Summary
この論文では、2つの表面タイプにおける3つの一般的なバイオフィルム収穫および分解技術、収穫方法の堅牢性試験、および再現性を高めるために収穫および分解技術を選択および最適化する際に考慮すべき最小限の情報を示す方法を詳述する。
Abstract
バイオフィルム法は、関連するモデルでバイオフィルムを成長させる、成熟したバイオフィルムを処理する、表面からバイオフィルムを採取し、凝集塊を分解する、およびサンプルを分析するという4つの異なるステップからなる。4つのステップのうち、収穫と分解は最も研究されていませんが、テストバイアスの可能性を考慮すると、それにもかかわらず重要です。この記事では、3つの異なる表面で成長したバイオフィルムに一般的に使用される収穫および分解技術を示します。広範な文献レビューから収集された3つのバイオフィルム収穫および分解技術には、ボルテックスおよび超音波処理、スクレイピングおよび均質化、ならびにスクレイピング、ボルテックスおよび超音波処理が含まれる。硬質非多孔質(ポリカーボネートおよびホウケイ酸ガラス)と多孔質(シリコーン)の2つの表面タイプが考慮される。さらに、従う収穫技術を報告する際に含めるべき最小限の情報と、バイアスをチェックするための付随する方法に関する推奨事項を提供します。
Introduction
バイオフィルムの定義は過去数十年にわたって進化しており、さまざまな生物学的および/または非生物学的表面との微生物の関連、マトリックス内の異なる成長および遺伝子発現2を示す非細胞成分1の包含を包含する。バイオフィルムは、乾燥などの環境ストレスからの保護を提供し、微生物の生存をもたらす化学消毒剤の作用をあまり効果的でないものにする可能性があります。バイオフィルム内の生存者は、公衆衛生上の懸念事項である病原性微生物の発生源を提供する可能性があります3。
バイオフィルム法は、成長、処理、サンプリング(収穫および分解)、および分析の4つのステップで構成されています。成長は、第1のステップにおいて、使用者が生物の生育条件、温度、媒体等を決定するところ、バイオフィルム文献4、5、6、7において最も考慮され、報告されている。処理ステップは、抗菌剤(例えば、消毒剤)を評価して、成熟バイオフィルム3、8、9に対するそれらの有効性を決定するか、または抗菌剤が表面に組み込まれ得るバイオフィルム増殖を防止または低減する製品の能力を決定する10。第3のステップは、サンプリング、それが成長していた表面からバイオフィルムを採取し、除去された凝集塊を分解するステップ3、8、11を含む。第4のステップは、分析、生細胞数、顕微鏡観察、蛍光測定、分子転帰、および/またはマトリックス成分評価8、9を含み得る。データの評価は、実験の結果に関する情報を提供します。4つのうち、サンプリングは、選択されたバイオフィルム収穫および/または分解技術が100%効果的であり、しばしば検証なしで行われると想定しているため、最も見過ごされがちなステップです11。
細菌のプランクトン懸濁液は、しばしば均質であると考えられ、分析の前に単純なボルテックスを必要とする。しかし、バイオフィルムは、微生物(原核生物および/または真核生物)、エキソ多糖類、タンパク質、脂質、細胞外DNA、および宿主細胞で構成される複雑なコミュニティです12。表面からバイオフィルムを適切に採取し、それを均質な単一細胞懸濁液に分解するためには、従来のプランクトン微生物学的培養方法を超えるステップが必要である。広範な文献レビュー(この刊行物には含まれていない情報)は、除去および脱凝集技術の選択が、バイオフィルム中に存在する種、バイオフィルムが付着している表面(非多孔質または多孔質)、成長表面への接近性(容易に除去可能なクーポンまたはバイオフィルムが成長している装置の物理的破壊)を含む多くの要因に依存することを実証した。 表面形状(面積および形状)、成長表面上のバイオフィルムの密度、および利用可能な実験装置。
