Summary
Cet article détaille les méthodes qui démontrent trois techniques courantes de récolte et de désagrégation du biofilm sur deux types de surface, les tests de robustesse d’une méthode de récolte et les informations minimales à prendre en compte lors du choix et de l’optimisation des techniques de récolte et de désagrégation pour augmenter la reproductibilité.
Abstract
Les méthodes de biofilm se composent de quatre étapes distinctes: cultiver le biofilm dans un modèle pertinent, traiter le biofilm mature, récolter le biofilm de la surface et désagréger les amas, et analyser l’échantillon. Des quatre étapes, la récolte et la désagrégation sont les moins étudiées, mais néanmoins essentielles lorsqu’on considère le potentiel de biais des tests. Cet article présente les techniques de récolte et de désagrégation couramment utilisées pour le biofilm cultivé sur trois surfaces différentes. Les trois techniques de récolte et de désagrégation du biofilm, glanées dans une vaste revue de la littérature, comprennent le vortex et la sonication, le grattage et l’homogénéisation, ainsi que le grattage, le vortex et la sonication. Deux types de surface sont considérés: dur non poreux (polycarbonate et verre borosilicate) et poreux (silicone). De plus, nous fournissons des recommandations pour les informations minimales qui devraient être incluses lors de la déclaration de la technique de récolte suivie et une méthode d’accompagnement pour vérifier les biais.
Introduction
La définition du biofilm a évolué au cours des dernières décennies et englobe l’association microbienne avec une variété de surfaces biologiques et/ou non biologiques, l’inclusion de composants non cellulaires1 qui présentent une croissance et une expression génétique différentes2 au sein d’une matrice. Le biofilm offre une protection contre les stress environnementaux tels que le séchage et peut rendre l’action des désinfectants chimiques moins efficace, ce qui entraîne la survie des microbes. Les survivants d’un biofilm peuvent potentiellement fournir une source de micro-organismes pathogènes qui constituent un problème de santé publique3.
Les méthodes de biofilm comprennent quatre étapes, la croissance, le traitement, l’échantillonnage (récolte et désagrégation) et l’analyse. La croissance, la première étape, où l’utilisateur détermine les conditions de croissance de l’organisme, la température, le milieu, etc., est la plus considérée et rapportée dans la littérature sur les biofilms4,5,6,7. L’étape du traitement évalue les antimicrobiens (p. ex. les désinfectants) afin de déterminer leur efficacité soit par rapport à un biofilm mature3,8,9, soit par l’antimicrobien qui peut être incorporé dans la surface pour déterminer la capacité du produit à prévenir ou à réduire la croissance du biofilm10. La troisième étape, l’échantillonnage, comprend des étapes pour récolter le biofilm de la surface sur laquelle il poussait et pour désagréger les touffes enlevées3,8,11. La quatrième étape, l’analyse, peut inclure le comptage de cellules viables, la microscopie, les mesures de fluorescence, les résultats moléculaires et/ou une évaluation des composants matriciels8,9. L’évaluation des données fournit des informations sur les résultats d’une expérience. Des quatre, l’échantillonnage est souvent l’étape la plus négligée car elle suppose que la technique de récolte et/ou de désagrégation du biofilm choisie est efficace à 100 %, souvent sans vérification11.
Les suspensions planctoniques de bactéries, souvent considérées comme homogènes, nécessitent un simple vortex avant l’analyse. Les biofilms, cependant, sont des communautés complexes composées de micro-organismes (procaryotes et/ou eucaryotes), d’exopolysaccharides, de protéines, de lipides, d’ADN extracellulaire et de cellules hôtes12. Des étapes au-delà des méthodes traditionnelles de culture microbiologique planctonique sont nécessaires pour récolter adéquatement le biofilm d’une surface, puis le désagréger en une suspension homogène à cellule unique. Une analyse approfondie de la littérature (informations non incluses dans cette publication) a démontré que le choix de la technique d’élimination et de désagrégation dépend d’un certain nombre de facteurs, notamment les espèces présentes dans le biofilm, la surface à laquelle le biofilm est attaché (non poreux ou poreux), l’accessibilité aux surfaces de croissance (coupon facilement amovible ou destruction physique de l’appareil dans lequel le biofilm se développe), la géométrie de surface (surface et forme), la densité du biofilm sur les surfaces de croissance et l’équipement de laboratoire disponible.
