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Biology

इन विट्रो E3 सर्वव्यापकिन लिगाज़ समारोह का विश्लेषण

Published: May 14, 2021 doi: 10.3791/62393
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Institute for Genetics and Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne

Summary

वर्तमान अध्ययन E3 सर्वव्यापकता लिगाज़ उत्प्रेरक गतिविधि के विश्लेषण के लिए विट्रो सर्वव्यापकता परख प्रोटोकॉल में विस्तृत प्रदान करता है। रेशेरिचिया कोलाई संस्कृति जैसे प्रोकैरियोटिक सिस्टम का उपयोग करके रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन व्यक्त किए गए थे।

Abstract

सब्सट्रेट प्रोटीन के आंतरिक lysine अवशेषों (एस) के लिए सर्वव्यापक लगाव, सर्वव्यापी कहा जाता है, यूकेरियोटिक जीवों में सबसे महत्वपूर्ण अनुवादात्मक संशोधनों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है। सर्वव्यापकता को तीन एंजाइम वर्गों के अनुक्रमिक झरने द्वारा मध्यस्थता की जाती है जिनमें सर्वव्यापकता-सक्रिय एंजाइम (ई 1 एंजाइम), सर्वव्यापक एंजाइम (E2 एंजाइम), और सर्वव्यापक लिगैस (ई 3 एंजाइम), और कभी-कभी, सर्वव्यापकइन-चेन एल्गोंगेशन कारक (ई 4 एंजाइम) शामिल हैं। यहां, सर्वव्यापकता परख के लिए इन विट्रो प्रोटोकॉल प्रदान किए जाते हैं, जो E3 सर्वव्यापकता लिगाज़ गतिविधि के आकलन, E2-E3 जोड़े के बीच सहयोग, और सब्सट्रेट चयन की अनुमति देते हैं। सहयोग E2-E3 जोड़े मुक्त पाली-सर्वव्यापकता श्रृंखला की पीढ़ी की निगरानी और/या E3 ligase के ऑटो सर्वव्यापकता द्वारा जांच की जा सकती है । सब्सट्रेट सर्वव्यापकता को E3 ligase के चयनात्मक बाध्यकारी द्वारा परिभाषित किया गया है और इन विट्रो प्रतिक्रिया के पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा पता लगाया जा सकता है। इसके अलावा, एक E2 ~ Ub निर्वहन परख वर्णित है, जो कार्यात्मक E2-E3 सहयोग के प्रत्यक्ष आकलन के लिए एक उपयोगी उपकरण है । यहां, सर्वव्यापकता के E3-निर्भर हस्तांतरण को इसी E2 एंजाइम से मुफ्त में लिसिन अमीनो एसिड (नकल करने वाले सब्सट्रेट सर्वव्यापकता) या ई 3 लिगाज़ के आंतरिक लिसिन (ऑटो-सर्वव्यापकता) पर पीछा किया जाता है। अंत में, तीन अलग-अलग इन विट्रो प्रोटोकॉल प्रदान किए जाते हैं जो E3 लिगाज़ उत्प्रेरक कार्यक्षमता को संबोधित करने के लिए तेजी से और आसान प्रदर्शन करने के लिए हैं।

Introduction

सर्वव्यापकता वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा यूबी को सब्सट्रेट प्रोटीन 1 से सहसंबद्ध रूप से जोड़ाजाताहै । यूबी संशोधन को लगातार एंजाइम वर्गों, यानीयूबी-एक्टिवेट एंजाइम (E1s), यूबी-कंजूगेटिंग एंजाइम (E2s), यूबी लिगिस (E3s), और संभवतः यूबी चेन स्फूर्ति कारकों (E4s)2,3,4,5की कार्रवाई से जुड़े द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है। एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) और मैग्नीशियम (एमजी2+)के बाद- ई 1 द्वारा यूबी की निर्भर सक्रियता, ई1 की सक्रिय साइट सिस्टीन यूबी के सी-टर्मिनल ग्लाइसिन पर हमला करती है, जो एक थिओएस्टर कॉम्प्लेक्स (यूबी ~ ई 1) बनाती है। एटीपी हाइड्रोलिसिस से तैयार ऊर्जा यूबी को एक उच्च ऊर्जा संक्रमणकालीन स्थिति प्राप्त करने का कारण बनती है, जिसे पूरे निम्नलिखित एंजाइम झरना में बनाए रखा जाता है। इसके बाद, ई 2 एंजाइम सक्रिय यूबी को अपने आंतरिक उत्प्रेरक सिस्टीन में स्थानांतरित करता है, जिससे क्षणिक यूबी ~ ई 2 थिओस्टर बॉन्ड बन जाता है। इसके बाद, यूबी को सब्सट्रेट प्रोटीन में स्थानांतरित कर दिया जाता है।

यह दो तरह से किया जा सकता है। या तो E3 ligase पहले E2 के लिए बाध्य कर सकते हैं, या E3 ligase सीधे यूबी बांध सकते हैं । बाद के रास्ते एक E3 ~ Ub मध्यवर्ती के गठन में परिणाम है । किसी भी मामले में, यूबी को यूबी के सी-टर्मिनल कार्बोक्सिल समूह और सब्सट्रेट 6 के लिसाइन Ɛ-अमीनो समूह के बीच आइसोपेटाइड बॉन्ड के गठन से सब्सट्रेट प्रोटीन से जोड़ाजाताहै। मानव जीनोम दो E1s, लगभग 40 E2s, और 600 से अधिक ख्यात सर्वव्यापकाइन li गैसों7encodes। E3 के यूबी हस्तांतरण तंत्र के आधार पर, यूबी लि गैसों को तीन श्रेणियों में विभाजित किया गया है जिसमें E6AP सी-टर्मिनस (हेक्ट))- प्रकार, वास्तव में दिलचस्प नए जीन (रिंग) /यू-बॉक्स-प्रकार, और रिंग (आरबीआर) के बीच रिंग (आरबीआर) प्रकार लीगैसों 8के मुताबिक़ शामिल हैं। इस अध्ययन में, एचएससी 70-इंटरैक्टिंग प्रोटीन (चिप) के लिगाज़, कार्बोक्सिल टर्मिनस युक्त यू-बॉक्स का उपयोग प्रतिनिधि E3 एंजाइम के रूप में किया जाता है। एचईसीटी-प्रकार के ई 3 एंजाइमों के विपरीत जो यूबी ~ E3 थिओएस्टर्स बनाते हैं, चिप का यू-बॉक्स डोमेन E2 ~ यूबी को बांधता है और बाद में यूबी/सब्सट्रेट ट्रांसफर को सीधे E2 एंजाइम8,9से बढ़ावा देता है। एंजाइमेटिक फ़ंक्शन के लिए यू-बॉक्स के महत्व के आधार पर, एक निष्क्रिय चिप यू-बॉक्स उत्परिवर्ती, चिप (H260Q), एक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है। चिप (H260Q) अपने कॉग्नेट E2s को बांधने में विफल रहता है, इस प्रकार अपनी E3 ligase गतिविधि10खोने ।

