Summary
Gangliosidler, beyinde özellikle bol miktarda bulunan sialik asit taşıyan glikozfingolipidlerdir. Amfipatik doğaları, optimum geri kazanım ve doğru analizler sağlamak için organik / sulu ekstraksiyon ve saflaştırma teknikleri gerektirir. Bu makalede, analitik ve hazırlayıcı ölçekli ganglioside ekstraksiyonu, saflaştırma ve ince tabaka kromatografisi analizine genel bakış sunulmaktadır.
Abstract
Gangliosidler, bir veya daha fazla sialik asit kalıntısı içeren glikozfingolipidlerdir. Tüm omurgalı hücrelerinde ve dokularında bulunurlar, ancak özellikle beyinde bol miktarda bulunurlar. Öncelikle hücrelerin plazma zarlarının dış broşüründe ifade edilen, hücre yüzey proteinlerinin faaliyetlerini lateral ilişki yoluyla modüle eder, hücre-hücre etkileşimlerinde reseptör görevi görür ve patojenler ve toksinler için hedeflerdir. İnsanlarda gangliosid biyosentezinin genetik disregülasyonu ciddi konjenital sinir sistemi bozukluklarına neden olur. Amfipatik doğaları nedeniyle, gangliosidlerin ekstraksiyonu, saflaştırılması ve analizi, keşiflerinden bu yana geçen 80 yıl içinde birçok araştırmacı tarafından optimize edilmiş teknikler gerektirir. Burada, birkaç saat içinde tamamlanabilen dokulardan ve hücrelerden majör gangliosidlerin ekstraksiyonu, saflaştırılması ve ön kalitatif ve kantitatif analizleri için tezgah düzeyinde yöntemler açıklanmaktadır. Ayrıca, büyük ganglioside türlerinin beyinden daha büyük ölçekli izolasyonu ve saflaştırılması için yöntemler de açıklıyoruz. Birlikte, bu yöntemler bu biyoaktif molekül sınıfına analitik ve hazırlayıcı ölçek erişimi sağlar.
Introduction
Gangliosidler, bir veya daha fazla sialik asit kalıntısı taşıyan glikozfingolipidler olarak tanımlanır1. Plazma zarının dış broşürüne gömülü hidrofobik seramid lipid köstebekleri ve hücre dışı boşluğa uzanan hidrofilik glikanları ile öncelikle hücre yüzeyinde eksprese edilirler2. Omurgalı hücrelerinde ve dokularında yaygın olarak dağılmış olmalarına rağmen, ilk keşfedildikleri ve adlandırıldıkları omurgalı beyninde3 özellikle bol miktarda bulunurlar4.
Gangliosid glikanlarının yapıları değişir ve isimlendirmelerinin temelidir (Şekil 1). Ganglioside glikanları, sialik asitlerin farklı sayılarını ve dağılımlarını taşıyan nötr bir şeker çekirdeğinden oluşur. En küçük ganglioside olan GM4, sadece iki şekere sahiptir (galaktoza bağlı sialik asit)5. Doğal olarak oluşan daha büyük gangliosidler, tek bir nötr çekirdek üzerinde bir düzineden fazla toplam şeker6 veya yedi adede kadar sialik asit içerebilir7. Seramid lipit moieties de farklı sfingozin uzunluklarına ve çeşitli yağ asidi amidlerine sahip olarak değişir. Omurgalı beyninde dört ganglioside türü, GM1, GD1a, GD1b ve GT1b baskındır. Ganglioside ekspresyonu gelişimsel olarak düzenlenir, dokuya özgüdür ve hücre tipine özgüdür.
Şekil 1: Majör beyin gangliyozları ve biyosentetik öncülleri. Yapılar, Glikanlar için Sembol İsimlendirmesi kullanılarak gösterilmiştir11. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Gangliosidler, proteinleri kendi zarlarına bağlayarak ve modüle ederek (cis regülasyonu) veya bakteriyel toksinler ve diğer hücrelerdeki lektinler de dahil olmak üzere hücre dışı ortamda glikan bağlayıcı proteinleri devreye sokarak moleküler düzeyde işlev görür (trans tanıma)3. Gangliosidlerin düzenleyici proteinlere spesifik bağlanması ve / veya diğer moleküllerle lipit sallarına kendi kendine bağlanması, sinir sistemi yapısını ve işlevini, kanser progresyonunu, metabolizmayı, inflamasyonu, nöronal proteinopatileri ve bulaşıcı hastalıkları etkileyen hücre davranışında değişikliklere neden olur8. Çeşitli hücresel rolleri nedeniyle, izolasyon ve analiz yöntemleri, fizyolojik ve patolojik süreçlerin düzenlenmesi konusunda gelişmiş bilgiler sağlayabilir. Burada, hızlı küçük ölçekli ekstraksiyon ve analiz için doğrulanmış yöntemler ve gangliosidlerin beyinden preparatif ölçekli izolasyonu sağlanmaktadır. Diğer dokulara uygulama fırsatları ve zorlukları tartışılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Doku toplama, Johns Hopkins Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından yetkilendirilen koşullar altında gerçekleştirildi.
