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Biology

In vitro Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase

Published: May 14, 2021 doi: 10.3791/62393
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Institute for Genetics and Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne

Summary

La présente étude fournit des protocoles détaillés de dosage d’ubiquitylation in vitro pour l’analyse de l’activité catalytique de l’ubiquitine ligase E3. Les protéines recombinantes ont été exprimées à l’aide de systèmes procaryotes tels que la culture d’Escherichia coli.

Abstract

La fixation covalente de l’ubiquitine (Ub) au(x) résidu(s) interne(s) de lysine d’une protéine de substrat, un processus appelé ubiquitylation, représente l’une des modifications post-traductionnelles les plus importantes chez les organismes eucaryotes. L’ubiquitylation est médiée par une cascade séquentielle de trois classes d’enzymes, notamment les enzymes activatrices de l’ubiquitine (enzymes E1), les enzymes conjuguant l’ubiquitine (enzymes E2) et les ligas d’ubiquitine (enzymes E3), et parfois les facteurs d’allongement de la chaîne ubiquitine (enzymes E4). Ici, des protocoles in vitro pour les tests d’ubiquitylation sont fournis, qui permettent l’évaluation de l’activité de l’ubiquitine ligase E3, la coopération entre les paires E2-E3 et la sélection du substrat. Les paires E2-E3 coopérantes peuvent être examinées en surveillant la génération de chaînes de poly-ubiquitine libres et/ou l’auto-ubiquitylation de la ligase E3. L’ubiquitylation du substrat est définie par liaison sélective de la ligase E3 et peut être détectée par transfert occidental de la réaction in vitro. En outre, un test de décharge E2 ~ Ub est décrit, ce qui est un outil utile pour l’évaluation directe de la coopération fonctionnelle E2-E3. Ici, le transfert dépendant de l’E3 de l’ubiquitine est suivi de l’enzyme E2 correspondante sur des acides aminés lysine libres (imitant l’ubiquitylation du substrat) ou des lysines internes de la ligase E3 elle-même (auto-ubiquitylation). En conclusion, trois protocoles in vitro différents sont fournis qui sont rapides et faciles à réaliser pour traiter la fonctionnalité catalytique de la ligase E3.

Introduction

L’ubiquitylation est le processus par lequel Ub est lié de manière covalente à une protéine de substrat1. La modification Ub est catalysée par des réactions enzymatiques successives impliquant l’action de trois classes d’enzymesdifférentes, à savoir les enzymes activatrices Ub (E1s), les enzymes conjuguantes Ub (E2s), les ligas Ub (E3s), et éventuellement les facteurs d’allongement de la chaîne Ub (E4s)2,3,4,5. Après l’activation de l’Ub dépendant de l’adénosine triphosphate (ATP) et du magnésium (Mg2+),le site actif cystéine d’E1 attaque la glycine C-terminale d’Ub, formant un complexe thioester (Ub ~E1). L’énergie tirée de l’hydrolyse de l’ATP permet à l’Ub d’atteindre un état de transition à haute énergie, qui est maintenu tout au long de la cascade enzymatique suivante. Ensuite, l’enzyme E2 transfère l’Ub activé à sa cystéine catalytique interne, formant ainsi une liaison transitoire Ub ~ E2 thioester. Par la suite, Ub est transféré à la protéine de substrat.

Cela peut être fait de deux manières. Soit la ligase E3 peut d’abord se lier à E2, soit la ligase E3 peut se lier directement à Ub. Cette dernière méthode aboutit à la formation d’un intermédiaire E3 ~ Ub. Dans les deux cas, Ub est lié à la protéine du substrat par la formation d’une liaison isopeptide entre le groupe carboxyle C-terminal d’Ub et le groupe lysine Ɛ-amino du substrat6. Le génome humain code deux E1, environ 40 E2, et plus de 600 ligases putatives d’ubiquitine7. Sur la base du mécanisme de transfert Ub de l’E3, les ligas Ub sont divisées en trois catégories impliquant le type Homologue au type E6AP C-Terminus (HECT), le type Really Interesting New Gene (RING) / U-box et le RING entre les ligas de type RING (RBR)8. Dans cette étude, la boîte en U contenant de la ligase, Carboxyl Terminus de la protéine en interaction HSC70 (CHIP), est utilisée comme enzyme E3 représentative. Contrairement aux enzymes E3 de type HECT qui forment des thioesters Ub ~ E3, le domaine U-box de CHIP lie E2 ~ Ub et favorise le transfert ultérieur Ub / substrat directement à partir de l’enzyme E28,9. Sur la base de l’importance de la boîte en U pour la fonction enzymatique, un mutant CHIP U-box inactif, CHIP (H260Q), est utilisé comme contrôle. CHIP(H260Q) ne parvient pas à se lier à ses E2 apparentés, perdant ainsi son activité de ligase E310.

