatanten, locket, virveln kraftigt och centrifugen enligt beskrivningen i steg 1.1.4.
- Omvänd fas patronkromatografi
- Tvätta en tC18 fastfasextraktionspatron (400 mg) med 3 ml metanol med 5 ml glasspruta och sedan 3 ml kloroform-metanol-vatten (2:43:55). Ladda den övre fasen från steg 1.2.2 på tC18-patronen med samma glasspruta, samla upp genomströmningen och ladda om den på kolonnen för att optimera adsorptionen.
- Tvätta patronen med 3 ml kloroform-metanol-vatten (2:43:55) och sedan 3 ml metanolvatten (1:1) med glassprutan.
- Eluera gangliosiderna med 3 ml metanol i ett nytt skruvlockat rör. Avdunsta till torrhet under en mild kväveström vid ≤ 45 °C. Lös upp i metanol vid 1 ml per g ursprunglig vävnads våtvikt.
2. Storskalig extraktion och rening av gangliosid
VARNING: Använd explosionsbeständiga blandare när du arbetar med flyktiga lösningsmedel. Använd inte plast utom PTFE. Tetrahydrofuran, kloroform och etyleter är giftiga flyktiga organiska föreningar. Arbeta i en draghuva med skyddshandskar och skyddsglasögon.
- Extraktion
- Tina fryst nötkreatur hjärna vid 4 ° C i flera timmar. Dissekera den grå substansen från hjärnhinnor och vit materia.
OBS: Följande procedur beskrivs för 100 ± 20 g isolerad hjärngrå substans och är skalbar. - Placera 100 g hjärngrå substans i en mixer och tillsätt 1 ml per g hjärnvåtvikt av kyld 10 mM kaliumfosfatbuffert pH 6,8. Homogenisera på låg i 20 s. Tillsätt 8 ml tetrahydrofuran per g hjärnvåtvikt och homogenisera på låg i 10 s. Dekantera till glascentrifugflaskor och centrifug vid 5 000 x g i 15 minuter vid omgivningstemperatur (22 °C).
- Samla supernatanten, mät dess volym och överför till en glasavskiljande tratt. Tillsätt 0,3 ml etyleter per ml supernatant. Skaka kraftigt och låt sedan sitta ostört i 30 minuter under vilka två faser, en övre eterfas och en lägre vattenfas, separeras. Samla den nedre fasen, som innehåller gangliosiderna, i en glasflaska med ett PTFE-fodrat lock.
- Till den övre (eter) fasen som återstår i separationstratten, tillsätt 0,1 ml vatten per ml ursprunglig supernatant (steg 2.1.3). Skaka kraftigt, låt faserna separera, samla den nedre (vattenhaltiga) fasen och kombinera med den tidigare nedre fasen. Avdunsta de kombinerade nedre faserna till ett torrt pulver och väga.
- Tina fryst nötkreatur hjärna vid 4 ° C i flera timmar. Dissekera den grå substansen från hjärnhinnor och vit materia.
- Saponifikation
- Tillsätt 10 ml 100 mM vattenhaltigt NaOH per g pulver i ett förseglat rör. Blanda och inkubera vid 37 °C i 3 timmar. Låt svalna och justera till pH 4,5 genom droppvis tillsats av 100 mM vattenhaltig HCl. Mät volymen och överför till en glasavskiljande tratt.
OBS: Sialinsyror är sura labila; Undvik försurning under pH 4,5. - Baserat på vattenvolymen, tillsätt 2,67 volymer metanol, blanda försiktigt och tillsätt sedan 1,33 volymer kloroform för att skapa en enfaslösning av kloroform-metanol-vattenhaltig (4:8:3). Blanda väl.
- Baserat på den ursprungliga vattenhaltiga volymen, tillsätt 2,6 volymer vatten för att bringa blandningen till kloroform-metanol-vattenhaltig till ett förhållande av 4:8:5,6. Skaka kraftigt och låt sedan sitta ostört för att separera två faser, en polär övre fas som innehåller gangliosiderna och en icke-polär nedre fas. Samla den övre fasen i en glasflaska med ett PTFE-fodrat lock.
