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Biology

시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 기능 분석

Published: May 14, 2021 doi: 10.3791/62393
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Institute for Genetics and Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne

Summary

본 연구는 E3 유비퀴틴 리구아제 촉매 활성의 분석을 위한 체외 유비쿼터스 분석 프로토콜에 대한 상세한 제공. 재조합 단백질은 대장균 배양과 같은 원핵계를 사용하여 발현되었다.

Abstract

기판 단백질의 내부 리신 잔류물, 유비쿼터스라고 불리는 공정에 유비퀴틴(Ub)의 공유 부착은 진핵 생물에서 가장 중요한 번역 후 수정 중 하나를 나타냅니다. 유비퀴틸화는 유비퀴틴 활성화 효소(E1 효소), 유비퀴틴-컨쥬게이팅 효소(E2 효소), 유비퀴틴 리구아제(E3 효소) 등 3가지 효소 클래스의 순차적 캐스케이드에 의해 매개되며, 때로는 유비퀴틴 사슬 연공인자(E4 효소)에 의해 매개된다. 여기서, 유비퀴틸레이션 분석용 체외 프로토콜이 제공되어 E3 유비퀴틴 리가제 활성, E2-E3 쌍 간의 협력 및 기판 선택의 평가를 가능하게 한다. E2-E3 쌍의 협력은 E3 리게아제의 무료 폴리 유비퀴틴 체인 및/또는 자동 유비쿼터션의 생성을 모니터링하여 스크리밍할 수 있습니다. 기판 유비쿼터틸레이션은 E3 리게아제의 선택적 결합에 의해 정의되며 체외 반응의 서쪽 블로팅에 의해 검출될 수 있다. 또한, E2~Ub 방전 분석체가 설명되어 있으며, 이는 기능적 E2-E3 협력의 직접적인 평가를 위한 유용한 도구이다. 여기서, 유비퀴틴의 E3 의존적 전달은 해당 E2 효소로부터 자유 리신 아미노산(기판 유비쿼터티화를 모방) 또는 E3 리게아제 자체의 내부 리신(auto-ubiquitylation)에 따른다. 결론적으로, E3 리구아제 촉매 기능을 해결하기 위해 빠르고 수행하기 쉬운 세 가지 다른 체외 프로토콜이 제공됩니다.

Introduction

유비쿼터션은 Ub가 기판 단백질1에공동으로 연결되는 과정입니다. Ub 수정은 세 가지 효소 클래스, 즉Ub 활성화 효소 (E1s), Ub-컨쥬게이팅 효소 (E2s), Ub ligases (E3s), 그리고 아마도 Ub 사슬 연신 요인 (E4s)2,3,4,5의작용을 포함하는 연속적인 효소 반응에 의해 촉매된다. E1에 의한 Ub의 아데노신 트리호스페이트(ATP)와 마그네슘(Mg2+)의존적활성화 후, E1의 활성 부위 시스테인은 Ub의 C-말단 글리신을 공격하여 티오에스테르 복합체(Ub~E1)를 형성한다. ATP 가수분해에서 가져온 에너지는 Ub가 다음과 같은 효소 캐스케이드 전반에 걸쳐 유지되는 높은 에너지 전환 상태를 달성하게 합니다. 다음으로, E2 효소는 활성 Ub를 내부 촉매 시스테인으로 전달하여 일시적인 Ub~E2 티오에스테르 결합을 형성합니다. 이어서, Ub는 기판 단백질로 옮겨질 것입니다.

이 작업은 두 가지 방법으로 수행할 수 있습니다. E3 리개세중 은 먼저 E2에 결합할 수 있거나 E3 리개세는 Ub를 직접 결합할 수 있습니다. 후자의 방법으로 E3~Ub 중간기의 형성이 발생합니다. 두 경우 모두, Ub는 Ub의 C-말단 카복실 그룹과 기판6의리신 아미노 그룹 사이의 이소펩티드 결합의 형성에 의해 기판 단백질에 연결된다. 인간 게놈은 2개의 E1s, 대략 40 E2s 및 600개 이상의 putative 유비퀴틴 리개사7을인코딩합니다. E3의 Ub 전송 메커니즘에 기초하여, Ub ligases는 E6AP C-terminus (HECT) 타입, 정말 흥미로운 새로운 유전자 (RING)/U 박스 형, 그리고 링 (RBR) 형 리게세스8사이의 링에 동종과 관련된 세 가지 범주로 나뉩니다. 본 연구에서는, HSC70-상호작용 단백질(CHIP)의 리구아제, 카르복실 터미누스를 함유한 U-box를 대표적인 E3 효소로 사용한다. Ub~E3 티오에스테르를 형성하는 HECT 형 E3 효소와는 달리, 칩의 U 박스 도메인은 E2~Ub를 결합하고 E2 효소8,9에서직접 후속 Ub/기판 전달을 촉진한다. 효소 기능에 대한 U-box의 중요성을 바탕으로 비활성 CHIP U-box 돌연변이인 CHIP(H260Q)이 컨트롤로 활용됩니다. CHIP(H260Q)은 코그네이트 E2에 결합하지 못해 E3 리구아제 활동10을잃습니다.