L’ubiquitylation des protéines joue un rôle crucial dans la régulation d’une multitude d’événements cellulaires dans les cellules eucaryotes. La diversité des résultats cellulaires favorisés par l’attachement réversible des molécules Ub aux protéines du substrat peut être attribuée aux caractéristiques moléculaires de l’Ub. Comme Ub lui-même contient sept résidus de lysine (K) pour une ubiquitylation ultérieure, il existe une riche variété de types de chaînes Ub de tailles et/ou de topologies différentes11. Par exemple, les substrats peuvent être modifiés par une seule molécule Ub à une (mono-ubiquitylation) ou plusieurs lysines (multi mono-ubiquitylation), et même par des chaînes Ub (poly-ubiquitylation)11. Les chaînes Ub sont formées homo- ou heterotypiquement via les mêmes ou différents résidus de lysine d’Ub, ce qui pourrait même entraîner des chaînes Ub ramifiées9. Ainsi, l’ubiquitylation des protéines conduit à divers arrangements de molécules Ub qui fournissent des informations spécifiques, par exemple,pour la dégradation, l’activation ou la localisation des protéines conjuguées12,13. Ces différents signaux Ub permettent une reprogrammation rapide des voies de signalisation cellulaire, ce qui est une exigence importante pour la capacité de la cellule à répondre aux besoins environnementaux changeants.

Un aspect central de l’ubiquitylation est lié au contrôle de la qualité des protéines. Les protéines mal repliées ou irréversiblement endommagées doivent être dégradées et remplacées par des protéines nouvellement synthétisées pour maintenir l’homéostasie ou la protéostasie des protéines14. Le contrôle qualité E3 ligase, CHIP, collabore avec des chaperons moléculaires dans la dégradation Ub-dépendante des protéines endommagées9,15,16,17. En dehors de cela, CHIP régule la stabilité du chaperon dirigé par la myosine, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), qui est étroitement coordonné avec la fonction musculaire et les écarts par rapport aux niveaux optimaux conduisent à une myopathie humaine18,19,20,21. La dégradation de l’UNC-45B par le protéasome 26S est médiée par la fixation d’une chaîne poly-Ub liée au K489. En l’absence de protéines de substrat, CHIP effectue une auto-ubiquitylation10,22,23, qui est caractéristique des ligas d’ubiquitine RING/U-box E324,25 et considérée comme régulant l’activité de la ligase26. L’application des méthodes de dosage d’ubiquitylation in vitro décrites dans cet article a permis d’identifier systématiquement les enzymes E2 qui s’associent à CHIP pour favoriser la formation de chaînes poly-Ub libres et/ou l’auto-ubiquitylation de CHIP (section 2 du protocole). En outre, une ubiquitylation dépendante de CHIP de l’UNC-45B a été observée, qui est un substrat connu de la ligase E318,19 (section 3 du protocole). En fin de compte, le transfert dépendant de CHIP de l’Ub activé à partir du thioester Ub ~ E2 a été surveillé (section 4 du protocole).

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Protocol

1. Préparation des tampons et des réactifs

REMARQUE : Les tampons et les réactifs qui ont été préparés manuellement en laboratoire sont énumérés ci-dessous. Tous les autres tampons et réactifs utilisés dans les protocoles ont été achetés auprès de différentes sources et utilisés conformément aux instructions des fabricants.

  1. Préparez 10x solution saline tamponnée au phosphate (10x PBS). À cette fin, mélanger 1,37 M de chlorure de sodium (NaCl), 27 mM de chlorure de potassium (KCl), 80 mM de dihydrate de dihydrate d’hydrogène-phosphate disodique (Na2HPO4,2H2O) et 20 mM de phosphate de potassium-dihydrogène (KH2PO4) dans 1 L deH2Odouble distillé (ddH2O). Autoclavez le PBS 10x et préparez une solution 1x PBS en ddH2O.
    1. L’autoclavage est effectué pendant 15 min à 121 °C et 98,9 kPa.
      REMARQUE: L’autoclavage est effectué dans ces conditions pour tous les tampons et solutions. Sauf indication contraire, les solutions sont conservées à température ambiante (RT).
  2. Préparer 1 L de solution PBS-Tween (PBS-T) en ajoutant 0,1 % de Tween à 1 L de 1x PBS.
  3. Préparer 10 mL d’une solution mère de L-lysine de 0,5 Men dissolvant la L-lysine dans ddH2 O. Aliquoter L-lysine en portions de 1 mL et les conserver à -20 °C jusqu’à nouvel usage.
    REMARQUE: La L-lysine peut être congelée et décongelée à plusieurs reprises.
  4. Préparer une solution d’acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) de 0,25 M en dissolvant l’EDTA dans 200 mL de ddH2O.
    1. Ajuster le pH à 8,0 avec de l’hydroxyde de sodium (NaOH).
    2. Réglez le volume à 250 mL avec ddH2O.
    3. Autoclavez la solution.
  5. Préparer 10 mL d’une solution d’albumine sérique bovine (BSA) de 20 mg/mL en dissolvant le BSA dans ddH2O. Conserver à -20 °C dans des aliquotes de 200 μL.
    REMARQUE: BSA peut être congelé et décongelé à plusieurs reprises.
  6. Préparer 1 L de tampon d’acide 2-(N-morpholino)éthane sulfonique (MES) en dissolvant 50 mM de MES, 50 mM de base de Tris, 3,47 mM de dodécylsulfate de sodium (SDS) et 1,03 mM d’EDTA dans 0,9 L deddH2O. Après avoir mélangé correctement, réglez le volume à 1 L.
    1. Le pH du tampon 1x est de 7,6. N’ajustez pas le pH avec de l’acide ou de la base.
  7. Préparer 200 mL de solution bloquante (lait à 5 %) en dissolvant 10 g de lait en poudre dans 1x PBS-T. Conserver la solution bloquante à 4 °C jusqu’à une semaine.
  8. Préparer 1 L de tampon de transfert (voir le tableau des matériaux)selon les instructions du fabricant.
  9. Préparer 2x tampon d’échantillon de FDS en dissolvant 125 mM de base de Tris, 4 % de FDS, 4 % de glycérol, 0,03 % de bleu de bromophénol et 50 μL/mL de β-mercaptoéthanol dans 50 mL de ddH2O. Aliquotet en portions de 1 mL et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.