OBS: Icke-sialylerade lipider kommer inte att visas på tunnskiktskromatografiplattor (TLC) färgade med resorcinol men kommer att visas vid användning av en p-anisaldehydfläck. Syftet med denna förtvålning är att avlägsna de O-acetylerade föreningarna såsom fosfolipider.
- Tillsätt 10 ml 100 mM vattenhaltigt NaOH per g pulver i ett förseglat rör. Blanda och inkubera vid 37 °C i 3 timmar. Låt svalna och justera till pH 4,5 genom droppvis tillsats av 100 mM vattenhaltig HCl. Mät volymen och överför till en glasavskiljande tratt.
- Omvänd faskromatografi
- Förtvätta en storskalig (10 g) tC18 fastfasextraktionspatron genom att passera 50 ml av vart och ett av följande tre lösningsmedel genom kolonnen med vakuum eller tryck (<1 min varje tvätt): metanol, metanol-vatten (1:1), sedan kloroform-metanol-vatten (2:43:55). Ladda den övre fasen från steg 2.2.3 på kolonnen genom vakuum eller tryck, samla flödet igenom, ladda om och samla flödet igenom.
- Tvätta kolonnen med 30 ml kloroform-metanol-vatten (2:43:55), sedan 30 ml metanolvatten (1:1), eluera sedan gangliosiderna med 50 ml metanol och igen med 10 ml metanol, samla varje tvätt och varje eluering separat. Användning av TLC (nedan) bekräftar att gangliosid saknas i flödet genom och tvättar och elueras vid den första elueringen (50 ml metanol). Avdunsta de eluerade gangliosiderna till ett torrt pulver och väga.
OBS: Syftet med tC18-kromatografi är att separera gangliosider från både mindre och mer polära föroreningar. Blandat hjärngangliosidutbyte efter förtvålning är ~ 120 mg per g torrt hjärnextrakt (steg 2.1.4). Utseende av gangliosider av TLC i flödet genom eller tvättar indikerar att extraktionskolonnen i fast fas var mättad. Efter metanoleluering kan kolonnen elueras ytterligare med kloroformmetanol (1:1) för att fånga upp mindre polära lipider.
- HPLC-rening av enskilda gangliosider
- Förbered HPLC-lösningsmedel A: acetonitril-5 mM vattenhaltig natriumfosfatbuffert pH 5,6 (83:17) och lösningsmedel B: acetonitril-20 mM natriumfosfatbuffert, pH 5,6 (1:1). Degas båda lösningsmedlen i 5 min.
- Förjämbalansera en HPLC-kolonn (20 x 250 mm kolonn packad med aminbundna (NH2) kiseldioxidkulor, 5 μm diameter, 100 Å porstorlek) med 100% lösningsmedel A i 20 min vid 5 ml / min. Ställ in en UV HPLC-kolonnavloppsdetektor på 215 nm.
- Lös upp gangliosidpulvret från omvänd fas eluat i vatten vid 5 mg / ml. Injicera 0,5 ml av gangliosidblandningen på HPLC och kör lösningsmedelsgradienten (tabell 1) vid 5 ml/min och samla upp fraktioner. Gangliosider kommer att visas som A215-toppar med retentionstider (stora hjärngangliosider) på 25-70 min: GM1 ≈ 28 min; GD1a ≈ 38 min; GD1b ≈ 46 min; GT1b ≈ 65 min. Balansera om 20 min med lösningsmedel A efter varje körning. Analysera fraktioner genom tunnskiktskromatografi.
| Tid (min) | %A | %B |
| 0 | 100 | 0 |
| 7 | 100 | 0 |
| 12 | 63 | 37 |
| 82 | 54 | 46 |
| 82.01 | 0 | 100 |
| 92 | 0 | 100 |
Tabell 1: Lösningsmedelsgradient för HPLC.
3. Tunnskiktskromatografi (TLC) analys av gangliosider
VARNING: Kloroform är en giftig flyktig organisk förening. Arbeta i en draghuva med skyddshandskar och skyddsglasögon.
- Beredning av löpande lösningsmedel och TLC-platta
- Förbered ett löpande lösningsmedel av kloroform-metanol-vattenhaltigt 0,25% KCl (60:35:8 i volym). Häll i en 10 cm x 10 cm TLC-kammare i glas med ett rostfritt stålskydd så att lösningsmedelsdjupet är ~ 0,5 cm. Täck över och låt jämvikt i ett område fritt från luftströmmar i >10 min.