Lorsque le biofilm est récolté à partir d’une surface, la suspension cellulaire résultante est hétérogène. Si cette suspension non uniforme doit être énumérée avec précision, elle doit être désagrégée en cellules individuelles. Les comptages sur plaque viables supposent qu’une unité formant une colonie provient d’une bactérie. Si des agrégats de biofilm sont placés sur le milieu de croissance, il est impossible de distinguer les cellules individuelles, ce qui pourrait conduire à des estimations inexactes. Par exemple, lors des tests d’efficacité du désinfectant, si un traitement élimine très efficacement le biofilm d’une surface par rapport au témoin, la réduction logarithmique pourrait sembler artificiellement importante par rapport au témoin. D’autre part, un désinfectant chimique qui fixe le biofilm sur une surface par rapport au témoin semblera avoir une réduction logarithmique plus faible11. Ce type de scénario pourrait conduire à une interprétation biaisée des données expérimentales.
En préparation de la publication, une revue de la littérature a déterminé que les approches courantes de la récolte et du désagrégage du biofilm comprennent le grattage, l’écouvillonnage, la sonication, le vortex ou une combinaison de ceux-ci. Le grattage est défini comme l’élimination physique du biofilm des surfaces à l’aide d’un bâton stérile, d’une spatule ou d’un autre outil. L’écouvillonnage fait référence à l’élimination du biofilm des surfaces avec un bâton à pointe de coton ou un autre matériau absorbant fixe. La sonication fait référence à la perturbation du biofilm des surfaces par des ondes ultrasonores distribuées dans l’eau. Le vortex fait référence à l’utilisation d’un mélangeur pour obtenir un vortex liquide de l’échantillon à l’intérieur d’un tube. L’homogénéisation utilise des lames rotatives pour cisailler les amas de biofilm récoltés en une suspension à cellule unique. Dans cet article, nous présentons trois méthodes de récolte et de désagrégation pour deux types de surface différents, dur/non poreux et poreux.
Une liste des renseignements minimaux recommandés que les chercheurs devraient inclure dans les sections sur les méthodes des publications est fournie. Nous espérons que l’inclusion de ces informations permettra à d’autres chercheurs de reproduire leurs travaux. Il n’y a pas de méthode parfaite de récolte et de désagrégation, par conséquent, des recommandations sur la façon de vérifier la technique sont également fournies.
Trois méthodes courantes pour récolter et désagréger le biofilm à partir de surfaces de croissance communes sont démontrées dans cet article. Cette information permettra aux chercheurs de mieux comprendre la précision globale et le biais d’une méthode d’essai de biofilm. Les méthodes décrites sont les suivantes: (1) Un biofilm de Pseudomonas aeruginosa cultivé sur des coupons en polycarbonate (surface dure non poreuse) sous cisaillement fluide élevé dans le réacteur à biofilm CDC est récolté et désagrégé après une combinaison en cinq étapes de vortex et de sonication pour obtenir la récolte et la désagrégation du biofilm (2) A P. aeruginosa le biofilm cultivé sur des coupons de verre borosilicate (surface dure non poreuse) dans le réacteur à écoulement goutte à goutte sous faible cisaillement fluide est récolté et désagrégé par grattage et homogénéisation (3) Un biofilm d’Escherichia coli cultivé dans des tubes en silicone (surface poreuse) est récolté et désagrégé par grattage, suivi d’une sonication et d’un vortex.
