Summary
Este documento detalla los métodos que demuestran tres técnicas comunes de recolección y desagregación de biopelículas en dos tipos de superficie, pruebas de robustez de un método de cosecha e información mínima a considerar al elegir y optimizar las técnicas de cosecha y desagregación para aumentar la reproducibilidad.
Abstract
Los métodos de biopelícula consisten en cuatro pasos distintos: cultivar la biopelícula en un modelo relevante, tratar la biopelícula madura, cosechar la biopelícula de la superficie y desagregar los grupos, y analizar la muestra. De los cuatro pasos, la recolección y la desagregación son los menos estudiados, pero sin embargo críticos cuando se considera el potencial de sesgo de la prueba. Este artículo demuestra las técnicas de cosecha y desagregación comúnmente utilizadas para biopelículas cultivadas en tres superficies diferentes. Las tres técnicas de recolección y desagregación de biopelículas, obtenidas de una extensa revisión de la literatura, incluyen vórtice y sonicación, raspado y homogeneización, y raspado, vórtice y sonicación. Se consideran dos tipos de superficie: dura no porosa (policarbonato y vidrio de borosilicato) y porosa (silicona). Además, proporcionamos recomendaciones para la información mínima que debe incluirse al informar la técnica de cosecha seguida y un método acompañante para verificar el sesgo.
Introduction
La definición de biofilm ha evolucionado en las últimas décadas y abarca la asociación microbiana con una variedad de superficies biológicas y/o no biológicas, la inclusión de componentes no celulares1 que muestran un crecimiento diferente y la expresión genética2 dentro de una matriz. La biopelícula proporciona protección contra las tensiones ambientales, como el secado, y puede hacer que la acción de los desinfectantes químicos sea menos efectiva, lo que resulta en la supervivencia de los microbios. Los sobrevivientes dentro de una biopelícula pueden potencialmente proporcionar una fuente de microorganismos patógenos que son un problema de salud pública3.
Los métodos de biopelícula se componen de cuatro pasos, crecimiento, tratamiento, muestreo (cosecha y desagregación) y análisis. El crecimiento, el primer paso, donde el usuario determina las condiciones de crecimiento del organismo, la temperatura, los medios, etc., es el más considerado e informado en la literatura de biofilm4,5,6,7. La etapa de tratamiento evalúa los antimicrobianos (por ejemplo, desinfectantes) para determinar su eficacia, ya sea contra una biopelícula madura3,8,9 o el antimicrobiano puede incorporarse a la superficie para determinar la capacidad del producto para prevenir o reducir el crecimiento de la biopelícula10. El tercer paso, el muestreo, incluye pasos para cosechar la biopelícula de la superficie en la que estaba creciendo y para desagregar los grupos eliminados3,8,11. El cuarto paso, el análisis, puede incluir recuentos celulares viables, microscopía, mediciones de fluorescencia, resultados moleculares y/o una evaluación de componentes matriciales8,9. La evaluación de los datos proporciona información sobre el resultado de un experimento. De los cuatro, el muestreo es a menudo el paso más pasado por alto porque supone que la técnica de recolección y/o desagregación de biopelícula elegida es 100% efectiva, a menudo sin verificación11.
Las suspensiones planctónicas de bacterias, a menudo consideradas homogéneas, requieren un vórtice simple antes del análisis. Los biofilms, sin embargo, son comunidades complejas compuestas por microorganismos (procariotas y/o eucariotas), exopolisacáridos, proteínas, lípidos, ADN extracelular y células huésped12. Se necesitan pasos más allá de los métodos tradicionales de cultivo microbiológico planctónico para cosechar adecuadamente la biopelícula de una superficie y luego desagregarla en una suspensión homogénea de una sola célula. Una extensa revisión de la literatura (información no incluida en esta publicación) demostró que la elección de la técnica de eliminación y desagregación depende de una serie de factores, incluidas las especies presentes en la biopelícula, la superficie a la que está unida la biopelícula (no porosa o porosa), la accesibilidad a las superficies de crecimiento (cupón fácilmente extraíble o destrucción física del aparato en el que crece la biopelícula), geometría de la superficie (área y forma), densidad de la biopelícula en las superficies de crecimiento y equipo de laboratorio disponible.
