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Teste Rápido de Suscetibilidade a Antimicrobianos por Imagem de Dispersão Raman Estimulada da Incorporação de Deutério em uma Única Bactéria

Published: February 14, 2022 doi: 10.3791/62398
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,4,5
1Department of Electrical and Computer Engineering, Boston University, 2Boston University Photonics Center, Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering, Boston University, 5Department of Chemistry, Boston University

Summary

Este protocolo apresenta ensaio rápido de suscetibilidade antimicrobiana (AST) em até 2,5 h por imagem de espalhamento Raman estimulado por célula única do metabolismo de D2O. Este método aplica-se a bactérias no ambiente urinário ou no sangue total, o que é transformador para AST fenotípica de célula única rápida na clínica.

Abstract

Para retardar e prevenir a propagação de infecções resistentes a antimicrobianos, o teste rápido de suscetibilidade antimicrobiana (AST) é urgente para determinar quantitativamente os efeitos antimicrobianos sobre os patógenos. Normalmente, leva dias para completar o AST por métodos convencionais baseados na cultura de longo prazo, e eles não funcionam diretamente para amostras clínicas. Aqui, relatamos um método AST rápido possibilitado por imagens estimuladas de espalhamento Raman (SRS) da incorporação metabólica de óxido de deutério (D2O). A incorporação metabólica de D2O na biomassa e a inibição da atividade metabólica após a exposição a antibióticos no nível de uma única bactéria são monitoradas por imagens SRS. A concentração de inativação do metabolismo unicelular (SC-MIC) de bactérias após a exposição a antibióticos pode ser obtida após um total de 2,5 h de preparação e detecção da amostra. Além disso, este método AST rápido é diretamente aplicável a amostras bacterianas em ambientes biológicos complexos, como urina ou sangue total. A imagem metabólica SRS da incorporação de deutério é transformadora para AST fenotípica rápida de célula única na clínica.

Introduction

A resistência antimicrobiana (RAM) é uma ameaça global crescente ao tratamento eficaz de doenças infecciosas1. Prevê-se que a RAM causará mais 10 milhões de mortes por ano e uma perda de PIB global de US $ 100 trilhões até 2050 se nenhuma ação para combater bactérias resistentes a antibióticos for tomada 1,2. Isso enfatiza a necessidade urgente de métodos diagnósticos rápidos e inovadores para o teste de suscetibilidade a antibióticos (AST) de bactérias infecciosas para retardar o surgimento de bactérias resistentes a antibióticos e reduzir a taxa de mortalidade relacionada3. Para garantir o melhor resultado clínico possível, é crucial introduzir uma terapia eficaz dentro de 24 horas. No entanto, o método padrão-ouro atual, como o método de difusão em disco ou diluição em caldo, geralmente requer pelo menos 24 h para o procedimento de pré-incubação para amostras clínicas e um adicional de 16-24 h para obter os resultados da concentração inibitória mínima (CIM). No geral, esses métodos são muito demorados para orientar uma decisão imediata para o tratamento de doenças infecciosas na clínica, o que leva ao surgimento e disseminação da resistência antimicrobiana4.

Métodos genotípicos de AST, como técnicas baseadas em reação em cadeia da polimerase (PCR)5, foram desenvolvidos para detecção rápida. Tais técnicas medem as sequências genéticas de resistência específicas, a fim de fornecer resultados rápidos de AST. Eles não dependem de cultura celular demorada; no entanto, apenas sequências genéticas específicas conhecidas com resistência são testadas. Portanto, sua aplicação é limitada a várias espécies bacterianas ou diferentes mecanismos de resistência. Além disso, não podem fornecer resultados de CIM para as decisões terapêuticas 6,7. Além disso, novos métodos fenotípicos para AST rápida estão em desenvolvimento para superar essas limitações8, incluindo dispositivos microfluídicos 9,10,11,12,13, dispositivos ópticos14,15,16, AST fenotípicos quantificando a cópia de ácidos nucleicos número 17,18 e métodos espectroscópicos Raman 19, 20,21,22,23,24. Esses métodos reduzem o tempo para orientar os resultados da AST, no entanto, a maioria deles só é aplicável a isolados bacterianos, não diretamente a espécimes clínicos, e ainda requer pré-incubação de longo prazo.