バイオフィルムが表面から回収されると、得られる細胞懸濁液は異種である。この不均一な懸濁液を正確に列挙しようとする場合、個々の細胞に分解されなければならない。生存プレート数は、コロニー形成単位が1つの細菌に由来すると仮定する。バイオフィルムの凝集体が増殖培地上に置かれると、個々の細胞を区別することは不可能であり、不正確な推定につながる可能性がある。例えば、消毒剤有効性試験中に、処置が対照と比較して表面からバイオフィルムを非常に効果的に除去する場合、対数の減少は対照と比較して人為的に大きく見える可能性がある。一方、バイオフィルムを表面に固定する化学消毒剤は、対照と比較して、対数減少が低いように見えます11。このタイプのシナリオは、実験データの偏った解釈につながる可能性があります。
出版の準備として、文献のレビューは、バイオフィルムを収穫および分解するための一般的なアプローチが、掻き取り、スワビング、超音波処理、ボルテックスまたはこれらの組み合わせを含むと判断した。掻き取りは、滅菌スティック、ヘラまたは他のツールを用いて表面からバイオフィルムを物理的に除去することと定義される。スワビングとは、綿の先端のスティックまたは他の固定吸収材料を用いて表面からバイオフィルムを除去することを指す。超音波処理は、水を介して分布する超音波を介して表面からのバイオフィルムの破壊を指す。ボルテックスとは、チューブ内のサンプルの液体渦を達成するためのミキサーの使用を指します。均質化は、回転ブレードを使用して、回収されたバイオフィルム凝集塊を単一の細胞懸濁液に剪断する。本稿では、硬質/非多孔質と多孔質の2つの異なる表面タイプに対する3つの収穫および分解方法を提示する。
研究者が出版物の方法セクションに含めるべき推奨される最低限の情報のリストが提供されています。この情報を含めることで、他の研究者が自分の研究を再現できることを願っています。完璧な収穫および分解方法がないため、技術を確認する方法に関する推奨事項も提供されます。
この記事では、一般的な成長表面からバイオフィルムを収穫および分解する3つの一般的な方法が示されています。この情報により、研究者はバイオフィルム試験法の全体的な精度とバイアスをよりよく理解することができます。記載されている方法は次のとおりです:(1)CDCバイオフィルムリアクター内の高流体せん断下でポリカーボネートクーポン(硬質非多孔質表面)上に成長させた 緑膿菌 バイオフィルムを採取し、バイオフィルムの採取および解凝集を達成するためにボルテックスおよび超音波処理の5つのステップの組み合わせに続いて解凝集する(2)A P. 低流体せん断下でドリップフローリアクター内のホウケイ酸ガラスクーポン(硬質非多孔質表面)上に成長したバイオフィルムを回収し、掻き取りおよび均質化を用いて解凝集させる(3)シリコーンチューブ(多孔質表面)で成長させた 大腸菌 バイオフィルムを採取し、掻き取りを用いて解凝集させ、続いて超音波処理およびボルテックス処理を行う。
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Protocol
1. ボルテックスと超音波処理
- 成熟した緑膿菌ATCC 15442バイオフィルムをASTM規格E25622に従って成長させる。
- 48時間の成長期間の終わりに、ASTM規格E28718に従ってバイオフィルムおよびサンプルクーポンを処理する準備をしてください
- オートクレーブ処理されたスプラッシュガードを、火炎滅菌された鉗子を使用して滅菌された50mL円錐形チューブに無菌的に挿入します。治療を受けるすべてのチューブについて繰り返します。コントロールクーポン用のチューブにはスプラッシュガードは必要ありません。
- 無作為に選択されたロッドをCDCバイオフィルムリアクターから無菌的に除去する。クーポンをすすぎ、ロッドを30mLの滅菌緩衝水に静かに浸漬して、緩く付着した細胞を除去する。
- ロッドをベンチトップと平行に保持し、空の滅菌された50mL円錐形チューブの上に、火炎滅菌アレンレンチを使用して、止めネジを緩めてバイオフィルムコーティングされたクーポンをチューブに落とします。希望数のクーポンについて繰り返します。スプラッシュガードを取り外し、滅菌のために別の容器に入れます。
