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Medicine

पूर्व वीवो पल्मोनरी वेसल स्ट्रक्चर और कॉन्ट्रैक्टिलिटी स्टडीज के लिए एक कुशल उपकरण के रूप में सटीक कट लंग स्लाइस

Published: May 24, 2021 doi: 10.3791/62392
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Divisions of Pulmonary Medicine, Boston Children's Hospital

Summary

यहां प्रस्तुत पीसीएलएस मुरीन फेफड़ों के ऊतकों की संवहनी संकुचन के संरक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल है, जिसके परिणामस्वरूप फेफड़े के संवहनी और वायुमार्ग की एक परिष्कृत त्रि-आयामी छवि होती है, जिसे 10 दिनों तक संरक्षित किया जा सकता है जो कई प्रक्रियाओं के लिए अतिसंवेदनशील है।

Abstract

मुरीन फेफड़ों के ऊतकों का दृश्य अंतर्निहित वायुमार्ग और वाक्यूलेचर के बारे में मूल्यवान संरचनात्मक और सेलुलर जानकारी प्रदान करता है। हालांकि, फेफड़े के जहाजों का संरक्षण जो वास्तव में शारीरिक स्थितियों का प्रतिनिधित्व करता है, अभी भी चुनौतियां प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, मुरीन फेफड़ों के नाजुक विन्यास के परिणामस्वरूप तकनीकी चुनौतियां उच्च गुणवत्ता वाली छवियों के लिए नमूने तैयार कर रही हैं जो सेलुलर संरचना और वास्तुकला दोनों को संरक्षित करते हैं। इसी तरह, सेलुलर संकुचन परख को विट्रो मेंवासोकॉन्स्ट्रिकर्स का जवाब देने के लिए कोशिकाओं की क्षमता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन ये परख बरकरार फेफड़ों के जटिल वातावरण को पुन: पेश नहीं करते हैं। इन तकनीकी मुद्दों के विपरीत, सटीक-कट फेफड़ों का टुकड़ा (पीसीएलएस) विधि क्षेत्रीय पूर्वाग्रह के बिना तीन आयामों में फेफड़ों के ऊतकों की कल्पना करने के लिए एक कुशल विकल्प के रूप में लागू किया जा सकता है और 10 दिनों तक के लिए एक लाइव सरोगेट संकुचन मॉडल के रूप में सेवा करते हैं। पीसीएलएस का उपयोग करके तैयार ऊतकों ने संरचना और स्थानिक अभिविन्यास को संरक्षित किया है, जिससे यह रोग प्रक्रियाओं पूर्व वीवोका अध्ययन करने के लिए आदर्श बन गया है। एक प्रेरक tdTomato रिपोर्टर मुरीन मॉडल से काटा पीसीएलएस में अंतर्जात tdTomato लेबल कोशिकाओं के स्थान को सफलतापूर्वक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की जा सकती है। वासोकॉन्ट्रिकर्स के संपर्क में आने के बाद, पीसीएलएस पोत संकुचन और फेफड़ों की संरचना दोनों के संरक्षण को दर्शाता है, जिसे समय-चूक मॉड्यूल द्वारा कैप्चर किया जा सकता है। पश्चिमी दाग और आरएनए विश्लेषण जैसी अन्य प्रक्रियाओं के संयोजन में, पीसीएलएस विभिन्न प्रकार के विकारों को रेखांकित करने वाले झरने को संकेत देने की व्यापक समझ में योगदान दे सकता है और फेफड़े के संवहनी रोगों में रोगविज्ञान की बेहतर समझ पैदा कर सकता है।

Introduction

शारीरिक संरचना का त्याग किए बिना सेलुलर घटकों को संरक्षित करने वाले फेफड़ों के ऊतकों की तैयारी और इमेजिंग में प्रगति फेफड़े की बीमारियों की विस्तृत समझ प्रदान करती है। शारीरिक संरचना को बनाए रखते हुए प्रोटीन, आरएनए और अन्य जैविक यौगिकों की पहचान करने की क्षमता कोशिकाओं की स्थानिक व्यवस्था के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करती है जो कई फेफड़े के रोगों में रोगविज्ञान की समझ को व्यापक बना सकती है। इन विस्तृत छवियों को फेफड़े की संवहनी रोगों की बेहतर समझ हो सकती है, जैसे फेफड़े की धमनी उच्च रक्तचाप, जब पशु मॉडल पर लागू होता है, संभावित रूप से बेहतर चिकित्सीय रणनीतियों के लिए अग्रणी होता है।