Neste trabalho, apresentamos um método para determinação rápida da suscetibilidade de bactérias na urina e no sangue total via monitoramento da atividade metabólica celular por meio de imagens SRS. A água (H2O) participa na grande maioria dos processos essenciais de síntese biomolecular em células vivas. Como um isotólogo da água, através da reação de troca H/D catalisada por enzimas entre o átomo de hidrogênio redox-ativo no NADPH e o átomo D em D2O, o deutério pode ser incorporado à biomassa dentro de uma célula25,26. Uma reação de síntese de ácidos graxos deuterados é mediada pelo deutério marcado NADPH. A incorporação de D2O em reações de aminoácidos (AAs) resulta na produção de proteína deuterada26 (Figura 1). Desta forma, as biomoléculas contendo ligações C-D recém-sintetizadas em células microbianas únicas podem ser empregadas como um marcador geral de atividade metabólica a ser detectado. Para ler ligações C-D sintetizadas de novo, a espectroscopia Raman, uma ferramenta analítica versátil que fornece informações químicas específicas e quantitativas de biomoléculas, é amplamente utilizada para determinar a suscetibilidade antimicrobiana e reduzir significativamente o tempo de teste para algumas horas27,28,29,30 . No entanto, devido à baixa eficiência inerente do processo de espalhamento Raman, a espectroscopia Raman espontânea é de baixa sensibilidade de detecção. Portanto, é um desafio obter resultados de imagem em tempo real usando espectroscopia Raman espontânea. O espalhamento Raman coerente (SRS), incluindo o espalhamento Raman anti-Stokes coerente (CARS) e o espalhamento Raman estimulado (SRS), atingiu alta sensibilidade de detecção devido ao campo de luz coerente para gerar ordens de magnitude maiores do que a da espectroscopia Raman espontânea, tornando assim imagens químicas de alta velocidade, específicas e quantitativas no nível de célula única 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

Aqui, com base em nosso trabalho mais recente40, apresentamos um protocolo para determinação rápida da atividade metabólica e suscetibilidade antimicrobiana por imagem C-D SRS de femtossegundos da incorporação de bactérias D2O no meio normal, urina e ambiente sanguíneo total no nível unicelular. A imagem SRS de femtossegundos facilita o monitoramento da concentração de inativação do metabolismo de célula única (SC-MIC) contra antibióticos no nível de bactéria única dentro de 2,5 h. Os resultados do SC-MIC são validados pelo teste MIC padrão via microdiluição em caldo. Nosso método é aplicável para determinar a suscetibilidade antimicrobiana de bactérias patogênicas de infecção do trato urinário (ITU) e infecção da corrente sanguínea (BSI) com um tempo de ensaio muito reduzido em comparação com o método convencional, o que abre a oportunidade para AST fenotípica rápida na clínica no nível de célula única.

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Protocol

O uso de amostras de sangue humano está de acordo com as diretrizes do IRB da Universidade de Boston e dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). Especificamente, os espécimes são de um banco e são completamente desidentificados. Esses espécimes não são considerados seres humanos pelo escritório do Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Universidade de Boston.

1. Preparação de bactérias e solução de estoque de antibióticos

  1. Preparar a solução-mãe de antibióticos (sulfato de gentamicina ou amoxicilina) numa concentração de 1 mg/ml dissolvida em solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou solvente de sulfóxido de dimetilo (DMSO) estéril 1x em microtubos de 1,5 ml. Dissolver sulfato de gentamicina em solução estéril de PBS e amoxicilina em solvente DMSO estéril. Posteriormente, conservar a solução antibiótica a 2-8 °C, conforme sugerido.
  2. Para fazer D 2O contendo caldo de Mueller-Hinton ajustado por cátion (MHB), adicione 220 mg de caldo MHB base a 10 mL de D 2 O para fazer 100% D2O contendo meio. Esterilizar a solução filtrando com filtros de poros de 200 nm.
    NOTA: Use este protocolo sempre para fazer e esterilizar soluções médias em etapas adicionais.
  3. Para preparar amostras bacterianas para imagens SRS, adicione 2 mL de meio MHB normal, que não contém deutério, a um tubo de cultura estéril de fundo redondo e, em seguida, pré-aqueça-o a 37 °C.
  4. Use uma alça estéril para selecionar uma colônia bacteriana (Escherichia coli BW 25113 ou Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) da cultura fresca em uma placa de ágar soja tríptica. Em seguida, suspenda-o no meio de cultura pré-aquecido e suavemente vórtice para preparar a suspensão de bactérias.
  5. Incubar as bactérias a 37 °C num agitador a 200 rotações por minuto (rpm) até atingir a fase logarítmica.