- 5 mLの血清学的ピペットを用いて、液体がチューブの壁の内側を流れ落ちるように、4 mLの処理または対照をチューブにゆっくりとピペットする。
- クーポンの下の気泡が変位するようにチューブの底を静かにタップします。各追加の間に 30 ~ 60 秒かかります。
- 指定された接触時間の終わりに、処置(または対照)と同じ順序でチューブに中和剤36mLのピペットが加えられた。
注:併用処理と中和剤の最終体積は、バイオフィルム対数密度を正確に決定するために重要です。 - 各チューブを30 ± 5秒の最高設定で渦巻きます。完全な渦が達成されていることを確認します。
注:破損が発生する可能性のあるガラスバイアルにステンレススチールなどの重いクーポンをボルテックスする場合は注意が必要です。 - 実際のサンプルを処理する前に、バスあたりのチューブの最適な数と試験チューブラック内の配置を決定します。複数のサンプルを処理する場合は、超音波処理浴内の水温が21 ± 2 oCであることを確認してください。
- 浴中の水位がチューブ内の液体レベルに等しくなるように、脱気超音波装置に懸濁されたチューブラックにチューブを置きます。45 kHzで超音波処理, 100% パワーとノーマル機能 30 ± 5 秒.渦と超音波処理サイクルを繰り返し、最終的な渦(合計5サイクル)で終了します。
注:採取および分解されたバイオフィルムを有するこれらのチューブは、100または0希釈である。 - サンプルを緩衝水で段階的に希釈する。適当な播種法を用いてR2A寒天上に平板する。36±2 °Cで24時間インキュベートする。使用しためっき方法に適宜コロニーをカウントし、データを記録する。
2. 削り取りと均質化
- 成熟した緑膿菌ATCC 15442バイオフィルムをASTM規格E264713に従って増殖させる。
- サンプリングボード、ビーカー内の95%エタノール、アルコールバーナー、止血剤、クーポン除去ツール、滅菌希釈水付きビーカー、クーポンをすすぐための希釈チューブを含むようにサンプリングステーションを設定します。
- ポンプの電源を切ります。チャンネルカバーを取り外し、滅菌クーポン取り外しツールと止血剤を使用してクーポンを取り除き、バイオフィルムを乱さないように注意してください。
- クーポンを、45 mL の滅菌希釈水 (50 mL 遠沈管に収容されている) に液体の動きで静かに浸漬してすすいでください。すぐにモーションを逆にしてクーポンを削除します。
- クーポンを45mLの滅菌希釈水を入れたビーカーに入れます。バイオフィルムで覆われたクーポン表面を、滅菌ヘラまたはスクレーパーを使用して、下方向に約15秒間こすります。ヘラまたはスクレーパーをビーカーでかき混ぜてすすいでください。掻き取りとすすぎのプロセスを3〜4回繰り返し、クーポン表面を完全に覆うようにします。
- クーポンを滅菌ビーカーの上に60°の角度で保持し、クーポンの表面上に1mLの滅菌希釈水をピペッティングして、クーポンをすすぎます。合計5回のすすぎを繰り返します。ビーカー内の最終容量は50mLである。
注:併用処理と中和剤の最終体積は、バイオフィルム対数密度を正確に決定するために重要です。 - クーポンが取り外されたら、各チャンネルカバーを交換してください。
- バイオセーフティキャビネットで作業し、掻き取ったバイオフィルムサンプルを均質化します。滅菌ホモジナイザープローブをホモジナイザーに取り付け、プローブチップを液体に入れ、ホモジナイザーをオンにして20,500rpmまでランプします。
- サンプルを30秒間均質化します。RPMの電源を切り、ホモジナイザーの電源を切ります。
- 上記のように、9 mL の滅菌希釈ブランクを 20,500 rpm で 30 秒間ホモジナイズすることにより、バイオフィルムサンプル間のプローブを消毒します。70%エタノールの9mLチューブを30秒間ホモジナイズし、プローブを取り外してエタノールチューブに1分間放置する。2つの追加の希釈ブランクを均質化する。