1. Küçük ölçekli ganglioside ekstraksiyonu ve kısmi arıtma
DİKKAT: Uçucu ve toksik çözücülerle çalışırken uygun havalandırma kullanın. Boyunca plastikten kaçının; çözücüler, sonraki analizlere müdahale eden birçok plastikten kimyasal bileşenleri çıkaracaktır. Politetrafloroetilen (PTFE) bir istisnadır; Cam saklama şişelerini kapatmak için PTFE astarlı kapaklar kullanılmalıdır.
- Çıkarma
- Tek bir taze veya çözülmüş fare beynini (veya sagital yarı beyin, ~ 0.2-0.5 g) tartın ve bir kova buz içinde önceden soğutulmuş bir Potter-Elvehjem homojenizatörüne yerleştirin.
NOT: Daha önce dondurulmuş beyinler 0-4 °C'de çözüldükten sonra kullanılabilir. - G başına 4,1 mL ıslak su ağırlığı ekleyin ve 10 vuruşla homojenleştirin.
NOT: Doğru çözücü oranları, optimum ekstraksiyon ve bölmenin anahtarıdır, amaç, beyin dokusunun% 80 sulu olduğu varsayılarak, kloroform-metanol-sulu (4: 8: 3). - G başına 13 mL ıslak ağırlık metanol ekleyin, ortam sıcaklığına (22 °C) kaydırın ve karıştırın.
NOT: Çözüm bulutlu görünecektir. Bu adımda metanol ilavesi, kloroform olmadan, protein çökelmesini optimize eder. Sonraki tüm adımlar ortam sıcaklığındadır (22 °C). - Ortam sıcaklığında (22 °C) PTFE astarlı vidalı kapaklı kalın duvarlı cam vidalı bir boruya aktarın ve iyice karıştırın. G başına 6,5 mL kloroform, kapak ıslak ağırlığı ekleyin ve iyice karıştırın. 15 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj. Şeffaf süpernatantı taze vidalı kapaklı bir tüpe aktarın ve "geri kazanılmış ekstrakt hacmi" hacmini ölçün.
- Tek bir taze veya çözülmüş fare beynini (veya sagital yarı beyin, ~ 0.2-0.5 g) tartın ve bir kova buz içinde önceden soğutulmuş bir Potter-Elvehjem homojenizatörüne yerleştirin.
- Bölüm
- Adım 1.1.4'te açıklandığı gibi berrak süpernatant, kapak, vorteks kuvvetlice ve santrifüje 0.173x "geri kazanılmış ekstrakt hacmi" su ekleyin.
NOT: Amaç, 4:8:5.6 oranında kloroform-metanolü-sulu olmasıdır. Karışım bulanık olacak ve iki faza ayrılacaktır: ~ 4: 1 oranında üst sulu zengin bir faz ve daha düşük kloroform bakımından zengin bir faz. Tam faz ayrımı için 60 dakika bekleyin veya 15 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın. - Gangliosidleri içeren üst fazı, PTFE astarlı vidalı kapaklı taze bir cam tüpe aktarın.
- Adım 1.1.4'te açıklandığı gibi berrak süpernatant, kapak, vorteks kuvvetlice ve santrifüje 0.173x "geri kazanılmış ekstrakt hacmi" su ekleyin.
- Ters faz kartuş kromatografisi
- 5 mL'lik bir cam şırınga kullanarak, bir tC18 katı faz ekstraksiyon kartuşunu (400 mg) 3 mL metanol ve ardından 3 mL kloroform-metanol su (2:43:55) ile yıkayın. Aynı cam şırıngayı kullanarak adım 1.2.2'den üst fazı tC18 kartuşuna yükleyin, akışı toplayın ve adsorpsiyonu optimize etmek için kolona yeniden yükleyin.
- Cam şırıngayı kullanarak, kartuşu 3 mL kloroform-metanol su (2:43:55) ve ardından 3 mL metanol su (1:1) ile yıkayın.
- Gangliosidleri 3 mL metanol ile taze vidalı kapaklı bir tüpe sürün. ≤ 45 °C'de yumuşak bir azot akışı altında kuruluğa buharlaştırın. Metanol içinde orijinal doku ıslak ağırlığının g'si başına 1 mL'de çözün.