Cuando la biopelícula se cosecha de una superficie, la suspensión celular resultante es heterogénea. Para que esta suspensión no uniforme se enumere con precisión, debe desglosarse en células individuales. Los recuentos de placas viables suponen que una unidad formadora de colonias se origina en una bacteria. Si se colocan agregados de biopelícula en el medio de crecimiento, es imposible distinguir células individuales, lo que podría conducir a estimaciones inexactas. Por ejemplo, durante las pruebas de eficacia del desinfectante, si un tratamiento elimina la biopelícula de manera muy efectiva de una superficie en comparación con el control, la reducción del registro podría parecer artificialmente grande en comparación con el control. Por otro lado, un desinfectante químico que fija biofilm en una superficie en comparación con el control parecerá tener una menor reducción de logaritmos11. Este tipo de escenario podría conducir a una interpretación sesgada de los datos experimentales.
En preparación para la publicación, una revisión de la literatura determinó que los enfoques comunes para cosechar y desagregar la biopelícula incluyen raspado, hisopo, sonicación, vórtice o una combinación de estos. El raspado se define como la eliminación física de la biopelícula de las superficies con un palo estéril, espátula u otra herramienta. El hisopo se refiere a la eliminación de la biopelícula de las superficies con un palo con punta de algodón u otro material absorbente fijo. La sonicación se refiere a la interrupción de la biopelícula de las superficies a través de ondas ultrasónicas distribuidas a través del agua. El vórtice se refiere al uso de un mezclador para lograr un vórtice líquido de la muestra dentro de un tubo. La homogeneización utiliza cuchillas giratorias para cortar por cizallamientos de biopelícula cosechados en una suspensión de una sola célula. En este trabajo, presentamos tres métodos de cosecha y desagregación para dos tipos de superficie diferentes, duro / no poroso y poroso.
Se proporciona una lista de información mínima recomendada que los investigadores deben incluir en las secciones de métodos de las publicaciones. Esperamos que la inclusión de esta información permita a otros investigadores reproducir su trabajo. No existe un método perfecto de cosecha y desagregación, por lo tanto, también se proporcionan recomendaciones sobre cómo verificar la técnica.
En este artículo se demuestran tres métodos comunes para cosechar y desagregar la biopelícula de las superficies de crecimiento comunes. Esta información permitirá a los investigadores comprender mejor la precisión general y el sesgo de un método de prueba de biopelícula. Los métodos descritos son los siguientes: (1) Una biopelícula de Pseudomonas aeruginosa cultivada en cupones de policarbonato (superficie dura no porosa) bajo alto cizallamiento de fluidos en el reactor de biopelícula CDC se cosecha y desagrega después de una combinación de cinco pasos de vórtice y sonicación para lograr la cosecha y desagregación de biopelícula (2) A P. aeruginosa La biopelícula cultivada en cupones de vidrio de borosilicato (superficie dura no porosa) en el reactor de flujo de goteo bajo cizallamiento de fluido se cosecha y desagrega mediante raspado y homogeneización (3) Una biopelícula de Escherichia coli cultivada en tubos de silicona (superficie porosa) se cosecha y desagrega mediante raspado, seguido de sonicación y vórtice.
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Protocol
1. Vórtice y sonicación
- Cultive una biopelícula madura de P. aeruginosa ATCC 15442 cultivada de acuerdo con la norma ASTM E25622.
- Al final del período de crecimiento de 48 h, prepárese para tratar la biopelícula y los cupones de muestra de acuerdo con la norma ASTM E28718
- Inserte asépticamente protectores contra salpicaduras en autoclave en tubos cónicos estériles de 50 ml utilizando pinzas esterilizadas por llama. Repita la repetición para todos los tubos que recibirán tratamiento. Los tubos para cupones de control no necesitan un protector contra salpicaduras.
- Retire asépticamente una varilla seleccionada al azar del reactor de biopelícula de los CDC. Enjuague los cupones para eliminar las células sueltas sumergiendo suavemente la varilla en 30 ml de agua tamponada estéril.
- Sostenga la varilla paralela a la mesa de trabajo, sobre un tubo cónico vacío y estéril de 50 ml y, utilizando una llave Allen esterilizada por llama, afloje el tornillo para dejar caer un cupón recubierto de biopelícula en el tubo. Repita para el número deseado de cupones. Retire los protectores contra salpicaduras y colóquelos en un recipiente separado para la esterilización.