단백질 유비쿼터스는 진핵 세포에 있는 세포 사건의 다수를 조절에 있는 중요한 역할을 합니다. 기판 단백질에 Ub 분자의 가역적 인 부착에 의해 촉진되는 세포 결과의 다양성은 Ub의 분자 특성에 기인 할 수있다. Ub 자체가 7개의 리신(K) 잔류물을 함유하고 있기 때문에, 다양한 크기 및/또는토폴로기(11)를가진 다양한 Ub 체인 타입이 있다. 예를 들어, 기판은 단일 Ub 분자(mono-ubiquitylation) 또는 다중 리신(멀티 모노-유비쿼터틸레이션)에 의해, 심지어 Ub 체인(poly-ubiquitylation)11에의해 변형될 수 있다. Ub 체인은 Ub의 동일하거나 다른 리신 잔류물을 통해 일반적으로 형성된 호모 또는 이종성이며, 이는 심지어 분지 된 Ub 체인9의결과를 초래할 수 있습니다. 따라서, 단백질 유비쿼터스는 유목 단백질의 분해, 활성화 또는 국소화를 위한 특정 정보(예:.,12,13)를제공하는 Ub 분자의 다양한 배열로 이어집니다. 이러한 다른 Ub 신호는 변화하는 환경 요구에 대응하는 세포의 능력에 대한 중요한 요구 사항인 세포 신호 경로의 빠른 재프로그래밍을 가능하게 합니다.

유비쿼터스의 중심적인 측면은 단백질 품질 관리와 관련이 있습니다. 잘못 접히거나 돌이킬 수 없는 손상된 단백질은 단백질 항상성 또는프로테오스타증(14)을유지하기 위해 새로 합성된 단백질로 분해되고 대체되어야 한다. 품질 관리 E3 리게아제, CHIP, 손상된 단백질의 Ub 의존 적 분해에분자 샤페론과 협력9,15,16,17. 그 외에도, CHIP은 근육 기능과 편차로 단단히 조정되는 뮤진 주도 샤페론, UNC-45B(UnC-45 Homolog B)의 안정성을 조절하여 인간 근병증18,19,20,21로이어진다. 26S 프로테솜에 의한 UNC-45B의 분해는 K48 연계 폴리-Ub 체인9의부착에 의해 중재된다. 기판 단백질이 없는 경우, CHIP은 링/U-box E3 유비퀴틴 리게아제(24, 25)의 특징인 자동 유비퀴틸레이션10,22,23을수행하며, 리구아제 활성(26)을조절하는 것으로 고려된다. 본 논문에 기재된 체외 유비쿼터션 분석 방법의 적용은 CHIP과 협력하여 CHIP의 무료 폴리-Ub 체인 및/또는 칩의 자동 유비쿼터션(프로토콜 섹션 2)의 형성을 촉진하는 E2 효소를 체계적으로 식별하는 데 도움이 되었습니다. 더욱이, UNC-45B의 칩 의존형 유비쿼터스(ubiquitylation)가 관찰되었으며, 이는 E3 리게아제18,19(프로토콜 섹션 3)의 공지된 기판이다. 궁극적으로, Ub~E2 티오에스테르로부터 활성화된 Ub의 칩 의존적 전송을 모니터링하였다(프로토콜 섹션 4).

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Protocol

1. 버퍼 및 시약 준비

참고: 실험실에서 수동으로 제조된 버퍼 및 시약은 다음과 같습니다. 프로토콜에 사용된 다른 모든 버퍼 및 시약은 다른 소스에서 구입하여 제조업체의 지침에 따라 사용되었습니다.

  1. 10배 인산염 완충식식염(10배 PBS)을 준비한다. 이를 위해 염화나트륨 1.37M 나트륨(NaCl), 염화27m 칼륨(KCl), 디나트륨-수소-인산염 이수제 80mMM(Na2HPO4.2 H2O),20mMMMM의 칼륨-디수소 인산염(KH2PO4)2l(2PO 4) 2L를 2L로 혼합한다. 10x PBS를 오토클레이브하고 ddH2O로 1배 PBS 솔루션을 준비합니다.
    1. 오토클레이빙은 121°C 및 98.9kPa에서 15분 동안 수행됩니다.
      참고: 자동 연결은 모든 버퍼 및 솔루션에 대해 이러한 조건에서 수행됩니다. 달리 표시되지 않으면 솔루션이 실온(RT)에 저장됩니다.
  2. PBS-Tween(PBS-T) 솔루션 1L을 1x PBS1L에 0.1% 펜을 추가하여 준비합니다.
  3. ddH2O. Aliquot L-lysine에서 L-리신을 1mL 부분으로 용해시켜 0.5 M L-리신 스톡 용액의 10mL를 준비하고 추가 사용전까지 -20°C에 보관하십시오.
    참고: L-리신은 반복적으로 동결및 해동할 수 있습니다.
  4. ddH 2O의 200mL에서 EDTA를 용해시켜 0.25 M 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA) 용액을 준비한다.
    1. 수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 pH를 8.0으로 조정합니다.
    2. ddH2O로 볼륨을 250mL로 조정합니다.
    3. 솔루션을 자동 복제합니다.
  5. 200 μL 알리쿼트에서 -20°C에서 ddH2O. 스토어에서 BSA를 용해시켜 20 mg/mL 소 소 세럼 알부민(BSA) 용액의 10mL를 준비한다.
    참고 : BSA는 반복적으로 동결 및 해동 할 수 있습니다.
  6. 2-(N-morpholino)에 탄 설포닉산(MES)의 러닝 버퍼는 50mM MES, 50m 트라이베이스, 3.47m 나트륨 도데킬 황산(SDS), ddH2O의0.9L로 1.03mM EDTA를 준비한다. 제대로 혼합 한 후 볼륨을 1 L로 조정합니다.
    1. 1x 버퍼의 pH는 7.6입니다. pH를 산이나 염기로 조정하지 마십시오.
  7. 1x PBS-T에서 10g의 분유를 용해하여 블로킹 용액(5% 우유)을 200mL준비한다. 블로킹 용액을 최대 1주일 동안 4°C에 저장합니다.
  8. 제조업체의 지시에 따라 1 L의전송 버퍼(재료 표 참조)를 준비합니다.
  9. 125m MM Tris 베이스, 4% SDS, 4% 글리세롤, 0.03% 브로모페놀 블루, 50 μL/mL의 β-메르카포에탄올50mL/mL를 50mL ddH2O. 알리쿼트1mL 부로, 1mL 부당에 2x SDS 샘플 버퍼를 준비하고 -20°C에 저장합니다.