प्रोटीन सर्वव्यापकता यूकेरियोटिक कोशिकाओं में सेलुलर घटनाओं की एक भीड़ को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सेलुलर परिणामों की विविधता है कि यूबी अणुओं के रिवर्सिबल लगाव द्वारा प्रोटीन सब्सट्रेट करने के लिए पदोंनत कर रहे है यूबी की आणविक विशेषताओं के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । चूंकि यूबी में ही आगे सर्वव्यापकता के लिए सात lysine (K) अवशेष होते हैं, इसलिए विभिन्न आकारों और/या टोपोलॉजी11के साथ यूबी चेन-प्रकारों की समृद्ध विविधता है । उदाहरण के लिए, सब्सट्रेट्स को एक (मोनो-सर्वव्यापकता) या मल्टीपल लिसाइन (मल्टी मोनो-सर्वव्यापकता) पर एक ही यूबी अणु द्वारा संशोधित किया जा सकता है, और यहां तक कि यूबी चेन (पॉली-सर्वव्यापकता)11द्वारा भी। यूबी चेन या तो यूबी के समान या विभिन्न lysine अवशेषों के माध्यम से होमो-या विषम रूप से गठित किए जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप शाखाबद्ध यूबी चेन9भी हो सकती है। इस प्रकार, प्रोटीन सर्वव्यापकता से यूबी अणुओं की विविध व्यवस्थाएं होती हैं, उदाहरणके लिए, संयुग्मित प्रोटीन12, 13के क्षरण, सक्रियण या स्थानीयकरण के लिए विशिष्ट जानकारी प्रदान करते हैं। ये विभिन्न यूबी सिग्नल सेलुलर सिग्नलिंग रास्तों के तेजी से पुनर्प्रोग्रामिंग को सक्षम करते हैं, जो बदलती पर्यावरणीय जरूरतों का जवाब देने की कोशिका की क्षमता के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है।

सर्वव्यापकता का एक केंद्रीय पहलू प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण से संबंधित है। गलत ढंग से क्षतिग्रस्त या अपरिवर्तनीय रूप से क्षतिग्रस्त प्रोटीन को अपमानित किया जाना चाहिए और उसकी जगह नए संश्लेषित प्रोटीन द्वारा प्रोटीन होरोस्टेसिस या प्रोटेओस्टेसिस14को बनाए रखने के लिए किया जाना चाहिए । गुणवत्ता नियंत्रण E3 ligase, चिप, क्षतिग्रस्त प्रोटीन9,15, 16, 17के यूबी-निर्भर क्षरण में आणविक चैपरोन के साथ सहयोग करता है। इसके अलावा, चिप मायोसिन-निर्देशित चैपरवन, यूएनसी-45बी (यूएनसी-45 होमोलॉग बी) की स्थिरता को नियंत्रित करता है, जो मांसपेशियों के कार्य और इष्टतम स्तरों से विचलन के साथ कसकर समन्वित होता है जिससे मानव मायोपैथी18,19,20, 21होजातीहै। 26S प्रोटेसोम द्वारा यूएनसी-45बी का क्षरण K48-लिंक्ड पॉली-यूबी चेन9के लगाव से मध्यस्थता की जाती है । सब्सट्रेट प्रोटीन के अभाव में, चिप ऑटो-सर्वव्यापकता10,22,23करता है, जो रिंग/यू-बॉक्स E3 सर्वव्यापी लिगिस24, 25की विशेषता है और लिगाज़ गतिविधि को विनियमित करने के लिए विचार कियाजाता है26। इस पेपर में वर्णित इन विट्रो सर्वव्यापकता परख विधियों के आवेदन ने E2 एंजाइमों की व्यवस्थित रूप से पहचान करने में मदद की जो चिप के साथ मुक्त पॉली-यूबी चेन और/या ऑटो-सर्वव्यापकता चिप (प्रोटोकॉल धारा 2) के गठन को बढ़ावा देने के लिए टीम करते हैं । इसके अलावा, यूएनसी-45B के चिप-निर्भर सर्वव्यापकता देखी गई, जो E3 ligase18, 19 (प्रोटोकॉल धारा 3) का एक ज्ञात सब्सट्रेट है। अंततः, यूबी ~ E2 थिओस्टर से सक्रिय यूबी के चिप-निर्भर हस्तांतरण की निगरानी की गई (प्रोटोकॉल धारा 4)।

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Protocol

1. बफ़र्स और रिएजेंट्स की तैयारी

नोट: प्रयोगशाला में मैन्युअल रूप से तैयार किए गए बफर और रिएजेंट नीचे सूचीबद्ध हैं। प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अन्य सभी बफ़र्स और रिएजेंट विभिन्न स्रोतों से खरीदे गए थे और निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार उपयोग किए जाते थे।

  1. 10x फॉस्फेट-बफर खारा (10x पीबीएस) तैयार करें। इस उद्देश्य के लिए, मिक्स 1.37 मीटर सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल), 27 एमएम पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल), 80 एमएम डिसोडियम-हाइड्रोजन-फॉस्फेट डिहाइड्रेट(एनए 2एचपीओ4.2 एच2ओ), और 20 m m पोटेशियम-डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट (केएच 2 पीओ4)डबल-डिस्टिल्ड एच2ओ (डीडीएच2ओ) के1एल में। 10x पीबीएस को ऑटोक्लेव करें, और डीडीएच2ओ में 1x पीबीएस समाधान तैयार करें।
    1. ऑटोक्लेविंग 121 डिग्री सेल्सियस और 98.9 केपीए पर 15 मिनट के लिए किया जाता है।
      नोट: ऑटोक्लेविंग सभी बफ़र्स और समाधानों के लिए इन शर्तों के तहत किया जाता है। यदि अन्यथा संकेत नहीं दिया जाता है, तो समाधान कमरे के तापमान (आरटी) पर संग्रहीत किए जाते हैं।
  2. 1x PBS के 1 एल में 0.1% ट्वीन जोड़कर पीबीएस-ट्वीन (पीबीएस-टी) समाधान के 1 एल तैयार करें।
  3. डीडीएच2ओ अलीकोट एल-लिसिन में एल-लिसिन को 1 मिलील हिस्सों में भंग करके 0.5 एम एल-लिसिन स्टॉक सॉल्यूशन की 10 एमएल तैयार करें, और आगे के उपयोग तक उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: एल-lysine जमे हुए और बार गल जा सकता है ।
  4. डीडीएच2 ओ के 200 एमएल में EDTA को भंग करके 0.25 एम एथिलीन डायमाइन टेट्रा एसिटिक एसिड (EDTA) समाधान तैयार करें।
    1. सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) के साथ पीएच को 8.0 तक समायोजित करें।
    2. मात्रा को डीडीएच 2 ओ के साथ250 एमएलमें समायोजित करें।
    3. समाधान को ऑटोक्लेव करें।
  5. 200 माइक्रोल एलिकॉट में डीडीएच 2 ओ स्टोर में बीएसए को भंग करके20मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) समाधान की 10 एमएल तैयार करें।
    नोट: बीएसए को बार-बार जम सकता है और गल सकता है।
  6. 50 एमएम एमईएस, 50 एमएम ट्रिस बेस, 3.47 एमएम सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) और 1.03 एमएम ईडीटीए को भंग करके 2-(एन-मॉर्फोलिनो) एथेन सल्फोनिक एसिड (एमईएस) रनिंग बफर तैयार करें। ठीक से मिलाने के बाद वॉल्यूम को 1 एल में एडजस्ट करें।
    1. 1x बफर का पीएच 7.6 है। पीएच को एसिड या बेस के साथ एडजस्ट न करें।
  7. 1x पीबीएस-टी में 10 ग्राम मिल्क पाउडर घोलकर ब्लॉकिंग सॉल्यूशन (5% दूध) का 200 एमएल तैयार करें। अवरुद्ध समाधान को एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. निर्माताओं के निर्देश के अनुसार 1 एल ट्रांसफर बफर (सामग्री की तालिकादेखें) तैयार करें।
  9. 125 mM Tris बेस, 4% एसडीएस, 4% ग्लाइसरोल, 0.03% ब्रोमोफेनॉल ब्लू, और 50 μL/50 μL/ml में β-mercaptoethanol के 50 mL ddH2O. Aliquot 1 mL भागों में भंग करके, और -20 सी पर स्टोर द्वारा तैयार करें ।