- Usando una pipeta serológica de 5 ml, pipetee lentamente 4 ml del tratamiento o control en los tubos para que el líquido fluya por el interior de la pared del tubo.
- Golpee suavemente la parte inferior del tubo para que las burbujas de aire debajo del cupón se desplacen. Permita 30 - 60 s entre cada adición.
- Al final del tiempo de contacto especificado, pipetee 36 ml de neutralizador en los tubos en el mismo orden en que se aplicó el tratamiento (o control).
NOTA: El volumen final de tratamiento combinado y neutralizador es importante para determinar con precisión la densidad logarítmica de la biopelícula. - Vórtice cada tubo en el ajuste más alto durante 30 ± 5 s. Asegúrese de que se logre un vórtice completo.
NOTA: Se debe tener precaución al vórtice cupones pesados como el acero inoxidable en viales de vidrio donde podría ocurrir una rotura. - Determine el número óptimo de tubos por baño y la colocación dentro del bastidor del tubo de ensayo antes de procesar las muestras reales. Si procesa varias muestras, confirme que la temperatura del agua en el baño sonicante es de 21 ± 2 oC.
- Coloque los tubos en el bastidor de tubos suspendidos en el sonicador desgasificado de tal manera que el nivel de agua en el baño sea igual al nivel de líquido en los tubos. Sonicado a 45 kHz, 100% de potencia y función Normal para 30 ± 5 s. Repita los ciclos de vórtice y sonicación y luego termine con un vórtice final (5 ciclos en total).
NOTA: Estos tubos con el biofilm cosechado y desagregado son la dilución 100 o 0. - Diluya en serie la muestra en agua tamponada. Placa en el agar R2A utilizando el método de chapado apropiado. Incubar a 36 ± 2 oC durante 24 h. Cuente las colonias según corresponda al método de recubrimiento utilizado y registre los datos.
2. Raspado y homogeneización
- Cultivar un biofilm maduro de P. aeruginosa ATCC 15442 según la Norma ASTM E264713.
- Configure la estación de muestreo para incluir tablero de muestreo, etanol al 95% en un vaso de precipitados, quemador de alcohol, hemostáticos, herramienta de eliminación de cupones, vasos de precipitados con agua de dilución estéril y tubos de dilución para enjuagar los cupones.
- Apague la bomba. Retire una cubierta de canal y use una herramienta estéril de eliminación de cupones y hemostáticos para quitar el cupón, teniendo cuidado de no molestar la biopelícula.
- Enjuague el cupón sumergiendo suavemente, con un movimiento fluido, en 45 ml de agua de dilución estéril (contenida en un tubo de centrífuga de 50 ml). Invierta inmediatamente el movimiento para eliminar el cupón.
- Coloque el cupón en un vaso de precipitados que contenga 45 ml de agua de dilución estéril. Raspe la superficie del cupón cubierta de biopelícula en una dirección descendente durante aproximadamente 15 s, utilizando una espátula o raspador estéril. Enjuague la espátula o el raspador revolviéndolo en el vaso de precipitados. Repita el proceso de raspado y enjuague 3-4 veces, asegurando una cobertura completa de la superficie del cupón.
- Enjuague el cupón manteniéndolo en un ángulo de 60° sobre el vaso de precipitados estéril y pipeteando 1 ml de agua de dilución estéril sobre la superficie del cupón. Repetir para un total de 5 enjuagues. El volumen final en el vaso de precipitados es de 50 ml.
NOTA: El volumen final de tratamiento combinado y neutralizador es importante para determinar con precisión la densidad logarítmica de la biopelícula. - Reemplace cada cubierta de canal a medida que se eliminan los cupones.
- Trabajando en el gabinete de bioseguridad, homogeneice la muestra de biopelícula raspada. Conecte una sonda homogeneizadora estéril al homogeneizador, coloque la punta de la sonda en el líquido, encienda el homogeneizador y aumente hasta 20.500 rpm.
- Homogeneizar la muestra durante 30 s. Apague las RPM y apague el homogeneizador.