2. 시험관 내 자동 유비쿼터션 분석

  1. 분석 준비 및 실행
    1. 단백질의 주어진 어과 단백질 농도를 기반으로 반응당 필요한 각 시약의 부피를 계산합니다. 자동 유비쿼터틸화 반응당 100nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3 및 50 μM Ub를 사용하십시오. ddH2O로 반응의 부피를 20 μL로 조정합니다.
      참고: ATP 솔루션 및 유비쿼터티션 버퍼는 10배 재고 솔루션으로 구입하여 1배에서 사용되었습니다.
    2. 모든 반응에 대한 파이펫 팅 구성표를 준비합니다. 치촉매 비활성 칩(H260Q) 돌연변이체로 칩(I) 기능(I) 기능( I) 및 (III) 개별 유비쿼터스 반응에서 CHIP 없이 9개의 다른 E2 효소를 테스트한다.
    3. 피펫팅 오류를 방지하려면 모든 반응에 필요한 볼륨과 하나의 추가 반응에 필요한 볼륨이 포함된 얼음에 마스터 믹스를 준비합니다. 반응당 필요한 마스터 믹스의 양을 계산합니다.
      참고: 마스터 믹스 구성 요소는 각 반응, 즉., E1, E3, Ub, ATP 및 유비쿼터티션 버퍼에 동등하게 필요한 시약입니다.
    4. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 튜브에 ddH2O 및 마스터 믹스를 추가합니다. 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
    5. E2 효소를 첨가하여 유비쿼터티화 반응을 시작하기 전에, 다음 프로그램으로 PCR 열 사이클러를 설정합니다: 2h, 37°C, 4°C, 무한히.
    6. 각 튜브에 E2 효소의 1 μM을 추가하고, 표시된 기간 동안 PCR 열 사이클러에서 샘플을 배양한다.
    7. 2시간 후 각 반응에 SDS 샘플 버퍼를 추가하고 여러 번 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
      참고: 샘플 버퍼의 필요한 부피는 샘플 버퍼의 재고 농도에 따라 달라집니다. 여기서, 2x SDS 샘플 버퍼의 20 μL이 각 반응에 첨가되었다.
    8. 샘플을 즉시 95°C에서 5분간 끓이고 폴리아크릴라미드 젤 전기포레시스(PAGE)를 계속합니다. 변성 단백질을 -20°C에 저장합니다.
  2. 젤 전기 전과 및 서부 얼룩
    1. 해동 후, 약 10s에 대한 샘플을 회전하고 SDS-PAGE 젤을로드합니다. 단백질 사다리를 크기 참조로 사용하십시오.
      참고: 여기, 4-12% 비스 트리그라데이션 젤과 단백질 사다리의 3 μL이 사용되었다. 샘플 볼륨을 나누고 각 샘플의 20 μL을 사용하여 두 젤을 동등하게 로드합니다.
    2. 샘플 전면이 젤의 바닥에 도달할 수 있도록 약 30-45 분 동안 160-200 V에서 젤을 실행합니다.
    3. 각 젤을 반건조 블로팅 버퍼로 채워진 플라스틱 용기에 옮기고 RT에서 2-5분 동안 배양합니다.
    4. SDS 젤 당 젤 크기의 니트로셀룰로오스 멤브레인 2개와 젤 크기의 니트로셀룰로오스 멤브레인 을 준비하고 세미드라이 블로팅 버퍼에 미리 담가 둡니다. 서쪽 블롯 (WB) 샌드위치를 아래에서 위쪽으로 조립 : 블로팅 종이, 니트로 셀룰로오스 막, SDS-PAGE 젤, 블로팅 페이퍼.
    5. 샌드위치 층 사이에 갇혀있을 수있는 기포를 제거합니다. 이를 위해 롤러를 사용하여 조심스럽게 샌드위치를 몇 번 롤오버하십시오.
    6. 챔버를 닫고 과도한 블롯 버퍼가 빠져나갈 수 있도록 합니다.
    7. 각 블로팅 장치에 챔버를 배치하고, 반건조 블로팅에 대한 다음 프로그램을 사용 : 25 V, 1.0 A, 30 분.
    8. 블로킹 멤브레인을 블로킹 솔루션으로 채워진 플라스틱 용기로 옮기고 RT에서 30분 동안 배양합니다.
    9. 블로킹 시약을 포함하는 PBS-T의 10mL에 항체를 추가하여 1차 항체 용액을 준비한다(재료의 표참조).
      참고: 항체의 작동 농도는 항체 특이적이다. 이 경우, 단일 클론 마우스 항 유비퀴틴 항체는 1:5,000의 희석에서 사용되었다. 제2 겔의 경우, 단클론 토끼 안티칩 항체는 PBS-T/차단 시약에서 1:5,000에서 사용되었다.
    10. 차단 용액을 1차 항체 용액으로 교체하고 로커의 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
    11. PBS-T로 멤브레인을 10분 동안 세 번 씻으시면 됩니다.
    12. PBS-T의 10mL에 각각의 항체를 추가하여 이차 항체 용액을 준비한다.
      참고: 여기에서 염소 항마우스 및 마우스 항래빗 항체는 1:10,000의 희석에 사용됩니다.
    13. 로커에 RT에서 1 시간 동안 이차 항체로 멤브레인을 배양하십시오.
    14. PBS-T로 멤브레인을 5분 동안 세 번 씻으시면 됩니다.
  3. 데이터 분석
    1. 제조사의 지시에 따라 고추냉이 과산화제(HRP)-컨쥬게이드 항체에 대한 서부 블롯 검출 시약을 제조사의 지시에 따라 세척된 멤브레인에 추가하고 X선 필름 또는 전하 결합 장치카메라(도 1)를사용하여 HRP 신호를 캡처합니다.