OBS:För att isolera TLC-kammaren från luftströmmar kan en akryl 5-sidig låda konstrueras eller köpas (figur 2). Använd inte lösningsmedelsmättat filterpapper inuti kammaren. - Placera en 10 cm x 10 cm eller 5 cm x 10 cm kiselgelbelagd högpresterande TLC-platta med glasrygg i en torkugn vid 125 °C i 10 min. Låt svalna. Använd en matt penna #2 för att rita 5 mm spottinglinjer med 2 mm separationer längs en linje 1 cm ovanför botten av plattan och minst 1 cm från vardera sidan (Figur 3). Undvik att störa kiseldioxidskiktet under märkning.
- Förbered en standardblandning av rena gangliosider i metanol innehållande 100 μM GM1, 50 μM vardera av GD1a och GD1b och 33 μM GT1b.
OBS: Denna blandning innehåller 100 pmol gangliosidsialinsyra per μL för var och en av de fyra gangliosiderna, en mängd som ger en stark kolorimetrisk signal genom resorcinolfärgning, vilket är sialinsyraberoende.
- Förbered ett löpande lösningsmedel av kloroform-metanol-vattenhaltigt 0,25% KCl (60:35:8 i volym). Häll i en 10 cm x 10 cm TLC-kammare i glas med ett rostfritt stålskydd så att lösningsmedelsdjupet är ~ 0,5 cm. Täck över och låt jämvikt i ett område fritt från luftströmmar i >10 min.
- Gangliosid upplösning
- Tvätta en 10-μL Hamilton-spruta med en fasad nål med metanol. Dra 1 μL metanol i en glasspruta för att fylla nålens döda volym och sedan 1 μL prov eller standard. Sätt provet jämnt på de 5 mm förmärkta linjerna tills <1 μL lösningsmedel (metanol) finns kvar i sprutan. Låt plattan torka vid omgivningstemperatur (22 °C) efter att alla prover har upptäckts.
OBS: Tvätta sprutan med metanol mellan provladdningen. En ouppvärmd luftfläkt inställd på låg kan användas för att påskynda torkningen. - Placera den fläckiga och torkade plattan i den förförvärkade TLC-kammaren med bottenkanten nedsänkt i det löpande lösningsmedlet och täck och skydda mot luftströmmar (figur 2). Låt det löpande lösningsmedlet avancera upp på plattan genom kapillärverkan tills lösningsmedlets framsida når inom 1 cm från toppen av plattan. Ta bort och markera lösningsmedlets framsida vid kanten av plattan med en penna. Låt lösningsmedlen avdunsta helt antingen ostört eller under milt luftflöde.
- Tvätta en 10-μL Hamilton-spruta med en fasad nål med metanol. Dra 1 μL metanol i en glasspruta för att fylla nålens döda volym och sedan 1 μL prov eller standard. Sätt provet jämnt på de 5 mm förmärkta linjerna tills <1 μL lösningsmedel (metanol) finns kvar i sprutan. Låt plattan torka vid omgivningstemperatur (22 °C) efter att alla prover har upptäckts.
Figur 2: Ganglioside TLC-utrustning och installation. En dubbel trågkammare fylls för att ≈ 0,5 cm på båda sidor med löpande lösningsmedel. Plattan placeras mot ena sidan med ursprungsänden nedsänkt i löpbufferten. Kammaren är täckt med en akryllåda för att undvika luftströmmar. Panel A, sidovy före plåtinsättning. Lösningsmedelsnivån är synlig några mm ovanför kammarbotten; Panel B, framsida under utveckling. Lösningsmedelsfronten är synlig vid cirka 40% av vägen upp på plattan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Gangliosidfärgning
VARNING: Reagensfläckar är giftiga. Saltsyra är frätande och giftigt. Förbered och spraya reagenser i en draghuva med skyddshandskar och skyddsglasögon.