2. इन विट्रो ऑटो-सर्वव्यापकता परख

  1. परख की तैयारी और निष्पादन
    1. प्रोटीन की दी गई मोलरिटीज और प्रोटीन समाधानों की प्रोटीन सांद्रता के आधार पर प्रति प्रतिक्रिया आवश्यक प्रत्येक अभिवात की मात्रा की गणना करें। ऑटो-सर्वव्यापकता प्रतिक्रिया के अनुसार, 100 एनएम E1, 1 μM E2, 1 μM E3, और 50 μM Ub का उपयोग करें। डीएच 2 ओ के साथ 20माइक्रोन की प्रतिक्रिया की मात्रा को समायोजित करें।
      नोट: एटीपी समाधान और सर्वव्यापकता बफर को 10x स्टॉक समाधान के रूप में खरीदा गया था और 1x पर उपयोग किया गया था।
    2. सभी प्रतिक्रियाओं के लिए एक पाइपिंग योजना तैयार करें। चिप के साथ कार्य करने की क्षमता (I) के लिए नौ अलग-अलग ई 2 एंजाइमों का परीक्षण करें, (II) एक उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय चिप (H260Q) उत्परिवर्ती के साथ, और (III) व्यक्तिगत सर्वव्यापकता प्रतिक्रियाओं में चिप के बिना।
    3. पाइपिंग त्रुटियों से बचने के लिए, बर्फ पर एक मास्टर मिश्रण तैयार करें जिसमें सभी प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक मात्रा और एक अतिरिक्त प्रतिक्रिया शामिल है। प्रति प्रतिक्रिया आवश्यक मास्टर मिश्रण की मात्रा की गणना करें।
      नोट: मास्टर मिक्स कंपोनेंट्स ऐसे रिएजेंट होते हैं जो प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए समान रूप से आवश्यक होते हैं, यानी, E1, E3, Ub, एटीपी, और सर्वव्यापकता बफर।
    4. पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) ट्यूब में डीडीएच2ओ और मास्टर मिक्स जोड़ें। ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
    5. E2 एंजाइमों को जोड़कर सर्वव्यापकता प्रतिक्रियाओं को शुरू करने से पहले, निम्नलिखित कार्यक्रम के साथ एक पीसीआर थर्मल साइकिलर स्थापित करें: 2 घंटे, 37 डिग्री सेल्सियस इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस, असीम रूप से।
    6. संबंधित ट्यूबों में E2 एंजाइमों के 1 μM जोड़ें, और समय की इंगित अवधि के लिए पीसीआर थर्मल साइकिलर में नमूनों को इनक्यूबेट ।
    7. 2 घंटे के बाद, प्रत्येक प्रतिक्रिया में एसडीएस नमूना बफर जोड़ें, और कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं।
      नोट: नमूना बफर की आवश्यक मात्रा नमूना बफर के स्टॉक एकाग्रता पर निर्भर करती है। यहां, प्रत्येक प्रतिक्रिया में 2x एसडीएस नमूना बफर के 20 माइक्रोल जोड़े गए थे।
    8. नमूनों को तुरंत 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालें, और पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (पेज) जारी रखें। विकृत प्रोटीन को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और पश्चिमी दाग
    1. विगलन के बाद, लगभग 10 एस के लिए नमूनों को स्पिन करें और एसडीएस-पेज जेल लोड करें। आकार संदर्भ के रूप में एक प्रोटीन सीढ़ी का प्रयोग करें।
      नोट: यहां, 4-12% बीआईएस-ट्रिविंट जैल और प्रोटीन सीढ़ी के 3 माइक्रोन का उपयोग किया गया था। नमूना मात्रा को विभाजित करें और प्रत्येक नमूने के 20 माइक्रोन का उपयोग करके समान रूप से दो जैल लोड करें।
    2. लगभग 30-45 मिनट के लिए 160-200 वी पर जेल चलाएं ताकि नमूना सामने जेल के नीचे तक पहुंच जाए।
    3. प्रत्येक जेल को सेमीड्री ब्लॉटिंग बफर से भरे प्लास्टिक कंटेनर में स्थानांतरित करें, और इसे आरटी में 2-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। स्टैकिंग जेल को हटा दें।
    4. जेल के आकार के ब्लॉटिंग पेपर के दो टुकड़े और एसडीएस जेल प्रति जेल आकार की नाइट्रोसेल्यूलोस झिल्ली तैयार करें और सेमीड्री ब्लॉटिंग बफर में प्री-सोख लें। निम्नलिखित क्रम में नीचे से ऊपर तक एक पश्चिम बंगाल कक्ष में पश्चिमी दाग (डब्ल्यूबी) सैंडविच को इकट्ठा करें: ब्लॉटिंग पेपर, नाइट्रोसेल्यूलोस झिल्ली, एसडीएस-पेज जेल, ब्लॉटिंग पेपर।
    5. सैंडविच परतों के बीच फंस गया हो सकता है कि हवा बुलबुले निकालें। इस उद्देश्य के लिए, सैंडविच पर ध्यान से रोल करने के लिए एक रोलर का उपयोग करें।
    6. कक्ष को बंद करें, और अतिरिक्त दाग बफर को बाहर निकालने की अनुमति दें।
    7. कक्ष को संबंधित ब्लॉटिंग डिवाइस में रखें, और सेमीड्री ब्लॉटिंग के लिए निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करें: 25 वी, 1.0 ए, 30 मिनट।
    8. ब्लॉकिंग समाधान से भरे प्लास्टिक कंटेनर में ब्लॉट्ड झिल्ली को स्थानांतरित करें, और आरटी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    9. एक अवरुद्ध अभिवाक युक्त पीबीएस-टी के 10 एमएल में एंटीबॉडी जोड़कर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
      नोट: एंटीबॉडी की काम कर रही एकाग्रता एंटीबॉडी-विशिष्ट है। इस मामले में, 1:5,000 के कमजोर पड़ने पर एक मोनोक्लोनल माउस एंटी-सर्वव्यापकता एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। दूसरे जेल के लिए पीबीएस-टी/ब्लॉकिंग रिएजेंट में 1:5,000 पर मोनोक्लोनल खरगोश एंटी-चिप एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया ।
    10. अवरुद्ध समाधान को प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ बदलें, और एक घुमाव पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    11. पीबीएस-टी के साथ 10 मिनट के लिए झिल्ली को तीन बार धोएं।
    12. पीबीएस-टी के 10 एमएल में संबंधित एंटीबॉडी को जोड़कर सेकेंडरी एंटीबॉडी सॉल्यूशन तैयार करें।
      नोट: यहां, बकरी विरोधी माउस और माउस विरोधी खरगोश एंटीबॉडी 1:10,000 के एक कमजोर पड़ने पर उपयोग किया जाता है ।
    13. एक घुमाव पर आरटी में 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
    14. पीबीएस-टी के साथ 5 मिनट के लिए झिल्ली को तीन बार धोएं।
  3. डेटा विश्लेषण
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार धोई गई झिल्ली में सहिजन पेरोक्सिडेज (एचआरपी) के लिए पश्चिमी दाग का पता लगाने वाले अभिकर्मक जोड़ें, और एक्स-रे फिल्मों या चार्ज-युग्मित डिवाइस कैमरा(चित्रा 1)का उपयोग करके एचआरपी सिग्नल को कैप्चर करें।