注:使い捨てホモジナイザープローブを各サンプルに使用することができます。 - サンプルを緩衝水で段階的に希釈する。適当な播種法を用いてR2A寒天上に平板する。プレートを36±2oCで24時間インキュベートし、使用したプレーティング方法に適宜コロニーをカウントし、データを記録する。
3.スクレイピング、ボルテックス、超音波処理
- 成熟 した大腸菌 ATCC 53498バイオフィルムをシリコーンカテーテルチューブで成長させる10。
- サンプリング材料を準備します:リンスチューブ、滅菌遠心分離チューブ、空の滅菌ペトリ皿、火炎滅菌されたステンレス鋼の止血剤およびはさみ、タイマー、および定規。
- ポンプを一時停止した状態で、70%エタノールを使用してチューブの外側を清掃します。コネクタに取り付けられた領域を避けて端から 2 cm を測定し、チューブにマークを付けて切断位置を決定します。
- 火炎滅菌はさみで、2cmマークのチューブを切断し、空の滅菌ペトリ皿にセグメントを置きます。チューブを70%エタノールで拭き取り、遠位端を廃チューブに再接続します。
- チューブセグメントをすすぎ、プランクトン細胞を除去した。火炎滅菌鉗子を使用して、チューブセグメントを20mLの滅菌希釈水に静かに浸漬し、直ちに除去する。セグメントを10mLの中和剤に入れる。
- 火炎滅菌された鉗子で、チューブセグメントを保持し、チューブのすべての内側領域が削られるまで滅菌木製アプリケータースティックでこすります。時折、スティックを10 mLの中和剤ですすぎ、セグメントをサンプルチューブに戻します。削り取られたチューブセグメントは、100 または0希釈です。
注:併用処理と中和剤の最終体積は、バイオフィルム対数密度を正確に決定するために重要です。 - 各チューブを30 ± 5秒の最高設定で渦巻きます。浴中の水位がチューブ内の液体レベルに等しくなるように超音波処理機に懸濁されたチューブラックにチューブを置きます。45 kHzで超音波処理, 100% パワーとノーマル機能 30 ± 5 秒.渦と超音波処理サイクルを繰り返し、最終的な渦で終わります。
注:採取および分解されたバイオフィルムを備えたこのチューブは、100 希釈液である。 - サンプルを緩衝水で段階的に希釈する。適切なメッキ方法を用いてトリプシン大豆寒天上にプレートする。
- プレートを36±2 °Cで24時間インキュベートする。使用するめっき方法に適宜コロニーをカウントし、データを記録し、算術平均を算出する。
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Representative Results
収穫方法の検証・確認
私たちの研究室で行われたいくつかの研究は、シングルチューブ法(ASTM E2871)8を使用して、バイオフィルムリアクター(ASTM E2562)2で成長したバイオフィルムを効果的に収穫するボルテックスと超音波処理の能力を調べました。
緑膿菌ATCC 15442バイオフィルムを、ホウケイ酸ガラスクーポン上でASTM E25622に従って増殖させた。48時間後、4枚のクーポンをバイアルに入れ、4mLの滅菌緩衝水で「処理」し、36mLの2x D/E中和ブロスで中和した。45kHzの初期超音波処理設定、10%パワー、スイープ設定、30±5秒は、4つのクーポンのうち3つからバイオフィルムを収穫し、分解するために使用されました。ボルテックスおよび超音波処理サイクルの完了時に、各クーポンをクリスタルバイオレットで染色し、写真に収めた。図1は、対照と比較してボルテックスおよび超音波処理後の3つのクーポン上に残存するバイオフィルムの量を示す。