OBS: Plattan kan avbildas för kvalitativ bildanalys eller lagras genom att ta bort klämmorna och säkra täckplattan på plats med klar tejp. Kvantitativ analys kan utföras genom att mäta densitometri av gangliosidstandarder som upptäcks i intilliggande körfält.- Förbered resorcinol sprayreagens för detektion av gangliosider baserat på deras sialinsyror. Lös upp 6 g resorcinol i 100 ml vatten för ett 6% resorcinollager. Lös upp 1 g CuSO4 i 100 ml vatten för att göra ett 1% lager. Till 64,7 ml vatten tillsätt 5 ml av 6% resorcinolbeståndet, 0,31 ml av 1% CuSO4-beståndet tillsätt sedan långsamt 30 ml koncentrerad HCl och rör om försiktigt. Kan förvaras vid 4 °C i en månad.
- I en kemisk rökhuva, placera TLC-plattan med upplösta gangliosider, ursprung hamnar, i en bortskuren kartong för att skydda huvens väggar från syraspray. Placera resorcinol sprayreagens i en TLC-spruta av glas, fäst vid en källa till trycksatt kväve och spraya plattan lätt diagonalt i vertikala och horisontella riktningar. Spraya TLC-sorbentytan jämnt, men lätt.
- Täck omedelbart plattan med en ren torr glasplatta av samma dimensioner och fäst täckplattan på plats med bindemedelsklämmor (figur 3). Värm den täckta plattan vid 125 ° C i 20 min. Gangliosider kommer att se mörklila ut mot en vit bakgrund.
OBS: Plattan ska inte se våt ut när sprutningen är klar. Täckplattor kan utformas genom att skrapa sorbenten från tidigare använda TLC-plattor med ett enkantigt rakblad.
VARNING: Kiseldioxidpulver är giftigt för lungorna. Använd en mask och kassera kiseldioxid i en förseglad behållare.
Figur 3: TLC-platta med upplöst blandad gangliosid. TLC-platta med upplösta blandade gangliosidstandarder (vänster körfält) och renade blandade bovin grå substansgangliosider (höger körfält) efter resorcinolfärgning och uppvärmning med glasskyddsplatta klippt på plats. Standard gangliosider (uppifrån och ner) är GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b, GT1b och GQ1b. Efter kylning kan plattan avbildas och/eller täckplattan tejpas på plats för förvaring. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Allmän lipidfärgning för gangliosider och fosfolipider.
VARNING: Svavelsyra är giftigt och frätande. Tillsats av koncentrerad syra till etanol är exoterm och måste göras långsamt. Förbered färgningsreagens i en draghuva med skyddshandskar och skyddsglasögon.- Förbered p-anisaldehydfläck genom att långsamt tillsätta 15 ml koncentrerad svavelsyra till 500 ml etanol. Rör om i 30 minuter så att lösningen kan svalna innan du fortsätter. Tillsätt 15 ml p-anisaldehyd och rör om försiktigt. Detta kan förvaras vid rumstemperatur (22 °C) upp till sex månader.
- Doppa TLC-plattan med upplösta gangliosider i en kemisk dragskåpa, ursprungsänden nedåt, i en bägare som innehåller p-anisaldehydfläcken. Sänk ner till löpfronten i ≥ 2 s. Ta bort TLC från fläcken och låt rinna av. Värm TLC-plattan på en kokplatta vid låg temperatur för att utvecklas.
OBS: Lipider kommer att se mörka ut mot en lila bakgrund. Färgningslösning kan återvinnas för upprepad användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De metoder som beskrivs i avsnitt 1 (småskalighet) ger gangliosider i tillräcklig mängd och renhet för kvalitativ och kvantitativ bestämning av större hjärngangliosider. Återhämtning från mushjärnan är ~ 1 μmol gangliosid per g hjärnvåtvikt (1 nmol / μL) när den bereds enligt beskrivningen. TLC-upplösning på 1 μL (1 nmol) med användning av avsnitt 3 ger gott om material för resorcinoldetektion och löser alla större hjärngangliosider som visas för vilda och genetiskt modifierade möss i figur 4. Även om blandade gangliosider framställda med användning av avsnitt 1 inte är fria från andra större lipider, är gangliosider av tillräcklig renhet för masspektrometrisk (MS) bestämning som visas i figur 5, antingen som inhemska renade gangliosider i negativt läge eller efter permetylering i positivt läge9. Eftersom avsnitt 1 undviker alkalisk hydrolys för att avlägsna fosfolipider, behåller den alkalikänsliga naturliga modifieringar, såsom O-acetylerade sialinsyror (se GT1b-OAc, figur 4)9.