3. इन विट्रो सब्सट्रेट सर्वापितव्य परख

  1. परख की तैयारी और निष्पादन
    1. प्रोटीन की दी गई मोलरिटी और प्रोटीन समाधानों की प्रोटीन सांद्रता के आधार पर प्रति प्रतिक्रिया आवश्यक प्रत्येक अभिवाक की मात्रा की गणना करें। सब्सट्रेट सर्वागीण प्रतिक्रिया के अनुसार, 100 एनएम E1, 1 μM E2, 1 μM E3, 1 μM सब्सट्रेट, और 50 माइक्रोन यूबी का उपयोग करें। 1x पर 10x एटीपी सॉल्यूशन और 10x सर्वव्यापकता बफर का उपयोग करें। डीएच2 ओ के साथ 20 माइक्रोन के लिए सब्सट्रेट सर्वव्यापकता प्रतिक्रिया की मात्रा को समायोजित करें।
    2. सभी प्रतिक्रियाओं के लिए एक पाइपिंग योजना तैयार करें। उचित नियंत्रण प्रतिक्रियाओं को शामिल करें जो यह सत्यापित करते हैं कि सब्सट्रेट सर्वव्यापकता E3-विशिष्ट है। चिप के प्रतिनिधि सब्सट्रेट और एक नियंत्रण के रूप में उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय चिप उत्परिवर्ती (H260Q) के रूप में प्रोटीन यूएनसी-45B का उपयोग करें। निम्नलिखित प्रतिक्रियाओं को तैयार करें: E1, E2, यूबी मिक्स (यूबी, एटीपी, सर्वव्यापकता बफर सहित); E1, E2, यूबी मिक्स, यूएनसी-45B; E1, E2, यूबी मिक्स, चिप (H260Q), UNC-45B; और E1, E2, यूबी मिक्स, चिप, यूएनसी-45B।
    3. पाइपिंग त्रुटियों से बचने के लिए, बर्फ पर एक मास्टर मिश्रण तैयार करें जिसमें सभी प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक मात्रा और एक अतिरिक्त प्रतिक्रिया शामिल है। मास्टर मिश्रण है कि प्रतिक्रिया के प्रति आवश्यक है की मात्रा की गणना करें।
      नोट: इस परख के लिए मास्टर मिश्रण घटकों में E1, E2, यूबी, एटीपी और सर्वव्यापकता बफर शामिल हैं।
    4. निम्नलिखित क्रम में प्रतिक्रिया घटक जोड़ें: डीडीएच2ओ, सब्सट्रेट, ई 3 लिगाज़।
    5. मास्टर मिश्रण के अलावा सर्वव्यापी प्रतिक्रिया शुरू करने से पहले, निम्नलिखित कार्यक्रम के साथ एक पीसीआर थर्मल साइकिलर स्थापित करें: 2 घंटे, 37 डिग्री सेल्सियस 4 डिग्री सेल्सियस के बाद, असीम रूप से।
    6. प्रत्येक ट्यूब में मास्टर मिश्रण जोड़ें, और पीसीआर थर्मल साइकिलर में नमूनों को इंगित अवधि के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. 2 घंटे के बाद, प्रत्येक प्रतिक्रिया में 2x एसडीएस नमूना बफर जोड़ें, और कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं।
    8. चलाने के बाद, नमूनों को तुरंत 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालें, और पेज जारी रखें। वैकल्पिक रूप से, -20 डिग्री सेल्सियस पर विकृत प्रोटीन स्टोर करें।
  2. जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और पश्चिमी दाग
    1. धारा 2.2 में वर्णित जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और पश्चिमी दाग का प्रदर्शन करें। क्रमशः सब्सट्रेट और ई 3 लिगाज़ का पता लगाने के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करें।
      नोट: यहां, यूएनसी-45B को सी-माइक जीन उत्पाद से प्राप्त पॉलीपेप्टाइड प्रोटीन टैग से जोड़ा गया है जो मोनोक्लोनल माउस एंटी-माईसी एंटीबॉडी के उपयोग के लिए अनुमति देता है। एंटी-MYC का उपयोग 1:10,000 पर किया जाता है।
  3. डेटा विश्लेषण
    1. धारा 2.3(चित्रा2) में वर्णित डेटा विश्लेषण करें।

