Summary
Dit artikel beschrijft methoden die drie gangbare biofilmoogst- en desaggregatietechnieken op twee oppervlaktetypen demonstreren, robuustheidstests van een oogstmethode en minimale informatie om te overwegen bij het kiezen en optimaliseren van oogst- en desaggregatietechnieken om de reproduceerbaarheid te vergroten.
Abstract
Biofilmmethoden bestaan uit vier verschillende stappen: het kweken van de biofilm in een relevant model, het behandelen van de volwassen biofilm, het oogsten van de biofilm van het oppervlak en het uitsplitsen van de klonten en het analyseren van het monster. Van de vier stappen zijn oogsten en uitsplitsen het minst bestudeerd, maar niettemin kritisch bij het overwegen van het potentieel voor testbias. Dit artikel demonstreert veelgebruikte oogst- en desaggregatietechnieken voor biofilm die op drie verschillende oppervlakken wordt gekweekt. De drie biofilmoogst- en desaggregatietechnieken, verzameld uit een uitgebreid literatuuronderzoek, omvatten vortexing en ultrasoonapparaat, schrapen en homogeniseren, en schrapen, vortexen en ultrasoonapparaat. Twee oppervlaktetypen worden overwogen: hard niet-poreus (polycarbonaat en borosilicaatglas) en poreus (siliconen). Daarnaast geven we aanbevelingen voor de minimale informatie die moet worden opgenomen bij het rapporteren van de gevolgde oogsttechniek en een bijbehorende methode om te controleren op vertekening.
Introduction
De definitie van biofilm is de afgelopen decennia geëvolueerd en omvat microbiële associatie met een verscheidenheid aan biologische en / of niet-biologische oppervlakken, inclusief niet-cellulaire componenten1 die verschillende groei en genetische expressie vertonen2 binnen een matrix. Biofilm biedt bescherming tegen omgevingsstress zoals drogen en kan de werking van chemische desinfectiemiddelen minder effectief maken, wat resulteert in het overleven van microben. De overlevenden in een biofilm kunnen mogelijk een bron van pathogene micro-organismen vormen die een probleem voor de volksgezondheid zijn3.
Biofilmmethoden bestaan uit vier stappen, groei, behandeling, bemonstering (oogsten en uitsplitsen) en analyse. Groei, de eerste stap, waarbij de gebruiker de groeiomstandigheden van het organisme, temperatuur, media, enz. bepaalt, is de meest overwogen en gerapporteerde in de biofilmliteratuur4,5,6,7. De behandelingsstap evalueert antimicrobiële stoffen (bijv. ontsmettingsmiddelen) om hun werkzaamheid te bepalen, hetzij tegen een volwassen biofilm3,8,9, hetzij de antimicrobiële stof kan in het oppervlak worden opgenomen om het vermogen van het product om biofilmgroei te voorkomen of te verminderen te bepalen10. De derde stap, bemonstering, omvat stappen om de biofilm te oogsten van het oppervlak waarop deze groeide en om de verwijderde klonten uit te splitsen3,8,11. De vierde stap, analyse, kan levensvatbare celtellingen, microscopie, fluorescentiemetingen, moleculaire uitkomsten en/of een matrixcomponentbeoordeling8,9 omvatten. Beoordeling van gegevens geeft informatie over de uitkomst van een experiment. Van de vier is bemonstering vaak de meest over het hoofd geziene stap omdat het veronderstelt dat de gekozen biofilmoogst- en / of desaggregatietechniek 100% effectief is, vaak zonder verificatie11.
Planktonische suspensies van bacteriën, vaak beschouwd als homogeen, vereisen eenvoudige vortexing voorafgaand aan de analyse. Biofilms zijn echter complexe gemeenschappen die bestaan uit micro-organismen (prokaryote en/of eukaryote), exopolysacchariden, eiwitten, lipiden, extracellulair DNA en gastheercellen12. Stappen verder dan traditionele planktonische microbiologische kweekmethoden zijn nodig om biofilm adequaat van een oppervlak te oogsten en vervolgens uit te splitsen in een homogene eencellige suspensie. Een uitgebreid literatuuronderzoek (informatie die niet in deze publicatie is opgenomen) toonde aan dat de keuze van de verwijderings- en desaggregatietechniek afhankelijk is van een aantal factoren, waaronder soorten die aanwezig zijn in de biofilm, oppervlak waaraan de biofilm is bevestigd (niet-poreus of poreus), toegankelijkheid tot groeioppervlakken (gemakkelijk verwijderbare coupon of fysieke vernietiging van apparaten waarin de biofilm groeit), oppervlaktegeometrie (oppervlakte en vorm), dichtheid van biofilm op groeioppervlakken en beschikbare laboratoriumapparatuur.