2. Essai d’auto-ubiquitylation in vitro

  1. Préparation et exécution des essais
    1. Calculer le volume de chaque réactif requis par réaction en fonction des molarités données des protéines et des concentrations protéiques des solutions protéiques. Par réaction d’auto-ubiquitylation, utilisez 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3 et 50 μM Ub. Réglez le volume de la réaction à 20 μL avec ddH2O.
      REMARQUE: La solution d’ATP et le tampon d’ubiquitylation ont été achetés en tant que solutions mères 10x et utilisés à 1x.
    2. Préparez un schéma de pipetage pour toutes les réactions. Testez neuf enzymes E2 différentes pour leur capacité à fonctionner (I) avec CHIP, (II) avec un mutant CHIP(H260Q) catalytiquement inactif, et (III) sans CHIP dans des réactions d’ubiquitylation individuelles.
    3. Pour éviter les erreurs de pipetage, préparez un mélange maître sur glace qui contient le volume requis pour toutes les réactions plus une réaction supplémentaire. Calculez la quantité de mélange maître requise par réaction.
      REMARQUE: Les composants du mélange maître sont des réactifs qui sont également requis pour chaque réaction, c’est-à-direE1, E3, Ub, ATP et tampon d’ubiquitylation.
    4. Ajouter ddH2O et le mélange maître aux tubes de réaction en chaîne par polymérase (PCR). Gardez les tubes sur la glace.
    5. Avant de commencer les réactions d’ubiquitylation en ajoutant les enzymes E2, mettez en place un cycleur thermique PCR avec le programme suivant: 2 h, 37 °C suivi de 4 °C, à l’infini.
    6. Ajouter 1 μM des enzymes E2 dans les tubes respectifs et incuber les échantillons dans le cycleur thermique PCR pendant la période indiquée.
    7. Après 2 h, ajoutez un tampon d’échantillon SDS à chaque réaction et mélangez en pipetant plusieurs fois de haut en bas.
      REMARQUE : Le volume requis du tampon d’échantillon dépend de la concentration en stock du tampon d’échantillon. Ici, 20 μL de tampon d’échantillon SDS 2x ont été ajoutés à chaque réaction.
    8. Faire bouillir les échantillons immédiatement à 95 °C pendant 5 min, et continuer avec l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE). Conserver les protéines dénaturées à -20 °C.
  2. Électrophorèse sur gel et transfert western
    1. Après la décongélation, faites tourner les échantillons pendant environ 10 s et chargez le gel SDS-PAGE. Utilisez une échelle de protéines comme référence de taille.
      REMARQUE: Ici, 4-12% de gels de gradient Bis-Tris et 3 μL d’échelle de protéines ont été utilisés. Divisez les volumes d’échantillon et chargez deux gels de manière égale en utilisant 20 μL de chaque échantillon.
    2. Faites couler le gel à 160-200 V pendant environ 30-45 min afin que le front de l’échantillon atteigne le fond du gel.
    3. Transférer chaque gel dans un récipient en plastique rempli de tampon de buvard semi-sec et l’incuber pendant 2 à 5 minutes à RT. Retirez le gel empilable.
    4. Préparez deux morceaux de papier buvard de la taille d’un gel et une membrane de nitrocellulose de la taille d’un gel de la taille d’un gel et pré-trempez dans un tampon de buvard semi-sec. Assemblez le sandwich western blot (WB) dans une chambre WB de bas en haut dans l’ordre suivant : papier buvard, membrane de nitrocellulose, gel SDS-PAGE, papier buvard.
    5. Enlevez les bulles d’air qui peuvent avoir été piégées entre les couches sandwich. À cette fin, utilisez un rouleau pour rouler soigneusement sur le sandwich plusieurs fois.
    6. Fermez la chambre et laissez l’excès de tampon de transfert s’écouler.
    7. Placez la chambre dans le dispositif de buvard respectif et utilisez le programme suivant pour le buvard semi-sec: 25 V, 1,0 A, 30 min.
    8. Transférer la membrane tachée dans un récipient en plastique rempli de solution bloquante et incuber pendant 30 min à TA.
    9. Préparer la solution d’anticorps primaire en ajoutant l’anticorps à 10 mL de PBS-T contenant un réactif bloquant (voir la Table des matériaux).
      REMARQUE: La concentration de travail de l’anticorps est spécifique à l’anticorps. Dans ce cas, un anticorps anti-ubiquitine monoclonal de souris a été utilisé à une dilution de 1:5 000. Pour le deuxième gel, un anticorps monoclonal anti-CHIP de lapin a été utilisé à 1:5 000 dans le pbS-T/réactif bloquant.
    10. Remplacer la solution bloquante par la solution d’anticorps primaire et incuber pendant la nuit à 4 °C sur une bascule.
    11. Lavez la membrane trois fois pendant 10 min avec du PBS-T.
    12. Préparer la solution d’anticorps secondaire en ajoutant l’anticorps respectif à 10 mL de PBS-T.
      REMARQUE: Ici, les anticorps anti-souris et anti-lapin de chèvre et de souris sont utilisés à une dilution de 1:10 000.
    13. Incuber la membrane avec l’anticorps secondaire pendant 1 h à TA sur une bascule.
    14. Lavez la membrane trois fois pendant 5 min avec PBS-T.
  3. Analyse des données
    1. Ajouter des réactifs de détection par transfert western pour les anticorps conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) à la membrane lavée conformément aux instructions du fabricant, et capturer le signal HRP à l’aide de films à rayons X ou d’une caméra à couplage de charge (Figure 1).