2. Büyük ölçekli ganglioside ekstraksiyonu ve saflaştırma
DİKKAT: Uçucu çözücülerle çalışırken, patlamaya dayanıklı karıştırıcılar kullanın. PTFE dışında plastik kullanmayın. Tetrahidrofuran, kloroform ve etil eter toksik uçucu organik bileşiklerdir. Koruyucu eldivenler ve güvenlik gözlükleri ile bir duman başlığında çalışın.
- Çıkarma
- Dondurulmuş sığır beynini birkaç saat boyunca 4 ° C'de çözün. Gri maddeyi meninkslerden ve beyaz maddeden ayırın.
NOT: Aşağıdaki prosedür 100 ± 20 g izole beyin gri maddesi için açıklanmıştır ve ölçeklenebilir. - Bir karıştırıcıya 100 g beyin gri maddesi yerleştirin ve soğutulmuş 10 mM potasyum fosfat tamponu pH 6.8'in g başına 1 mL beyin ıslak ağırlığı ekleyin. 20 sn'lik düşük seviyede homojenize edin. Beyin ıslak ağırlığı başına 8 mL tetrahidrofuran ekleyin ve 10 saniye boyunca düşük homojenize edin. Cam santrifüj şişelerine dekant ve ortam sıcaklığında (22 °C) 15 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüj.
- Süper natantı toplayın, hacmini ölçün ve bir cam ayırıcı huniye aktarın. Süpernatanın mL'si başına 0.3 mL etil eter ekleyin. Kuvvetlice çalkalayın, ardından iki fazın, bir üst eter fazının ve bir alt sulu fazın ayrıldığı 30 dakika boyunca rahatsız edilmeden oturmaya bırakın. Gangliosidleri içeren alt fazı, PTFE astarlı kapaklı bir cam şişede toplayın.
- Ayırma hunisinde kalan üst (eter) faza, orijinal süpernatantın mL'si başına 0,1 mL su ekleyin (adım 2.1.3). Kuvvetlice çalkalayın, fazların ayrılmasına izin verin, alt (sulu) fazı toplayın ve önceki alt fazla birleştirin. Birleştirilmiş alt fazları kuru bir toza buharlaştırın ve tartın.
- Dondurulmuş sığır beynini birkaç saat boyunca 4 ° C'de çözün. Gri maddeyi meninkslerden ve beyaz maddeden ayırın.
- Sabunlaşma
- Kapalı bir tüpe g tozu başına 10 mL 100 mM sulu NaOH ekleyin. 3 saat boyunca 37 °C'de karıştırın ve inkübe edin. 100 mM sulu HCl'nin damla damla eklenmesiyle soğumaya ve pH 4.5'e ayarlanmaya bırakın. hacmi ölçün ve bir cam ayırıcı huniye aktarın.
NOT: Siyalik asitler asit kararsızdır; pH 4.5'in altında asitleşmeyi önleyin. - Sulu hacme dayanarak, 2.67 hacim metanol ekleyin, yavaşça karıştırın, ardından tek fazlı bir kloroform-metanol sulu çözeltisi oluşturmak için 1.33 hacim kloroform ekleyin (4: 8: 3). İyice karıştırın.
- Orijinal sulu hacme dayanarak, karışımı kloroform-metanol-sulu hale getirmek için 2.6 hacim su ekleyin ve 4: 8: 5.6 oranına getirin. Kuvvetlice çalkalayın, ardından iki fazı, gangliosidleri içeren bir polar üst fazı ve polar olmayan bir alt fazı ayırmak için rahatsız edilmeden oturmaya bırakın. Üst fazı PTFE astarlı kapaklı bir cam şişede toplayın.
NOT: Yalile edilmemiş lipitler, resorsinol kullanılarak boyanmış ince tabaka kromatografisi (TLC) plakalarında görünmeyecek, ancak bir p-anisaldehit boyası kullanıldığında görünecektir. Bu sabunlaştırmanın amacı, fosfolipitler gibi O-asetillenmiş bileşikleri uzaklaştırmaktır.
- Kapalı bir tüpe g tozu başına 10 mL 100 mM sulu NaOH ekleyin. 3 saat boyunca 37 °C'de karıştırın ve inkübe edin. 100 mM sulu HCl'nin damla damla eklenmesiyle soğumaya ve pH 4.5'e ayarlanmaya bırakın. hacmi ölçün ve bir cam ayırıcı huniye aktarın.
- Ters faz kromatografisi
- Aşağıdaki üç çözücünün her birinin 50 mL'sini vakum veya basınç kullanarak kolondan geçirerek büyük ölçekli (10 g) bir tC18 katı faz ekstraksiyon kartuşunu önceden yıkayın (her yıkamada <1 dakika): metanol, metanol su (1:1), ardından kloroform-metanol-su (2:43:55). Üst fazı adım 2.2.3'ten kolona vakum veya basınçla yükleyin, akışı toplayın, yeniden yükleyin ve akışı toplayın.