Wanneer biofilm van een oppervlak wordt geoogst, is de resulterende celsuspensie heterogeen. Om deze niet-uniforme suspensie nauwkeurig te kunnen opsommen, moet deze worden opgesplitst in individuele cellen. Levensvatbare plaattellingen gaan ervan uit dat een kolonievormende eenheid afkomstig is van één bacterie. Als aggregaten van biofilm op het groeimedium worden geplaatst, is het onmogelijk om individuele cellen te onderscheiden, wat tot onnauwkeurige schattingen kan leiden. Bijvoorbeeld, tijdens het testen van de werkzaamheid van desinfectiemiddelen, als een behandeling biofilm zeer effectief van een oppervlak verwijdert in vergelijking met de controle, kan de logreductie kunstmatig groot lijken in vergelijking met de controle. Aan de andere kant zal een chemisch ontsmettingsmiddel dat biofilm op een oppervlak fixeert in vergelijking met de controle een lagere logreductie lijken te hebben11. Dit type scenario kan leiden tot een bevooroordeelde interpretatie van experimentele gegevens.
Ter voorbereiding op de publicatie heeft een literatuuroverzicht vastgesteld dat veel voorkomende benaderingen voor het oogsten en uitsplitsen van biofilm schrapen, swabben, ultrasoonapparaat, vortexing of een combinatie hiervan omvatten. Schrapen wordt gedefinieerd als fysieke verwijdering van biofilm van oppervlakken met een steriele stok, spatel of ander gereedschap. Swabbing verwijst naar het verwijderen van biofilm van oppervlakken met een wattenstokje of ander vast absorberend materiaal. Sonicatie verwijst naar verstoring van biofilm van oppervlakken via ultrasone golven die door water worden verspreid. Vortexing verwijst naar het gebruik van een mixer om een vloeibare vortex van het monster in een buis te bereiken. Homogenisatie maakt gebruik van roterende messen om geoogste biofilmklonten in een eencellige suspensie te scheren. In dit artikel presenteren we drie oogst- en desaggregatiemethoden voor twee verschillende oppervlaktetypen, hard/niet-poreus en poreus.
Er wordt een lijst met aanbevolen minimuminformatie verstrekt die onderzoekers moeten opnemen in de secties methoden van publicaties. We hopen dat het opnemen van deze informatie andere onderzoekers in staat stelt hun werk te reproduceren. Er is geen perfecte oogst- en uitsplitsingsmethode, daarom worden er ook aanbevelingen gegeven voor het controleren van de techniek.
Drie veelgebruikte methoden om biofilm van gemeenschappelijke groeioppervlakken te oogsten en af te splitsen, worden in dit artikel gedemonstreerd. Deze informatie zal onderzoekers in staat stellen om de algehele precisie en vooringenomenheid van een biofilmtestmethode beter te begrijpen. Beschreven methoden zijn als volgt: (1) Een Pseudomonas aeruginosa biofilm gekweekt op polycarbonaatcoupons (hard niet-poreus oppervlak) onder hoge vloeistofafschuiving in de CDC Biofilm Reactor wordt geoogst en uitgesplitst na een vijfstappencombinatie van vortexing en ultrasoonapparaat om biofilmoogst en -desaggregatie te bereiken (2) A P. aeruginosa biofilm gekweekt op borosilicaatglascoupons (hard niet-poreus oppervlak) in de druppelstroomreactor onder lage vloeistofafschuiving wordt geoogst en uitgesplitst met behulp van schrapen en homogenisatie (3) Een Escherichia coli-biofilm gekweekt in siliconenbuizen (poreus oppervlak) wordt geoogst en uitgesplitst met behulp van schrapen, gevolgd door ultrasoonapparaat en vortexing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vortexing en ultrasoonapparaat
- Kweek een volwassen P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm gekweekt volgens ASTM Standaard E25622.