2. D2O tratamento de incorporação na presença de antibióticos (Figura 2a)

  1. Verifique a concentração bacteriana medindo a densidade óptica (OD) com um fotômetro a um comprimento de onda de 600 nm.
  2. Diluir a solução bacteriana utilizando o meio MHB normal, que não contém deutério, para atingir uma concentração celular final de 8 x 105 UFC/ml. Vórtice suavemente para misturar as células bacterianas.
  3. Preparar alíquotas de 300 μL da solução bacteriana em sete microtubos de 1,5 ml e alíquotas de 600 μL da solução bacteriana num microtubos de 1,5 ml.
  4. Adicionar 4,8 μL de solução-mãe de antibiótico (gentamicina ou amoxicilina) (1 mg/ml) no microtubo contendo 600 μL da solução bacteriana, para aumentar a concentração final do antibiótico para 8 μg/ml.
  5. Retirar 300 μL de solução dos 8 μg/ml de solução bacteriana contendo antibióticos e adicionar a outros 300 μL de solução bacteriana, para obter uma solução bacteriana contendo duas vezes antibiótico diluído (4 μg/ml).
  6. Repetir a dupla diluição em série dos antibióticos de ensaio, gentamicina ou amoxicilina, até atingir o microtubo com a concentração mais baixa (0,25 μg/ml) e eliminar 300 μL do tubo. Tanto para a gentamicina quanto para a amoxicilina, as concentrações seriadas variam de 0,25 μg/mL a 8 μg/mL.
    1. Deixe um tubo sem antibióticos para controle em branco. Este será o controle positivo para inspecionar a atividade metabólica bacteriana sem tratamento com antibióticos, mas com tratamento D2O.
    2. Deixe um tubo sem antibióticos e sem D2O para o controle negativo.
  7. Incubar a alíquota bacteriana com o antibiótico certo (gentamicina ou amoxicilina) contendo MHB por 1 h.
  8. Durante a incubação, preparar uma diluição em série de antibióticos com meio contendo 100% de D 2 O com o mesmo gradiente de concentração de antibióticos preparados na etapa2.6. Tanto para a gentamicina quanto para a amoxicilina, as concentrações seriadas variam de 0,25 μg/mL a 8 μg/mL.
  9. Após 1 h de tratamento com antibióticos, adicionar 700 μL de antibiótico diluído em série e meio MHB contendo 100% D 2 O aos 300 μL de bactérias pré-tratadas com antibióticos na mesma concentração de antibiótico (preparado na etapa2.6), respectivamente.
    1. Por exemplo, adicione 700 μL de meio MHB contendo 100% D2O (contendo 8 μg/mL de antibiótico) aos 300 μL de bactérias pré-tratadas com antibiótico de 8 μg/mL. Da mesma forma, transfira para os tubos correspondentes da próxima concentração e homogeneize pipetando para cima e para baixo várias vezes.
    2. Adicionar 700 μL de meio MHB 100% D 2 contendoMHB 100% D 2 isentos de antibióticos a 300 μL de bactérias isentas de antibióticos (preparado no passo 2.6.1) como controlo em branco.
    3. Incubar a 37 °C num agitador de incubação a 200 rpm durante mais 30 min.
      NOTA: Nesta etapa, a concentração final de D2O no meio para o teste é de 70%.
  10. Primeiro, centrifugar o 1 mL de antibiótico e a amostra bacteriana tratada com D2O a 6200 x g por 5 min a 4 °C e, em seguida, lavar duas vezes com água purificada. Por último, fixar as amostras em solução de formalina a 10% e armazená-las a 4 °C.

3. Preparação de bactérias no ambiente urinário (Figura 2b)

  1. Para preparar E. coli BW 25113 na fase logarítmica, siga os passos em 1,4 e 1,5.
  2. Verifique a concentração bacteriana medindo a OD com um fotômetro a um comprimento de onda de 600 nm.
  3. Para mimetizar as amostras clínicas de ITU 14,18,41, espete a solução de E. coli em 10 mL de urina desidentificada para atingir uma concentração celular final de 10 a 6 UFC/mL.
  4. Filtre a urina com espinhos de E. coli usando um filtro de 5 μm e, em seguida, divida a solução bacteriana em alíquotas de 300 μL em sete microtubos de 1,5 mL e alíquotas de 600 μL da solução bacteriana em um microtubos de 1,5 mL.
  5. Realizar o tratamentode incorporação D 2 O na presença de antibióticos e coleta de amostras, conforme descrito nas etapas anteriores de 2,4 a 2,10.