- Kolonu 30 mL kloroform-metanol su (2:43:55), daha sonra 30 mL metanol su (1:1) ile yıkayın, ardından gangliosidleri 50 mL metanol ile ve tekrar 10 mL metanol ile süzün, her yıkamayı ve her elüsyonu ayrı ayrı toplayın. TLC (aşağıda) kullanılması, gangliosidin akışta bulunmadığını ve ilk elüsyonda (50 mL metanol) yıkandığını ve salındığını doğrular. Salınan gangliosidleri kuru bir toza buharlaştırın ve tartın.
NOT: tC18 kromatografisinin amacı, gangliosidleri hem daha az hem de daha fazla polar kirleticiden ayırmaktır. Sabunlaştırmadan sonra karışık beyin gangliosid verimi, g kuru beyin ekstresi başına ~ 120 mg'dır (adım 2.1.4). Gangliosidlerin TLC tarafından akışta veya yıkamalarda görünmesi, katı faz ekstraksiyon kolonunun doymuş olduğunu gösterir. Metanol elüsyonundan sonra, daha az polar lipitleri yakalamak için kolon kloroform-metanol (1: 1) ile daha da salınabilir.
- Bireysel gangliosidlerin HPLC saflaştırılması
- HPLC Solvent A: asetonitril-5 mM sulu sodyum fosfat tamponu pH 5.6 (83:17) ve Solvent B: asetonitril-20 mM sodyum fosfat tamponu, pH 5.6 (1:1) hazırlayın. Her iki çözücüyü de 5 dakika boyunca gazdan arındırın.
- Bir HPLC kolonunu (amin bağlı (NH2) silika kürelerle dolu 20 x 250 mm sütun, 5 μm çap, 100 şgözenek boyutu) %100 Solvent A ile 5 mL/dk'da 20 dakika boyunca önceden dengeleyin. UV HPLC kolon atık su dedektörünü 215 nm'ye ayarlayın.
- Ganglioside tozunu ters fazdan çözün, 5 mg / mL'de suda süzün. Ganglioside karışımının 0,5 mL'sini HPLC üzerine enjekte edin ve çözücü gradyanını (Tablo 1) 5 mL / dak'da çalıştırarak fraksiyonları toplayın. Gangliosidler, 25-70 dakika tutma süreleri (majör beyin gangliosidleri) ile A215 zirveleri olarak görünecektir: GM1 ≈ 28 dakika; GD1a ≈ 38 dk; GD1b ≈ 46 dk; GT1b ≈ 65 dk. Her çalıştırmadan sonra 20 dakika boyunca Solvent A ile yeniden dengeleyin. İnce tabaka kromatografisi ile fraksiyonları analiz edin.
| Süre (dk) | %A | %B |
| 0 | 100 | 0 |
| 7 | 100 | 0 |
| 12 | 63 | 37 |
| 82 | 54 | 46 |
| 82.01 | 0 | 100 |
| 92 | 0 | 100 |
Tablo 1: HPLC için çözücü gradyanı.
3. Gangliosidlerin ince tabaka kromatografisi (TLC) analizi
DİKKAT: Kloroform toksik uçucu bir organik bileşiktir. Koruyucu eldivenler ve güvenlik gözlükleri ile bir duman başlığında çalışın.
- Solvent ve TLC plaka hazırlamanın çalıştırılması
- Kloroform-metanol-sulu% 0.25 KCl (hacimce 60:35:8) çalışan bir çözücü hazırlayın. Paslanmaz çelik kapaklı 10 cm x 10 cm'lik bir cam TLC haznesine dökün, böylece çözücü derinliği ~ 0,5 cm olur. Hava akımları olmayan bir alanda >10 dakika boyunca örtün ve dengelenmeye izin verin.
NOT: TLC odasını hava akımlarından izole etmek için, akrilik 5 taraflı bir kutu inşa edilebilir veya satın alınabilir (Şekil 2). Odanın içinde solvente doymuş filtre kağıdı kullanmayın. - 10 cm x 10 cm veya 5 cm x 10 cm silika jel kaplı cam destekli yüksek performanslı TLC plakayı 10 dakika boyunca 125 °C'de bir kurutma fırınına yerleştirin. Soğumaya bırakın. Plakanın altından 1 cm yukarıda ve her iki taraftan en az 1 cm yükseklikte bir çizgi boyunca 2 mm'lik ayrımlarla 5 mm'lik lekelenme çizgileri çizmek için donuk bir #2 kalem kullanın (Şekil 3). İşaretleme sırasında silika tabakasını rahatsız etmekten kaçının.