- Desinfecte la sonda entre muestras de biofilm homogeneizando un espacio en blanco de dilución estéril de 9 ml a 20.500 rpm durante 30 s como se describió anteriormente. Homogeneizar un tubo de 9 mL de etanol al 70% durante 30 s, separar la sonda y dejar reposar en el tubo de etanol durante 1 min. Homogeneizar dos espacios en blanco de dilución adicionales.
NOTA: Se puede utilizar una sonda homogeneizadora desechable para cada muestra. - Diluya en serie las muestras en agua tamponada. Placa en agar R2A utilizando el método de chapado apropiado. Incubar placas a 36 ± 2oC durante 24 h, contar colonias según corresponda al método de chapado utilizado y registrar datos.
3. Raspado, vórtice y sonicación
- Cultivar una biopelícula madura de Escherichia coli ATCC 53498 en tubos de catéter de silicona10.
- Prepare los materiales de muestreo: tubos de enjuague, tubo de centrífuga estéril, placa de Petri estéril vacía, hemostático y tijeras de acero inoxidable esterilizados por llama, temporizador y regla.
- Con la bomba en pausa, use etanol al 70% para limpiar el exterior de la tubería. Mida 2 cm desde el extremo, evitando el área unida al conector, y marque el tubo para determinar las ubicaciones de corte.
- Con tijeras esterilizadas a la llama, corte el tubo en la marca de 2 cm y coloque el segmento en una placa de Petri estéril vacía. Limpie el tubo con etanol al 70% y vuelva a conectar el extremo distal al tubo de desecho.
- Enjuague el segmento de tubos para eliminar las células planctónicas. Con pinzas esterilizadas por llama, sumerja suavemente el segmento de tubería en 20 ml de agua de dilución estéril y luego retire inmediatamente. Coloque el segmento en 10 ml de neutralizador.
- Con pinzas esterilizadas por llama, sostenga el segmento del tubo y raspe con una barra aplicadora de madera estéril hasta que se hayan raspado todas las áreas internas del tubo. Ocasionalmente enjuague el palo en los 10 ml de neutralizador y vuelva a colocar el segmento en el tubo de muestra. El segmento de tubos raspados es la dilución 100 o 0.
NOTA: El volumen final de tratamiento combinado y neutralizador es importante para determinar con precisión la densidad logarítmica de la biopelícula. - Vórtice cada tubo en el ajuste más alto durante 30 ± 5 s. Coloque el tubo en el bastidor de tubos suspendido en el sonicador de modo que el nivel de agua en el baño sea igual al nivel de líquido en los tubos. Sonicado a 45 kHz, 100% de potencia y función Normal durante 30 ± 5 segundos. Repita los ciclos de vórtice y sonicación y luego termine con un vórtice final.
NOTA: Este tubo con la biopelícula cosechada y desagregada es la dilución 100 . - Diluya en serie las muestras en agua tamponada. Plato en agar de soja tríptico utilizando el método de recubrimiento apropiado.
- Incubar placas a 36 ± 2 oC durante 24 h. Contar las colonias según corresponda al método de chapado utilizado, registrar los datos y calcular la media aritmética.
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Representative Results
Validación/Confirmación de un Método de Cosecha
Varios estudios que se llevaron a cabo en nuestro laboratorio examinaron la capacidad del vórtice y la sonicación para cosechar eficazmente la biopelícula cultivada en el reactor de biopelícula (ASTM E2562)2 utilizando el método de tubo único (ASTM E2871)8.
Una biopelícula atcc 15442 de P. aeruginosa se cultivó de acuerdo con ASTM E25622 en cupones de vidrio de borosilicato. Después de 48 horas, se colocaron cuatro cupones en viales, "tratados" con 4 ml de agua tamponada estéril y neutralizados con 36 ml de caldo neutralizante 2x D / E. La configuración de sonicación inicial de 45 kHz, 10% de potencia, configuración de barrido, 30 ± 5 s se utilizó para cosechar y desagregar la biopelícula de tres de los cuatro cupones. Al finalizar el ciclo de vórtice y sonicación, cada cupón se tiñó con cristal violeta y se fotografió. La Figura 1 muestra la cantidad de biopelícula restante en los tres cupones después del vórtice y la sonicación en comparación con el control.