- Bereid je aan het einde van de groeiperiode van 48 uur voor op de behandeling van de biofilm en monstercoupons volgens ASTM Standard E28718
- Plaats aseptisch geautoclaveerde spatschermen in steriele conische buizen van 50 ml met behulp van een vlamsteriliseerde tang. Herhaal dit voor alle buizen die een behandeling krijgen. Buizen voor bedieningscoupons hebben geen spatscherm nodig.
- Verwijder aseptisch een willekeurig geselecteerde staaf uit de CDC Biofilm Reactor. Spoel coupons om losjes gehechte cellen te verwijderen door de staaf voorzichtig in 30 ml steriel gebufferd water te dompelen.
- Houd de staaf parallel aan het tafelblad, boven een lege, steriele conische buis van 50 ml en maak met behulp van een vlamgestiliseerde inbussleutel de stelschroef los om een met biofilm gecoate coupon in de buis te laten vallen. Herhaal dit voor het gewenste aantal kortingsbonnen. Verwijder spatschermen en plaats ze in een aparte container voor sterilisatie.
- Pipetteer met behulp van een serologische pipet van 5 ml langzaam 4 ml van de behandeling of controle in de buizen, zodat de vloeistof langs de binnenkant van de wand van de buis stroomt.
- Tik zachtjes op de onderkant van de buis zodat eventuele luchtbellen onder de coupon worden verplaatst. Laat 30 - 60 s tussen elke toevoeging.
- Pipetteer aan het einde van de opgegeven contacttijd 36 ml neutralisator in de buizen in dezelfde volgorde als de behandeling (of controle) werd toegepast.
OPMERKING: Het uiteindelijke volume van de gecombineerde behandeling en neutralisator is belangrijk voor het nauwkeurig bepalen van de biofilmlogdichtheid. - Vortex elke buis op de hoogste stand gedurende 30 ± 5 s. Zorg ervoor dat een volledige vortex wordt bereikt.
OPMERKING: Voorzichtigheid is geboden bij het vortexen van zware coupons zoals roestvrij staal in glazen injectieflacons waar breuk kan optreden. - Bepaal het optimale aantal buizen per bad en plaatsing in het reageerbuisrek voordat de werkelijke monsters worden verwerkt. Als u meerdere monsters verwerkt, controleert u of de watertemperatuur in het ultrasoonapparaatbad 21 ± 2 oC is.
- Plaats buizen in buizenrek opgehangen in ontgaste sonicator, zodat het waterniveau in het bad gelijk is aan het vloeistofniveau in buizen. Sonicate op 45 kHz, 100% vermogen en normale functie voor 30 ± 5 s. Herhaal vortex- en ultrasoonapparaatcycli en eindig vervolgens met een laatste vortex (5 cycli totaal).
OPMERKING: Deze buisjes met de geoogste en gedesaggregeerde biofilm zijn de 100 of 0 verdunning. - Serieel verdund monster in gebufferd water. Plaat op R2A-agar met behulp van de juiste platingmethode. Incubeer bij 36 ± 2 oC gedurende 24 uur. Tel kolonies zoals geschikt voor de gebruikte platingmethode en registreer gegevens.
2. Schrapen en homogeniseren
- Kweek een volwassen P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm volgens de ASTM Standaard E264713.
- Stel het bemonsteringsstation in met bemonsteringsbord, 95% ethanol in een bekerglas, alcoholbrander, hemostaten, gereedschap voor het verwijderen van coupons, bekers met steriel verdunningswater en verdunningsbuizen voor het spoelen van de coupons.
- Zet de pomp uit. Verwijder een kanaalafdekking en gebruik een steriel hulpmiddel voor het verwijderen van coupons en hemostaten om de coupon te verwijderen, waarbij u voorzichtig bent om de biofilm niet te verstoren.
- Spoel de coupon door voorzichtig onder te dompelen, met een vloeistofbeweging, in 45 ml steriel verdunningswater (vervat in een centrifugebuis van 50 ml). Draai de motie om de coupon te verwijderen onmiddellijk terug.
- Plaats de coupon in een bekerglas met 45 ml steriel verdunningswater. Schraap het met biofilm bedekte couponoppervlak ongeveer 15 s in neerwaartse richting met behulp van een steriele spatel of schraper. Spoel de spatel of schraper af door deze in het bekerglas te roeren. Herhaal het schraap- en spoelproces 3-4 keer en zorg voor volledige dekking van het couponoppervlak.