प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में प्रगति के बावजूद, मुरीन फेफड़ों के ऊतकों की उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करना एक चुनौती बनी हुई है । श्वसन चक्र साँस लेने के दौरान उत्पन्न नकारात्मक इंट्राथोरेसिक दबाव से प्रेरित होता है1. जब परंपरागत रूप से बायोप्सी प्राप्त करने और इमेजिंग के लिए फेफड़ों के नमूने तैयार करने, नकारात्मक दबाव ढाल वायुमार्ग और vasculature, जो अब अपने वर्तमान राज्य में ही प्रतिनिधित्व करता है के पतन में जिसके परिणामस्वरूप खो दिया है । वर्तमान परिस्थितियों को प्रतिबिंबित यथार्थवादी छवियों को प्राप्त करने के लिए, फेफड़े के वायुमार्ग को फिर से फुलाया जाना चाहिए, और वाक्यूलेचर एक स्थिर स्थिरता में गतिशील फेफड़ों को बदल दिया जाना चाहिए। इन विशिष्ट तकनीकों का अनुप्रयोग संरचनात्मक अखंडता, फेफड़े के वास्कुलेचर और सेलुलर घटकों के संरक्षण की अनुमति देता है, जिसमें मैक्रोफेज जैसी प्रतिरक्षा कोशिकाएं शामिल हैं, जिससे फेफड़ों के ऊतकों को यथासंभव अपनी शारीरिक स्थिति के करीब देखा जा सकता है।

सटीक कट फेफड़ों की टुकड़ा करने की क्रिया (पीसीएलएस) पल्मोनरी वैक्यूलेचर2के शरीर रचना विज्ञान और शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श उपकरण है। पीसीएलएस संरचनात्मक और सेलुलर घटकों को संरक्षित करते हुए तीन आयामों में फेफड़ों के ऊतकों की विस्तृत इमेजिंग प्रदान करता है। पीसीएलएस का उपयोग पशु और मानव मॉडल में तीन आयामों में सेलुलर कार्यों के लाइव, उच्च-संकल्प छवियों के लिए अनुमति देने के लिए किया गया है, जिससे यह संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों का अध्ययन करने, छोटे वायुमार्ग संकुचन को मापने और सीओपीडी, आईएलडी और फेफड़ों के कैंसर जैसे पुराने फेफड़ों के रोगों के रोगविज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श उपकरण बनगयाहै। इसी तरह की तकनीकों का उपयोग करना, वासोकॉन्ट्रिकर्स के लिए पीसीएलएस नमूनों के जोखिम फेफड़ों की संरचना और पोत संकुचन को संरक्षित कर सकते हैं, विट्रो स्थितियों में नकल । संकुचन के संरक्षण के साथ, तैयार नमूने आरएनए अनुक्रमण, पश्चिमी दाग, और प्रवाह साइटोमेट्री जैसे अतिरिक्त विश्लेषण से गुजरना कर सकते हैं जब सही ढंग से तैयार किया जाता है। अंत में, फेफड़ों की फसल के बाद tdTomato फ्लोरेसेंस के साथ चिह्नित रिपोर्टर रंग लेबल कोशिकाओं माइक्रोस्लिक्स तैयार करने के बाद लेबलिंग की रक्षा कर सकते हैं, यह सेल ट्रैकिंग अध्ययन के लिए आदर्श बना रही है । इन तकनीकों का एकीकरण कोशिकाओं और पोत संकुचन की स्थानिक व्यवस्था को संरक्षित करने वाला एक परिष्कृत मॉडल प्रदान करता है जो फेफड़े के वास्कुलेचर रोग में सिग्नलिंग कैस्केड और संभावित चिकित्सीय विकल्पों की अधिक विस्तृत समझ का कारण बन सकता है।

इस पांडुलिपि में, पीसीएलएस मुरीन फेफड़ों के ऊतक वासोकॉन्ट्रिकर्स के संपर्क में हैं, जो संरक्षित संरचनात्मक अखंडता और पोत संकुचन का प्रदर्शन करते हैं। अध्ययन दर्शाता है कि तैयार और उचित रूप से संभाला ऊतक 10 दिनों के लिए व्यवहार्य रह सकते हैं । अध्ययन भी अंतर्जात फ्लोरेसेंस (tdTomato) के साथ कोशिकाओं के संरक्षण को दर्शाता है, नमूनों फेफड़े के वास्कुलेचर और वास्तुकला के उच्च संकल्प छवियों को प्रदान करने के लिए अनुमति देता है । अंत में, अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए आरएनए माप और पश्चिमी दाग के लिए ऊतक स्लाइस को संभालने और तैयार करने के तरीके बताए गए हैं।

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Protocol

सभी पशु देखभाल बोस्टन बच्चों के अस्पताल के दिशा निर्देशों के अनुसार था और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी । इस अध्ययन में इस्तेमाल चूहों जंगली प्रकार C57/B6 चूहों और Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato चूहों को पार कर रहे हैं ।