3. 체외 기판 유비쿼터션 분석

  1. 분석 준비 및 실행
    1. 단백질의 주어진 어과 단백질 농도를 기반으로 반응당 필요한 각 시약의 양을 계산합니다. 기판 유비쿼터틸화 반응당 100nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3, 1 μM 기판 및 50 μM Ub를 사용합니다. 10x ATP 솔루션과 10배 유비쿼터틸레이션 버퍼를 1배에서 사용하십시오. ddH2O로 기판 유비쿼터션 반응의 부피를 20 μL로 조정합니다.
    2. 모든 반응에 대한 파이펫 팅 구성표를 준비합니다. 기판 유비쿼터틸화가 E3 특이적임을 확인하는 적절한 제어 반응을 포함한다. 단백질 UNC-45B를 칩의 대표적인 기판으로 사용하고 촉매비활성 칩 돌연변이체(H260Q)를 대조군으로 사용한다. E1, E2, Ub 믹스(Ub, ATP, 유비쿼터티션 버퍼 포함) 다음 반응을 준비합니다. E1, E2, Ub 믹스, UNC-45B; E1, E2, Ub 믹스, 칩 (H260Q), UNC-45B; 및 E1, E2, Ub 믹스, 칩, UNC-45B.
    3. 피펫팅 오류를 방지하려면 모든 반응에 필요한 볼륨과 하나의 추가 반응에 필요한 볼륨이 포함된 얼음에 마스터 믹스를 준비합니다. 반응당 필요한 마스터 믹스의 볼륨을 계산합니다.
      참고: 이 분석의 마스터 믹스 구성 요소에는 E1, E2, Ub, ATP 및 유비쿼터션 버퍼가 포함됩니다.
    4. ddH2O, 기판, E3 리게아제 : 다음 순서로 반응 성분을 추가합니다.
    5. 마스터 믹스의 첨가에 의한 유비쿼터스 반응을 시작하기 전에, 다음 프로그램으로 PCR 열 사이클러를 설정: 2 h, 37°C 다음에 4°C, 무한히.
    6. 각 튜브에 마스터 믹스를 추가하고 표시된 기간 동안 PCR 열 사이클러의 샘플을 배양합니다.
    7. 2시간 후 각 반응에 2x SDS 샘플 버퍼를 추가하고 여러 번 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
    8. 실행 후, 샘플을 즉시 95°C에서 5분 동안 끓이고 PAGE로 계속 끓입니다. 대안적으로, -20°C에 변성 단백질을 저장합니다.
  2. 젤 전기 전과 및 서부 얼룩
    1. 섹션 2.2에 설명된 바와 같이 겔 전기 전구 및 서부 블롯을 수행합니다. 기판과 E3 리게아제의 검출을 위해 각각 특정 항체를 사용한다.
      참고: 여기서, UNC-45B는 단일클론 마우스 항MYC 항체의 사용을 허용하는 c-myc 유전자 제품으로부터 유래된 폴리펩티드 단백질 태그에 융합된다. 안티 MYC는 1:10,000에 사용됩니다.
  3. 데이터 분석
    1. 섹션 2.3(그림 2)에설명된 바와 같이 데이터 분석을 수행합니다.