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Protocol
1. Vortex et sonication
- Cultivez un biofilm mature de P. aeruginosa ATCC 15442 cultivé selon la norme ASTM E25622.
- À la fin de la période de croissance de 48 h, préparez-vous à traiter le biofilm et échantillonnez les coupons conformément à la norme ASTM E28718
- Insérer de manière aseptique des pare-éclaboussures autoclavés dans des tubes coniques stériles de 50 mL à l’aide de pinces stérilisées à la flamme. Répétez l’opération pour tous les tubes qui recevront un traitement. Les tubes pour coupons de contrôle n’ont pas besoin d’un pare-éclaboussures.
- Retirez de manière aseptique une tige sélectionnée au hasard du réacteur à biofilm du CDC. Rincez les coupons pour enlever les cellules lâchement attachées en trempant doucement la tige dans 30 mL d’eau tamponnée stérile.
- Maintenez la tige parallèlement à la paillasse, sur un tube conique vide et stérile de 50 mL et à l’aide d’une clé Allen stérilisée à la flamme, desserrez la vis pour laisser tomber un coupon enduit de biofilm dans le tube. Répétez l’opération pour le nombre de coupons souhaité. Retirez les pare-éclaboussures et placez-les dans un récipient séparé pour la stérilisation.
- À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, pipette lentement 4 mL du traitement ou de la commande dans les tubes afin que le liquide s’écoule à l’intérieur de la paroi du tube.
- Tapotez doucement le fond du tube afin que toutes les bulles d’air sous le coupon soient déplacées. Prévoyez 30 à 60 s entre chaque ajout.
- À la fin du temps de contact spécifié, pipette 36 mL de neutralisant dans les tubes dans le même ordre que le traitement (ou le contrôle) a été appliqué.
REMARQUE: Le volume final de traitement combiné et de neutralisant est important pour déterminer avec précision la densité logarithmique du biofilm. - Vortex chaque tube sur le réglage le plus élevé pendant 30 ± 5 s. Assurez-vous qu’un vortex complet est atteint.
REMARQUE: Il faut faire preuve de prudence lors du vortex de coupons lourds tels que l’acier inoxydable dans des flacons en verre où une rupture pourrait se produire. - Déterminez le nombre optimal de tubes par bain et par emplacement dans le rack de tubes à essai avant de traiter les échantillons réels. Si vous traitez plusieurs échantillons, vérifiez que la température de l’eau dans le bain de mesure est de 21 ± 2 oC.
- Placez les tubes dans un rack à tubes suspendu dans un sonicateur dégazé de telle sorte que le niveau d’eau dans le bain soit égal au niveau de liquide dans les tubes. Sonicate à 45 kHz, puissance à 100% et fonction normale pendant 30 ± 5 s. Répétez les cycles de vortex et de sonication, puis terminez par un vortex final (5 cycles au total).
REMARQUE: Ces tubes avec le biofilm récolté et désagrégé sont la dilution 100 ou 0. - Diluer l’échantillon en série dans de l’eau tamponnée. Plaque sur gélose R2A en utilisant la méthode de placage appropriée. Incuber à 36 ± 2 oC pendant 24 h. Compter les colonies en fonction de la méthode de placage utilisée et enregistrer les données.
2. Raclage et homogénéisation
- Cultivez un biofilm mature de P. aeruginosa ATCC 15442 selon la norme ASTM E264713.
- Configurez la station d’échantillonnage pour inclure une planche d’échantillonnage, de l’éthanol à 95% dans un bécher, un brûleur à alcool, des hémostats, un outil de retrait de coupon, des béchers avec de l’eau de dilution stérile et des tubes de dilution pour rincer les coupons.
- Éteignez la pompe. Retirez un couvercle de canal et utilisez un outil de retrait de coupon stérile et des hémostats pour retirer le coupon, en prenant soin de ne pas perturber le biofilm.