4. Lysine निर्वहन परख

  1. परख की तैयारी और निष्पादन
    1. E1 द्वारा यूबी के साथ E2 एंजाइम का चार्ज
      1. प्रोटीन की दी गई मोलरिटीज और प्रोटीन समाधानों की प्रोटीन सांद्रता के आधार पर प्रति प्रतिक्रिया आवश्यक प्रत्येक अभिवात की मात्रा की गणना करें। चार्जिंग रिएक्शन के अनुसार, 2 माइक्रोन ई 1, 4 माइक्रोन ई 2, और 4 μM lysine-मुक्त सर्वव्यापी (Ub K0) का उपयोग करें। 1x पर 10x एटीपी और 10x सर्वव्यापकता बफर का प्रयोग करें। चार्जिंग रिएक्शन की मात्रा को डीडीएच 2 0 के साथ20माइक्रोल में समायोजित करें।
        नोट: lysine मुक्त Ub K0 उत्परिवर्ती मोनो-सर्वव्यापक E2 के विशेष उत्पादन को लागू करने के लिए प्रयोग किया जाता है । जंगली प्रकार यूबी भी इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, इससे विविध E2 ~ यूबी संशोधन(उदाहरण के लिए,E2 के पॉली-सर्वव्यापकता) हो सकते हैं, जिनका विश्लेषण करना अधिक कठिन है। पहली बार उपयोग के लिए या जब एक नए E2 एंजाइम का उपयोग कर, E2 पर Ub चार्ज के स्तर का निर्धारण है कि E1 द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । चार्जिंग की उपज निर्धारित करने के लिए, Coomassie धुंधला के माध्यम से आरोप लगाया E2 बनाम अनचार्ज्ड कल्पना । यहां, यूबी 2डी2 और यूबी के0(पूरक चित्रा S2A)के सममोल अनुपात का उपयोग करते समय यूबी के0 का लगभग आधा हिस्सा मज़बूती से UBE2D2 ~ यूबी में परिवर्तित हो गया था।
      2. चार्जिंग रिएक्शन के लिए एक पाइपिंग स्कीम तैयार करें। पसंद की बाद की निर्वहन प्रतिक्रियाओं के लिए चार्जिंग प्रतिक्रिया की मात्रा को समायोजित करें, उदाहरण के लिए,व्यक्तिगत निर्वहन प्रतिक्रियाओं में चिप और चिप (H260Q) का उपयोग करें। इस प्रकार, एक चार्जिंग रिएक्शन की दोगुनी मात्रा तैयार करें।
        नोट: पहली बार उपयोग के लिए, इष्टतम निर्वहन स्थितियों की निगरानी करने के लिए पसंद के E3 ligase की विभिन्न सांद्रता का परीक्षण करें, और पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा उनका विश्लेषण करें। एक आदर्श स्थिति में, E2 से यूबी का निर्वहन समय के साथ बढ़ेगा जब तक कि संबंधित E2 ~ यूबी प्रोटीन बैंड गायब नहीं हो जाता।
      3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए चार्जिंग रिएक्शन को इनक्यूबेट करें।
    2. चार्जिंग प्रतिक्रिया की समाप्ति
      1. १.८ यू/एमएल की अंतिम एकाग्रता पर apyrase के अलावा द्वारा चार्ज प्रतिक्रिया बंद करो । आरटी में 5 मिनट के लिए एपरैसे के साथ इनक्यूबेशन को पूरा करें, इसके बाद 30 mm की अंतिम एकाग्रता पर EDTA को जोड़ा जाए। डीडीएच2ओ के साथ 30 माइक्रोन के लिए चार्जिंग रिएक्शन की मात्रा को समायोजित करें।
        नोट: एप्रासे का उपयोग एटीपी अणुओं को एडीपी (एडेनोसाइन डिफोस्फेट) अणुओं में परिवर्तित करने के लिए किया जाता है। चूंकि ई 1 एंजाइम की गतिविधि एटीपी-निर्भर है, इसलिए E1 अब E2 को चार्ज नहीं कर सकता है। EDTA का अतिरिक्त उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है कि ई 1 को एमई 1 के लिए आवश्यक सह-कारकों को बुझाने के लिए एमजी2 + आयनों को बुझाने से हिचकाया जाता है। प्रतिक्रिया को रोकने के लिए आवश्यक एपरैसे की मात्रा परख स्थितियों के बीच भिन्न हो सकती है। हालांकि अकेले एपरेज़ पहले से ही उपलब्ध एटीपी अणुओं quenches, apyrase और EDTA का एक संयोजन E1-UBE2D2 जोड़ी के लिए चार्ज प्रतिक्रिया को रोकने में अधिक प्रभावी था । प्रतिक्रिया को रोकना परख प्रजनन क्षमता के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है, नए E1-E2 जोड़े के लिए कुशल रोक का परीक्षण किया जाना चाहिए। इस उद्देश्य के लिए, एक चार्जिंग प्रतिक्रिया सेट करें, इसे रोकें, और विशिष्ट समय बिंदुओं पर नमूने एकत्र करें, उदाहरण के लिए,2, 5, 10 और 15 मिनट के बाद। E2 ~ Ub के गैर-बदलते स्तरों से संकेत मिलता है कि प्रतिक्रिया बंद हो गई है, और उस अवधि के दौरान थिओस्टर स्थिर था(पूरक चित्रा S2B)।
    3. E3 द्वारा E2 ~ Ub का निर्वहन
      1. विभिन्न समय बिंदुओं (टी0, टी1, टी2, टी3)के अनुरूप चार ट्यूब तैयार करें; प्रत्येक ट्यूब में गैर-कमिंग नमूना बफर (4x लिथियम डॉडेक्सिल सल्फेट (एलडीएस) बफर के 6.7 माइक्रोन जोड़ें।
        नोट: नमूना बफर में कम करने वाले एजेंट का उपयोग न करें।
      2. टी 0 के लिए बंद चार्ज रिएक्शन से 6माइक्रोननिकालें, और मात्रा को डीडीएच 2 ओ के साथ20माइक्रोल में समायोजित करें।
      3. टी 0 के नमूने को 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
        नोट: इनक्यूबेशन समय का विस्तार करके नमूना उबालें नहीं क्योंकि थिओस्टर उच्च तापमान पर प्रयोगशाला हैं।
      4. डिस्चार्ज रिएक्शन के अनुसार आवश्यक प्रत्येक अभिवाक की मात्रा की गणना करें। चार्ज किए गए ई2 के शेष 24 माइक्रोन का उपयोग करें, और 10 mM एल-lysine, 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर बीएसए, और E3 ligase के ५०० एनएम जोड़ें । 1x पर सर्वव्यापकता बफर का उपयोग करें, और मात्रा को डीएच2ओ के साथ 80 माइक्रोन में समायोजित करें।
      5. सभी निर्वहन प्रतिक्रियाओं के लिए एक पाइपिंग योजना तैयार करें, और चिप (डब्ल्यूटी) के अलावा नियंत्रण के रूप में चिप (H260Q) का उपयोग करें।
      6. निम्नलिखित क्रम में आवश्यक घटकों को जोड़कर बर्फ पर डिस्चार्ज प्रतिक्रियाएं सेट करें: डीएच2ओ, सर्वव्यापकता बफर, बीएसए, लिसिन, E3 ligase, और प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए चार्ज E2।
      7. आरटी में डिस्चार्ज रिएक्शन को इनक्यूबेट करें ।
      8. संबंधित नमूना ट्यूबों में डिस्चार्ज रिएक्शन के 20 माइक्रोन स्थानांतरित करके 5, 30 और 60 मिनट के बाद नमूने लें।
        नोट: डिस्चार्ज की उचित निगरानी के लिए अनुमति देने वाले उपयुक्त समय बिंदु E2-E3 जोड़े के बीच भिन्न हो सकते हैं।
      9. भंवर नमूना तुरंत, और 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
      10. सीधे पेज के साथ आगे बढ़ें।
        नोट: E2 ~ Ub थिओस्टर्स नमूना बफर में denaturing के बाद भी प्रयोगशाला हो सकता है । इस प्रकार, परख निष्पादन के बाद सीधे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस किया जाना चाहिए।
  2. जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और पश्चिमी दाग
    1. धारा 2.2 में वर्णित जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और पश्चिमी ब्लॉटिंग का प्रदर्शन करें। यूबी-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करें और यदि उपलब्ध हो, तो एक ई 3-विशिष्ट एंटीबॉडी का भी उपयोग करें जो एक अलग प्रजाति में उठाया गया था, जिससे यूबी और E3 लीगाज़ सिग्नल का एक साथ पता लगाने की अनुमति मिलती है।
  3. डेटा विश्लेषण
    1. धारा 2.3(चित्र3) में वर्णित डेटा विश्लेषण करें।

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Representative Results

सर्वव्यापक लिगास चिप के साथ सहयोग करने वाले E2 एंजाइमों की पहचान करने के लिए, E2 उम्मीदवारों के एक सेट का परीक्षण व्यक्तिगत इन विट्रो सर्वव्यापकता प्रतिक्रियाओं में किया गया था। सहयोग E2-E3 जोड़े E3-निर्भर सर्वव्यापकता उत्पादों के गठन, यानी,E3 ligase के ऑटो सर्वव्यापकता और मुक्त Ub बहुलक के गठन के गठन के द्वारा निगरानी की गई । सर्वव्यापकता उत्पादों का विश्लेषण पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा किया गया था। डेटा व्याख्या आणविक वजन मार्कर के साथ परिणामस्वरूप प्रोटीन बैंड के आकार की तुलना पर आधारित है। प्रोटीन सर्वव्यापकता 8.6 केडीए (एक एकल यूबी अणु का आकार) के संबंधित आकार अंतर के साथ डबल बैंड या कई पुनरावृत्ति बैंड की उपस्थिति की विशेषता वाले विशिष्ट बैंड पैटर्न के गठन की ओर जाता है।

यहां, सर्वव्यापकता उत्पादों के गठन को बढ़ावा देने के लिए नौ E2s की क्षमता का परीक्षण जंगली प्रकार की चिप(चित्रा 1A),निष्क्रिय यू-बॉक्स उत्परिवर्ती चिप (H260Q)(चित्रा 1B)या चिप(पूरक चित्रा S1)के बिना की उपस्थिति में किया गया था । ई 3-स्वतंत्र सर्वव्यापकता उत्पादों का गठन निष्क्रिय चिप की उपस्थिति में और चिप(चित्रा 1B और पूरक चित्रा S1)की अनुपस्थिति में किया गया था। निष्क्रिय चिप ऑटो-सर्वव्यापक(चित्रा 1B)नहीं था। इसके विपरीत, यूबीई2डी परिवार (डी 1-डी 3) के सदस्यों और यूबीई 2ई परिवार (E1, E3) के सदस्यों के साथ संयुक्त होने पर जंगली-प्रकार की चिप को क्रमशः(चित्रा 1 ए,लेन 3, 4 और 5) के सदस्यों के साथ संयुक्त किया गया था। जबकि यूबी2डी1-3 के सहयोग से मुफ्त पॉली-यूबी चेन का उत्पादन किया गया था, यह क्रमशः UBE2E1 या UBE2E3 के लिए नहीं पता चला था(चित्रा 1A,लेन 6 और 7)।