4. 리신 방전 분석

  1. 분석 준비 및 실행
    1. E1로 Ub을 사용하는 E2 효소 충전
      1. 단백질의 주어진 어과 단백질 농도를 기반으로 반응당 필요한 각 시약의 부피를 계산합니다. 충전 반응당 2μM E1, 4 μM E2 및 4 μM 리신 프리 유비퀴틴(Ub K0)을 사용하십시오. 10배 ATP와 10배 유비쿼터티 버퍼를 1배에서 사용하십시오. ddH20으로 충전 반응의 부피를 20 μL로 조정합니다.
        참고: 리신이 없는 Ub K0 돌연변이체는 모노 유비쿼터스 E2의 독점 생산을 시행하는 데 사용됩니다. 야생 형 Ub도 사용할 수 있습니다. 그러나, 이것은 분석하기 어려운 다양한 E2~Ub수정(예:E2의 폴리-유비쿼터스)으로 이어질 수 있습니다. 처음 사용하거나 새로운 E2 효소를 사용할 때 E1에서 얻을 수 있는 E2에 대한 Ub 충전 수준을 결정합니다. 충전 의 수율을 확인하려면 쿠마시 염색을 통해 충전되지 않은 대 충전 된 E2를 시각화하십시오. 여기서 Ub K0의 약 절반은 UBE2D2 및 Ub K0(보충피규어 S2A)의평형 비율을 사용할 때 UBE2D2~Ub로 안정적으로 전환되었습니다.
      2. 충전 반응에 대한 파이펫팅 구성표를 준비합니다. 개별 방전 반응에서 칩 및 CHIP(H260Q)을 사용한다. 따라서, 하나의 충전 반응의 두 배 의 부피를 준비한다.
        참고: 처음으로 사용하는 경우 최적의 방전 상태를 모니터링하고 서부 블로팅으로 분석하기 위해 선택한 E3 리개서의 다양한 농도를 테스트합니다. 이상적인 조건에서, E2에서 Ub의 출력은 각각E2~Ub 단백질 밴드가 사라질 때까지 시간이 지남에 따라 증가할 것입니다.
      3. 37°C에서 15분 동안 충전 반응을 배양한다.
    2. 충전 반응 종료
      1. 최종 농도 1.8 U/mL에서 apyrase를 첨가하여 충전 반응을 중지하십시오. RT에서 5분 동안 아피라제로 인큐베이션을 수행하고, 최종 농도인 30mM에서 EDTA를 추가합니다. ddH2O로 충전 반응의 부피를 30 μL로 조정합니다.
        참고: Apyrase는 ATP 분자를 ADP(아데노신 디포스페이트) 분자로 변환하는 데 사용됩니다. E1 효소의 활성은 ATP 의존성이기 때문에 E1은 더 이상 E2를 충전할 수 없습니다. EDTA는 E1에 필요한 동인 Mg2+ 이온을 담금질하여 E1이 억제되도록 추가로 사용됩니다. 반응을 중지하는 데 필요한 apyrase의 양은 분석 조건 마다 다를 수 있습니다. apyrase 혼자 이미 사용할 수 있는 ATP 분자를 담금질, apyrase와 EDTA의 조합은 E1-UBE2D2 쌍에 대 한 충전 반응을 중지에 더 효과적이었다. 반응을 중지하는 것은 분석 재현성에 대한 중요한 요소이기 때문에 새로운 E1-E2 쌍을 테스트해야합니다. 이를 위해 충전 반응을 설정하고 중지하고 특정 시점에서 샘플을 수집합니다(예:2, 5, 10 및 15분 후). E2~Ub의 변속되지 않는 수준은 반응이 중단되었고, 티오에스테르가 그 기간 동안 안정적이었다는 것을나타낸다(보충 도도 S2B).
    3. E3로 E2~Ub 의 배출
      1. 다른 시간 점에 해당하는 4개의 튜브를 준비합니다(t0, t1, t2, t3); 각 튜브에 비감소 시료 버퍼(4배 리튬 도데실 황산염(LDS) 버퍼의 6.7 μL을 추가합니다.
        참고: 샘플 버퍼에서 감소 제를 사용하지 마십시오.
      2. t0에대한 정지 충전 반응에서 6 μL을 제거하고 ddH2O로 부피를 20 μL로 조정합니다.
      3. 70°C에서 10분 동안 t0 샘플을 배양한다.
        참고: 티오에스테르가 더 높은 온도에서 음순이 기때문에 배양 시간을 연장하여 샘플을 끓이지 마십시오.
      4. 방전 반응당 필요한 각 시약의 부피를 계산합니다. 충전된 E2의 나머지 24μL을 사용하고 E3 리게아제의 10mM L-리신, 1 mg/ml BSA 및 500nM을 추가합니다. 1x에서 유비쿼터티션 버퍼를 사용하고 ddH2O로 부피를 80 μL로 조정합니다.
      5. 모든 방전 반응에 대한 파이펫팅 체계를 준비하고 CHIP(WT) 외에 CHIP(H260Q)을 제어로 사용합니다.
      6. ddH2O, 유비쿼터틸션 버퍼, BSA, 리신, E3 리개제 및 충전된 E2의 반응과 같은 순서로 필요한 구성 요소를 추가하여 얼음에 방전 반응을 설정합니다.
      7. RT에서 방전 반응을 배양합니다.
      8. 각 샘플 튜브로 방전 반응의 20 μL을 전송하여 5, 30 및 60 분 후에 샘플을 채취하십시오.
        참고: 방전을 적절하게 모니터링할 수 있는 적절한 시간점은 E2-E3 쌍마다 다를 수 있습니다.
      9. 즉시 샘플을 소용돌이시키고 70 °C에서 10 분 동안 배양합니다.
      10. 페이지로 직접 진행합니다.
        참고: E2~Ub 티오에스테르는 시료 버퍼에서 데우러진 후에도 음순이 될 수 있습니다. 따라서, 겔 전기전광은 분석 실행 후에 직접 수행되어야 한다.
  2. 젤 전기 전과 및 서부 얼룩
    1. 2.2항에 설명된 바와 같이 겔 전기전과 서부 블로팅을 수행한다. Ub 특이적 항체를 사용하고, 사용 가능한 경우, 또한 다른 종에서 제기된 E3 특이적 항체를 사용하여 Ub 및 E3 리게아제 신호를 동시 검출할 수 있게 한다.
  3. 데이터 분석
    1. 섹션 2.3(그림3)에설명된 바와 같이 데이터 분석을 수행합니다.

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Representative Results

유비퀴틴 리가제 칩과 협력하는 E2 효소를 식별하기 위해, E2 후보 세트는 체외 유비쿼터션 반응에서 개별에서 테스트되었다. 협력 E2-E3 쌍은 E3 의존형 유비쿼터티화 제품, 즉E3 리게세의 자동 편평성 및 무료 Ub 폴리머형성에 의해 모니터링되었다. 유비쿼터티화 제품은 서양 블로팅에 의해 분석되었다. 데이터 해석은 분자량 마커를 가진 결과 단백질 밴드의 크기 비교를 기반으로 합니다. 단백질 유비쿼터스는 각각 의 크기 차이가 8.6 kDa (단일 Ub 분자의 크기)를 가진 이중 밴드 또는 다중 반복 밴드의 외관을 특징으로하는 특정 밴드 패턴의 형성에 이르게한다.