- Metanol içinde 100 μM GM1, 50 μM GD1a ve GD1b ve 33 μM GT1b içeren standart bir saf gangliosit karışımı hazırlayın.
NOT: Bu karışım, dört gangliosidin her biri için μL başına 100 pmol ganglioside sialik asit içerir; bu, sialik aside bağımlı olan resorsinol boyama ile güçlü bir kolorimetrik sinyal sağlayan bir miktardır.
- Kloroform-metanol-sulu% 0.25 KCl (hacimce 60:35:8) çalışan bir çözücü hazırlayın. Paslanmaz çelik kapaklı 10 cm x 10 cm'lik bir cam TLC haznesine dökün, böylece çözücü derinliği ~ 0,5 cm olur. Hava akımları olmayan bir alanda >10 dakika boyunca örtün ve dengelenmeye izin verin.
- Ganglioside çözünürlüğü
- 10-μL Hamilton şırıngasını metanol ile eğimli bir iğne ile yıkayın. İğnenin ölü hacmini doldurmak için bir cam şırıngaya 1 μL metanol ve ardından 1 μL numune veya standart çekin. Şırıngada <1 μL çözücü (metanol) kalana kadar numuneyi 5 mm'lik önceden işaretlenmiş çizgiler üzerinde eşit şekilde tespit edin. Tüm numuneler tespit edildikten sonra plakanın ortam sıcaklığında (22 °C) kurumasını bekleyin.
NOT: Şırıngayı numune yükleme arasında metanol ile yıkayın. Kurumayı hızlandırmak için düşük ayarlı ısıtılmamış bir hava üfleyici kullanılabilir. - Benekli ve kurutulmuş plakayı, alt kenarı çalışan çözücüye batırılmış olarak önceden dengelenmiş TLC odasına yerleştirin ve hava akımlarını örtün ve koruyun (Şekil 2). Çalışan çözücünün, çözücü ön kısım plakanın üst kısmından 1 cm içeri ulaşana kadar kılcal hareketle plakayı yukarı doğru ilerletmesine izin verin. Plakanın kenarındaki çözücü önünü çıkarın ve bir kalemle işaretleyin. Çözücülerin bozulmadan veya hafif hava akışı altında tamamen buharlaşmasına izin verin.
- 10-μL Hamilton şırıngasını metanol ile eğimli bir iğne ile yıkayın. İğnenin ölü hacmini doldurmak için bir cam şırıngaya 1 μL metanol ve ardından 1 μL numune veya standart çekin. Şırıngada <1 μL çözücü (metanol) kalana kadar numuneyi 5 mm'lik önceden işaretlenmiş çizgiler üzerinde eşit şekilde tespit edin. Tüm numuneler tespit edildikten sonra plakanın ortam sıcaklığında (22 °C) kurumasını bekleyin.
Resim 2: Ganglioside TLC ekipmanı ve kurulumu. İkiz oluk haznesi, çalışan çözücü ile her iki tarafta 0,5 cm ≈ doldurulur. Plaka, menşe ucu çalışan tampona batırılmış olarak bir tarafa doğru yerleştirilir. Oda, hava akımlarını önlemek için akrilik bir kutu ile kaplanmıştır. Panel A, plaka yerleştirmeden önce yandan görünüm. Solvent seviyesi, hazne tabanının birkaç mm yukarısında görülebilir; Panel B, geliştirme sırasında önden görünüm. Solvent ön kısmı, plakanın yukarısındaki yolun yaklaşık% 40'ında görülebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Ganglioside boyama
DİKKAT: Reaktif lekeleri toksiktir. Hidroklorik asit aşındırıcı ve toksiktir. Reaktifleri koruyucu eldivenler ve güvenlik gözlükleri ile bir duman başlığında hazırlayın ve püskürtün.
NOT: Plaka, kalitatif görüntü analizi için görüntülenebilir veya kelepçeleri çıkarıp kapak plakasını şeffaf bantla yerine sabitleyerek saklanabilir. Kantitatif analiz, bitişik şeritlerde tespit edilen ganglioside standartlarının dansitometrisi ölçülerek gerçekleştirilebilir.- Sialik asitlerine dayanarak gangliosidlerin tespiti için resorsinol sprey reaktifi hazırlayın. % 6'lık bir resorsinol stoğu için 6 g resorsinol 100 mL suda çözün. % 1'lik bir stok yapmak için 1 g CuSO4'ü 100 mL suda çözün. 64.7 mL suya% 6 resorsinol stoğunun 5 mL'sini,% 1 CuSO4 stoğunun 0.31 mL'sini ekleyin, ardından yavaşça 30 mL konsantre HCl ekleyin ve hafifçe karıştırın. Bir ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
- Kimyasal bir duman davlumbazında, davlumbazın duvarlarını asit spreyinden korumak için çözülmüş gangliosidlere sahip TLC plakasını, menşei biten kesilmiş bir karton kutuya yerleştirin. Resorsinol sprey reaktifini bir cam TLC püskürtücüye yerleştirin, basınçlı azot kaynağına takın ve plakayı dikey ve yatay yönlerde çapraz olarak hafifçe püskürtün. TLC sorbent yüzeyine eşit şekilde, ancak hafifçe püskürtün.