Figur 4: TLC av mushjärnan gangliosider. TLC av mushjärngangliosider från vildtyp (WT) och St3gal enkel- och dubbel-null möss renade som i protokoll 1. Denna siffra har modifierats från Sturgill et al, 20129. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: MS för permetylerade vildtyp och St3gal2/3-dubbel-null mus hjärngangliosider renade som i avsnitt 1. Observera att GD1a och GD1b löser sig med TLC (figur 4) men har samma massa så de kan inte särskiljas med endimensionell MS. Denna siffra har modifierats från Sturgill et al, 20129. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Storskalig rening (avsnitt 2) inkluderar extraktion, förtvålning (för att avlägsna fosfolipider) och HPLC-upplösning för att tillhandahålla renade större hjärngangliosider GM1, GD1a, GD1b och GT1b lämpliga för biologiska experiment och för ytterligare kemiska och enzymatiska modifieringar. En exemplifierande HPLC-profil och efterföljande TLC-analys visas i figur 6. Alkalibehandling (förtvålning) är nödvändig i detta protokoll för att hydrolysera och avlägsna förorenande fosfolipider (figur 7) men kommer också att hydrolysera naturliga modifieringar av gangliosider, såsom O-acetylerade sialinsyror, vilket kan vara viktigt i vissa sammanhang10. För dessa tillämpningar har alternativa effektiva metoder för avlägsnande av fosfolipider från isolerade gangliosider publicerats6.
Figur 6: Representativ HPLC för bovin hjärngangliosider. Elueringsgradienten (%B, prickad linje) är överlagrad på absorbansen (A215, heldragen linje) under de första 75 min av cykeln. Toppar (A215) samlades in (siffror inom parentes) och utsattes för TLC som i protokoll 3. Körfältsnummer hänvisar till toppnumren på kromatogrammet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: TLC-platta med upplöst blandad gangliosid. TLC-platta med upplösta blandade gangliosiderstandarder (körfält 1) tillsammans med partitionerade gangliosider efter förtvålning (körfält 2) och frigjorda fettsyror (körfält 3). Lipider, inklusive gangliosider, detekteras med p-anisaldehydfläck. Standard gangliosider (uppifrån och ner) är GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b och GT1b. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoderna för extraktion och isolering av gangliosid som rapporteras här är inte unika – det finns många olika metoder för extraktion och rening av lösningsmedel som ger utmärkta resultat12. De metoder som här redovisas för småskalig rening från hjärnan, från Fredman och Svennerholm13, har visat sig optimera återhämtningen och har under många år visat sig vara robusta och okomplicerade i vårt laboratorium. Isolering och rening som är lämplig för TLC och MS kan lätt slutföras, från intakt vävnad till isolerade gangliosider, på några timmar. MS kan utföras på inhemska renade gangliosider i negativt läge eller efter permetylering i positivt läge (figur 7, t.ex. se Sturgill et al.9). Utbytet är mycket konsekvent, ≈ 1 μmol gangliosid (≈ 2 μmol gangliosidbunden sialinsyra) per g färsk hjärnvävnad för de flesta däggdjur. Metoden för storskalig extraktion och partition från hjärnan som rapporteras här, introducerad av Tettamani et al.14, väljs för att minimera volymen av gangliosidhaltigt lösningsmedel vid den första partitionen (eter-tetrahydrofuran-vatten). Detta förenklar efterföljande steg som kan bli besvärliga med tekniker som genererar stora volymer partitionerade gangliosider i de första stegen. HPLC-metoden som beskrivs, från Gazzotti et al.15, har relativt hög kapacitet och god upplösning av de stora hjärngangliosiderna.
De småskaliga protokoll som beskrivs är väl lämpade för både celler och vävnader och är skalbara. Eftersom de sista stegen är omvänd fasinfångning, avdunstning och omfördelning i metanol kan de appliceras i godtycklig skala på små prover, såsom odlade nervceller. I det här fallet skrapar vi och homogeniserar celler i 1 ml vatten för bekvämlighet och fortsätter med metanol och kloroformtillsats för att generera lämpliga förhållanden för extraktion och sedan partitionering. De slutliga torkade gangliosiderna efter omvänd fas kan lösas upp på bara några mikroliter och analyseras av TLC och MS.