- Spoel de coupon af door deze in een hoek van 60° boven het steriele bekerglas te houden en 1 ml steriel verdunningswater over het oppervlak van de coupon te pipetteren. Herhaal dit voor een totaal van 5 spoelingen. Het uiteindelijke volume in het bekerglas is 50 ml.
OPMERKING: Het uiteindelijke volume van de gecombineerde behandeling en neutralisator is belangrijk voor het nauwkeurig bepalen van de biofilmlogdichtheid. - Vervang elke kanaalomslag wanneer de kortingsbonnen worden verwijderd.
- Werk in de bioveiligheidskast en homogeniseer het geschraapte biofilmmonster. Bevestig een steriele homogenisatorsonde aan de homogenisator, plaats de sondepunt in de vloeistof, zet de homogenisator aan en voer op tot 20.500 tpm.
- Homogeniseer het monster gedurende 30 s. Zet de RPM's lager en schakel de homogenisator uit.
- Ontsmet de sonde tussen biofilmmonsters door een 9 ml steriele verdunning blanco te homogeniseren bij 20.500 tpm gedurende 30 s zoals hierboven beschreven. Homogeniseer een buis van 9 ml van 70% ethanol gedurende 30 s, maak de sonde los en laat 1 minuut in de ethanolbuis staan. Homogeniseer twee extra verdunningslekken.
OPMERKING: Voor elk monster kan een wegwerphomogenisatorsonde worden gebruikt. - Verdun de monsters serieel in gebufferd water. Plaat op R2A-agar met behulp van de juiste platingmethode. Incubateer platen bij 36 ± 2oC gedurende 24 uur, tel kolonies zoals geschikt voor de gebruikte platingmethode en registreer gegevens.
3. Schrapen, vortexing en ultrasoonapparaat
- Kweek een volwassen Escherichia coli ATCC 53498 biofilm in siliconenkatheterbuizen10.
- Bereid bemonsteringsmaterialen voor: spoelbuizen, steriele centrifugebuis, lege steriele petrischaal, vlam gesteriliseerde roestvrijstalen hemostaat en schaar, timer en liniaal.
- Gebruik, terwijl de pomp is gepauzeerd, 70% ethanol om de buitenkant van de slang te reinigen. Meet 2 cm van het uiteinde, vermijd het gebied dat aan de connector is bevestigd en markeer de slang om de snijlocaties te bepalen.
- Knip met een vlamsteriliseerde schaar de slang op de markering van 2 cm en plaats het segment in een lege steriele petrischaal. Veeg de slang af met 70% ethanol en sluit het distale uiteinde weer aan op de afvalbuizen.
- Spoelslangsegment om planktoncellen te verwijderen. Dompel met een vlamgesteriliseerde tang het slangsegment voorzichtig onder in 20 ml steriel verdunningswater en verwijder het vervolgens onmiddellijk. Plaats het segment in 10 ml neutralisator.
- Houd met vlamgestiliseerde tang het slangsegment vast en schraap met steriele houten applicatorstok totdat alle binnenste delen van de buis zijn geschraapt. Spoel de stick af en toe in de 10 ml neutralisator en plaats het segment terug in de monsterbuis. Het geschraapte buizensegment is de verdunning van 100 of 0.
OPMERKING: Het uiteindelijke volume van de gecombineerde behandeling en neutralisator is belangrijk voor het nauwkeurig bepalen van de biofilmlogdichtheid. - Vortex elke buis op de hoogste stand gedurende 30 ± 5 s. Plaats de buis in een buizenrek dat in de sonicator is opgehangen, zodat het waterniveau in het bad gelijk is aan het vloeistofniveau in buizen. Sonicate op 45 kHz, 100% vermogen en normale functie gedurende 30 ± 5 seconden. Herhaal vortex- en ultrasoonapparaatcycli en eindig vervolgens met een laatste vortex.
OPMERKING: Deze buis met de geoogste en gedesaggregeerde biofilm is de 100 verdunning. - Verdun de monsters serieel in gebufferd water. Plaat op Tryptic Soy Agar met behulp van de juiste plating methode.