Para probar esto aún más, se cultivó una biopelícula ATCC 15442 de P. aeruginosa como se describió anteriormente y se compararon dos configuraciones de sonicación: 1) 45 kHz, 10% de potencia, configuración de barrido, 30 ± 5 segundos y 2) 45 kHz, 100% de potencia, configuración normal, 30 ± 5 segundos. Un cupón de cada conjunto de los tres se tiñó con tinción BacLight Live/ Dead y se tomó una imagen utilizando microscopía confocal (CM). Los dos cupones restantes de cada conjunto fueron diluidos, chapados y enumerados para células viables. Los resultados viables del recuento de placas fueron 9.230 CFU Log10 / cupón ± 0.007 (SD_R) para la configuración 1 y 9.272 CFU Log10 / cupón ± 0.066 (SD_R) para la configuración de sonicación 2. Estos datos corroboraron un Estudio Colaborativo del Método de Un Solo Tubo de la EPA de 2015 donde se logró 9.03 CFU/cupón Log10 ± 0.272 (SD_R)9. De acuerdo con los recuentos de placas viables, parece que los tres medios son lo suficientemente similares como para no justificar una mayor investigación sobre las diferencias entre los dos métodos de cosecha. Sin embargo, las imágenes microscópicas mostradas en la Figura 2 pueden sugerir que quedó más biopelícula después del uso de la configuración 1 que de la configuración 2. Si bien observamos que la biopelícula que permanece en los cupones aparece muerta (de color rojo), la interpretación de la viabilidad cuando se usa la tinción BacLight Live/Dead es difícil14,15. En lugar de centrarnos en las implicaciones de viabilidad de la biopelícula teñida, utilizamos esta tinción para visualizar la biopelícula que permanece en las superficies. Además, si bien reconocemos que la sonicación podría ser perjudicial para la viabilidad bacteriana, una publicación de 2007 de Kobayashi et al.16 demostró que el aumento del tiempo de sonicación más allá de 5 minutos resultó en una disminución de los recuentos de placas viables. Dado que nuestro estudio utilizó un total de sonicación de 1 minuto, estamos seguros de que pocas células fueron asesinadas a través de la sonicación, como lo muestra la ufc / cupones >9.2 LOG10 para los dos parámetros de sonicación. Es interesante que no se logró una cosecha completa de la biopelícula de la superficie por ninguno de los dos métodos. Este hallazgo demuestra que los recuentos de placas viables por sí solos no son adecuados para determinar el sesgo de cosecha y desagregación y, por lo tanto, deben combinarse con un método adicional, la microscopía, por ejemplo.
Además de la configuración del sonicador, investigamos otros factores importantes que afectan la sonicación. Estos incluyeron el volumen de líquido en los viales (10 o 40 ml), el tipo de líquido en el vial (agua tamponada o caldo neutralizante 2X D/E) y el número de viales colocados en el baño al mismo tiempo (3 o 12 viales)9.
Las biopelículas de P. aeruginosa en los cupones del reactor de biopelículas cdc se sonicaron utilizando la configuración del sonicador 2 (45 kHz, 100% de potencia, configuración normal, 30 ± 5 segundos). Todas las muestras se vórtices 3 a la vez o 6 a la vez utilizando un vórtice equipado con un accesorio de tubo de 6 lugares y luego se sonicaron como se describe en la Figura 3. Se tomó una imagen de un cupón de cada una de las siguientes categorías utilizando CM (Figura 3).
En el segundo estudio donde se investigaron los parámetros de sonicación, las imágenes microscópicas (Figura 3) sugieren que minimizar el volumen en los tubos, reducir el número de tubos procesados a la vez y el uso de caldo neutralizante D / E (que contiene surfactante) contribuyen a mejorar la recolección de biopelículas de los cupones.
Los biocidas pueden mejorar positiva o negativamente la cosecha y el desagregación. Similar a confirmar que un neutralizador detiene efectivamente el activo sin aumentar la muerte antes de realizar una prueba de eficacia, es importante confirmar que un biocida no afecta de manera diferencial la recolección y la desagregación. Para las pruebas de eficacia, los resultados de sesgo si y solo si hay una eliminación diferencial para las muestras de biopelícula control vs tratadas11.