Uppmärksamhet på lösningsmedelsförhållanden är avgörande för framgång vid extraktions- och lösningsmedelspartitioneringssteg för gangliosidisolering. För småskalig extraktion och partitionering testades olika kloroform-metanol-vattenförhållanden och de som genererade nära kvantitativ gangliosidisolering rapporteras här13. Variationer från de beskrivna förhållandena kommer att minska återhämtningen och/eller reningen. På samma sätt är uppmärksamhet på lösningsmedelsförhållanden i TLC-utveckling av lösningsmedel kritisk. De rapporterade kloroform-metanol-vattenförhållandena resulterar i en enda klar fas. Små variationer kan ge grumliga utvecklingslösningar som inte bör användas men som kan klargöras genom droppvis tillsats av metanol med virvlande. Även om olika extraktions- och delningslösningsmedel är vanliga, bör lösningsmedelsförhållandena följas noggrant för varje variation12. Förändringar i TLC-lösningsmedel är också vanliga för att optimera separationen av specifika gangliosider16. Ett relativt enkelt sätt att modifiera TLC-migration av gangliosider är att ändra lösningsmedelsblandningens vattenhaltiga fas. Användning av vattenhaltig ammoniumhydroxid eller kalciumklorid istället för kaliumklorid förändrar gangliosidsaltformen och den relativa TLC-migrationen17.
Medan alla ryggradsdjurs celler och vävnader uttrycker gangliosider, är hjärnan och nervcellerna ovanliga i de höga mängder som uttrycks. Protokollen som beskrivs här är tillämpliga på andra vävnader och celler, men modifieringar kan krävas på grund av lägre överflöd och potentiell kontaminering med andra lipider. Dessa metoder som tillämpas på humana neutrofiler6 och musadipose18 ger exempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna hävdar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) Common Fund for Glycoscience grant U01CA241953. MJP stöddes av Chemistry-Biology Interface Program vid Johns Hopkins (T32GM080189).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine brain, stripped | PelFreez | 57105-1 | |
| Ganglioside standards | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| Glass bottle with PTFE-lined cap | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| Glass centrifuge bottle | Fisher Scientific | 05-586B | |
| Glass culture tubes, 16 x 125 mm | VWR | 60825-430 | for collecting HPLC fractions |
| Glass separatory funnel (2 L) | Pyrex | 6400-2L | |
| Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 µl | Hamilton | 81265 | |
| p-Anisaldehyde, 98% | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Potter-Elvhjem Homogenizer | Fisher Scientific | 08-414-14A | Choose appropriate volume option |
| Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns | Analytics-Shop | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column | Analytics-Shop | custom packed | other sizes available |
| Resorcinol | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-300 | |
| Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml) | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) | Waters | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg | Waters | WAT036810 | |
| Spotting syringe - Hamilton 701N 10 µl | Hamilton | 80300 | |
| Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-933A | |
| Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-955-323 | For ganglioside storage |
| TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat | Fisher Scientific | M1056350001 | Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface |
| TLC reagent sprayer | Fisher Scientific | 05-723-26A | |
| TLC running chamber for 10 x 10 cm plates | Camag | 22.5155 | |
| Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender | Waring | E8520 |
References
- Schnaar, R. L.
- DeMarco, M. L., Woods, R. J. Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces. Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).
- Schnaar, R. L.
- Klenk, E. Über die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids]. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).
- Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells. Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).
- Nimrichter, L., et al.
- Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).
- Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).
- Sturgill, E. R., et al. Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b. Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).
- Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy. Cells. 9 (3), (2020).
- Varki, A., et al. Symbol nomenclature for graphical representations of glycans. Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).
- Schnaar, R. L.
- Svennerholm, L., Fredman, P. A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).
- Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).
- Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures. Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).
- Schnaar, R. L., Needham, L. K.
- Ledeen, R. W., Yu, R. K. Gangliosides: structure, isolation, and analysis. Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).
- Lopez, P. H., et al. Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance. Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).