- Incubeer platen bij 36 ± 2 oC gedurende 24 uur. Tel kolonies zoals geschikt voor de gebruikte platingmethode, registreer gegevens en bereken het rekenkundig gemiddelde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validatie/bevestiging van een oogstmethode
Verschillende studies die in ons laboratorium werden uitgevoerd, onderzochten het vermogen van vortexing en ultrasoonapparaat om biofilm gekweekt in de biofilmreactor (ASTM E2562)2 effectief te oogsten met behulp van de Single Tube Method (ASTM E2871)8.
Een P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm werd gekweekt volgens ASTM E25622 op borosilicaatglascoupons. Na 48 uur werden vier coupons in injectieflacons geplaatst, "behandeld" met 4 ml steriel gebufferd water en geneutraliseerd met 36 ml 2x D / E neutraliserende bouillon. De initiële ultrasoonapparaatinstelling van 45 kHz, 10% vermogen, Sweep-instelling, 30 ± 5 s werd gebruikt om de biofilm van drie van de vier coupons te oogsten en uit te splitsen. Na voltooiing van de vortex- en ultrasoonapparaatcyclus werd elke coupon gekleurd met kristalviolet en gefotografeerd. Figuur 1 toont de hoeveelheid biofilm die overblijft op de drie coupons na vortexing en ultrasoonapparaat in vergelijking met de controle.
Om dit verder te testen, werd een P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm gekweekt zoals eerder beschreven en werden twee ultrasoonapparaatinstellingen vergeleken: 1) 45 kHz, 10% vermogen, Sweep-instelling, 30 ± 5 seconden en 2) 45 kHz, 100% vermogen, Normale instelling, 30 ± 5 seconden. Een coupon van elke set van de drie werd gekleurd met BacLight Live / Dead-vlek en afgebeeld met confocale microscopie (CM). De overige twee coupons van elke set werden verdund, verguld en opgesomd voor levensvatbare cellen. De haalbare plaattellingen waren 9.230 Log10 CFU/coupon ± 0.007 (SD_R) voor instelling 1 en 9.272 Log10 CFU/coupon ± 0.066 (SD_R) voor sonicatie-instelling 2. Deze gegevens bevestigden een 2015 EPA Single Tube Method Collaborative Study waarbij 9,03 Log10 CFU / coupon ± 0,272 (SD_R) werd bereikt9. Volgens de levensvatbare plaattellingen lijkt het erop dat alle drie de middelen vergelijkbaar genoeg zijn om verder onderzoek naar verschillen tussen de twee oogstmethoden niet te rechtvaardigen. De microscopische beelden in figuur 2 kunnen er echter op wijzen dat er na gebruik van instelling 1 meer biofilm overbleef dan na instelling 2. Hoewel we zien dat biofilm die op de coupons achterblijft dood lijkt (rood van kleur), is interpretatie van levensvatbaarheid bij gebruik van BacLight Live / Dead-vlek moeilijk14,15. In plaats van ons te concentreren op de levensvatbaarheidsimplicaties van de gekleurde biofilm, gebruikten we deze vlek om biofilm te visualiseren die op de oppervlakken achterbleef. Bovendien, hoewel we erkennen dat ultrasoonapparaat schadelijk kan zijn voor de bacteriële levensvatbaarheid, toonde een publicatie uit 2007 van Kobayashi et al.16 aan dat een verhoogde ultrasoonapparaattijd van meer dan 5 minuten resulteerde in een verminderd aantal levensvatbare platen. Aangezien onze studie in totaal 1 minuut ultrasoonapparaat gebruikte, zijn we ervan overtuigd dat weinig cellen werden gedood via ultrasoonapparaat, zoals blijkt uit de >9.2 LOG10 CFU / coupons voor de twee ultrasoonapparaatparameters. Het is interessant dat een volledige oogst van de biofilm van het oppervlak door geen van beide methoden werd bereikt. Deze bevinding toont aan dat haalbare plaattellingen alleen niet voldoende zijn om oogst- en desaggregatiebias te bepalen en daarom moeten worden gecombineerd met een aanvullende methode, bijvoorbeeld microscopie.
Naast de sonicatorinstellingen hebben we andere belangrijke factoren onderzocht die van invloed zijn op de ultrasoonapparaat. Deze omvatten het volume vloeistof in de injectieflacons (10 of 40 ml), het type vloeistof in de injectieflacon (gebufferd water of 2X D/E neutraliserende bouillon) en het aantal injectieflacons dat tegelijkertijd in het bad werd geplaatst (3 of 12 injectieflacons)9.