4. Preparação de bactérias no ambiente sanguíneo (Figura 2c)

  1. Para preparar Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 na fase logarítmica, siga os passos em 1,4 e 1,5.
  2. Para mimetizar as amostras clínicas de infecções da corrente sanguínea42,43, espiga de P. aeruginosa em 1 mL de sangue humano desidentificado para atingir uma concentração de 107 UFC/mL.
  3. Adicione 9 mL de água purificada estéril para lisar o sangue.
  4. Filtre o sangue cravado de P. aeruginosa usando um filtro de 5 μm. Em seguida, colher as bactérias até 1 mL de volume por centrifugação a 6200 x g por 5 min a 4 °C.  Adicione 9 mL de MHB normal pré-aquecido à solução bacteriana e suavemente vórtice. A concentração final de bactérias é de 106 UFC/mL
  5. Divida a solução sanguínea com espinhos de P. aeruginosa em alíquotas de 300 μL em sete microtubos de 1,5 mL e alíquotas de 600 μL da solução bacteriana em um microtubos de 1,5 mL.
  6. Realizar o tratamentode incorporação D 2 O na presença de antibióticos e coleta de amostras, conforme descrito nas etapas anteriores de 2,4 a 2,10.

5. Imagem SRS da incorporação metabólica de D2O em uma única bactéria

  1. Lavar 1 ml de solução bacteriana fixa com água purificada e, em seguida, centrifugar a 6200 x g durante 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante. Enriqueça a solução bacteriana a cerca de 20 μL.
  2. Deposite a solução bacteriana em um vidro de cobertura revestido de poli-L-lisina. Sanduíche e sele a amostra para imagens SRS.
  3. Imagem de bactérias na frequência vibracional C-D a 2168 cm-1 usando um microscópio SRS.
    1. Insira e ajuste o comprimento de onda da bomba para 852 nm usando o software de controle em um computador.
    2. Meça a potência do laser usando um medidor de energia. Defina a potência do laser da bomba na amostra para ~ 8 mW e a potência do laser Stokes na amostra para ~ 40 mW, ajustando a placa de meia onda na frente da saída do laser.
      NOTA: No microscópio SRS, um laser de femtossegundo ajustável com uma taxa de repetição de 80 MHz fornece os lasers de excitação da bomba (680 a 1300 nm) e Stokes (1045 nm).
  4. Ajustando os parafusos dos espelhos de reflexão, alinhe espacialmente a bomba e os feixes de Stokes e direcione os dois feixes para um microscópio vertical equipado com sistema de espelho galvo 2D para digitalização a laser.
    1. Use um objetivo de imersão em água de 60x para focar a bomba e os lasers Stokes na amostra.
    2. Use um condensador de óleo para coletar os sinais da amostra na direção para a frente.
    3. Use um filtro passa-banda para filtrar o laser Stokes antes de direcioná-lo para um fotodiodo.
    4. Extraia o sinal Raman estimulado por um amplificador de bloqueio e detecte os sinais pelo fotodiodo.
  5. Defina cada imagem SRS para conter 200 x 200 pixels e o tempo de permanência do pixel para 30 μs no painel de controle do software. O tempo total de aquisição para uma imagem é de ~1,2 s. Defina o tamanho da etapa para 150 nm, para que o tamanho da imagem seja de cerca de 30 x 30 μm2. Mostre pelo menos três campos de visão para cada amostra.