- Plakayı hemen aynı boyutlarda temiz bir kuru cam kapak plakasıyla örtün ve kapak plakasını bağlayıcı klipslerle yerine sabitleyin (Şekil 3). Kapalı plakayı 125 °C'de 20 dakika ısıtın. Gangliosidler beyaz bir arka plana karşı koyu mor görünecektir.
NOT: Püskürtme tamamlandığında plaka ıslak görünmemelidir. Kapak plakaları, sorbentin daha önce kullanılan TLC plakalarından tek kenarlı bir tıraş bıçağı kullanılarak kazınmasıyla şekillendirilebilir.
DİKKAT: Silika tozu akciğerler için toksiktir. Bir maske kullanın ve silikayı kapalı bir kaba atın.
Şekil 3: Çözülmüş karışık gangliosidin TLC plakası. Resorsinol boyama ve ısıtıldıktan sonra resorsinol lekelendikten ve yerine kırpılmış cam kapak plakası ile ısıtıldıktan sonra çözülmüş karışık gangliosid standartlarının (sol şerit) ve saflaştırılmış karışık sığır gri madde gangliosidlerinin (sağ şerit) TLC plakası. Standart gangliosidler (yukarıdan aşağıya) GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b, GT1b ve GQ1b'dir. Soğuduktan sonra, plaka görüntülenebilir ve / veya kapak plakası depolama için yerine bantlanabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Gangliosidler ve fosfolipitler için genel lipid boyaması.
DİKKAT: Sülfürik asit toksik ve aşındırıcıdır. Etanol'e konsantre asit ilavesi ekzotermiktir ve yavaşça yapılmalıdır. Boyama reaktifini koruyucu eldivenler ve güvenlik gözlükleri ile bir duman başlığında hazırlayın.- 500 mL etanol'e yavaşça 15 mL konsantre sülfürik asit ekleyerek p-anisaldehit boyası hazırlayın. Devam etmeden önce çözeltinin soğumasını sağlamak için 30 dakika karıştırın. 15 mL p-anisaldehit ekleyin ve hafifçe karıştırın. Bu, altı aya kadar oda sıcaklığında (22 ° C) saklanabilir.
- Kimyasal bir duman davlumbazında, TLC plakasını çözülmüş gangliosidlerle, orijin ucu aşağıya, p-anisaldehit lekesi içeren bir beherin içine batırın. ≥ 2 s için koşu cephesine daldırın. TLC'yi lekeden çıkarın ve boşalmasına izin verin. TLC plakasını sıcak bir plaka üzerinde düşük sıcaklıkta ısıtarak geliştirin.
NOT: Lipitler mor bir arka plana karşı koyu görünecektir. Boyama çözeltisi tekrarlanan kullanım için geri kazanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bölüm 1'de (küçük ölçekli) açıklanan yöntemler, majör beyin gangliosidlerinin kalitatif ve kantitatif tayini için yeterli miktarda ve saflıkta gangliosidler sağlar. Fare beyninden iyileşme, tarif edildiği gibi hazırlandığında g beyin ıslak ağırlığı (1 nmol / μL) başına ~ 1 μmol gangliosiddir. Bölüm 3 kullanılarak 1 μL'lik (1 nmol) TLC çözünürlüğü, resorsinol tespiti için yeterli materyal sağlar ve Şekil 4'te vahşi tip ve genetiği değiştirilmiş fareler için gösterildiği gibi tüm büyük beyin gangliosidlerini çözer. Bölüm 1 kullanılarak hazırlanan karışık gangliosidler diğer majör lipitlerden arındırılmış olmamakla birlikte, gangliosidler Şekil 5'te gösterildiği gibi kütle spektrometrik (MS) tayini için yeterli saflıktadır, negatif modda doğal saflaştırılmış gangliosidler olarak veya pozitif modda permetilasyondan sonra9. Bölüm 1, fosfolipitleri uzaklaştırmak için alkali hidrolizden kaçındığından, O-asetillenmiş sialik asitler gibi alkaliye duyarlı doğal modifikasyonları korur (bakınız GT1b-OAc, Şekil 4)9.