1. समाधान की तैयारी

  1. पहले से प्रयोग के दौरान आवश्यक फॉस्फेट बफर सॉल्यूशन (1x पीबीएस) और 2% एग्रिसिंग सॉल्यूशन तैयार करें।
    1. ऑटोक्लेव्ड पानी के 100 एमएल में 2 g agarose पाउडर मिलाएं। समाधान स्पष्ट होने तक इसे माइक्रोवेव में कुछ सेकंड गर्म करें।
    2. उपयोग होने तक 42 डिग्री सेल्सियस पर पानी स्नान में समाधान रखें।
      नोट: दोनों PBS और 2% agarose सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है ।

2. माउस फेफड़ों का निष्कर्षण

  1. आइसोफ्लुने ओवरडोज से माउस को इच्छामृत्यु दें। निचले स्तर में टिश्यू पेपर पर आइसोफ्लुन की थोड़ी मात्रा में आइसोफ्लुनान रखकर और माउस को ऊपरी स्तर में एक डेसीकेटर में रखकर आइसोफ्लुने ओवरडोज प्राप्त करें। माउस बेहोश होने तक डिसिकेटर में रहता है।
  2. गर्दन पर अवर दबाव लगाने और पूंछ पर कौडल खींचने से माउस की मौत सुनिश्चित करें। माउस को विच्छेदन सतह पर लाएं।
  3. माउस को रीढ़ की स्थिति में रखें और चिपकने वाले टेप के साथ टेबल पर पंजे और नाक को टेप करने के स्थान पर सुरक्षित करें।
  4. माउस की वेंट्रल सतह को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और अतिरिक्त इथेनॉल को मिटा दें।
  5. मूत्राशय के स्थान पर संदंश के साथ माउस की पेट की त्वचा को उठाएं और सर्जिकल कैंची के साथ मिडलाइन पर काटें, श्वासनली क्षेत्र में बेहतर ढंग से आगे बढ़ रहे हैं।
  6. चिमटी के साथ अंतर्निहित फासल परत उठाएं और आंत के अंगों और मध्यस्थ डिब्बे को बेनकाब करने के लिए सर्जिकल कैंची से काटें, फिर से बेहतर से कमतर काटें।
  7. दिल और फेफड़ों को बेनकाब करने के लिए मिडलाइन पर स्टर्नम काटें।
  8. कुंद विच्छेदन का उपयोग करना, जिगर और पेट के डिब्बे से डायाफ्राम अलग।
  9. आंतों के नीचे अवर वेना कावा (आईवीसी) का पता लगाएं और आईवीसी को काटें।
  10. सही वेंट्रिकल का पता लगाएं।
    नोट: दाएं वेंट्रिकल में बाएं वेंट्रिकल की तुलना में हल्का रूप होगा और इंट्रावेंट्रिकुलर सेप्टम की कल्पना की जानी चाहिए, बाएं वेंट्रिकल से दाएं वेंट्रिकल को अलग करना चाहिए।
  11. 25-30 जी तितली सुई के साथ सही वेंट्रिकल के लिए 1% के 0.5 एमएल इंजेक्ट करें और फिर धीरे-धीरे फ्लश करें लेकिन 1x पीबीएस(चित्रा1 ए) के 10-15 एमएल के साथ तेजी से फ्लश करें।
    1. सावधानी का प्रयोग करें कि दिल के माध्यम से सुई डालें और मीडियास्टिनल गुहा में हेपरिन इंजेक्ट न करें।
      नोट: 1x PBS के इंजेक्शन फेफड़ों के ऊतकों सफेद बदल जाता है । पेट महाधमनी से एक्सट्रावसिंग तरल पदार्थ स्पष्ट और बेरंग होना चाहिए और सफल फ्लशिंग के बाद जिगर दिखने में सफेद हो सकता है।
  12. गला का पता लगाएं और कुंद टिप चिमटी का उपयोग कर आसपास के प्रावरणी और ऊतक विच्छेदन।
  13. शल्य चिकित्सा सीवन को श्वासनली के नीचे रखें और एक शल्य चिकित्सा गाँठ को शिथिल करें।
  14. श्वासनली में एक छोटा सा छेद स्ट्रिंग से बेहतर रखें और 20 ग्राम कुंद-समाप्त सुई के साथ कैनुलेट करें।
  15. एक शल्य गांठ का उपयोग कर सुई और श्वासनली के चारों ओर सीवन कस।
  16. ट्रेचिया में एगर के 2.5-4 एमएल इंजेक्ट करें और फेफड़ों की मुद्रास्फीति के लिए निगरानी करें।
  17. के बाद agarose डाले है, ठंडा डालना, फेफड़ों पर ठंडा 1x PBS अगर उठी जमना ।
  18. श्वासनली को सर्जिकल सीवन से बेहतर काटें और किसी भी आसंजन और प्रावरणी को हटाकर फेफड़ों और दिल को मीडियास्टिनम से काट लें।
  19. ठोसकरण के बाद, बर्फ पर रखने के लिए पेट्री डिश में 1x डीएमईएम (ऊतक को जलमग्न करने के लिए पर्याप्त) में रखें। तुरंत एक कंपन मशीन(चित्रा 1B)का उपयोग कर एक पालि टुकड़ा ।