- Rincer le coupon en immergeant doucement, avec un mouvement fluide, dans 45 mL d’eau de dilution stérile (contenue dans un tube centrifuge de 50 mL). Inversez immédiatement le mouvement pour retirer le coupon.
- Placer le coupon dans un bécher contenant 45 mL d’eau de dilution stérile. Gratter la surface du coupon recouverte de biofilm dans une direction descendante pendant environ 15 s, à l’aide d’une spatule stérile ou d’un grattoir. Rincez la spatule ou le grattoir en le remuant dans le bécher. Répétez le processus de raclage et de rinçage 3-4 fois, en assurant une couverture complète de la surface du coupon.
- Rincez le coupon en le maintenant à un angle de 60° sur le bécher stérile et en pipetant 1 mL d’eau de dilution stérile sur la surface du coupon. Répétez l’opération pour un total de 5 rinçages. Le volume final dans le bécher est de 50 mL.
REMARQUE: Le volume final de traitement combiné et de neutralisant est important pour déterminer avec précision la densité logarithmique du biofilm. - Remplacez chaque couvercle de canal lorsque les coupons sont retirés.
- En travaillant dans l’armoire de biosécurité, homogénéiser l’échantillon de biofilm gratté. Fixez une sonde d’homogénéisateur stérile à l’homogénéisateur, placez la pointe de la sonde dans le liquide, allumez l’homogénéisateur et montez jusqu’à 20 500 tr / min.
- Homogénéiser l’échantillon pendant 30 s. Baissez les rpm et éteignez l’homogénéisateur.
- Désinfecter la sonde entre les échantillons de biofilm en homogénéisant un blanc de dilution stérile de 9 mL à 20 500 tr/min pendant 30 s comme décrit ci-dessus. Homogénéiser un tube de 9 mL d’éthanol à 70% pendant 30 s, détacher la sonde et laisser reposer dans le tube d’éthanol pendant 1 min. Homogénéiser deux ébauches de dilution supplémentaires.
REMARQUE: Une sonde d’homogénéisateur jetable peut être utilisée pour chaque échantillon. - Diluer en série les échantillons dans de l’eau tamponnée. Plaque sur gélose R2A en utilisant la méthode de placage appropriée. Incuber des plaques à 36 ± 2 oC pendant 24 h, compter les colonies en fonction de la méthode de placage utilisée et enregistrer les données.
3. Grattage, vortex et sonication
- Cultivez un biofilm mature d’Escherichia coli ATCC 53498 dans un tube de cathéter en silicone10.
- Préparer le matériel d’échantillonnage: tubes de rinçage, tube de centrifugeuse stérile, boîte de Petri stérile vide, hémostat et ciseaux en acier inoxydable stérilisé à la flamme, minuterie et règle.
- Lorsque la pompe est en pause, utilisez 70% d’éthanol pour nettoyer l’extérieur du tube. Mesurez 2 cm de l’extrémité, en évitant la zone fixée au connecteur, et marquez le tube pour déterminer les emplacements de coupe.
- Avec des ciseaux stérilisés à la flamme, coupez le tube sur la marque de 2 cm et placez le segment dans une boîte de Petri stérile vide. Essuyez le tube avec de l’éthanol à 70% et reconnectez l’extrémité distale au tube à déchets.
- Segment de tuyauterie de rinçage pour éliminer les cellules planctoniques. Avec des pinces stérilisées à la flamme, immergez doucement le segment de tuyau dans 20 mL d’eau de dilution stérile, puis retirez-le immédiatement. Placez le segment dans 10 mL de neutralisant.
- Avec les pinces stérilisées à la flamme, maintenez le segment de tube et grattez avec un bâton applicateur en bois stérile jusqu’à ce que toutes les zones intérieures du tube aient été grattées. Rincez de temps en temps le bâton dans les 10 mL de neutralisant et replacez le segment dans le tube d’échantillonnage. Le segment de tube raclé est la dilution 100 ou 0.