Şekil 4: Fare beyni gangliosidlerinin TLC'si. Vahşi tip (WT) ve St3gal tek ve çift null farelerden fare beyni gangliosidlerinin TLC'si, Protokol 1'de olduğu gibi saflaştırılmıştır. Bu rakam Sturgill ve ark., 20129'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Permetillenmiş vahşi tip ve St3gal2/3-double-null fare beyin gangliosidlerinin MS'i, bölüm 1'deki gibi saflaştırılmıştır. GD1a ve GD1b'nin TLC ile çözüldüğünü unutmayın (Şekil 4) ancak aynı kütleye sahiptir, bu nedenle tek boyutlu MS ile ayırt edilemez. Bu rakam Sturgill ve ark., 20129'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Büyük ölçekli saflaştırma (bölüm 2), biyolojik deneyler ve daha ileri kimyasal ve enzimatik modifikasyonlar için uygun saflaştırılmış majör beyin gangliosidleri GM1, GD1a, GD1b ve GT1b sağlamak için ekstraksiyon, sabunlaştırma (fosfolipitleri uzaklaştırmak için) ve HPLC çözünürlüğünü içerir. Örnek bir HPLC profili ve ardından gelen TLC analizleri Şekil 6'da gösterilmiştir. Bu protokolde kirletici fosfolipitleri hidrolize etmek ve uzaklaştırmak için alkali muamelesi (sabunlaştırma) gereklidir (Şekil 7), ancak aynı zamanda bazı bağlamlarda önemli olabilecek O-asetillenmiş sialik asitler gibi gangliosidlerin doğal modifikasyonlarını hidrolize edecektir10. Bu uygulamalar için, fosfolipitlerin izole gangliosidlerden uzaklaştırılması için alternatif etkili yöntemler yayınlanmıştır6.
Şekil 6: Sığır beyni gangliosidlerinin temsili HPLC'si. Elüsyon gradyanı (%B, noktalı çizgi), döngünün ilk 75 dakikası boyunca absorbans (A215, katı çizgi) üzerine bindirilir. Zirveler (A215) toplandı (parantez içindeki sayılar) ve Protokol 3'te olduğu gibi TLC'ye tabi tutuldu. Şerit numaraları, kromatogramdaki tepe sayılarını ifade eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Çözülmüş karışık gangliosidin TLC plakası. Çözümlenmiş karışık gangliosid standartlarının (şerit 1) TLC plakası, sabunlaşma sonrası bölümlenmiş gangliosidler (şerit 2) ve salınan yağ asitleri (şerit 3) ile birlikte. Gangliosidler de dahil olmak üzere lipitler p-anisaldehit boyası ile tespit edilir. Standart gangliosidler (yukarıdan aşağıya) GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b ve GT1b'dir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada bildirilen küçük ve büyük ölçekli gangliosid ekstraksiyonu ve izolasyonu yöntemleri benzersiz değildir - mükemmel sonuçlar veren birçok farklı çözücü ekstraksiyonu ve saflaştırma yaklaşımı vardır12. Burada beyinden, Fredman ve Svennerholm'dan13 küçük ölçekli saflaştırma için bildirilen yöntemlerin iyileşmeyi optimize ettiği ve laboratuvarımızda uzun yıllar boyunca sağlam ve basit olduğu kanıtlanmıştır. TLC ve MS için uygun izolasyon ve saflaştırma, sağlam dokudan izole gangliosidlere kadar birkaç saat içinde kolayca tamamlanabilir. MS, negatif modda doğal saflaştırılmış gangliosidlerde veya pozitif modda permetilasyondan sonra yapılabilir (Şekil 7, örneğin, Sturgill ve ark.9'a bakınız). Verim çok tutarlıdır, çoğu memeli için g taze beyin dokusu başına 1 μmol gangliosid (≈ 2 μmol ganglioside bağlı sialik asit) ≈. Tettamani ve ark.14 tarafından tanıtılan, burada bildirilen beyinden büyük ölçekli ekstraksiyon ve bölme yöntemi, ilk bölmede (eter-tetrahidrofuran-su) ganglioside içeren çözücünün hacmini en aza indirmek için seçilmiştir. Bu, ilk adımlarda büyük miktarlarda bölümlenmiş gangliosidler üreten tekniklerle hantal hale gelebilecek sonraki adımları basitleştirir. Gazzotti ve ark.15'ten tanımlanan HPLC yöntemi, majör beyin gangliosidlerinin nispeten yüksek kapasitesine ve iyi çözünürlüğüne sahiptir.