3. सटीक कट फेफड़ों के स्लाइस

  1. नमूना को सुपरग्लू के साथ प्लेटफ़ॉर्म पर संलग्न करें, नमूने के मध्यमुखी पक्ष को सामने रखते हुए।
  2. नमूना कंटेनर को 1x पीबीएस के साथ भरें, यह सुनिश्चित करते हुए कि नमूना पूरी तरह से जलमग्न है।
  3. पीबीएस और नमूना ठंडा आसपास रखने के लिए बर्फ के साथ नमूना कंटेनर आसपास के कंटेनर भरें।
  4. वाइब्रेटम चालू करें और नीचे वांछित सेटिंग्स में समायोजित करें।
    1. मोटाई को 300um तक सेट करें।
    2. 100 हर्ट्ज के लिए आवृत्ति सेट करें।
    3. आयाम को 0.6 मिमी तक सेट करें।
    4. गति को 5 माइक्रोन/एस तक सेट करें ।
  5. एलन रिंच का उपयोग करके, ब्लेड धारक को सुरक्षित स्थिति में बदल दें और ब्लेड डालने के लिए जबड़े खोलें।
  6. एक एलन रिंच के साथ जबड़े कस और टुकड़ा करने की क्रिया के लिए उपयुक्त स्थिति में ब्लेड धारक बारी।
  7. नमूना और मंच बॉक्स पर रखें और ब्लेड के सामने स्लाइड करें।
  8. नमूना जलमग्न होने तक 1x पीबीएस के साथ नमूना मंच के चारों ओर बॉक्स भरें।
  9. वाइब्रेटम ब्लेड को ब्लॉक के किनारे तक लाएं और मैन्युअल रूप से ब्लेड को कम करें जब तक कि यह नमूने के शीर्ष के साथ भी न हो।
  10. उपयुक्त सेटिंग्स की पुष्टि करें और वाइब्रेकोम(चित्रा 2) चलाएं।
  11. जैसे ही ताजा स्लाइस काटे जाते हैं, पीबीएस से नमूनों को हटा दें और उन्हें 1x डीएमईएम के 10 एमएल के साथ बाँझ पेट्री डिश में रखें जिसमें 1x एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक होता है।
  12. समाप्त होने पर, ब्लेड को पूरी तरह से वापस लें और फिर ब्लेड को सुरक्षित स्थिति में उठाने के लिए एलन रिंच का उपयोग करें।
  13. 10 दिनों तक संरक्षित व्यवहार्यता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में 1x डीएमईएम में नमूनों को स्टोर करें (नीचे व्यवहार्यता प्रयोग देखें)।

4. उदाहरण वासोकॉनस्ट्रिक्टर प्रयोग

  1. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वाइब्रेटम स्लाइस रखें।
  2. इसे स्लाइड पर रखने से पहले, अतिरिक्त माध्यम (पीबीएस) से छुटकारा पाने के लिए एक सफाई पोंछ का उपयोग करें।
  3. नमूने को चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत रखें और एक पोत की पहचान करने के लिए 10-20x आवर्धन का उपयोग करें।
  4. स्लाइड को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए 60 mm KCl या 1 μM Endothelin-1 जैसे वासोकॉन्स्ट्रिकेटर्स के 500 माइक्रोन डालें।
  5. 30 एस-60 एस(वीडियो 1)के लिए रिकॉर्डिंग करके वीडियो का निरीक्षण करें और कैप्चर करें।

5. पीसीएलएस पर आरएनए या प्रोटीन लाइसिस के लिए ऊतक तैयार करना

  1. प्रयोग शुरू करने से पहले, तरल नाइट्रोजन के 1 एल के साथ एक छोटे पॉलीस्टीरिन फोम बॉक्स भरें।
  2. शुरू करने से पहले तरल नाइट्रोजन के साथ कंटेनर में दो छोटे माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब (1.5 एमएल) रखें।
    नोट: तरल नाइट्रोजन ट्यूबों के बाहर ठंडा होना चाहिए, हालांकि, अंदर नहीं होना चाहिए । देखभाल के साथ तरल नाइट्रोजन को संभालना सुनिश्चित करें और त्वचा को तरल नाइट्रोजन के लिए बेनकाब न करें। बॉक्स से ट्यूबों को रखने और हटाने के लिए संदंश और दस्ताने का उपयोग करें।
  3. मोर्टार कटोरे में 4-5 ताजा वाइब्रेकोम स्लाइस रखें।
  4. मोर्टार कटोरे में स्लाइस के शीर्ष पर तरल N2 के 5-10 एमएल डालो।
  5. तरल नाइट्रोजन वाष्पित होने से पहले फ्लैश फ्रीज स्लाइस को पाउडर में पीसने के लिए मूसल का उपयोग करें।
    नोट: ऊतक एक ठीक पाउडर में गाढ़ा होना चाहिए। यदि नहीं, तो प्राप्त होने तक अतिरिक्त तरल नाइट्रोजन जोड़ें।
  6. एक स्टील प्रयोगशाला स्कूपर (तरल नाइट्रोजन के साथ prechilled) का उपयोग करना, पाउडर को दो ठंडा माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्कूप करें।
  7. प्रोटीन लाइसिस के साथ आगे बढ़ने के लिए आरएनए अलगाव या रिपा बफर (1x प्रोटीज अवरोधकों शामिल हैं) के साथ आगे बढ़ने के लिए आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट के 500 माइक्रोन जोड़कर पाउडर को लाइसे करें।
  8. अतिरिक्त आरएनए अलगाव, बीसीए माप, और पश्चिमी दाग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करें।