REMARQUE: Le volume final de traitement combiné et de neutralisant est important pour déterminer avec précision la densité logarithmique du biofilm. - Vortex chaque tube sur le réglage le plus élevé pendant 30 ± 5 s. Placez le tube dans un rack à tubes suspendu dans un sonicator de telle sorte que le niveau d’eau dans le bain soit égal au niveau de liquide dans les tubes. Sonicate à 45 kHz, puissance à 100% et fonction normale pendant 30 ± 5 secondes. Répétez les cycles de vortex et de sonication, puis terminez par un vortex final.
REMARQUE: Ce tube avec le biofilm récolté et désagrégé est la dilution 100 . - Diluer en série les échantillons dans de l’eau tamponnée. Plaque sur gélose de soja tryptique en utilisant la méthode de placage appropriée.
- Incuber des plaques à 36 ± 2 oC pendant 24 h. Compter les colonies en fonction de la méthode de placage utilisée, enregistrer les données et calculer la moyenne arithmétique.
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Representative Results
Validation/Confirmation d’une méthode de récolte
Plusieurs études menées dans notre laboratoire ont examiné la capacité du vortex et de la sonication à récolter efficacement le biofilm cultivé dans le réacteur à biofilm (ASTM E2562)2 en utilisant la méthode du tube unique (ASTM E2871)8.
Un biofilm P. aeruginosa ATCC 15442 a été cultivé selon la norme ASTM E25622 sur des coupons en verre borosilicate. Après 48 heures, quatre coupons ont été placés dans des flacons, « traités » avec 4 mL d’eau tamponnée stérile et neutralisés avec 36 mL de bouillon neutralisant 2x D/E. Le réglage initial de sonication de 45 kHz, 10% de puissance, réglage de balayage, 30 ± 5 s a été utilisé pour récolter et désagréger le biofilm de trois des quatre coupons. À la fin du cycle de vortex et de sonication, chaque coupon a été taché de violet cristallin et photographié. La figure 1 montre la quantité de biofilm restant sur les trois coupons après vortex et sonication par rapport au témoin.
Pour tester cela plus avant, un biofilm P. aeruginosa ATCC 15442 a été cultivé comme décrit précédemment et deux paramètres de sonication ont été comparés: 1) 45 kHz, 10% de puissance, réglage de balayage, 30 ± 5 secondes et 2) 45 kHz, 100% de puissance, réglage normal, 30 ± 5 secondes. Un coupon de chaque ensemble des trois a été taché avec la tache BacLight Live / Dead et imagé à l’aide de la microscopie confocale (CM). Les deux coupons restants de chaque ensemble ont été dilués, plaqués et énumérés pour les cellules viables. Les résultats viables du nombre de plaques étaient de 9,230 Log10 UFC/coupon ± de 0,007 (SD_R) pour le réglage 1 et de 9,272 Log10 UFC/coupon ± de 0,066 (SD_R) pour le réglage de sonication 2. Ces données ont corroboré une étude collaborative de l’EPA sur la méthode du tube unique de 2015 où 9,03 Log10 UFC/coupon ± 0,272 (SD_R) ont été atteints9. Selon les dénombrements viables sur plaques, il semble que les trois moyens soient suffisamment similaires pour ne pas justifier une enquête plus approfondie sur les différences entre les deux méthodes de récolte. Cependant, les images microscopiques montrées à la figure 2 peuvent suggérer qu’il restait plus de biofilm après l’utilisation du réglage 1 que du réglage 2. Bien que nous observions que le biofilm restant sur les coupons semble mort (de couleur rouge), l’interprétation de la viabilité lors de l’utilisation de la tache BacLight Live/Dead est difficile14,15. Plutôt que de nous concentrer sur les implications du biofilm coloré sur la viabilité, nous avons utilisé cette tache pour visualiser le biofilm restant sur les surfaces. De plus, bien que nous reconnaissions que la sonication pourrait être délétère pour la viabilité bactérienne, une publication de 2007 de Kobayashi et al.16 a démontré que l’augmentation du temps de sonication au-delà de 5 minutes entraînait une diminution du nombre de plaques viables. Étant donné que notre étude a utilisé un total de 1 minute de sonication, nous sommes convaincus que peu de cellules ont été tuées par sonication, comme le montre l'>9,2 LOG10 UFC / coupons pour les deux paramètres de sonication. Il est intéressant de noter qu’une récolte complète du biofilm de la surface n’a pas été obtenue par l’une ou l’autre méthode. Cette découverte démontre que les numérations sur plaques viables seules ne sont pas suffisantes pour déterminer le biais de récolte et de désagrégation et doivent donc être associées à une méthode supplémentaire, la microscopie, par exemple.