여기서, 9개의 E2s의 능력은 야생형칩(도 1A),비활성 U박스 돌연변이 칩(H260Q)(도 1B)또는 칩(보충도면 S1)의존재속에서 시험되었다. E3 독립적인 유비퀴틴 제품은 비활성 칩의 존재와 CHIP(도1B 및 보충 도 S1)의부재 에서 형성되었다. 비활성 칩은 자동 보편화되지 않았습니다(도 1B). 반면, 와일드타입 칩은 UBE2D 제품군(D1-D3) 및 UBE2E 제품군(E1, E3)의 구성원과 결합했을 때 자동 보편화되었다(그림1A,차선 3, 4, 5). 무료 폴리-Ub 체인은 UBE2D1-3과 협력하여 생산되었지만, 이는 각각 UBE2E1 또는 UBE2E3(그림1A,차선 6 및 7)에 대해 검출되지 않았다.

UBE2D 제품군이 무료 Ub 폴리머형성과 CHIP의 자동 유비쿼터티화를 모두 촉진하는 능력은 E227,28의뒷면에 비공유 유비퀴틴 결합 부위의 존재에 기인한다. 유사하게, UBE2N/V1(도1A,레인 9)에 의한 무료 Ub 체인의 배타적 형성은 K63 연계 Ub체인(29)의형성을 지시하는 특정 UBE2V1 서브유닛(Uev subunit)에 의한 Ub의 결합에 기인한다. UBE2C1 및 UBE2H(그림1A,차선 2 및 8)의 존재에 유비쿼터션 제품이 형성되지 않았다. 결론적으로, 칩은 시험관내의여러 E2 효소와 협력할 수 있습니다. 그러나, 그것의 자동 유비쿼터스는 E2 효소 특이적이다.

다음으로, UBE2D2-CHIP 쌍은 CHIP ligase활성(그림 2)에의해 미오신 지향 샤페론, UNC-45B의 유비쿼터션을 조사하는 데 사용되었다. 기판 유비쿼터틸화는 서부 블로팅을 통해 분석되었다. 비보쿼터스 UNC-45B는 분자량이 103kDa(도2,레인 4)이다. CHIP의 비활성 U 박스 돌연변이는 UNC-45B의 유비쿼터스 또는 자동 유비쿼터스(그림 2,레인 3)를 수행하지 않았다. 대조적으로, UNC-45B의 유비쿼터스 및 칩의 자동 유비쿼터션은 야생형CHIP(그림 2,차선 6)으로 인큐베이션 시 검출되었다. 따라서 칩은 시험관내에서UNC-45B를 보편화할 수 있으며, 이는 UNC-45B가 CHIP18의보존기판임을 시사한다.

궁극적으로, CHIP의 촉매 활성은 기질 단백질이 없는 상태에서 분석되었다. 이를 위해, 자유리신 아미노산이 E3 기판의 부재 시 Ub 수용자로 작용할 수 있는 리신 방전분석(도 3, 보충 도서 S2C)이수행되었다. 방전 분석법은 Ub이 E1에 의해 E2에 로드되는 충전 단계, Ub의 추가 적재를 E2로 방지하기 위한 정지 단계, 그리고 Ub가 일시적인 Ub~E2 티오에스테르에서 자유 리신 아미노산 및/또는 E3 ligase의 라이신 잔류물으로 전송되는 방전 단계로 구성됩니다. 웨스턴 블롯 분석은 Ub-변형 단백질과 E3 리게아제 칩을 모두 시각화하기 위해 수행되었다. 충전되지 않은 UBE2D2 효소는 분자량이 17kDa(보조도도 S2C)이다.

단일 Ub 분자로 충전될 때-리신 프리 Ub (Ub K0)-UBE2D2~Ub의 분자량이 약 26 kDa로 위쪽으로 이동합니다. 시간점 0(t0)은충전된 E2(도3)의전체 수율을 나타냅니다. 비활성 칩(35 kDa)이 존재하면서, UBE2D230,31의희미한 E3 리게세 독립적인 방전이 검출되었지만 칩의 자동 유비쿼터스는 검출되지 않았다. 반면, 야생형 CHIP(35kDa)이 있는 상황에서 UBE2D2의 빠른 방전이 검출되어 60분 이내에 완전한 방전을 생성했다. 동시에 칩의 자동 유비쿼터스가 관찰되었으며, 이는 CHIP이 자체 리신 잔류물으로 Ub의 이전을 촉진했음을 나타냅니다.