これをさらに試験するために、緑膿菌ATCC 15442バイオフィルムを前述のように成長させ、2つの超音波処理設定を比較した:1)45kHz、10%電力、掃引設定、30±5秒および2)45kHz、100%電力、ノーマル設定、30±5秒。3つのセットの各セットから1枚のクーポンをBacLight Live/Dead染色で染色し、共焦点顕微鏡(CM)を使用して画像化しました。各セットの残りの2つのクーポンを希釈し、播種し、生細胞について列挙した。実行可能なプレートカウントの結果は、9.230 Log10 CFU /クーポン±0.007(SD_R)で、超音波処理設定2の場合は9.272 Log10 CFU /クーポン±0.066(SD_R)でした。このデータは、9.03 Log10 CFU/クーポン±0.272(SD_R)が達成された2015年のEPAシングルチューブ法共同研究を裏付けました9。実行可能なプレート数によると、3つの手段はすべて十分に類似しており、2つの収穫方法の違いについてさらなる調査を正当化するものではないようです。しかしながら、図2に示される顕微鏡画像は、設定1の使用後に、設定2よりも多くのバイオフィルムが残存したことを示唆し得る。クーポンに残っているバイオフィルムは死んでいる(赤色)ように見えるが、BacLight Live/Dead染色を使用した場合の生存率の解釈は困難である14,15。染色されたバイオフィルムの生存率への影響に焦点を当てるのではなく、この染色を使用して、表面に残っているバイオフィルムを視覚化しました。さらに、超音波処理が細菌の生存率に有害である可能性があることを認める一方で、小林らによる2007年の出版物16は、5分を超える超音波処理時間の増加が生存可能なプレート数の減少をもたらしたことを実証した。私たちの研究は1分間の超音波処理の合計を使用したので、我々はいくつかの細胞が2つの超音波処理パラメータのための>9.2 LOG10 CFU /クーポンによって示されるように超音波処理を介して殺されたと確信しています。興味深いことに、表面からのバイオフィルムの完全な収穫は、どちらの方法でも達成されなかった。この知見は、生存可能なプレート数だけでは収穫および分解バイアスを決定するには不十分であり、したがって、追加の方法、例えば顕微鏡法と組み合わせる必要があることを示している。
超音波処理器の設定に加えて、我々は超音波処理に影響を与える他の重要な要素を調査しました。これらには、バイアル内の液体の量(10または40mL)、バイアル内の液体の種類(緩衝水または2X D/E 中和ブロス)、および同時に浴に入れたバイアルの数(3または12バイアル)が含まれます9。
CDCバイオフィルムリアクタークーポン上の緑膿菌バイオフィルムは、超音波装置設定2(45kHz、100%電力、通常設定、30±5秒)を使用して超音波処理した。すべてのサンプルを、図3に記載されるように超音波処理した6箇所のチューブアタッチメントを取り付けたボルテクサーを使用して、一度に3つまたは一度に6つの渦巻き処理を行った。以下の各カテゴリのクーポン1枚をCMを用いて画像化した(図3)。
超音波処理パラメータが調査された2番目の研究では、顕微鏡画像(図3)は、チューブ内の体積を最小限に抑え、一度に処理されるチューブの数を減らし、D / E中和ブロス(界面活性剤を含む)の使用はすべて、クーポンからのバイオフィルム収穫の強化に寄与することを示唆している。
殺生物剤は、収穫および分解を肯定的または否定的に増強し得る。有効性試験を行う前に、中和剤が活性を効果的に停止させない一方で殺傷性を増加させないことを確認するのと同様に、殺生物剤が収穫および分解に差次的に影響しないことを確認することが重要です。有効性試験の場合、バイアスは、対照対処理されたバイオフィルムサンプル11について差異除去がある場合に限り、生じる。
図1:残留バイオフィルムを示すクリスタルバイオレットで染色されたクーポンの写真。 A)クーポンを反応器から取り出し、クリスタルバイオレットで染色した。B、C、D)3つの複製クーポンを、滅菌緩衝水で別々に「処理」し、次いで中和した。収穫して分解するために、クーポンをボルテックス(30±5秒)し、超音波処理(45kHz、10%パワー、スイープ設定、30±5秒)を2回行い、その後最終ボルテックスを受け取りました。画像提供:ダニエル・オアとブレイン・フリッツ この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:2つの異なる超音波処理設定を比較するクーポンの共焦点顕微鏡画像。