En plus des réglages du sonicator, nous avons étudié d’autres facteurs importants qui affectent la sonication. Il s’agissait notamment du volume de liquide dans les flacons (10 ou 40 mL), du type de liquide dans le flacon (eau tamponnée ou 2X D/E de bouillon neutralisant) et du nombre de flacons placés dans le bain en même temps (3 ou 12 flacons)9.
Les biofilms de P. aeruginosa sur les coupons du réacteur CDC Biofilm ont été soniqués à l’aide du réglage du sonicateur 2 (45 kHz, 100% de puissance, réglage normal, 30 ± 5 secondes). Tous les échantillons ont été vortexés soit 3 à la fois, soit 6 à la fois à l’aide d’un vortexeur équipé d’un tube à 6 places puis soniqués comme décrit à la figure 3. Un coupon de chacune des catégories suivantes a été imagé à l’aide de CM (Figure 3).
Dans la deuxième étude où les paramètres de sonication ont été étudiés, les images microscopiques (Figure 3) suggèrent que la minimisation du volume dans les tubes, la réduction du nombre de tubes traités à la fois et l’utilisation de bouillon neutralisant D / E (qui contient du tensioactif) contribuent tous à améliorer la récolte du biofilm à partir des coupons.
Les biocides peuvent améliorer positivement ou négativement la récolte et la désagrégation. De la même manière qu’un neutralisant arrête efficacement l’actif tout en n’augmentant pas la mortalité avant d’effectuer un test d’efficacité, il est important de confirmer qu’un biocide n’a pas d’impact différentiel sur la récolte et la désagrégation. Pour les tests d’efficacité, les résultats de biais sont obtenus si et seulement s’il y a élimination différentielle pour les échantillons de biofilm témoins par rapport aux échantillons de biofilm traités11.
Figure 1 : Photos de coupons colorés avec du violet cristallin démontrant un biofilm résiduel. A) Coupon retiré du réacteur et taché de cristal violet. B, C, D) Trois coupons répliqués ont été « traités » séparément avec de l’eau tamponnée stérile puis neutralisés. Pour récolter et désagréger, les coupons ont été tourbillonnés (30 ± 5 secondes) et soniqués (45 kHz, 10% de puissance, réglage Sweep, 30 ± 5 secondes) deux fois puis ont reçu un vortex final. Images reproduites avec l’aimable autorisation de Danielle Orr et Blaine Fritz. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images de microscopie confocale de coupons comparant deux paramètres de sonication différents. Coupons (grossissement 12,5X) traités via le réglage de sonication 1 (45 kHz, 10% de puissance, réglage Sweep) à gauche ou le réglage de sonication 2 (45 kHz, 100% de puissance, réglage normal) à droite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Images de microscopie confocale de coupons comparant les volumes, le liquide de sonication et le nombre de tubes. Coupons (grossissement 12,5X) traités en volumes de 10 ou 40 mL, dans de l’eau de dilution (DW) ou du bouillon neutralisant D/E (D/E), 3 ou 12 tubes à la fois avec réglage de sonication optimisé (45 kHz, puissance 100%, réglage normal). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Fichier supplémentaire 1 : Paramètres clés importants pour la récolte et la désagrégation Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Informations minimales pour les méthodes de récolte et de désagrégation