यूबी2डी परिवार की मुक्त यूबी पॉलिमर के गठन और चिप के ऑटो-सर्वव्यापकता दोनों को बढ़ावा देने की क्षमता को ई27, 28की पीठ पर एक गैर-सहसंयोजक सर्वव्यापक बाध्यकारी साइट की उपस्थिति के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है। इसी तरह, UBE2N/V1(चित्रा 1A,लेन 9) द्वारा मुक्त यूबी चेन के अनन्य गठन को एक विशिष्ट UBE2V1 उपइकाई (Uev subunit) द्वारा यूबी के बाध्यकारी के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है, जो K63-लिंक्ड यूबी चेन29के गठन का निर्देशन करता है । UBE2C1 और UBE2H(चित्रा 1A,लेन 2 और 8) की उपस्थिति में कोई सर्वव्यापकता उत्पाद नहीं बनाए गए थे। अंत में, चिप विट्रो मेंकई E2 एंजाइमों के साथ सहयोग कर सकते हैं; हालांकि, इसका ऑटो-सर्वव्यापकता E2 एंजाइम-विशिष्ट है।

इसके बाद, UBE2D2-CHIP जोड़ी का उपयोग चिप लिगाज़ गतिविधि(चित्रा 2)द्वारा मायोसिन निर्देशित चैपरोन, यूएनसी-45B के सर्वव्यापकता की जांच करने के लिए किया गया था। सब्सट्रेट सर्वव्यापकता का विश्लेषण पश्चिमी ब्लॉटिंग के माध्यम से किया गया था। गैर-सर्वव्यापक यूएनसी-45बी का आणविक वजन 103 केडीए(चित्रा 2,लेन 4) है। चिप के निष्क्रिय यू-बॉक्स उत्परिवर्ती ने न तो यूएनसी-45B का सर्वव्यापकता किया और न ही ऑटो-सर्वव्यापकता(चित्रा 2,लेन 3) । इसके विपरीत, यूएफसी-45बी का सर्वव्यापकता और चिप के ऑटो-सर्वव्यापकता का पता इनक्यूबेशन पर जंगली प्रकार की चिप(चित्रा 2,लेन 6) के साथ पाया गया था। इस प्रकार, चिप यूएफसी-45B इन विट्रो मेंसर्वव्यापी रूप से यह सुझाव दे सकती है कि यूएनसी-45बी चिप18का संरक्षित सब्सट्रेट है।

अंततः, किसी भी सब्सट्रेट प्रोटीन की अनुपस्थिति में चिप की उत्प्रेरक गतिविधि का विश्लेषण किया गया। इस उद्देश्य के लिए, एक lysine निर्वहन परख किया गया था जिसमें मुक्त lysine अमीनो एसिड E3 सब्सट्रेट्स(चित्रा 3, पूरक चित्रा S2C)की अनुपस्थिति में यूबी स्वीकारकर्ता के रूप में काम कर सकते हैं । निर्वहन परख में एक चार्जिंग कदम होता है जिसमें यूबी को E2 पर E1 द्वारा लोड किया जाता है, ई 2 पर यूबी की आगे की लोडिंग को रोकने के लिए एक स्टॉप स्टेप, और एक डिस्चार्ज स्टेप जहां यूबी को क्षणिक यूबी ~ E2 थिओएस्टर से फ्री लिसिन अमीनो एसिड पर स्थानांतरित किया जाता है और/ पश्चिमी दाग विश्लेषण दोनों Ub संशोधित प्रोटीन और E3 ligase चिप कल्पना करने के लिए किया गया था । अनचार्ज्ड UBE2D2 एंजाइम में 17 केडीए(पूरक चित्रा S2C)का आणविक वजन है।

जब एक यूबी अणु के साथ आरोप लगाया-lysine मुक्त Ub (Ub K0) के उपयोग से सुनिश्चित-UBE2D2 ~ Ub के आणविक वजन लगभग 26 केडीए के लिए ऊपर की ओर बदलाव । समय बिंदु शून्य (टी0)चार्ज E2(चित्रा 3)की समग्र उपज का प्रतिनिधित्व करता है। निष्क्रिय चिप (35 केडीए) की उपस्थिति में, UBE2D230,31के एक बेहोश E3 ligase-स्वतंत्र निर्वहन, लेकिन चिप का कोई ऑटो-सर्वव्यापकता का पता चला। इसके विपरीत, जंगली प्रकार चिप (35 केडीए) की उपस्थिति में, UBE2D2 के एक तेजी से निर्वहन का पता चला, 60 मिनट के भीतर एक पूर्ण निर्वहन उपज। इसके साथ ही, चिप का ऑटो-सर्वव्यापकता देखी गई, जो यह दर्शाता है कि चिप ने यूबी के हस्तांतरण को अपने ही lysine अवशेषों पर बढ़ावा दिया ।