3. Essai d’ubiquitylation de substrat in vitro

  1. Préparation et exécution des essais
    1. Calculer le volume de chaque réactif requis par réaction, en fonction des molarités données des protéines et des concentrations protéiques des solutions protéiques. Par réaction d’ubiquitylation du substrat, utilisez 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3, 1 μM de substrat et 50 μM Ub. Utilisez 10x solution d’ATP et 10x tampon d’ubiquitylation à 1x. Ajuster le volume de la réaction d’ubiquitylation du substrat à 20 μL avec ddH2O.
    2. Préparez un schéma de pipetage pour toutes les réactions. Inclure des réactions de contrôle appropriées vérifiant que l’ubiquitylation du substrat est spécifique à l’E3. Utilisez la protéine UNC-45B comme substrat représentatif de CHIP et un mutant CHIP catalytiquement inactif (H260Q) comme témoin. Préparer les réactions suivantes: E1, E2, Ub mélange (y compris Ub, ATP, tampon d’ubiquitylation); E1, E2, mélange Ub, UNC-45B; E1, E2, Ub mix, CHIP(H260Q), UNC-45B; et E1, E2, Ub mix, CHIP, UNC-45B.
    3. Pour éviter les erreurs de pipetage, préparez un mélange maître sur glace qui contient le volume requis pour toutes les réactions plus une réaction supplémentaire. Calculez le volume du mélange principal requis par réaction.
      REMARQUE: Les composants du mélange principal pour ce test comprennent E1, E2, Ub, ATP et tampon d’ubiquitylation.
    4. Ajouter les composants de réaction dans l’ordre suivant : ddH2O, substrat, E3 ligase.
    5. Avant de commencer la réaction d’ubiquitylation par addition du mélange maître, mettez en place un cycleur thermique PCR avec le programme suivant: 2 h, 37 °C suivi de 4 °C, à l’infini.
    6. Ajouter le mélange maître à chaque tube et incuber les échantillons dans le cycleur thermique PCR pendant la période indiquée.
    7. Après 2 h, ajoutez 2x tampon d’échantillon SDS à chaque réaction et mélangez en pipetant plusieurs fois de haut en bas.
    8. Après l’exécution, faire bouillir les échantillons immédiatement à 95 °C pendant 5 min, puis continuer avec PAGE. Alternativement, stockez les protéines dénaturées à -20 °C.
  2. Électrophorèse sur gel et transfert western
    1. Effectuer l’électrophorèse sur gel et le transfert western comme décrit à la rubrique 2.2. Utilisez des anticorps spécifiques pour la détection du substrat et de la ligase E3, respectivement.
      REMARQUE: Ici, UNC-45B est fusionné à une étiquette de protéine polypeptidique dérivée du produit du gène c-myc permettant l’utilisation d’un anticorps anti-MYC monoclonal de souris. Anti-MYC est utilisé à 1:10 000.
  3. Analyse des données
    1. Effectuer l’analyse des données comme décrit à la section 2.3 (Figure 2).