Figure 1
그림 1: 시험관내E2-E3 효소 협업을 위한 웨스턴 블롯 분석. 다른 인간 E2 효소를 이용한 시험관 내 자동 유비쿼터션 반응(왼쪽부터: 비어 있음, UBE2-D1, -D2, -D3, -E1, -E3, -H, 및 -N/V1)를 사용하여 표시된 대로 수행하였다(A) 와일드 타입 칩 또는(B)비활성 칩 U-박스 돌연변이, CHIP(H2QQ) 샘플은 동등하게 분할되었다, 별도의 폴리 아크릴 아미드 젤에 실행, 반응 제품을 시각화하는 안티 칩 및 안티 Ub 항체와 면역 블로트. 약어: Ub = 유비퀴틴; 칩 = HSC70 상호 작용 단백질의 카복틸 종점; ATP = 아데노신 트리호스페이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 기판 유비쿼터션을 모니터링하는 서양 얼룩 분석. 체외 기판 유비쿼터션 반응은 칩 와일드 타입 또는 비활성 칩 U 박스 돌연변이체, CHIP(H260Q)에 의해 인간 UNC-45B의 유비쿼터션을 검출하기 위해 지시된 바와 같이 수행되었다. 인간 UBE2D2는 E2 효소로 사용되었다. 약어 : WT = 야생 유형; Ub = 유비퀴틴; 칩 = HSC70 상호 작용 단백질의 카복실 종점. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: UBE2D2~Ub 티오에스테르에서 칩 의존형 Ub 전송을 모니터링하는 서부 블롯 분석. 리신 프리 Ub(Ub K0)에 의한 인간 UBE2D2충전, 충전 반응 정지, UBE2D2~Ub의 방전이 설명된 대로 수행되었다. 방전 반응의 경우, 야생형 칩 또는 비활성 칩 U박스 돌연변이체, CHIP(H260Q)은 유비퀴틴 리개세및 10mM L-리신으로 사용되어 잠재적인 Ub 수용자로 공급되었다. 샘플은 표시된 기간 후에 수집되었고, 폴리아크릴아미드 젤에서 실행되고, 항Ub/anti-CHIP 항체 혼합물로 면역블화하였다. 약어: Ub = 유비퀴틴; 칩 = HSC70 상호 작용 단백질의 카복틸 종점; ATP = 아데노신 트리호스페이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 S1: 대표적인 서부 얼룩 모니터링 E2 효소 활동 E3의 부재에. 다른 인간 E2 효소를 가진 체외 유비쿼터션 반응(왼쪽부터: 비어 있음, UBE2-D1, -D2, -D3, -E1, -E3, -H 및 -N/V1)은 E3 독립적인 반응 제품을 선별하는 E3 리구아제의 부재시와 같이 수행되었다. 샘플은 폴리아크릴아미드 젤에서 실행되었고 항 Ub로 면역블화되었습니다. 약어: Ub = 유비퀴틴; ATP = 아데노신 트리호스페이트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도서 S2: UBE2D2~Ub K0 티오에스테르의 충전 수율 및 안정성 분석. (A)E1이 달성한 UBE2D2 충전의 수율은 다양한 조건에서 테스트하였다. 첫 번째 충전 반응(I)은 5 μM E1, 5 μM E2 및 50 μM Ub K0으로 구성되었습니다. 두 번째 충전 반응(II)은 2 μM E1, 4 μM E2 및 4 μM Ub K0으로 구성되었다. 충전 반응은 37°C에서 30분 동안 기술된 바와 같이 수행되었다. 샘플은 15 분 및 30 분 후에 수집되었습니다. 반응은 4x LDS 샘플 버퍼의 첨가에 의해 중단되었고 겔 전기포고및 쿠마시 염색 전에 10분 동안 70°C에서 배양되었다. 충전되지 않은 UBE2D2는 제어로 사용되었습니다. UBE2D2의 약 절반이 UBE2D2~Ub로 전환되었습니다. 15분 후에추가 충전이 감지되지 않았습니다. 또한 E1의 증가나 무료 유비퀴틴의 증가는 UBE2D2~Ub의 충전 수익률을 변경하지 않았습니다. 따라서, 충전은 2 μM E1, 4 μM E2 및 4 μM Ub K0을 사용하여 37°C에서 15분 동안 수행되었다. (B)충전 후, 반응이 1.8 U/mL apyrase 및 30 mMEDTA를 추가하여 중단하고 RT에서 배양하였다. 샘플은 2, 5, 8, 10 및 15 분 (차선 2-6) 후에 수집되었으며, 충전되지 않은 UBE2D2는 제어 (차선 1)로 사용되었다. 4x LDS 샘플 버퍼를 첨가하고, 시료는 겔 전기포고증 및 쿠마시 염색 전에 10분 동안 70°C에서 배양되었다. 정지는 UBE2D2~Ub 단백질의 일정한 대역 강도에 의해 측정된 것으로 효율적이었으며, 또한 티오에스테르가 표시된 기간 동안 안정적이었다는 것을 나타낸다. (C)리신 프리 Ub(Ub K0)에 의한 인간 UBE2D2 의 충전, 충전 반응정지, UBE2D2~Ub의 방전이 설명된 대로 수행되었다. 방전 반응의 경우, 야생형 칩 또는 비활성 칩 U박스 돌연변이체, CHIP(H260Q)을 유비퀴틴 리개주로 사용되었고, 10mM L-리신이 잠재적인 Ub 수용자로 공급되었다. 샘플은 표시된 기간 후에 수집되었고, 별도의 폴리아크릴아미드 젤에서 실행되며, 쿠마시 염색하였다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 논문은 E3 리게아제 기능 의 분석을 위한 기본 체외 보편화 방법을 설명합니다. 시험관 내 유비쿼터티션 어약을 수행할 때, 일부 E2 효소는 활성부위(30)에근접한 자체 리신 잔류물의 공격으로 인해 자동 유비쿼터티화를 수행할 수 있다고 고려해야 한다. 이러한 문제점을 회피하기 위해, 각각의 리신 잔류물이 아르기닌으로 교환되는 E2 돌연변이제를 사용하는 것이 좋습니다, 이는 자동유비쿼터션(32)에저항하는 촉매 활성 E2 효소를 초래한다. 이는 분석의 재현성을 보장하기 위해 리신 방전 분석서를 통해 Ub 전송을 모니터링할 때 특히 중요합니다. 또 다른 중요한 요소는 E2~Ub 티오에스 본드의 일시적인 특성입니다. 티오에스테르 안정성이 시험관내 적용에서 가능한 경우, E2의 활성 시스테인 잔류물은 세린으로 교환되어 보다 안정적인 E2~Uboxyester(33)를생성할 수 있다. 처음 사용하거나 새로운 E2 효소를 사용할 때 E1에서 얻을 수 있는 E2에 대한 Ub 충전 수준을 결정합니다. 충전 효율은 E1의 종 기원, 충전 반응의 온도 및 Ub 대 E2의 어금니 비율을 포함한 여러 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 충전 의 수율을 확인하려면, 미충전 대시각화 . 쿠마시 스테인링을 통해 E2를 충전했습니다.