Figure 1
चित्रा 1: Vitro मेंE2-E3 एंजाइम सहयोग के लिए पश्चिमी दाग विश्लेषण । विभिन्न मानव E2 एंजाइमों के साथ विट्रो ऑटो-सर्वव्यापकता प्रतिक्रियाओं में (बाएं से दाएं: खाली, UBE2-D1, -D2,-D3, -E1, -E3,-H, और -N/V1) का उपयोग करके संकेत के रूप में प्रदर्शन किया गया(ए)वाइल्ड-टाइप चिप या(बी)निष्क्रिय चिप यू-बॉक्स उत्परिवर्ती, चिप (H260Q), E3 quitinse के रूप में नमूनों को समान रूप से विभाजित किया गया था, अलग पॉलीएक्रीलामाइड जैल पर चलाया गया था, और प्रतिक्रिया उत्पादों की कल्पना करने के लिए एंटी-चिप और एंटी-यूब एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोब्लोट किया गया था। संक्षिप्त: यूबी = सर्वव्यापकता; चिप = HSC70-बातचीत प्रोटीन के कार्बोक्सिल टर्मिनस; एटीपी = एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:पश्चिमी दाग विश्लेषण निगरानी सब्सट्रेट सर्वागीण। इन विट्रो सब्सट्रेट सर्वापितव्यापकता प्रतिक्रियाओं को चिप वाइल्ड-टाइप या निष्क्रिय चिप यू-बॉक्स उत्परिवर्ती, चिप (एच260क्यू) द्वारा मानव यूएनसी-45B के सर्वव्यापकता का पता लगाने के लिए संकेत के रूप में किया गया था। मानव UBE2D2 E2 एंजाइम के रूप में इस्तेमाल किया गया था। संक्षिप्त रूप: डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; यूबी = सर्वव्यापकता; चिप = HSC70-बातचीत प्रोटीन के कार्बोक्सिल टर्मिनस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:पश्चिमी दाग विश्लेषण UBE2D2 ~ Ub thioester से चिप पर निर्भर Ub हस्तांतरण की निगरानी । lysine मुक्त Ub (Ub K0) द्वारा मानव UBE2D2 का चार्ज, चार्जिंग प्रतिक्रिया को रोकना, और UBE2D2 ~ यूबी का निर्वहन वर्णित के रूप में किया गया था। निर्वहन प्रतिक्रियाओं के लिए, जंगली प्रकार चिप या निष्क्रिय चिप यू-बॉक्स उत्परिवर्ती, चिप (H260Q), सर्वव्यापी li गैसों के रूप में इस्तेमाल किया गया और 10 mM एल-lysine संभावित Ub स्वीकारकर्ता के रूप में आपूर्ति की गई थी । संकेत समय अवधि के बाद नमूने एकत्र किए गए थे, एक पॉलीएक्रीलामाइड जेल पर चलाते हैं, और एंटी-यूबी/एंटी-चिप एंटीबॉडी मिश्रण के साथ इम्यूनोब्लोटेड होते हैं । संक्षिप्त: यूबी = सर्वव्यापकता; चिप = HSC70-बातचीत प्रोटीन के कार्बोक्सिल टर्मिनस; एटीपी = एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा S1: प्रतिनिधि पश्चिमी दाग E3 की अनुपस्थिति में E2 एंजाइम गतिविधियों की निगरानी। विभिन्न मानव E2 एंजाइमों के साथ विट्रो सर्वव्यापकता प्रतिक्रियाओं (बाएं से दाएं: खाली, UBE2-D1, -D2,-D3,-E1, -E3,-H, और-N/V1) के रूप में E3-स्वतंत्र प्रतिक्रिया उत्पादों स्क्रीन करने के लिए एक E3 ligase के अभाव में संकेत के रूप में प्रदर्शन किया गया । नमूनों को एक पॉलीएक्रिलैमाइड जेल पर चलाया गया और एंटी यूबी के साथ इम्यूनोब्लॉटेड किया गया । संक्षिप्त: यूबी = सर्वव्यापकता; एटीपी = एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा S2: चार्जिंग यील्ड और UBE2D2 ~ Ub K0 थिओस्टर की स्थिरता का विश्लेषण। (क)E1 द्वारा प्राप्त UBE2D2 चार्जिंग की उपज का विभिन्न परिस्थितियों में परीक्षण किया गया । पहली चार्जिंग रिएक्शन (I) में 5 माइक्रोन ई 1, 5 माइक्रोन ई 2 और 50 माइक्रोन्यूबी यूबी के0 शामिल थे। दूसरी चार्जिंग रिएक्शन (II) में 2 माइक्रोन ई 1, 4 माइक्रोन ई 2 और 4 माइक्रोन्यूब यूबी के0 शामिल थे। चार्जिंग प्रतिक्रियाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए वर्णित किया गया था। 15 और 30 मिनट के बाद नमूने एकत्र किए गए । प्रतिक्रियाओं को 4x एलडीएस नमूना बफर के अलावा बंद कर दिया गया था और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और कूमासी स्टेनिंग से पहले 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया गया था। अनचार्ज्ड UBE2D2 को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । UBE2D2 का लगभग आधा UBE2D2 ~ यूबी में बदल दिया गया था। 15 मिनट के बाद कोई अतिरिक्त चार्जिंग का पता नहीं चला । इसके अलावा, न तो E1 में वृद्धि और न ही मुक्त सर्वव्यापकता में वृद्धि UBE2D2 ~ Ub की चार्जिंग उपज बदल दिया है । इस प्रकार, चार्जिंग को बाद में 2 माइक्रोएम ई 1, 4 माइक्रोएम ई 2, और 4 माइक्रोएम यूबी के0 का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए किया गया था। (ख)चार्ज करने के बाद, प्रतिक्रिया १.८ U/ml apyrase और 30 mM EDTA के अलावा और आरटी में इनक्यूबेटेड द्वारा बंद कर दिया गया था । नमूने 2, 5, 8, 10, और 15 मिनट (लेन 2-6) के बाद एकत्र किए गए थे, और अनचार्ज UBE2D2 नियंत्रण (लेन 1) के रूप में इस्तेमाल किया गया था । 4x एलडीएस नमूना बफर जोड़ा गया था, और नमूनों को जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और कूमासी स्टेनिंग से पहले 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया गया था। रोक UBE2D2 ~ Ub प्रोटीन की निरंतर बैंड तीव्रता से मापा के रूप में कुशल था, यह भी दर्शाता है कि थिओएस्टर संकेत समय अवधि के दौरान स्थिर था । (C)lysine-मुक्त Ub (Ub K0) द्वारा मानव UBE2D2 का चार्ज, चार्जिंग प्रतिक्रिया को रोकना, और UBE2D2 ~ यूबी का निर्वहन वर्णित के रूप में किया गया था। निर्वहन प्रतिक्रियाओं के लिए, जंगली प्रकार चिप या निष्क्रिय चिप यू-बॉक्स उत्परिवर्ती, चिप (H260Q) सर्वव्यापी li गैसों के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और 10 mM एल-lysine संभावित Ub स्वीकारकर्ता के रूप में आपूर्ति की गई थी । संकेत समय अवधि के बाद नमूने एकत्र किए गए थे, अलग पॉलीएक्रीलामाइड जैल पर चलते हैं, और कूमासी-दाग। कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करें ।

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Discussion

यह पेपर E3 ligase समारोह के विश्लेषण के लिए बुनियादी इन विट्रो सर्वव्यापकता विधियों का वर्णन करता है। इन विट्रो सर्वव्यापकता परखते समय, यह माना जाना चाहिए कि कुछ ई-2 एंजाइम अपने स्वयं के लिसाइन अवशेषों पर अपने सक्रिय सिस्टीन के हमले के कारण ऑटो-सर्वव्यापकता कर सकते हैं जो सक्रिय साइट30के करीब निकटता में स्थित हैं। इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, ई 2 उत्परिवर्ती के उपयोग की सिफारिश की जाती है जिसमें संबंधित lysine अवशेषों को आर्जिनिन के लिए आदान-प्रदान किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप उत्प्रेरक रूप से सक्रिय E2 एंजाइम होता है जो ऑटो-सर्वव्यापकता32के लिए प्रतिरोधी है। यह विशेष महत्व का है जब lysine निर्वहन परख के माध्यम से यूबी हस्तांतरण की निगरानी परख की प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए । एक और महत्वपूर्ण कारक E2 ~ Ub थिओस्टर बांड की क्षणिक प्रकृति है। यदि थियोस्टर स्थिरता विट्रो अनुप्रयोगों में संभव है, तो E2 के सक्रिय सिस्टीन अवशेषों को अधिक स्थिर E2 ~ Ub ऑक्सीस्टर33उत्पन्न करने के लिए एक सेरीन के लिए आदान-प्रदान किया जा सकता है। पहली बार उपयोग के लिए या जब एक नए E2 एंजाइम का उपयोग कर, E2 पर Ub चार्ज के स्तर का निर्धारण है कि E1 द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । चार्जिंग दक्षता E1 की प्रजातियों की उत्पत्ति, चार्जिंग प्रतिक्रिया के तापमान, और यूबी से ई 2 के मोलर अनुपात सहित कई कारकों से प्रभावित हो सकती है। चार्जिंग की उपज निर्धारित करने के लिए, बिना चार्ज किए गए बनामकल्पना करें । Coomassie धुंधला के माध्यम से E2 चार्ज किया ।