Figura 1: Fotos de cupones teñidos con cristal violeta que demuestran biofilm residual. A) Cupón retirado del reactor y teñido con cristal violeta. B, C, D) Tres cupones replicados fueron "tratados" por separado con agua tamponada estéril y luego neutralizada. Para cosechar y desagregar, los cupones fueron vórtices (30 ± 5 segundos) y sonicados (45 kHz, 10% de potencia, ajuste de barrido, 30 ± 5 segundos) dos veces y luego recibieron un vórtice final. Imágenes cortesía de Danielle Orr y Blaine Fritz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de microscopía confocal de cupones que comparan dos configuraciones de sonicación diferentes. Cupones (aumento de 12,5X) procesados mediante el ajuste de sonicación 1 (45 kHz, 10% de potencia, ajuste de barrido) a la izquierda o el ajuste de sonicación 2 (45 kHz, 100% de potencia, ajuste normal) a la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Imágenes de microscopía confocal de cupones comparando volúmenes, líquido de sonicación y número de tubos. Cupones (aumento de 12.5X) procesados en volúmenes de 10 o 40 ml, en agua de dilución (DW) o caldo neutralizante D / E (D / E), 3 o 12 tubos a la vez con ajuste de sonicación optimizado (45 kHz, 100% de potencia, ajuste normal). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo complementario 1: Parámetros clave de importancia para la cosecha y la desagregación Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Información mínima para los métodos de recolección y desagregación
Para crear datos de biopelícula reproducibles en toda la comunidad científica, es imperativo que los autores incluyan tantos detalles como sea posible con respecto a cada uno de los pasos de crecimiento, tratamiento, muestreo y análisis de un método de biopelícula. La estandarización de los métodos de biopelícula ha ayudado en este esfuerzo, ya que permite al investigador hacer referencia a un método específico y cualquier modificación relevante. Sin embargo, muchos artículos incluyen solo una o dos oraciones para describir la recolección y desagregación de biopelículas. Para una mejor reproducibilidad, recomendamos que se incluya en las publicaciones información mínima para la recolección de biopelículas. Esto se basa en la iniciativa Minimum Information About a Biofilm Experiment (MIABiE) presentada por Lourenco et al.17. En el caso de utilizar la sonicación para la recolección de biopelículas y los parámetros de desagregación, la información debe incluir: posición de los tubos dentro del baño (recomendaciones de los fabricantes para evitar dañar los transductores), número de tubos sonicados al mismo tiempo, material del tubo, volumen y tipo de líquido en el tubo, presencia de surfactante, posición del líquido en los tubos en relación con el nivel de líquido del baño ultrasónico, dispositivo utilizado para mantener los tubos en el baño (vasos de precipitados de vidrio vs. bastidor de tubos de ensayo), desgasificación del baño de agua antes de la sonicación de las muestras (si la desgasificación no es una opción del fabricante, la operación simple del baño antes de insertar las muestras ayudará a eliminar algunos gases disueltos del líquido del baño), temperatura del baño de agua (las temperaturas pueden aumentar después de largos períodos de sonicación), frecuencia (25 kHz o 45 kHz, por ejemplo), función de baño (barrido o normal, por ejemplo) y rango de potencia entregado a los transductores (10 - 100%, por ejemplo). Estos ajustes deben optimizarse para el biofilm que se está estudiando, el sistema utilizado para cultivar el biofilm y la marca/modelo específico del baño ultrasónico18.
La configuración del sonicador se puede cambiar para optimizar los efectos de cosecha deseados. La desgasificación elimina el aire disuelto dentro del líquido del baño, mejorando así el poder de limpieza. La frecuencia se puede ajustar a un ajuste bajo o alto. Un ajuste bajo, como 25 kHz, por ejemplo, ayudaría a cosechar muestras tenaces, mientras que un ajuste más alto de 45 kHz sería más apropiado para muestras sensibles. Una función de baño de barrido o normal permite la distribución de la cavitación. La función de barrido crea un desplazamiento continuo de los máximos de presión acústica. La función normal permite que los transductores funcionen en modo de doble media onda, lo que puede dar lugar a zonas muertas, lo que hace que la sonicación sea menos eficaz. Los rangos de potencia se pueden alterar del 10 al 100% de la potencia entregada a los transductores19. Se sabe que la sonicación puede afectar negativamente la viabilidad bacteriana. Un estudio de 2008 realizado por Stamper et al.20 expuso los cultivos bacterianos al aumento de la energía ultrasónica con el tiempo para crear curvas de muerte bacteriana. Recomendamos que los usuarios confirmen que una combinación particular de configuraciones de sonicación no causa una disminución de bacterias viables20.