4. Dosage de décharge de lysine

  1. Préparation et exécution des essais
    1. Charge de l’enzyme E2 avec Ub par E1
      1. Calculer le volume de chaque réactif requis par réaction en fonction des molarités données des protéines et des concentrations protéiques des solutions protéiques. Par réaction de charge, utilisez 2 μM E1, 4 μM E2 et 4 μM d’ubiquitine sans lysine (Ub K0). Utilisez 10x ATP et 10x tampon d’ubiquitylation à 1x. Réglez le volume de la réaction de charge à 20 μL avec ddH20.
        REMARQUE: Le mutant Ub K0 sans lysine est utilisé pour renforcer la production exclusive d’E2 mono-ubiquitylé. Ub de type sauvage peut également être utilisé; cependant, cela pourrait conduire à diverses modifications E2 ~ Ub(par exemple,poly-ubiquitylation de E2), qui sont plus difficiles à analyser. Pour la première utilisation ou lors de l’utilisation d’une nouvelle enzyme E2, déterminez le niveau de charge Ub sur E2 qui peut être atteint par E1. Pour déterminer le rendement de la charge, visualisez l’E2 non chargé par rapport à l’E2 chargé via la coloration coomassie. Ici, environ la moitié de Ub K0 a été convertie de manière fiable en UBE2D2 ~ Ub lors de l’utilisation de rapports équimolaires de UBE2D2 et Ub K0(figure supplémentaire S2A).
      2. Préparez un schéma de pipetage pour la réaction de charge. Ajustez le volume de la réaction de charge aux réactions de décharge ultérieures de votre choix, par exemple,utilisez CHIP et CHIP (H260Q) dans des réactions de décharge individuelles. Ainsi, préparez le double du volume d’une réaction de charge.
        REMARQUE: Pour la première utilisation, testez différentes concentrations de la ligase E3 de votre choix pour surveiller les conditions de décharge optimales et analysez-les par transfert western. Dans des conditions idéales, la décharge d’Ub de E2 augmentera au fil du temps jusqu’à ce que la bande protéique E2 ~ Ub respective disparaisse.
      3. Incuber la réaction de charge pendant 15 min à 37 °C.
    2. Fin de la réaction de charge
      1. Arrêter la réaction de charge par addition d’apyrase à une concentration finale de 1,8 U/mL. Effectuer l’incubation avec de l’apyrase pendant 5 min à RT, suivie de l’ajout d’EDTA à une concentration finale de 30 mM. Réglez le volume de la réaction de charge à 30 μL avec ddH2O.
        REMARQUE: L’apyrase est utilisée pour convertir les molécules d’ATP en molécules d’ADP (adénosine diphosphate). Comme l’activité de l’enzyme E1 dépend de l’ATP, E1 ne peut plus charger E2. L’EDTA est également utilisé pour s’assurer que l’E1 est inhibé par la trempe des ions Mg2+ qui sont des cofacteurs nécessaires pour l’E1. Le volume d’apyrase nécessaire pour arrêter la réaction peut varier selon les conditions d’essai. Bien que l’apyrase seule éteigne déjà les molécules d’ATP disponibles, une combinaison d’apyrase et d’EDTA était plus efficace pour arrêter la réaction de charge de la paire E1-UBE2D2. Comme l’arrêt de la réaction est un facteur critique pour la reproductibilité du test, un arrêt efficace doit être testé pour les nouvelles paires E1-E2. À cette fin, configurez une réaction de charge, arrêtez-la et collectez des échantillons à des moments précis, par exempleaprès 2, 5, 10 et 15 minutes. Les niveaux inchangés de E2 ~ Ub indiquent que la réaction s’est arrêtée et que le thioester était stable pendant cette période de temps (Figure supplémentaire S2B).
    3. Décharge de E2 ~ Ub par E3
      1. Préparer quatre tubes correspondant aux différents points temporels (t0, t1, t2, t3); ajouter un tampon d’échantillon non réducteur (6,7 μL de tampon 4x de dodécylsulfate de lithium (LDS)) à chaque tube.
        Remarque : N’utilisez pas d’agent réducteur dans l’exemple de tampon.
      2. Retirez 6 μL de la réaction de charge arrêtée pour t0et réglez le volume à 20 μL avec ddH2O.
      3. Incuber l’échantillon t0 pendant 10 min à 70 °C.
        REMARQUE: Ne pas faire bouillir l’échantillon en prolongeant le temps d’incubation car les thioesters sont labiles à des températures plus élevées.
      4. Calculer le volume de chaque réactif requis par réaction de décharge. Utilisez les 24 μL restants de l’E2 chargé et ajoutez 10 mM de L-lysine, 1 mg/ml de BSA et 500 nM de ligase E3. Utilisez le tampon d’ubiquitylation à 1x et réglez le volume à 80 μL avec ddH2O.
      5. Préparez un schéma de pipetage pour toutes les réactions de décharge et utilisez CHIP(H260Q) comme contrôle en plus de CHIP(WT).
      6. Mettez en place des réactions de décharge sur la glace en ajoutant les composants requis dans l’ordre suivant: ddH2O, tampon d’ubiquitylation, BSA, lysine, ligase E3 et E2 chargé pour démarrer la réaction.
      7. Incuber la réaction de décharge à RT.
      8. Prélever des échantillons après 5, 30 et 60 min en transférant 20 μL de la réaction de décharge dans les tubes d’échantillonnage respectifs.
        REMARQUE: Les points temporels appropriés qui permettent une surveillance appropriée de la décharge peuvent varier entre les paires E2-E3.
      9. Vortex l’échantillon immédiatement, et l’incuber à 70 °C pendant 10 min.
      10. Passez directement à PAGE.
        REMARQUE: E2 ~ Ub thioesters peuvent être labiles même après la dénaturation dans le tampon de l’échantillon. Ainsi, l’électrophorèse sur gel doit être effectuée directement après l’exécution du test.
  2. Électrophorèse sur gel et transfert western
    1. Effectuer l’électrophorèse sur gel et le transfert western comme décrit à la rubrique 2.2. Utilisez un anticorps spécifique à l’Ub et, si disponible, utilisez également un anticorps spécifique à l’E3 qui a été élevé chez une espèce différente, permettant la détection simultanée du signal de ligase Ub et E3.
  3. Analyse des données
    1. Effectuer l’analyse des données comme décrit à la section 2.3 (Figure 3).

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Representative Results

Pour identifier les enzymes E2 qui coopèrent avec l’ubiquitine ligase CHIP, un ensemble de candidats E2 a été testé dans des réactions d’ubiquitylation in vitro individuelles. Les paires E2-E3 coopérantes ont été surveillées par la formation de produits d’ubiquitylation dépendants de l’E3, c’est-à-direl’auto-ubiquitylation de la ligase E3 et la formation de polymères Ub libres. Les produits d’ubiquitylation ont été analysés par western blotting. L’interprétation des données est basée sur la comparaison de la taille des bandes protéiques résultantes avec des marqueurs de poids moléculaire. L’ubiquitylation des protéines conduit à la formation de motifs de bandes spécifiques caractérisés par l’apparition de doubles bandes ou de bandes itératives multiples avec une différence de taille respective de 8,6 kDa (taille d’une seule molécule Ub).