6. व्यवहार्यता का निर्धारण

  1. वाइब्रेकोम तैयारी के बाद, दो फेफड़ों के स्लाइस को डीएमईएम मीडिया के 450 माइक्रोन और सेल व्यवहार्यता अभिकर् ताव के 50 माइक्रोन के साथ 24-अच्छी संस्कृति प्लेट में रखें (यह सुनिश्चित करें कि ऊतक पूरी तरह से जलमग्न है)।
  2. नमूनों को प्रकाश के न्यूनतम जोखिम के साथ रात भर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर 5% सीओ2 में वापस रखें।
  3. सुबह, रंग परिवर्तन के लिए समाधान का निरीक्षण करें। जब ऊतक व्यवहार्य होता है तो नीला समाधान गुलाबी हो जाता है।

7. सेल लेबलिंग का संरक्षण

  1. टीडीटोमाटो लेबल क्रे पॉजिटिव कोशिकाओं को प्रेरित करने के लिए कुल 5 दिनों (कुल खुराक 10 मिलीग्राम टैमोक्सिफेन) के लिए टैमोक्सिफेन (2 मिलीग्राम/दिन) के आईपी इंजेक्शन के साथ Ai14 tdTomato माउस के साथ पार किए गए ट्रांसजेनिक Cdh5-CreERT2 का इलाज करें।
  2. इंजेक्शन के एक सप्ताह बाद, उपरोक्त चरणों 1 से 3 का उपयोग करके फेफड़ों को तैयार करें।
  3. सटीक-कट फेफड़ों के टुकड़े की तैयारी के बाद, ऊतक को माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें और ऊतक के शीर्ष पर एक कवरलिप रखें।
  4. tdTomato धुंधला (उत्तेजन तरंग दैर्ध्य 555 एनएम का उपयोग कर) का पता लगाने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।

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Representative Results

जब कोशिकाओं या ऊतकों में जोड़ा जाता है, तो व्यवहार्यता अभिकर्ण को व्यवहार्य ऊतक के कम वातावरण द्वारा संशोधित किया जाता है और गुलाबी/लाल हो जाता है, अत्यधिक फ्लोरोसेंट बन जाता है। प्रतिनिधि रंग परिवर्तन दिन 0-1 और दिन 9-10 से पता चला चित्र 3में प्रदर्शित कर रहे हैं । जैसा कि उल्लेख किया गया है, समाधान नीला शुरू हो गया और रात भर गुलाबी हो गया, व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया। रंग परिवर्तन आमतौर पर 1-4 घंटे के भीतर होता है; हालांकि, एक लंबा समय आवश्यक हो सकता है। व्यवहार्यता के लिए परख करने के लिए, एक प्लेट रीडर का उपयोग एक कंपन-तैयार नमूने के अवशोषण और 4% पीएफए फिक्स्ड फेफड़ों के टुकड़े को निर्धारित करने के लिए किया गया था, जो नियंत्रण के रूप में कार्य करता था। जिन समाधानों में नमूनों को इनक्यूबेटेड किया गया था, उन्हें निर्माता की सिफारिश के बाद 562 एनएम और 630 एनएम के अवशोषण में पढ़ा गया था। वाइब्रेकोम तैयार ऊतक के लिए 562 एनएम और 630 एनएम तरंगदैर्ध्य पर अवशोषण और नियंत्रण ऊतक की तुलना के बीच दैनिक अंतर चित्र 3में दिखाया गया है।

वाइब्रेटोम-तैयार फेफड़ों के ऊतकों की संकुचनता प्रदर्शित करने के लिए, ऊतक का एक ताजा टुकड़ा 400x पर उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के नीचे रखा गया था और ऊतक जलमग्न होने तक केसीएल या एंडोथेलियन-1 का उपयोग करके इलाज किया गया था। ऊतक के 30-60 एस पर लिया गया एक वीडियो वैक्यूलेचर(वीडियो 1)के संकीर्तन का पता चलता है।