P. aeruginosa biofilms op CDC Biofilm Reactor coupons werden gesoniseerd met behulp van sonicator instelling 2 (45 kHz, 100% vermogen, Normale instelling, 30 ± 5 seconden). Alle monsters werden 3 voor één of 6 tegelijk gevortexed met behulp van een vortexer uitgerust met een 6-plaats buisbevestiging en vervolgens gesoniseerd zoals beschreven in figuur 3. Eén coupon uit elk van de volgende categorieën werd afgebeeld met CM (figuur 3).
In de tweede studie waar ultrasoonapparaatparameters werden onderzocht, suggereren de microscopische beelden (figuur 3) dat het minimaliseren van het volume in de buizen, het verminderen van het aantal in één keer verwerkte buizen en het gebruik van D / E Neutralizing Broth (die oppervlakteactieve stof bevat) allemaal bijdragen aan een verbeterde biofilmoogst van de coupons.
Biociden kunnen de oogst en desaggregatie positief of negatief bevorderen. Net als bij het bevestigen dat een neutralisator de actieve stof effectief stopt zonder de sterfte te verhogen voordat een werkzaamheidstest wordt uitgevoerd, is het belangrijk om te bevestigen dat een biocide geen differentiële invloed heeft op het oogsten en desaggregatie. Voor werkzaamheidstests resulteert bias dan en slechts dan als er differentiële verwijdering is voor de controle versus behandelde biofilmmonsters11.
Figuur 1: Foto's van coupons gekleurd met kristalviolet die resterende biofilm demonstreren. A) Coupon verwijderd uit de reactor en gekleurd met kristalviolet. B, C, D) Drie replicatiecoupons werden afzonderlijk "behandeld" met steriel gebufferd water en vervolgens geneutraliseerd. Om te oogsten en uit te splitsen, werden de coupons vortexed (30 ± 5 seconden) en gesoniseerd (45 kHz, 10% vermogen, Sweep-instelling, 30 ± 5 seconden) en ontvingen vervolgens twee keer een laatste vortex. Afbeeldingen met dank aan Danielle Orr en Blaine Fritz. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Confocale microscopiebeelden van coupons waarin twee verschillende ultrasoonapparaatinstellingen worden vergeleken. Coupons (12,5x vergroting) verwerkt via ultrasoonapparaatinstelling 1 (45 kHz, 10% vermogen, Sweep-instelling) aan de linkerkant of ultrasoonapparaatinstelling 2 (45 kHz, 100% vermogen, normale instelling) aan de rechterkant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Confocale microscopiebeelden van coupons waarin volumes, ultrasoonapparaatvloeistof en aantal buizen worden vergeleken. Coupons (12,5x vergroting) verwerkt in volumes van 10 of 40 ml, in verdunningswater (DW) of D/E-neutraliserende bouillon (D/E), 3 of 12 buizen tegelijk met geoptimaliseerde ultrasoonapparaatinstelling (45 kHz, 100% vermogen, normale instelling). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Belangrijke parameters van belang voor het oogsten en ontglijden Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Minimale informatie voor oogst- en desaggregatiemethoden
Om reproduceerbare biofilmgegevens in de wetenschappelijke gemeenschap te creëren, is het noodzakelijk dat auteurs zoveel mogelijk details opnemen over elk van de groei-, behandelings-, bemonsterings- en analysestappen van een biofilmmethode. De standaardisatie van biofilmmethoden heeft geholpen bij dit streven, omdat het de onderzoeker in staat stelt om naar een specifieke methode en eventuele relevante wijzigingen te verwijzen. Veel artikelen bevatten echter slechts een zin of twee om het oogsten en uitsplitsen van biofilms te beschrijven. Voor een betere reproduceerbaarheid raden we aan om minimale informatie voor het oogsten van biofilms op te nemen in publicaties. Dit bouwt voort op het minimuminformatie over een biofilmexperiment (MIABiE) -initiatief gepresenteerd door Lourenco et al.17. In het geval van het gebruik van ultrasoonapparaat voor biofilmoogst en desaggregatieparameters moet de informatie omvatten: positie van buizen in het bad (aanbevelingen van de fabrikanten om beschadiging van de transducers te voorkomen), aantal buizen dat tegelijkertijd wordt gesoniseerd, buismateriaal, volume en type vloeistof in de buis, aanwezigheid van oppervlakteactieve stof, positie van vloeistof in buizen ten opzichte van het vloeistofniveau van ultrasoon bad, apparaat dat wordt gebruikt om de buizen in het bad te houden (glazen bekers versus reageerbuisrek), ontgassing van het waterbad voorafgaand aan het ultrasoonapparaat van monsters (als ontgassen geen optie van de fabrikant is, zal eenvoudige bediening van het bad voordat de monsters worden ingebracht, helpen sommige opgeloste gassen uit de badvloeistof te verwijderen), temperatuur van het waterbad (temperaturen kunnen stijgen na lange perioden van ultrasoonapparaat), frequentie (bijvoorbeeld 25 kHz of 45 kHz), badfunctie (sweep of normaal bijvoorbeeld) en vermogensbereik geleverd aan transducers (bijvoorbeeld 10 - 100%). Deze instellingen moeten worden geoptimaliseerd voor de biofilm die wordt bestudeerd, het systeem dat wordt gebruikt om de biofilm te laten groeien en het specifieke merk / model van ultrasoon bad18.