Ici, la capacité de neuf E2 à favoriser la formation de produits d’ubiquitylation a été testée en présence de CHIP de type sauvage (Figure 1A), du mutant U inactif CHIP (H260Q) (Figure 1B), ou sans CHIP (Figure supplémentaire S1). Des produits d’ubiquitine indépendants de l’E3 ont été formés en présence de CHIP inactif et en l’absence de CHIP(Figure 1B et Figure supplémentaire S1). Le CHIP inactif n’était pas auto-ubiquitylé (Figure 1B). En revanche, le CHIP de type sauvage était auto-ubiquitylé lorsqu’il était combiné avec des membres de la famille UBE2D (D1-D3) et des membres de la famille UBE2E (E1, E3), respectivement(Figure 1A,voies 3, 4 et 5). Alors que les chaînes poly-Ub libres ont été produites en coopération avec UBE2D1-3, cela n’a pas été détecté pour UBE2E1 ou UBE2E3, respectivement (Figure 1A, voies 6 et 7).

La capacité de la famille UBE2D à favoriser à la fois la formation de polymères Ub libres et l’auto-ubiquitylation de CHIP a été attribuée à la présence d’un site de liaison à l’ubiquitine non covalent à l’arrière de l’E227,28. De même, la formation exclusive de chaînes Ub libres par UBE2N/V1(Figure 1A,voie 9) a été attribuée à la liaison d’Ub par une sous-unité UBE2V1 spécifique (sous-unité Uev), dirigeant la formation de chaînes Ub liées à K6329. Aucun produit d’ubiquitylation n’a été formé en présence d’UBE2C1 et d’UBE2H(figure 1A,voies 2 et 8). En conclusion, CHIP peut collaborer avec plusieurs enzymes E2 in vitro; cependant, son auto-ubiquitylation est spécifique à l’enzyme E2.

Ensuite, la paire UBE2D2-CHIP a été utilisée pour étudier l’ubiquitylation du chaperon dirigé par la myosine, UNC-45B, par l’activité de la ligase CHIP (Figure 2). L’ubiquitylation du substrat a été analysée par transfert western. UNC-45B non ubiquitylé a un poids moléculaire de 103 kDa(Figure 2,voie 4). Le mutant U-box inactif de CHIP n’a effectué ni ubiquitylation de l’UNC-45B ni auto-ubiquitylation (Figure 2, voie 3). En revanche, l’ubiquitylation de l’UNC-45B et l’auto-ubiquitylation de CHIP ont été détectées lors de l’incubation avec un CHIP de type sauvage (Figure 2, voie 6). Ainsi, CHIP peut ubiquitylater UNC-45B in vitro,suggérant que UNC-45B est un substrat conservé de CHIP18.

En fin de compte, l’activité catalytique de CHIP a été analysée en l’absence de toute protéine de substrat. À cette fin, un test de décharge de lysine a été effectué dans lequel des acides aminés de lysine libres peuvent servir d’accepteur Ub en l’absence de substrats E3 (Figure 3, Figure supplémentaire S2C). Le test de décharge consiste en une étape de charge au cours de laquelle Ub est chargé sur l’E2 par E1, une étape d’arrêt pour empêcher le chargement ultérieur d’Ub sur E2 et une étape de décharge où Ub est transféré du thioester transitoire Ub ~ E2 sur les acides aminés lysine libres et / ou sur les résidus de lysine de la ligase E3. L’analyse par transfert Western a été effectuée pour visualiser à la fois les protéines modifiées par Ub et la ligase E3 CHIP. L’enzyme UBE2D2 non chargée a un poids moléculaire de 17 kDa(figure supplémentaire S2C).

Lorsqu’il est chargé avec une seule molécule Ub - assurée par l’utilisation d’Ub sans lysine (Ub K0) - le poids moléculaire de UBE2D2 ~ Ub se déplace vers le haut à environ 26 kDa. Le point de temps zéro (t0) représente le rendement global de l’E2 chargé(Figure 3). En présence de CHIP inactif (35 kDa), une faible décharge indépendante de la ligase E3 d’UBE2D230,31, mais aucune auto-ubiquitylation de CHIP, a été détectée. En revanche, en présence de CHIP de type sauvage (35 kDa), une décharge plus rapide d’UBE2D2 a été détectée, donnant une décharge complète en 60 minutes. Simultanément, une auto-ubiquitylation de CHIP a été observée, indiquant que CHIP favorisait le transfert d’Ub sur ses propres résidus de lysine.