No existe un método perfecto para cosechar y desagregar la biopelícula, pero los métodos particulares funcionan mejor para algunas combinaciones de superficies / microbios que otros. Abogamos por que el lector determine qué parámetros son importantes para su escenario particular de biopelícula. Los parámetros clave de importancia para la cosecha y el desagregación se incluyen en el Archivo Suplementario 1.
Para los estudios de sonicación realizados para evaluar el sesgo de cosecha y desagregación, encontramos que la sonicación es conveniente, eficiente y capaz de estandarizarse para cosechar y desagregar biopelículas de superficies. La colocación de cupones en viales minimiza la variabilidad de técnico a técnico que se encontraría en los métodos donde los cupones son raspados físicamente por el personal del laboratorio, por ejemplo. Aunque parece bastante simple colocar viales en un baño de agua sonicante, hay muchos parámetros que deben considerarse para lograr una cosecha óptima de biopelícula.
Hay dos tipos de equipos de sonicación disponibles, baños ultrasónicos y sondas ultrasónicas. Este documento se centra principalmente en baños ultrasónicos donde se genera energía ultrasónica en el rango de frecuencia alta (20 - 45 kHz) a normal (40 - 60 Hz).
Tres procesos principales están en juego cuando se utiliza un dispositivo ultrasónico para limpiar una superficie. La energía eléctrica se convierte en energía acústica cuando se envía una corriente de alta frecuencia a un transductor piezoeléctrico o magnetostrictivo que oscila en respuesta a la corriente. La oscilación genera ondas de compresión (rarefacción) en el líquido. Las burbujas de cavitación se forman debido a la presión negativa durante la rarefacción. Las burbujas crecen hasta alcanzar un tamaño inestable y colapsan, creando un chorro de agua que limpia las superficies21.
En este artículo se demuestran tres enfoques de cosecha y desagregación: métodos de sonicación y vórtice para cosechar y desagregar biopelícula cuando se cultiva en cupones de policarbonato en el reactor de biopelícula de los CDC de acuerdo con el método de tubo único. Los métodos de raspado y homogeneización para la recolección y desagregación de biopelículas se muestran cuando se cultivan en cupones de vidrio utilizando el reactor de biopelícula de flujo de goteo. Los métodos de raspado, sonicación y vórtice para cosechar y desagregar la biopelícula se muestran cuando se cultivan en tubos de silicona.
No existe un método perfecto para cosechar y desagregar la biopelícula, pero algunos enfoques son mejores para diferentes superficies y / o aplicaciones. Lo importante es tomarse el tiempo para validar el método utilizado. En este artículo, discutimos el uso de cristal violeta y microscopía, pero existen otras opciones dependiendo de la sensibilidad requerida. Si la investigación incluye pruebas de eficacia, entonces es fundamental confirmar la validez del enfoque en presencia del antimicrobiano6. Todos los equipos son ligeramente diferentes, por lo que incluso si el método de cosecha y desagregación se ha estandarizado, aún es prudente confirmar el proceso para el equipo utilizado. Los métodos de recolección y desagregación son específicos para bacterias asociadas a la superficie y de biopelícula. La investigación ha demostrado que las elecciones inadecuadas pueden conducir a resultados de pruebas sesgados. Sin embargo, la cosecha y la desagregación son los cuatro pasos menos estudiados en los métodos de biopelícula. Por lo general, también es el paso no validado (que se da por sentado como trabajo) con la menor cantidad de información presente en el artículo publicado, lo que dificulta la reproducción del proceso en un laboratorio diferente. Este documento y el video que lo acompaña muestran tres enfoques comunes para dos tipos de superficie y sugieren cómo validar un método para un laboratorio individual. Esta información ayudará a los investigadores a tomar decisiones más informadas sobre qué método usar y proporciona orientación sobre qué informar para mejorar la reproducibilidad.
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Disclosures
Los autores no tienen revelaciones.
Acknowledgments
Queremos agradecer a Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers y Fei San Lee por sus contribuciones a este documento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
References
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