6. Processamento de imagens e análise de dados ( Figura 3 )

  1. Para obter a intensidade média do sinal C-D, abra e processe imagens SRS com o software ImageJ.
  2. Primeiro, converta imagens SRS em imagens do tipo 8 bits com cores invertidas clicando em Imagem | Tipo | 8 bits e, em seguida, Editar | Inverta botões no software ImageJ.
  3. Em seguida, filtre as imagens com desfoque gaussiano clicando em Processar | Filtros | Botões de desfoque gaussiano e defina o Sigma (Raio) como 1.
  4. Use o ajuste do limite da imagem para selecionar a área bacteriana. Clique na imagem | Ajustar | Limite para garantir que os tamanhos bacterianos selecionados correspondam aos das imagens SRS originais. Elimine pequenas partículas ajustando o limite de tamanho para determinar as partículas. Clique em Aplicar.
  5. Aplicar | de análise Botões de análise de partículas para rotular e determinar a área das bactérias.
  6. Ao clicar no botão Mostrar tudo no gerenciador de ROI para a imagem SRS original não processada, rotule a mesma área de bactérias, determine a intensidade média de cada ponto de dados clicando no botão Medir no gerenciador de ROI.
  7. Circule a área de fundo na imagem SRS original e meça a intensidade média do plano de fundo. As intensidades médias de C-D de cada bactéria são obtidas deduzindo-se a intensidade do sinal de fundo.

7. Quantificação da suscetibilidade antimicrobiana via SC-MIC

NOTA: O valor de corte em 0,60 para determinar a CIM-SC é estabelecido de acordo com a análise estatística das intensidades SRS C-D das condições metabolismo-ativas e inibidas pelo metabolismo de bactérias em várias concentrações de exposição a medicamentos40. As intensidades de C-D para os grupos suscetível a antibióticos e resistentes a antibióticos foram ajustadas com distribuição normal.

  1. Plotar a curva ROC (receiver operating characteristic) e avaliar o limiar de corte em 0,60. Com base nesse valor de corte, o SC-MIC como um indicador da eficácia dos antibióticos pode ser definido para determinar o grupo metabolicamente inativo e metabolicamente ativo.
  2. Para analisar quantitativamente os dados de imagem SRS, plotar os histogramas das intensidades de sinal C-D para cada grupo de bactérias tratadas com a concentração de antibiótico diluído em série. Os pontos de dados coloridos representam diferentes bactérias individuais.
  3. Normalizar as intensidades C-D do grupo tratado com antibióticos para a intensidade média do grupo controle sem tratamento com antibióticos. Determine os resultados do SC-MIC de diferentes combinações de bactérias e antibióticos quantificando as intensidades de sinal SRS na região C-D versus várias concentrações de antibióticos usando o valor de corte de 0,60.
  4. Validar e comparar a leitura do SC-MIC com a CIM determinada usando o ensaio convencional de microdiluição em caldo.
  5. De acordo com o Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), a categoria de suscetibilidade baseada nos resultados de imagem metabólica SRS para cada cepa bacteriana testada é interpretada como "suscetível", "resistente" ou "intermediária".

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Representative Results

O efeito do tempo de incubação na incorporação de deutério é medido por microespectroscopia Raman espontânea nas regiões C-D (2070 a 2250 cm-1) e C-H (2.800 a 3.100 cm-1) (Figura 4a). Os espectros Raman unicelulares de lapso de tempo de P. aeruginosa cultivados em meio contendo 70% de D 2 O mostram aumento da intensidade de CD/CH ao longo do tempo de incubação de 0 a 180 min. (Figura 4b) O aumento da abundância de C-D em células microbianas únicas revelaque D2O é incorporado em biomoléculas deuteradas dentro da célula.

D2A marcação O acima de 50% afeta significativamente o metabolismo bacteriano durante um período de incubação de 23 h27. Observou-se inibição do crescimento bacteriano quando a concentração de marcação D2O está acima de 70% durante um período de incubação de 25 h (Figura S1). Realizamos CIM por diluição de caldo padrão-ouro e obtivemos resultados de CIM-SC em duas cepas de P. aeruginosa (P. aeruginosa ATCC 47085 e P. aeruginosa 1133) (Tabela S1). Nossos resultados atuais mostram que 70% D2O não afeta o desempenho do nosso método em P. aeruginosa. A concordância da categoria do nosso método SC-MIC com o método convencional baseado em cultura é de 100% para todas as combinações testadas de P. aeruginosa e antibióticos, como mostra a Tabela S1. Atribuímos essa boa concordância à toxicidade mínima de 70% D2O em P. aeruginosa durante o período de incubação de 30 min na determinação de SC-MIC.