Figure 1
Figure 1: Analyse par transfert western pour la collaboration enzymatique E2-E3 in vitro. Des réactions d’auto-ubiquitylation in vitro avec différentes enzymes E2 humaines (de gauche à droite : vide, UBE2-D1, -D2, -D3, -E1, -E3, -H et -N/V1) ont été réalisées comme indiqué en utilisant(A)CHIP de type sauvage ou(B)le mutant inactif CHIP U-box, CHIP(H260Q), sous forme de ligase d’ubiquitine E3. Les échantillons ont été divisés également, exécutés sur des gels de polyacrylamide séparés et immunodiffusés avec des anticorps anti-CHIP et anti-Ub pour visualiser les produits de réaction. Abréviations : Ub = ubiquitine ; CHIP = terminaison carboxyle de la protéine interagissant avec HSC70; ATP = adénosine triphosphate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Analyse par transfert western surveillant l’ubiquitylation du substrat. Des réactions d’ubiquitylation de substrat in vitro ont été réalisées comme indiqué pour détecter l’ubiquitylation de l’UNC-45B humain par CHIP de type sauvage ou le mutant inactif CHIP U-box, CHIP(H260Q). L’UBE2D2 humain a été utilisé comme enzyme E2. Abréviations: WT = wild-type; Ub = ubiquitine; CHIP = terminaison carboxyle de la protéine interagissant avec HSC70. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Analyse western blot surveillant le transfert Ub dépendant de CHIP à partir de UBE2D2 ~Ub thioester. La charge de l’UBE2D2 humain par Ub sans lysine (Ub K0), l’arrêt de la réaction de charge et la décharge de l’UBE2D2 ~ Ub ont été effectués comme décrit. Pour les réactions de décharge, chip de type sauvage ou le mutant inactif CHIP U-box, CHIP(H260Q), ont été utilisés comme ligas d’ubiquitine et 10 mM de L-lysine ont été fournis comme accepteur potentiel d’Ub. Les échantillons ont été prélevés après les périodes indiquées, exécutés sur un gel de polyacrylamide et immunodiffusés avec un mélange d’anticorps anti-Ub/anti-CHIP. Abréviations : Ub = ubiquitine ; CHIP = terminaison carboxyle de la protéine interagissant avec HSC70; ATP = adénosine triphosphate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Surveillance représentative par transfert de Western des activités de l’enzyme E2 en l’absence d’E3. Des réactions d’ubiquitylation in vitro avec différentes enzymes E2 humaines (de gauche à droite : vide, UBE2-D1, -D2, -D3, -E1, -E3, -H et -N/V1) ont été réalisées comme indiqué en l’absence d’une ligase E3 pour dépister les produits de réaction indépendants de l’E3. Les échantillons ont été exécutés sur un gel de polyacrylamide et immuno-gonflés avec de l’anti-Ub. Abréviations : Ub = ubiquitine ; ATP = adénosine triphosphate. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2: Analyse du rendement de charge et de la stabilité de l’UBE2D2 ~ Ub K0 thioester. (A) Le rendement de la charge UBE2D2 obtenu par E1 a été testé dans diverses conditions. La première réaction de charge (I) consistait en 5 μM E1, 5 μM E2 et 50 μM Ub K0. La deuxième réaction de charge (II) consistait en 2 μM E1, 4 μM E2 et 4 μM Ub K0. Les réactions de charge ont été effectuées comme décrit pendant 30 min à 37 °C. Les échantillons ont été prélevés après 15 et 30 minutes. Les réactions ont été arrêtées par l’ajout de 4x tampon d’échantillon LDS et incubées à 70 °C pendant 10 min avant l’électrophorèse sur gel et la coloration de Coomassie. UBE2D2 non chargé a été utilisé comme contrôle. Environ la moitié de l’UBE2D2 a été convertie en UBE2D2 ~ Ub. Aucune charge supplémentaire n’a été détectée après 15 minutes. De plus, ni l’augmentation de e1 ni l’augmentation de l’ubiquitine libre n’ont modifié le rendement de charge de UBE2D2 ~ Ub. Ainsi, la charge a ensuite été effectuée pendant 15 min à 37 °C en utilisant 2 μM E1, 4 μM E2 et 4 μM Ub K0. (B) Après la charge, la réaction a été arrêtée par addition de 1,8 U/mL d’apyrase et de 30 mM d’EDTA et incubée à RT. Des échantillons ont été prélevés après 2, 5, 8, 10 et 15 min (voies 2 à 6), et l’UBE2D2 non chargé a été utilisé comme témoin (voie 1). 4x tampon d’échantillon LDS a été ajouté, et les échantillons ont été incubés à 70 ° C pendant 10 minutes avant l’électrophorèse sur gel et la coloration de Coomassie. L’arrêt était efficace, mesuré par l’intensité de la bande constante de la protéine UBE2D2 ~ Ub, indiquant également que le thioester était stable pendant la période indiquée. (C) La charge de l’UBE2D2 humain par Ub sans lysine (Ub K0), l’arrêt de la réaction de charge et la décharge de l’UBE2D2 ~ Ub ont été effectués comme décrit. Pour les réactions de décharge, chip de type sauvage ou mutant inactif CHIP U-box, CHIP (H260Q) ont été utilisés comme ligas d’ubiquitine, et 10 mM de L-lysine ont été fournis comme accepteur potentiel d’Ub. Les échantillons ont été prélevés après les périodes indiquées, exécutés sur des gels de polyacrylamide séparés et colorés par Coomassie. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Cet article décrit les méthodes d’ubiquitylation in vitro de base pour l’analyse de la fonction de la ligase E3. Lors de la réalisation de tests d’ubiquitylation in vitro, il convient de considérer que certaines enzymes E2 peuvent effectuer une auto-ubiquitylation en raison de l’attaque de leur cystéine active sur leurs propres résidus de lysine situés à proximité du site actif30. Pour contourner ce problème, l’utilisation d’un mutant E2 est recommandée dans lequel le résidu de lysine respectif est échangé contre de l’arginine, ce qui donne une enzyme E2 catalytiquement active résistante à l’auto-ubiquitylation32. Ceci est particulièrement important lors de la surveillance du transfert d’Ub via des tests de décharge de lysine pour assurer la reproductibilité du test. Un autre facteur critique est la nature transitoire de la liaison E2 ~ Ub thioester. Dans le cas où la stabilité du thioester limite les applications in vitro possibles, le résidu actif de cystéine de l’E2 pourrait être échangé contre une sérine pour générer un oxyester E2~Ub plus stable33. Pour la première utilisation ou lors de l’utilisation d’une nouvelle enzyme E2, déterminez le niveau de charge Ub sur E2 qui peut être atteint par E1. L’efficacité de charge peut être affectée par plusieurs facteurs, notamment l’origine de l’espèce E1, la température de la réaction de charge et le rapport molaire Ub / E2. Pour déterminer le rendement de charge, visualisez les fichiers non chargés par rapport à. chargé E2 via la coloration coomassie.