クーポン(12.5倍)は、左側の超音波処理設定1(45kHz、10%パワー、スイープ設定)または右側の超音波処理設定2(45kHz、100%パワー、ノーマル設定)を介して処理されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3.クーポンの共焦点顕微鏡画像は、体積、超音波処理液およびチューブの数を比較する。 クーポン(12.5倍倍率)は、希釈水(DW)またはD / E中和ブロス(D / E)、最適化された超音波処理設定(45kHz、100%電力、通常設定)で一度に3または12本のチューブで、10または40mLの容量で処理されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:収穫と分解にとって重要な主要パラメータ このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
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Discussion
収穫および分解方法に関する最小情報
科学界全体で再現可能なバイオフィルムデータを作成するには、バイオフィルム法の成長、治療、サンプリング、分析の各ステップについて、著者ができるだけ多くの詳細を含めることが不可欠です。バイオフィルム法の標準化は、研究者が特定の方法および関連する修正を参照することを可能にするので、この努力を助けてきた。しかし、多くの論文には、バイオフィルムの収穫と分解を説明するための1〜2文しか含まれていません。再現性を高めるために、バイオフィルム収穫に関する最小限の情報を出版物に含めることをお勧めします。これは、Lourenco et al.17によって提示されたバイオフィルム実験(MIABiE)イニシアチブに関する最小情報に基づいています。バイオフィルムの収穫と分解パラメータに超音波処理を使用する場合、情報には、バス内のチューブの位置(トランスデューサの損傷を避けるためのメーカーの推奨事項)、同時に超音波処理されたチューブの数、チューブの材料、チューブ内の液体の体積と種類、界面活性剤の存在、超音波浴の液体レベルに対するチューブ内の液体の位置、 バス内のチューブを保持するために使用される装置(ガラスビーカー対試験管ラック)、サンプルの超音波処理前の水浴の脱気(脱気がメーカーの選択肢でない場合、サンプルを挿入する前に浴の簡単な操作は、バス液からいくつかの溶解ガスを除去するのに役立ちます)、水浴の温度(超音波処理の長期間後に温度が上昇する可能性があります)、 周波数(例えば、25kHzまたは45kHz)、バス機能(例えば、掃引またはノーマル)、および探触子に供給される電力範囲(例えば、10〜100%)。これらの設定は、研究されているバイオフィルム、バイオフィルムを成長させるために使用されるシステム、および超音波浴の特定の製造元/モデル18のために最適化されるべきである。
超音波処理器の設定は、所望の収穫効果を最適化するために変更することができる。脱気により、浴液内の溶存空気を除去し、洗浄力を高めます。周波数は、低または高の設定に調整することができます。たとえば、25 kHz などの低い設定は粘り強いサンプルの収集に役立ちますが、感度の高いサンプルには 45 kHz という高い設定の方が適しています。掃引または法線の浴場機能は、キャビテーションの分布を可能にする。スイープ機能は、音圧の最大値の継続的なシフトを作成します。通常の機能により、トランスデューサはデッドゾーンをもたらす可能性のある二重半波モードで動作することができ、それによって超音波処理の効果が低くなります。電力範囲は、トランスデューサ19に供給される電力の10~100%から変更することができます。超音波処理が細菌の生存率に有害な影響を与えることができることが知られている。Stamper et al.20による2008 年の研究では、細菌培養物が時間の経過とともに超ソニスエネルギーを増加させ、細菌の死滅曲線を作り出した。我々は、ユーザーが超音波処理の設定の特定の組み合わせは、生菌の減少を引き起こさないことを確認することをお勧めします20.