Açıklanan küçük ölçekli protokoller hem hücreler hem de dokular için çok uygundur ve ölçeklenebilir. Son adımlar metanolde ters faz yakalama, buharlaşma ve çözünme olduğundan, kültürlenmiş sinir hücreleri gibi küçük örneklere keyfi bir ölçekte uygulanabilirler. Bu durumda, kolaylık sağlamak için hücreleri 1 mL suya kazıyıp homojenize ediyoruz ve ekstraksiyon ve daha sonra bölme için uygun oranları üretmek üzere metanol ve kloroform ilavesi ile devam ediyoruz. Ters fazdan sonra son kurutulmuş gangliosidler sadece birkaç mikrolitre içinde yeniden çözülebilir ve TLC ve MS tarafından analiz edilebilir.
Solvent oranlarına dikkat, ganglioside izolasyonu için ekstraksiyon ve solvent bölümleme adımlarında başarı için kritik öneme sahiptir. Küçük ölçekli ekstraksiyon ve bölümleme için, farklı kloroform-metanol-su oranları test edilmiş ve kantitatif gangliosid izolasyonuna yakın üretilenler burada bildirilmiştir13. Açıklanan oranlardan farklılıklar geri kazanımı ve / veya saflaştırmayı azaltacaktır. Aynı şekilde, TLC'de solvent geliştiren solvent oranlarına dikkat edilmesi kritik öneme sahiptir. Bildirilen kloroform-metanol-su oranları tek bir net faz ile sonuçlanır. Küçük varyasyonlar, kullanılmaması gereken bulutlu gelişen çözümler üretebilir, ancak dönen metanolün damla damla eklenmesiyle açıklığa kavuşturulabilir. Farklı ekstraksiyon ve bölme çözücüleri yaygın olsa da, her varyasyon için çözücü oranları dikkatle takip edilmelidir12. TLC çözücülerdeki değişiklikler, spesifik gangliosidlerin ayrılmasını optimize etmek için de yaygındır16. Gangliosidlerin TLC göçünü değiştirmenin nispeten basit bir yolu, çözücü karışımının sulu fazını değiştirmektir. Potasyum klorür yerine sulu amonyum hidroksit veya kalsiyum klorür kullanılması, ganglioside tuz formunu ve göreceli TLC migrasyonunu değiştirir17.
Tüm omurgalı hücreleri ve dokuları gangliyozları eksprese ederken, beyin ve sinir hücreleri eksprese edilen yüksek miktarlarda olağandışıdır. Burada açıklanan protokoller diğer dokulara ve hücrelere uygulanabilir, ancak daha düşük bolluk ve diğer lipitlerle potansiyel kontaminasyon nedeniyle modifikasyonlar gerekebilir. İnsan nötrofillerine6 ve fare adipozuna18 uygulanan bu yöntemler örnekler sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını iddia ediyorlar.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Glikobilim Ortak Fonu hibesi U01CA241953 tarafından desteklenmiştir. MJP, Johns Hopkins'teki Kimya-Biyoloji Arayüz Programı (T32GM080189) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine brain, stripped | PelFreez | 57105-1 | |
| Ganglioside standards | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| Glass bottle with PTFE-lined cap | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| Glass centrifuge bottle | Fisher Scientific | 05-586B | |
| Glass culture tubes, 16 x 125 mm | VWR | 60825-430 | for collecting HPLC fractions |
| Glass separatory funnel (2 L) | Pyrex | 6400-2L | |
| Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 µl | Hamilton | 81265 | |
| p-Anisaldehyde, 98% | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Potter-Elvhjem Homogenizer | Fisher Scientific | 08-414-14A | Choose appropriate volume option |
| Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns | Analytics-Shop | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column | Analytics-Shop | custom packed | other sizes available |
| Resorcinol | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-300 | |
| Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml) | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) | Waters | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg | Waters | WAT036810 | |
| Spotting syringe - Hamilton 701N 10 µl | Hamilton | 80300 | |
| Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-933A | |
| Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-955-323 | For ganglioside storage |
| TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat | Fisher Scientific | M1056350001 | Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface |
| TLC reagent sprayer | Fisher Scientific | 05-723-26A | |
| TLC running chamber for 10 x 10 cm plates | Camag | 22.5155 | |
| Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender | Waring | E8520 |
References
- Schnaar, R. L.
- DeMarco, M. L., Woods, R. J. Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces. Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).
- Schnaar, R. L.
- Klenk, E. Über die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids]. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).
- Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells. Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).
- Nimrichter, L., et al.
- Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).
- Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).
- Sturgill, E. R., et al. Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b. Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).
- Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy. Cells. 9 (3), (2020).
- Varki, A., et al. Symbol nomenclature for graphical representations of glycans. Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).
- Schnaar, R. L.
- Svennerholm, L., Fredman, P. A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).
- Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).
- Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures. Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).
- Schnaar, R. L., Needham, L. K.
- Ledeen, R. W., Yu, R. K. Gangliosides: structure, isolation, and analysis. Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).
- Lopez, P. H., et al. Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance. Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).