Dans l’ensemble, ces restrictions potentielles soulignent l’importance de l’optimisation empirique des conditions de dosage in vitro, telles que la paire E2-E3, la cinétique de charge et de décharge E2, la molarité et l’activité des protéines recombinantes, en particulier pour le test de décharge de lysine, afin d’obtenir des résultats reproductibles. Compte tenu des diverses fonctions cellulaires de la fixation covalente de l’Ub aux protéines du substrat, l’analyse de l’ubiquitylation des protéines est un domaine de recherche populaire. Cependant, l’analyse des événements d’ubiquitylation peut être difficile, en particulier in vivo. Cette difficulté provient de multiples facteurs dont la nature transitoire de l’interaction E3-substrat34,la redondance de nombreuses ligas E3, ainsi que la promiscuité des ligas E3 pour plusieurs substrats35. En outre, la caractérisation d’événements d’ubiquitylation spécifiques in vivo est entravée par l’existence de facteurs contributifs supplémentaires tels que les facteurs d’allongement de la chaîne d’ubiquitine et les enzymes de désubiquitylation qui modulent la topologie de la chaîne d’ubiquitine36. Ces contraintes soulignent l’importance de techniques in vitro robustes qui aident à caractériser les activités enzymatiques des ligas d’ubiquitine E3 dans un système recombinant défini.

Outre les applications décrites, les tests d’ubiquitylation in vitro peuvent également être utilisés pour détecter le type de liaison Ub en utilisant des anticorps spécifiques de type liaison. Comme approche supplémentaire plus détaillée, la bande protéique respective du substrat modifié par Ub peut être extraite du gel de polyacrylamide et analysée par spectrométrie de masse. L’identification du type de liaison permet de comprendre le rôle physiologique de l’interaction E3-substrat, qui revêt une importance particulière pour la caractérisation des voies de dégradation du substrat associées à la maladie37,38. De même, le test de décharge de lysine peut être utilisé comme un outil efficace pour démêler les différences catalytiques entre les ligas d’ubiquitine E3 ou les familles de ligase E330. En conclusion, les méthodes d’ubiquitylation in vitro décrites ici sont des outils efficaces pour analyser différents aspects de la fonction de la ligase E3. Outre l’exécution relativement simple des méthodes décrites, un avantage majeur est l’applicabilité générale car les protéines de toutes les sources eucaryotes pouvaient être exprimées et étudiées in vitro de manière recombinante sans avoir besoin d’un équipement spécial.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous remercions les membres de notre laboratoire pour leur discussion critique et leurs conseils utiles sur le manuscrit. Nous nous excusons de ne pas avoir cité de précieuses contributions en raison de la limitation de taille. Ce travail est soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 et Cluster of Excellence EXC 229 / CECAD à TH. Ce travail a été financé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne - EXC 2030 - 390661388 et - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 to T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 an T.H. gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amershan Protran 0.1 µm NC GE Healthcare 10600000 nitrocellulose membrane
Anti-CHIP Cell Signaling 2080 Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6
Anti-MYC Roche OP10 Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10
Anti-ubiquitin Upstate 05-944 Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11
Apyrase Sigma A6535-100UN
ATP (10x) Enzo 12091903
BSA Sigma A6003-10G
EDTA Roth 8043.2
KCl Roth 6781.1
K2HPO4 Roth P749.2
KH2PO4 Roth 3904.1
LDS sample buffer (4x) novex B0007
L-Lysine Sigma L5501-5G
MES Roth 4256.4
MeOH VWR Chemicals 2,08,47,307 100%
Milchpulver Roth T145.3
NaCl Roth P029.3
NuPAGE Antioxidant invitrogen NP0005
NuPAGE Transfer buffer (20x) novex NP0006-1
Page ruler plus Thermo Fisher 26619 Protein ladder
RotiBlock Roth A151.1 Blocking reagent
SDS (20%) Roth 1057.1
S1000 Thermal Cycler Bio Rad 1852196
Trans-Blot Turbo Bio Rad 1704150EDU Transfer system
Tris base Roth 4855.3
Tween 20 Roth 9127.2
UbcH Enzyme Set BostonBiochem K-980B E2 enzymes
Ubiquitin BostonBiochem U-100H
Ubiquitin-activating enzyme E1 Enzo BML-UW941U-0050
Ubiquitylation buffer (10x) Enzo BML-KW9885-001
Whatman blotting paper Bio Rad 1703969 Extra thick filter paper

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Biologie numéro 171
<em>In vitro</em> Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase
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Müller, L., Kutzner, C. E.,… More

Müller, L., Kutzner, C. E., Balaji, V., Hoppe, T. In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function. J. Vis. Exp. (171), e62393, doi:10.3791/62393 (2021).

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