टैमोक्सिफेन इंजेक्शन के 1 सप्ताह बाद सेल लेबलिंग के संरक्षण को प्रदर्शित करने के लिए, उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करके वाइब्रेटोम सेक्शनिंग के बाद प्राप्त फेफड़ों के स्लाइस एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत देखे गए थे। फेफड़ों के स्लाइस में टीडीटोमा लेबलिंग चित्र 4में प्रदर्शित की गई है।

Figure 1
चित्रा 1:कंपन अनुभागिंग के लिए मुरीन फेफड़ों के ऊतकों की तैयारी। (क)आरवी को हेपरिन से पीबीएस तक स्विचिंग समाधानों की सुविधा प्रदान करने के लिए 30 ग्राम तितली सुई के साथ कैनलेटेड किया गया है । (ख)agarose मुद्रास्फीति के बाद पूरे फेफड़ों पालि कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:कंपन अनुभागिंग का उपयोग कर फेफड़ों के स्लाइस। मोटाई: 300 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3:पीसीएलएस स्लाइस के लिए व्यवहार्यता प्रयोग दिन 1 से 10 दिन तक। (A)पीसीएलएस-तैयार टिश्यू बनाम 4% पीएफए-फिक्स्ड टिश्यू के रिएजेंट कलर चेंज की रिप्रेजेंटेटिव इमेज। ताजा पीसीएलएस ऊतक और 4% फिक्स्ड पीएफए ऊतक ऊतक मीडिया के 450 माइक्रोन और व्यवहार्यता अभिकर् प के 50 माइक्रोन में रखा गया था। समाधान रंग शुरू में बैंगनी, जैसा कि 0 दिन और 9 दिन पर देखा जा सकता है। रात भर इनक्यूबेटिंग के बाद, ताजा तैयार पीसीएलएस ऊतकों युक्त समाधान बैंगनी/गुलाबी रंग (दिन 1 और दिन 10) जीवित ऊतकों के कम वातावरण के कारण बदल गया । (ख)पीसीएलएस व्यवहार्यता का दिन 1 से 10 दिन तक 562 एनएम और प्लेट रीडर के साथ 630 एनएम पर अवशोषण के अनुपात से। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:फसल के बाद संरक्षित tdTomato सकारात्मक कोशिकाओं लेबलिंग का प्रदर्शन। पीसीएलएस तैयारी एक Cdh5-tdT ट्रांसजेनिक माउस से है। स्केल बार = 20 माइक्रोन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: पीसीएलएस पर एंडोथेलिन-1 का उपयोग करके जहाजों का संकीर्तन। वाइल्डटाइप C57/B6 चूहों को 1.5% के 1.5 एमएल के साथ फुलाया जाता है और वाइब्रेटोम का उपयोग करके 130 माइक्रोन में विभाजित किया जाता है। ऊतक का एक ताजा टुकड़ा 400x पर उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के नीचे रखा गया था और केसीएल या एंडोथेलियन-1 का उपयोग करके इलाज किया गया था। आवर्धन: 400x. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस पांडुलिपि में, संवहनी संरचना को संरक्षित करने और प्रयोगात्मक लचीलेपन को अनुकूलित करने वाले मुरीन फेफड़ों के ऊतकों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों का उत्पादन करने के लिए एक बढ़ी हुई विधि का वर्णन किया गया है, विशेष रूप से फेफड़ों के ऊतकों के माइक्रोस्लिकेशन प्राप्त करने के लिए पीसीएलएस के आवेदन का उपयोग करके जिसे संवहनी की संरक्षित संकुचन के साथ तीन आयामों में देखा जा सकता है। व्यवहार्यता अभिकर्ण का उपयोग करना, प्रोटोकॉल दर्शाता है कि ध्यान से तैयार और संरक्षित स्लाइस एक सप्ताह से अधिक के लिए व्यवहार्यता बनाए रख सकते हैं । माइक्रोस्लिक की संरक्षित व्यवहार्यता कई और लंबे समय तक प्रयोगों के लिए संभावना को वैकुलेचर और वायुमार्ग संरचनाओं पर प्रदर्शन करने की अनुमति देती है, जिससे यह कई दवाओं की पूर्व वीवो प्रतिक्रिया का परीक्षण करने, अंतर्निहित आणविक तंत्र का मूल्यांकन करने और परीक्षण अभिकर्षकों का मूल्यांकन करने के लिए एक आदर्श नमूना बन जाता है। यह तैयार नमूनों को वीवो परीक्षणों से पहले संवहनी स्वर पर संभावित चिकित्सीय प्रभावों का अध्ययन करने के लिए आदर्श मंच बनाता है4. पल्मोनरी एयरवे और वैक्यूलेचर के संरक्षण से तैयार नमूनों को इस लेख में वर्णित अनुबंध परीक्षण जैसी अतिरिक्त तकनीकों के साथ इलाज किया जा सकता है और तालिका 1में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। यह फेफड़े के संवहनी रोगों के रोगजनकों में योगदान देने वाले पल्मोनरी वैक्यूलेचर और सिग्नलिंग कैस्केड की स्थानिक व्यवस्था का ब्यौरा देने वाले उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्रदान करने के अवसर के लिए अनुमति देता है।