Pour créer des données reproductibles sur les biofilms dans l’ensemble de la communauté scientifique, il est impératif que les auteurs incluent autant de détails que possible concernant chacune des étapes de croissance, de traitement, d’échantillonnage et d’analyse d’une méthode de biofilm. La normalisation des méthodes de biofilm a aidé dans cette entreprise car elle permet au chercheur de référencer une méthode spécifique et toute modification pertinente. Cependant, de nombreux articles ne contiennent qu’une phrase ou deux pour décrire la récolte et la désagrégation du biofilm. Pour une meilleure reproductibilité, nous recommandons que des informations minimales pour la récolte du biofilm soient incluses dans les publications. Cela s’appuie sur l’initiative Minimum Information About a Biofilm Experiment (MIABiE) présentée par Lourenco et al.17. Dans le cas de l’utilisation de la sonication pour la récolte du biofilm et les paramètres de désagrégation, les informations doivent inclure: la position des tubes dans le bain (recommandations des fabricants pour éviter d’endommager les transducteurs), le nombre de tubes soniqués en même temps, le matériau du tube, le volume et le type de liquide dans le tube, la présence de tensioactif, la position du liquide dans les tubes par rapport au niveau de liquide du bain à ultrasons, dispositif utilisé pour maintenir les tubes dans le bain (béchers en verre vs support de tube à essai), dégazage du bain-marie avant la sonication des échantillons (si le dégazage n’est pas une option du fabricant, un simple fonctionnement du bain avant d’insérer les échantillons aidera à éliminer certains gaz dissous du liquide du bain), température du bain-marie (les températures peuvent augmenter après de longues périodes de sonication), fréquence (25 kHz ou 45 kHz, par exemple), fonction bain (balayage ou normal, par exemple) et plage de puissance fournie aux transducteurs (10 - 100%, par exemple). Ces paramètres doivent être optimisés pour le biofilm étudié, le système utilisé pour cultiver le biofilm et la marque/modèle spécifique du bain à ultrasons18.
Les paramètres du sonicator peuvent être modifiés pour optimiser les effets de récolte souhaités. Le dégazage élimine l’air dissous dans le liquide du bain, améliorant ainsi le pouvoir nettoyant. La fréquence peut être ajustée à un réglage bas ou haut. Un réglage bas tel que 25 kHz, par exemple, aiderait à récolter des échantillons tenaces tandis qu’un réglage plus élevé de 45 kHz serait plus approprié pour les échantillons sensibles. Une fonction de bain de balayage ou normale permet la distribution de la cavitation. La fonction de balayage crée un décalage continu des maxima de pression acoustique. La fonction normale permet aux transducteurs de fonctionner en mode double demi-onde, ce qui peut entraîner des zones mortes, rendant ainsi la sonication moins efficace. Les plages de puissance peuvent être modifiées de 10 à 100 % de la puissance fournie aux transducteurs19. On sait que la sonication peut nuire à la viabilité bactérienne. Une étude réalisée en 2008 par Stamper et al.20 a exposé les cultures bactériennes à l’augmentation de l’énergie ultrasonore au fil du temps pour créer des courbes de destruction bactériennes. Nous recommandons aux utilisateurs de confirmer qu’une combinaison particulière de paramètres de sonication n’entraîne pas de diminution du nombre de bactéries viables20.
Il n’existe pas de méthode parfaite pour récolter et désagréger le biofilm, mais certaines méthodes fonctionnent mieux pour certaines combinaisons surfaces/microbes que d’autres. Nous préconisons au lecteur de déterminer quels paramètres sont importants pour son scénario de biofilm particulier. Les principaux paramètres importants pour la récolte et la désagrégation sont inclus dans le dossier supplémentaire 1.