전부, 이러한 잠재적 인 제한은 E2-E3 쌍, E2 충전 및 배출 운동, 모호성 및 재조합 단백질의 활동, 특히 리신 방전 분석, 재현 가능한 결과를 얻기 위해 시험관 내 분석 조건의 경험적 최적화의 중요성을 강조한다. 기판 단백질에 Ub의 공유 부착의 다양 한 세포 기능을 감안할 때, 단백질 편평의 분석은 인기 있는 연구 분야. 그러나, 유비쿼터틸화 이벤트의 분석은 특히 생체 내에서어려울 수 있습니다. 이러한 난이도는 E3기판상호작용(34)의과도 특성, 많은 E3 리구아제의 중복성, 그리고 여러기판(35)에대한 E3 리구아제의 난교를 포함한 여러 가지 요인으로부터 발생한다. 더욱이, 생체 내의 특정 유비퀴틸화 이벤트의 특성화는 유비퀴틴 사슬 신장 인자 및 유비퀴틴 사슬 토폴로지(36)를 조절하는 비비퀴틸화 효소와 같은 추가적인 기여 요인의 존재에 의해 방해된다. 이러한 제약 조건은 정의된 재조합 시스템에서 E3 유비퀴틴 리가제의 효소 활동을 특성화하는 데 도움이 되는 강력한 체외 기술의 중요성을 강조합니다.

설명된 응용 분야 외에도, 시험관 내 유비쿼터틸화 소는 또한 연결형 특이항체를 이용하여 Ub-linkage 유형을 검출하는 데 사용될 수 있다. 추가적인 보다 상세한 접근법으로서, Ub-변형 기판의 각 단백질 대역은 폴리아크릴아미드 겔로부터 추출되고 질량 분광법을 통해 분석될 수 있다. 연결 유형의 식별은 질병 관련 기질 분해경로(37,38)의특성화에 특히 중요한 E3 기질 상호 작용의 생리적 역할에 대한 이해를 뒷받침한다. 유사하게, 리신 방전 분석체는 E3 유비퀴틴 리개세 또는 E3 리게아제패밀리(30)의촉매 차이를 해소하는 효과적인 도구로 사용될 수 있다. 결론적으로, 본원에 기재된 체외 유비쿼터스 방법은 E3 리구아제 기능의 상이한 측면을 분석하는 효과적인 도구이다. 설명된 방법의 비교적 간단한 실행 외에, 주요 장점은 모든 진핵 소스에서 단백질이 특수 장비없이 시험관내에서 재조합및 연구될 수 있기 때문에 일반적인 적용성이다.

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Disclosures

저자는 이해상충이 없습니다.

Acknowledgments

우리는 원고에 대한 비판적 인 토론과 유용한 조언을 우리 실험실의 회원들에게 감사드립니다. 크기 제한으로 인해 귀중한 기여를 인용하지 않은 것에 대해 사과드립니다. 이 작품은 도이치 포르충스게마인샤프트(DFG, 독일 연구재단)-SFB 1218 - 프로제크넘 269925409 및 우수 EXC 229/CECAD 클러스터에서 TH까지 지원된다. 이 작품은 독일의 우수 전략인 EXC 2030 - 390661388 및 SFB 1218 - Projektnumber 269925409 T.H에 대한 독일의 우수 전략에 따라 도이치 포르스충스게마인샤프트(DFG, 독일 연구 재단)의 지원을 받았습니다. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 T.H. gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amershan Protran 0.1 µm NC GE Healthcare 10600000 nitrocellulose membrane
Anti-CHIP Cell Signaling 2080 Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6
Anti-MYC Roche OP10 Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10
Anti-ubiquitin Upstate 05-944 Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11
Apyrase Sigma A6535-100UN
ATP (10x) Enzo 12091903
BSA Sigma A6003-10G
EDTA Roth 8043.2
KCl Roth 6781.1
K2HPO4 Roth P749.2
KH2PO4 Roth 3904.1
LDS sample buffer (4x) novex B0007
L-Lysine Sigma L5501-5G
MES Roth 4256.4
MeOH VWR Chemicals 2,08,47,307 100%
Milchpulver Roth T145.3
NaCl Roth P029.3
NuPAGE Antioxidant invitrogen NP0005
NuPAGE Transfer buffer (20x) novex NP0006-1
Page ruler plus Thermo Fisher 26619 Protein ladder
RotiBlock Roth A151.1 Blocking reagent
SDS (20%) Roth 1057.1
S1000 Thermal Cycler Bio Rad 1852196
Trans-Blot Turbo Bio Rad 1704150EDU Transfer system
Tris base Roth 4855.3
Tween 20 Roth 9127.2
UbcH Enzyme Set BostonBiochem K-980B E2 enzymes
Ubiquitin BostonBiochem U-100H
Ubiquitin-activating enzyme E1 Enzo BML-UW941U-0050
Ubiquitylation buffer (10x) Enzo BML-KW9885-001
Whatman blotting paper Bio Rad 1703969 Extra thick filter paper

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생물학 제 171
<em>시험관 내</em> E3 유비퀴틴 리가제 기능 분석
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Müller, L., Kutzner, C. E.,… More

Müller, L., Kutzner, C. E., Balaji, V., Hoppe, T. In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function. J. Vis. Exp. (171), e62393, doi:10.3791/62393 (2021).

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