प्रयोग के लिए ऊतक माइक्रोस्लिक की तैयारी एक तकनीक है जो सटीक-कट ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस का उत्पादन करने के लिए वाइब्रेटोम, या कंपन ब्लेड का उपयोग करती है। यह पारंपरिकतकनीकोंकी तुलना में सटीकता और प्रजनन क्षमता में वृद्धि की अनुमति देता है। पीसीएलएस के साथ प्राप्त फेफड़ों के माइक्रोस्लिक एक सेलुलर स्तर तक फेफड़ों के ऊतकों की शारीरिक संरचना को बनाए रखते हैं, जिससे यह विभिन्न प्रकार के फेफड़े के संवहनी रोगों का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण बन जाता है। इस तकनीक का उपयोग पशु और मानव मॉडल दोनों में जटिल फेफड़ों की शरीर रचना और फेफड़े की विकृति का अध्ययन करने के लिए किया गया है, जिसमें विषाक्त एक्सपोजर, संक्रामक रोगों और इम्यूनोलॉजिकल अध्ययन6,7,8पर विशेष ध्यान दिया गया है। अंतर्निहित रोगविज्ञान के आधार पर, रोग विषमता की तुलना करने के लिए ब्याज के विशिष्ट लोब्स या एक/सभी लोब्स से माइक्रोस्लिक्स प्राप्त किए जा सकते हैं। स्लाइस संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने में कठिनाई में बहुत पतली परिणाम है, जबकि मोटा स्लाइस अतिरिक्त धुंधला या ऊतक इमेजिंग में गहरी प्रदर्शन करने के लिए और अधिक कठिन हो सकता है ।

संवहनी रोग के लिए विशिष्ट, पीसीएलएस का उपयोग फेफड़े की धमनी उच्च रक्तचाप (पीएएच) का अध्ययन करने के लिए किया गया है, जिससे संभावित उपचारों के प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए एक परिष्कृत मॉडल की अनुमति दी गई है9,10,11। मुरीन फेफड़ों के नमूनों में संवहनी संकुचन के संरक्षण में कई चिकित्सीय और जांच लाभ होते हैं। पल्मोनरी वैसकुलेचर की संरचना और संकुचन दोनों को संरक्षित करने वाली तकनीक को शामिल करके, तैयार नमूने पल्मोनरी वैस्कुलर रोग पूर्व वीवोको मॉडल कर सकते हैं। यह अतीत में Rieg एट अल द्वारा प्रदर्शित किया गया है, जो पीसीएलएस नमूनों के साथ प्रदर्शित करने में सक्षम थे कि फेफड़े की नसों a1-agonists और b2-agonists के साथ अधिक संवेदनशील थे, बाएं दिल की विफलता में इन दवाओं के उपयोग का सुझाव फेफड़े की विफलता में वृद्धि फेफड़े एडीमा12का कारण बन सकता है । दवाओं के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इस मॉडल का उपयोग करना, पूर्व वीवो संभावित नैदानिक परीक्षणों के लिए संभावित चिकित्सीय एजेंटों की पहचान करने में मदद करता है। इस पांडुलिपि में, प्रोटोकॉल ऊतक को 10 दिनों के लिए संरक्षित व्यवहार्यता के साथ संभालने और स्टोर करने के तरीकों का वर्णन करता है, जिससे संभावित हस्तक्षेपों के बाद ऊतकों की निगरानी की अनुमति होती है और अधिक प्रायोगिक लचीलापन प्रदान करता है। पिछले अध्ययनों ने अस्थमा मॉडल में वायुमार्ग संकुचन को संरक्षित करने के लिए इसी तरह के तरीके लागू किए हैं, आईएल-13 प्रभाव 15 दिनों तकबने रहे। इम्यूनोस्टेटिंग आरएनए और साइटोकिन्स विभिन्न संवहनी रोगों में रोग प्रगति और विकास के लिए जिम्मेदार अंतर्निहित रोगजनकों की बेहतर समझ का कारण बन सकते हैं। तैयार नमूने तैयार करने के बाद सेल लेबलिंग को बनाए रख सकते हैं, इस पांडुलिपि में टीडीटोमाटो लेबल Cdh5 + एंडोथेलियल कोशिकाओं के संरक्षण के साथ प्रदर्शित किया जाता है। वाइब्रेकोम-तैयार नमूनों में इस तरह के लेबलिंग का संरक्षण संरचना को सेल लेबलिंग के साथ संरक्षित करने की अनुमति देता है, जिससे यह सेल ट्रैकिंग प्रयोगों को करने के लिए एक आदर्श उपकरण बन जाता है। अंत में, तैयार नमूनों को आगे की जांच के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं जैसे कि आरएनए लाइसिस या पश्चिमी दाग इस प्रोटोकॉल में वर्णित अंतर्निहित रोगविज्ञान और रोग प्रगति के कारण तंत्र का अध्ययन करने के लिए।