कुल मिलाकर, ये संभावित प्रतिबंध इन विट्रो परख स्थितियों के अनुभवजन्य अनुकूलन के महत्व को उजागर करते हैं, जैसे E2-E3 जोड़ी, E2 चार्जिंग और निर्वहन काइनेटिक्स, मोलेरिटी और रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन की गतिविधि, विशेष रूप से lysine निर्वहन परख के लिए, प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए। प्रोटीन को सब्सट्रेट करने के लिए यूबी के सहसंयोजक लगाव के विविध सेलुलर कार्यों को देखते हुए, प्रोटीन सर्वव्यापकता का विश्लेषण एक लोकप्रिय अनुसंधान क्षेत्र है। हालांकि, सर्वव्यापकता की घटनाओं का विश्लेषण मुश्किल हो सकता है, विशेष रूप से वीवो में। यह कठिनाई ई 3-सब्सट्रेट इंटरैक्शन34की क्षणिक प्रकृति, कई ई 3 लि गैसों की अतिरेक, साथ ही कई सब्सट्रेट्स35के लिए ई 3 लि गैसों की संकीर्णता सहित कई कारकों से उत्पन्न होती है। इसके अलावा, वीवो में विशिष्ट सर्वव्यापकता घटनाओं का लक्षण वर्णन अतिरिक्त योगदान कारकों जैसे सर्वव्यापकता श्रृंखला विस्तार कारकों और ड्यूफिक्विटाइलेशन एंजाइमों के अस्तित्व से बाधित होता है जो सर्वव्यापकाइन चेन टोपोलॉजी36को संशोधित करते हैं। ये बाधाएं मजबूत इन विट्रो तकनीकों के महत्व को रेखांकित करती हैं जो एक परिभाषित पुनर्संयोजन प्रणाली में E3 सर्वव्यापी लि गैसों की एंजाइमेटिक गतिविधियों को चित्रित करने में मदद करती हैं।

वर्णित अनुप्रयोगों के अलावा, इन विट्रो सर्वव्यापकता परख का उपयोग लिंकेज-प्रकार विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके यूबी-लिंकेज प्रकार का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है। एक अतिरिक्त अधिक विस्तृत दृष्टिकोण के रूप में, यूबी-संशोधित सब्सट्रेट के संबंधित प्रोटीन बैंड को पॉलीएक्रेलैमाइड जेल से निकाला जा सकता है और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है। लिंकेज प्रकार की पहचान ई 3-सब्सट्रेट इंटरैक्शन की शारीरिक भूमिका की समझ का समर्थन करती है, जो रोग से जुड़े सब्सट्रेट क्षरणमार्ग 37,38के लक्षण वर्णन के लिए विशेष महत्व रखती है। इसी तरह, लाइसिन डिस्चार्ज परख का उपयोग ई 3 सर्वव्यापी लि गैसों या ई 3 लिगाज़परिवारोंके बीच उत्प्रेरक मतभेदों को जानने के लिए एक प्रभावी उपकरण के रूप में किया जा सकता है। अंत में, यहां वर्णित इन विट्रो सर्वव्यापकता विधियां E3 लीगाज़ फ़ंक्शन के विभिन्न पहलुओं का विश्लेषण करने के लिए प्रभावी उपकरण हैं। वर्णित तरीकों के अपेक्षाकृत सरल निष्पादन के अलावा, एक प्रमुख लाभ सामान्य प्रयोज्यता है क्योंकि सभी यूकेरियोटिक स्रोतों से प्रोटीन को विशेष उपकरणों की आवश्यकता के बिना विट्रो में फिर से व्यक्त और अध्ययन किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि पर महत्वपूर्ण चर्चा और सहायक सलाह के लिए हमारी प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं । हम आकार सीमा के कारण मूल्यवान योगदान का हवाला नहीं देने के लिए माफी मांगते हैं । इस काम को ड्यूश फोर्चुंग्स्जेमीस्चफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) - एसएफबी 1218 - प्रोजेक्टनंबर 269925409 और क्लस्टर ऑफ एक्सीलेंस एक्ससी 229/ इस काम को जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति के तहत ड्यूश फोर्स्चुंग्सगेमेन्चेफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) द्वारा वित्त पोषित किया गया था -EXC 2030 - 390661388 और - एसएफबी 1218 - प्रोजेक्टनंबर 269925409 टी एच Diese Arbeit wurde वॉन डेर ड्यूशेन Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie-EXC २०३०-390661388 und-SFB १२१८-Projektnummer: 269925409 एक एच gefördert ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amershan Protran 0.1 µm NC GE Healthcare 10600000 nitrocellulose membrane
Anti-CHIP Cell Signaling 2080 Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6
Anti-MYC Roche OP10 Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10
Anti-ubiquitin Upstate 05-944 Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11
Apyrase Sigma A6535-100UN
ATP (10x) Enzo 12091903
BSA Sigma A6003-10G
EDTA Roth 8043.2
KCl Roth 6781.1
K2HPO4 Roth P749.2
KH2PO4 Roth 3904.1
LDS sample buffer (4x) novex B0007
L-Lysine Sigma L5501-5G
MES Roth 4256.4
MeOH VWR Chemicals 2,08,47,307 100%
Milchpulver Roth T145.3
NaCl Roth P029.3
NuPAGE Antioxidant invitrogen NP0005
NuPAGE Transfer buffer (20x) novex NP0006-1
Page ruler plus Thermo Fisher 26619 Protein ladder
RotiBlock Roth A151.1 Blocking reagent
SDS (20%) Roth 1057.1
S1000 Thermal Cycler Bio Rad 1852196
Trans-Blot Turbo Bio Rad 1704150EDU Transfer system
Tris base Roth 4855.3
Tween 20 Roth 9127.2
UbcH Enzyme Set BostonBiochem K-980B E2 enzymes
Ubiquitin BostonBiochem U-100H
Ubiquitin-activating enzyme E1 Enzo BML-UW941U-0050
Ubiquitylation buffer (10x) Enzo BML-KW9885-001
Whatman blotting paper Bio Rad 1703969 Extra thick filter paper

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References

  1. Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).
  2. Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
  3. Dye, B. T., Schulman, B. A. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).
  4. Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
  5. Hoppe, T. Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all. Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).
  6. Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. E2 enzymes: more than just the middle men. Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).
  7. Clague, M. J., Heride, C., Urbé, S. The demographics of the ubiquitin system. Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).
  8. Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).
  9. French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7, 6 (2021).
  10. Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).
  11. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  12. Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
  13. Hochstrasser, M. Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly. Cell. 124 (1), 27-34 (2006).
  14. Hoppe, T., Cohen, E. Organismal protein homeostasis mechanisms. Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).
  15. Okiyoneda, T., et al. Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane. Science. 329 (5993), 805-810 (1997).
  16. Tawo, R., et al. The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell. 169 (3), 470-482 (2017).
  17. Albert, M. C., et al. CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage. Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).
  18. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  19. Kim, J., Löwe, T., Hoppe, T. Protein quality control gets muscle into shape. Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).
  20. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  21. Donkervoort, S., et al. Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores. The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).
  22. Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).
  23. Jiang, J., et al. CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).
  24. Yang, Y., Yu, X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way. The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).
  25. Lamothe, B., et al. TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).
  26. Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration. Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).
  27. Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination. Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).
  28. Sakata, E., et al. Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates. Structure. 18 (1), 138-147 (2010).
  29. Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).
  30. Buetow, L., et al. Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin. Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).
  31. Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).
  32. McKenna, S., et al. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).
  33. Plechanovová, A., et al. Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4. Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).
  34. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  35. Jain, A. K., Barton, M. C. Regulation of p53: TRIM24 enters the RING. Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).
  36. Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26, 399-422 (2016).
  37. Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).
  38. Dammer, E. B., et al. Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).

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जीव विज्ञान अंक 171
<em>इन विट्रो</em> E3 सर्वव्यापकिन लिगाज़ समारोह का विश्लेषण
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Müller, L., Kutzner, C. E.,… More

Müller, L., Kutzner, C. E., Balaji, V., Hoppe, T. In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function. J. Vis. Exp. (171), e62393, doi:10.3791/62393 (2021).

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