Sonicatorinstellingen kunnen worden gewijzigd om de gewenste oogsteffecten te optimaliseren. Ontgassen verwijdert opgeloste lucht in de badvloeistof, waardoor de reinigingskracht wordt verbeterd. De frequentie kan worden ingesteld op een lage of hoge instelling. Een lage instelling zoals 25 kHz zou bijvoorbeeld helpen bij het oogsten van vasthoudende monsters, terwijl een hogere instelling van 45 kHz geschikter zou zijn voor gevoelige monsters. Een badfunctie van vegen of normaal zorgt voor de verdeling van cavitatie. De veegfunctie zorgt voor een continue verschuiving van de geluidsdrukmaxima. Met de normale functie kunnen de transducers in de dubbele halve golfmodus werken, wat kan resulteren in dode zones, waardoor de ultrasoonapparaat minder effectief wordt. Vermogensbereiken kunnen worden gewijzigd van 10 - 100% van het vermogen dat aan de transducers wordt geleverd19. Het is bekend dat ultrasoonapparaat de bacteriële levensvatbaarheid nadelig kan beïnvloeden. Een studie uit 2008 door Stamper et al.20 stelde bacteriële culturen bloot aan toenemende ultrasone energie in de loop van de tijd om bacteriële kill curven te creëren. We raden gebruikers aan te bevestigen dat een bepaalde combinatie van ultrasoonapparaatinstellingen geen afname van levensvatbare bacteriën veroorzaakt20.
Er is niet één perfecte methode om biofilm te oogsten en uit te splitsen, maar bepaalde methoden werken beter voor sommige oppervlakken / microbe-combinaties dan andere. We pleiten ervoor dat de lezer bepaalt welke parameters belangrijk zijn voor hun specifieke biofilmscenario. Belangrijke parameters die van belang zijn voor het oogsten en uitsplitsen zijn opgenomen in aanvullend dossier 1.
Voor de ultrasoonapparaatstudies die zijn uitgevoerd om de oogst- en desaggregatiebias te beoordelen, ontdekten we dat ultrasoonapparaat handig, efficiënt en gestandaardiseerd kan worden voor het oogsten en uitsplitsen van biofilm van oppervlakken. Plaatsing van coupons in flacons minimaliseert de variabiliteit van technicus tot technicus die zou worden aangetroffen bij methoden waarbij coupons fysiek worden geschraapt door laboratoriumpersoneel, bijvoorbeeld. Hoewel het eenvoudig genoeg lijkt om flacons in een ultrasoonmakend waterbad te plaatsen, zijn er veel parameters waarmee rekening moet worden gehouden om een optimale oogst van biofilm te bereiken.
Er zijn twee soorten ultrasoonapparaat beschikbaar, ultrasone baden en ultrasone sondes. Dit artikel richt zich voornamelijk op ultrasone baden waar ultrasone energie wordt gegenereerd in het bereik van hoge (20 - 45 kHz) tot normale (40 - 60 Hz) frequentie.
Drie belangrijke processen spelen een rol bij het gebruik van een ultrasoon apparaat om een oppervlak te reinigen. Elektrische energie wordt omgezet in akoestische energie wanneer een hoogfrequente stroom wordt gestuurd naar een piëzo-elektrische of magnetostrictieve transducer die oscilleert als reactie op de stroom. De oscillatie genereert compressie (zeldzaamheid) golven in de vloeistof. Cavitatiebellen vormen zich als gevolg van negatieve druk tijdens zeldzaamheid. De bubbels groeien totdat ze een onstabiele grootte bereiken en instorten, waardoor een waterstraal ontstaat die oppervlakken reinigt21.