バイオフィルムを収穫して分解する完璧な方法は1つではありませんが、特定の方法は、他の方法よりも一部の表面/微生物の組み合わせでうまく機能します。私たちは、読者が特定のバイオフィルムシナリオにとってどのパラメータが重要であるかを判断することを提唱します。ハーベスティングと分解にとって重要な主要なパラメータは、 補足ファイル 1 に含まれています。
収穫と分解バイアスを評価するために行われた超音波処理研究のために、我々は、超音波処理が便利で効率的であり、表面からバイオフィルムを収穫および分解するために標準化することができることを発見しました。バイアルにクーポンを配置すると、たとえば、クーポンが実験室の人員によって物理的に削られる方法で遭遇する技術者間の変動性が最小限に抑えられます。バイアルを超音波処理水浴に入れるのに十分簡単に思えるが、バイオフィルムの最適な収穫を達成するために考慮する必要がある多くのパラメータがある。
超音波処理装置の2つのタイプは、超音波浴および超音波探触子利用できる。この論文は、超音波エネルギーが高(20 - 45 kHz)から通常の(40 - 60 Hz)周波数の範囲で生成される超音波浴に主に焦点を当てます。
超音波装置を使用して表面をきれいにするとき、3つの主要なプロセスが作用しています。電気エネルギーは、高周波電流が電流に応答して振動する圧電型または磁歪型変換器に送られると、音響エネルギーに変換されます。振動は液体中に圧縮(希薄化)波を生成します。キャビテーション気泡は、希薄化中の負圧のために形成される。気泡は不安定なサイズに達して崩壊するまで成長し、表面をきれいにするウォータージェットを作り出します21。
この記事では、3つの収穫および分解アプローチが実証されています:シングルチューブ法に従ってCDCバイオフィルムリアクター内のポリカーボネートクーポンで成長させたときにバイオフィルムを収穫および分解するための超音波処理およびボルテックス法。バイオフィルムを収穫および分解するための掻き取りおよび均質化方法は、ドリップフローバイオフィルムリアクターを使用してガラスクーポン上で成長させた場合に示されている。バイオフィルムを収穫および分解するための掻き取り、超音波処理およびボルテックス法は、シリコーンチューブで成長させた場合に示されている。
バイオフィルムを収穫して分解する完璧な方法はありませんが、いくつかのアプローチは異なる表面および/または用途に適しています。重要なことは、使用するメソッドを検証するために時間をかけることです。本稿では、クリスタルバイオレットと顕微鏡の使用について論じたが、必要な感度に応じて他の選択肢が存在する。研究に有効性試験が含まれる場合、抗菌剤の存在下でアプローチの有効性を確認することが重要です6。すべての機器が若干異なるため、収穫方法や分解方法が標準化されていても、使用する機器の工程を確認することは賢明です。収穫および脱凝集方法は、表面関連およびバイオフィルム細菌に特異的である。研究は、不適切な選択が偏ったテスト結果につながる可能性があることを示しています。それにもかかわらず、収穫と分解は、バイオフィルム法における4つのステップの中で最も研究されていない。また、一般に、未検証のステップ(作業として当然のことと考えられている)でもあり、公開された論文に存在する情報が最小限であるため、別のラボでプロセスを再現することは困難です。このホワイト ペーパーと付随するビデオでは、2 つのサーフェス タイプに対する 3 つの一般的なアプローチを示し、個々のラボのメソッドを検証する方法を提案します。この情報は、研究者がどの方法を使用するかについてより多くの情報に基づいた決定を下すのに役立ち、再現性を向上させるために何を報告すべきかについてのガイダンスを提供します。
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Disclosures
著者らは開示していない。
Acknowledgments
Danielle Orr Goveia、Blaine Fritz、Jennifer Summers、Fei San Leeが本論文に貢献したことに感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
References
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