अन्य तकनीकों के लिए अपने फायदे के बावजूद, पीसीएलएस-तैयार ऊतक की सीमाएं हैं। पीसीएलएस का प्रदर्शन गतिशील फेफड़ों को एक स्थिर स्थिरता में बदल देता है, बायोप्सी के समय फेफड़ों के ऊतकों के भीतर मौजूद कोशिकाओं और अणुओं के समय में एक स्नैपशॉट प्रदान करता है। जब तक कई नमूने प्राप्त नहीं किए जाते हैं, यह आमतौर पर क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी) जैसे कई फेफड़े की बीमारियों में देखी जाने वाली विशाल विषमता के लिए खाता नहीं है। पीसीएलएस से तैयार ऊतक मुख्य रूप से छोटे वायुमार्ग और पोत रोग तक सीमित होते हैं। यह ऊतक संचयन के साथ तकनीकी चुनौतियों के कारण है, क्योंकि श्वासनली आमतौर पर फेफड़ों की मुद्रास्फीति के लिए चीरा जाता है और बड़े ब्रोंची की पहचान और अलग-थलग करना चुनौतीपूर्ण है। ये तकनीकी सीमाएं बड़े ब्रोंची और संचालन वायुमार्ग का अध्ययन करने के लिए पीसीएलएस ऊतक उप-क्षातिमाल का उपयोग करती हैं। गतिशील परीक्षण भी सीमित है, जिससे वेंटिलेटर से जुड़े फेफड़ों की बीमारी और बारोट्रामा का अध्ययन करने के लिए यह आदर्श मंच से कम है। अंत में, पल्मोनोलॉजी के क्षेत्र में पीसीएलएस के आवेदन ने मुख्य रूप से मुरीन फेफड़ों के ऊतकों पर ध्यान केंद्रित किया है, और चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक परिदृश्य में मानव ऊतक पर लागू होने से पहले आगे के परीक्षण और प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है।

संक्षेप में, पांडुलिपि पीसीएलएस मुरीन फेफड़ों के ऊतकों की संवहनी संकुचन को संरक्षित करने के लिए एक पूरक विधि प्रदान करती है, जिसके परिणामस्वरूप 10 दिनों तक पल्मोनरी वैक्यूलेचर की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां होती हैं जिनमें अंतर्जात फ्लोरोसेंट कोशिकाएं और कई अन्य प्रक्रियाएं होती हैं।

तालिका 1: विभिन्न वासोकॉन्स्ट्रिकेटर्स की विशेषता और उपयोग। (* इस अध्ययन में इस्तेमाल किया) कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक डीआरएस युआन हाओ और कैफेंग लियू को उनकी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे । इस काम को एक NIH 1R01 HL150106-01A1, पार्कर बी फ्रांसिस फैलोशिप, और पल्मोनरी उच्च रक्तचाप एसोसिएशन Aldrighetti अनुसंधान पुरस्कार डॉ के युआन को समर्थन दिया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5cc of fractionated heparin in syringe BD 100 USP units per mL
1X PBS Corning  21-040-CM
20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation Cml Supply 90120050D
30cc syringe BD 309650
Anti Anti solution Gibco 15240096
Automated vibrating blade microtome Leica VT1200S
Cell Viability Reagent (alamarBlue) Thermofisher DAL1025
Confocal Zeiss 880
Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep Gibco 10569-010
Endothelin-1 Sigma E7764
KCl Sigma 7447-40-7
Mortar and Pestle Amazon
RIPA lysis and extraction buffer Thermoscientific 89900
Surgical suture 6/0 FST 18020-60
TRIzol Reagent Invitrogen, Thermofisher 15596026
UltraPure Low Melting Point Agarose Invitrogen 16520050
Vibratome Leica Biosystems VT1200 S
Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G BD 25-30G

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References

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चिकित्सा अंक 171
<em>पूर्व वीवो</em> पल्मोनरी वेसल स्ट्रक्चर और कॉन्ट्रैक्टिलिटी स्टडीज के लिए एक कुशल उपकरण के रूप में सटीक कट लंग स्लाइस
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Klouda, T., Kim, H., Kim, J., Visner, G., Yuan, K. Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies. J. Vis. Exp. (171), e62392, doi:10.3791/62392 (2021).

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