Pour les études de sonication effectuées pour évaluer le biais de récolte et de désagrégation, nous avons constaté que la sonication est pratique, efficace et capable d’être normalisée pour la récolte et le désagrégation du biofilm des surfaces. Le placement de coupons dans des flacons minimise la variabilité de technicien à technicien qui serait rencontrée dans les méthodes où les coupons sont physiquement grattés par le personnel de laboratoire, par exemple. Bien qu’il semble assez simple de placer des flacons dans un bain-marie sonique, de nombreux paramètres doivent être pris en compte pour obtenir une récolte optimale du biofilm.
Deux types d’équipements de sonication sont disponibles, les bains à ultrasons et les sondes à ultrasons. Cet article se concentre principalement sur les bains à ultrasons où l’énergie ultrasonique est générée dans la gamme de fréquence élevée (20 - 45 kHz) à normale (40 - 60 Hz).
Trois processus principaux sont en jeu lors de l’utilisation d’un appareil à ultrasons pour nettoyer une surface. L’énergie électrique est convertie en énergie acoustique lorsqu’un courant à haute fréquence est envoyé à un transducteur piézoélectrique ou magnétostrictif qui oscille en réponse au courant. L’oscillation génère des ondes de compression (raréfaction) dans le liquide. Des bulles de cavitation se forment en raison d’une pression négative lors de la raréfaction. Les bulles se développent jusqu’à ce qu’elles atteignent une taille instable et s’effondrent, créant un jet d’eau qui nettoie les surfaces21.
Trois approches de récolte et de désagrégation sont démontrées dans cet article: méthodes de sonication et de vortex pour la récolte et la désagrégation du biofilm lorsqu’il est cultivé sur des coupons en polycarbonate dans le réacteur à biofilm du CDC selon la méthode du tube unique. Les méthodes de grattage et d’homogénéisation pour la récolte et le désagrégation du biofilm sont montrées lorsqu’elles sont cultivées sur des coupons en verre à l’aide du réacteur à biofilm à flux goutte à goutte. Les méthodes de raclage, de sonication et de vortex pour la récolte et le désagrégation du biofilm sont montrées lorsqu’elles sont cultivées dans des tubes en silicone.
Il n’existe pas de méthode parfaite pour récolter et désagréger le biofilm, mais certaines approches sont meilleures pour différentes surfaces et / ou applications. Ce qui est important, c’est de prendre le temps de valider la méthode utilisée. Dans cet article, nous avons discuté de l’utilisation du violet cristallin et de la microscopie, mais d’autres choix existent en fonction de la sensibilité requise. Si la recherche comprend des tests d’efficacité, il est essentiel de confirmer la validité de l’approche en présence de l’antimicrobien6. Tous les équipements sont légèrement différents, donc même si la méthode de récolte et de désagrégation a été normalisée, il est toujours prudent de confirmer le processus pour l’équipement utilisé. Les méthodes de récolte et de désagrégation sont spécifiques aux bactéries associées à la surface et au biofilm. La recherche a démontré que des choix inappropriés peuvent conduire à des résultats de test biaisés. Néanmoins, la récolte et la désagrégation sont les moins étudiées des quatre étapes des méthodes de biofilm. C’est généralement aussi l’étape non validée (considérée comme allant de soi comme un travail) avec le moins d’informations présentes dans l’article publié, ce qui rend difficile la reproduction du processus dans un laboratoire différent. Cet article et la vidéo qui l’accompagne montrent trois approches communes pour deux types de surface et suggèrent comment valider une méthode pour un laboratoire individuel. Cette information aidera les chercheurs à prendre des décisions plus éclairées sur la méthode à utiliser et fournira des conseils sur ce qu’il faut signaler pour améliorer la reproductibilité.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucune divulgation.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers et Fei San Lee pour leurs contributions à ce document.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
References
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