Drie oogst- en desaggregatiebenaderingen worden in dit artikel gedemonstreerd: ultrasoonapparaat- en vortexingmethoden voor het oogsten en uitsplitsen van biofilm wanneer gekweekt op polycarbonaatcoupons in de CDC Biofilm Reactor volgens de Single Tube Method. Schraap- en homogenisatiemethoden voor het oogsten en uitsplitsen van biofilm worden getoond wanneer ze op glazen coupons worden gekweekt met behulp van de Drip Flow Biofilm Reactor. Schraap-, ultrasoonapparaat- en vortexingmethoden voor het oogsten en uitsplitsen van biofilm worden getoond wanneer ze in siliconenbuizen worden gekweekt.
Er is geen perfecte methode om de biofilm te oogsten en uit te splitsen, maar sommige benaderingen zijn beter voor verschillende oppervlakken en / of toepassingen. Wat belangrijk is, is om de tijd te nemen om de gebruikte methode te valideren. In dit artikel hebben we het gebruik van kristalviolet en microscopie besproken, maar er zijn andere keuzes afhankelijk van de vereiste gevoeligheid. Als onderzoek werkzaamheidstests omvat, is het van cruciaal belang om de validiteit van de aanpak in aanwezigheid van de antimicrobiële stof te bevestigen6. Alle apparatuur is iets anders, dus zelfs als de oogst- en desaggregatiemethode zijn gestandaardiseerd, is het nog steeds verstandig om het proces voor de gebruikte apparatuur te bevestigen. Oogst- en desaggregatiemethoden zijn specifiek voor oppervlakte- en biofilmbacteriën. Onderzoek heeft aangetoond dat onjuiste keuzes kunnen leiden tot bevooroordeelde testresultaten. Niettemin zijn oogsten en uitsplitsen de minst bestudeerde van de vier stappen in biofilmmethoden. Het is over het algemeen ook de niet-gevalideerde stap (als vanzelfsprekend beschouwd als werkend) met de minste informatie die aanwezig is in gepubliceerd papier, waardoor het een uitdaging is om het proces in een ander laboratorium te reproduceren. Dit artikel en de bijbehorende video tonen drie veel voorkomende benaderingen voor twee oppervlaktetypen en suggereren hoe een methode voor een individueel laboratorium kan worden gevalideerd. Deze informatie zal onderzoekers helpen beter geïnformeerde beslissingen te nemen over welke methode ze moeten gebruiken en biedt richtlijnen over wat ze moeten rapporteren om de reproduceerbaarheid te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen.
Acknowledgments
We willen Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers en Fei San Lee bedanken voor hun bijdragen aan deze krant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
References
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
- ASTM International. ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2017).
- Environmental Protection Agency (USEPA). Efficacy Test Methods, Test Criteria, and Labeling Guidance for Antimicrobial Products with Claims Against Biofilm on Hard, Non-Porous Surfaces. Environmental Protection Agency (USEPA). , Available from: http://www.epa.gov/perticide-analytical-methods/efficacy-test-methods-test-criteria-and-labeling-guidance-antimicrobial (2021).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Gomes, I. B., et al. Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications. Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).
- Goeres, D. M., et al. Design and fabrication of biofilm reactors. Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. Simoes, M., et al. , Elsevier Science and Technology. 71-88 (2020).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).
- ASTM International. ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2019).
- Goeres, D. M., et al. Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method. Journal of Microbiological Methods. , (2019).
- Summers, J. G. The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University. , Available from: https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149 (2019).
- Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants. Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).
- Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K. Persister Cells in Biofilm Associated Infections. Biofilm-based Healthcare-associated Infections. Donelli, G. , (2015).
- ASTM International. ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2020).
- Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells. Scientific Reports. , (2019).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. , (2015).
- Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant. Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).
- Lourenco, A., et al. Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces. Pathogens and Disease. 0, 1-7 (2014).
- Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions. Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).
- Elma GmbH & Co. KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions. Elma GmbH & Co. , Singen, Germany. (2009).
- Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage. Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).
- Suslick, K. S.