Seguindo o protocolo, P. aeruginosa foi incubada com gentamicina diluída em série por 1 h e, em seguida, 70% D2O por 30 minutos adicionais. As intensidades de C-D no tratamento com antibióticos são divididas pelo valor médio do grupo controle, que está sem tratamento com antibióticos. A análise estatística quantitativa (Figura 5b) mostrou que os sinais de C-D de P. aeruginosa foram significativamente menores em 2 μg/mL ou maior concentração de gentamicina do que aqueles sem tratamento com gentamicina (0 μg/mL). Usando o limiar de corte de 0,60, a P. aeruginosa foi inibida metabolicamente a 2 μg/mL e maiores concentrações de gentamicina. A linha pontilhada mostra o valor de corte definido em 0,60 na Figura 5b. Desta forma, a CIM SC para P. aeruginosa contra gentamicina em meio MHB normal foi determinada como sendo de 2 μg/mL. Verifica-se que este valor de SC-MIC está dentro da faixa de diferença de uma dobra com a CIM (4 μg/mL) determinada pelo método de microdiluição em caldo (Figura 5c). Em conjunto, o SC-MIC determinado pela nossa tecnologia permite a quantificação da suscetibilidade antimicrobiana.

Para explorar o potencial da AST rápida por SRS de incorporação metabólica de deutério para aplicações clínicas, especialmente para a infecção por ITU mais prevalente, testamos amostra de urina com pico de bactérias usando E. coli, o patógeno mais comum para causar infecção por ITU44. Para imitar as amostras clínicas de ITU em uma concentração bacteriana relavente, E. coli é adicionada à urina desidentificada a uma concentração final de 10a 6 UFC/mL. Após a purificação da amostra, as amostras de urina foram incubadas com amoxicilina e D2O. O fundo limpo nas imagens SRS mostrou que o protocolo de preparo da amostra era aplicável para a medição rápida da AST (Figura 5d). A SC-MIC para a amostra de urina com espinhos de E. coli contra amoxicilina foi determinada como sendo de 4 μg/mL (Figura 5e), que tem a mesma leitura de suscetibilidade com a CIM (8 μg/mL) pelo método convencional de diluição de caldo para E. coli pura em meio MHB normal (Figura 5f). Esses resultados mostraram coletivamente que a AST rápida por SRS de incorporação metabólica de deutério é de grande potencial para o diagnóstico clínico de patógenos infecciosos da ITU.

Em comparação com a infecção por ITU, a AST rápida para patógenos do BSI é muito mais desafiadora para o estudo in situ da atividade metabólica bacteriana, já que muitas células sanguíneas se apresentam no sangue. Para investigar a aplicabilidade da AST rápida por imagem SRS da incorporação metabólica de D2O para amostras clínicas de BSI, foi detectado um pico de P. aeruginosa no sangue humano desidentificado. Como mostra a Figura 5g, a intensidade C-D da imagem SRS a 2168 cm-1 foi dominada por sinais bacterianos. Uma vez que os glóbulos vermelhos não têm atividade metabólica para absorver D2O para posterior biossíntese, os sinais C-D foram originados da incorporação metabólica de deutério de bactérias vivas. A modulação de fase cruzada ou o sinal fototérmico de espécies de detritos ou glóbulos vermelhos contribuiu para os sinais de fundo fracos, sem afetar a análise quantitativa do SC-MIC. O resultado da CIM-SC para P. aeruginosa no sangue foi determinado como sendo de 2 μg/mL (Figura 5h), o que concordou bem com o resultado padrão convencional da CIM para P. aeruginosa em meio de crescimento normal (Figura 5i). Tomados em conjunto, esses resultados mostraram que a imagem metabólica SRS da incorporação metabólica de deutério pode ser um método AST rápido para determinar o SC-MIC para bactérias em infecções por BIS.

Figure 1
Figura 1: Esquema para incorporação de D2O em lipídios e proteínas deuterados25,26. O deutério pode ser incorporado à biomassa dentro de uma célula através da reação de troca H/D catalisada por enzimas entre o átomo de hidrogênio redox-ativo no NADPH e o átomo D no D2O. A reação de síntese de ácidos graxos deuterados é mediada pelo deutério marcado NADPH. A incorporação de D2O em reações de aminoácidos resulta na produção de proteínas deuteradas. Este valor foi modificado a partir da ref.40. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Fluxo de trabalho de AST rápido por SRS imagem metabólica de incorporação de deutério. (a) Tratamento de incorporação de D2O na presença de antibióticos em meio MHB e os seguintes procedimentos de imagem SRS. b) Preparação de bactérias no ambiente urinário. c) Preparação de bactérias no ambiente sanguíneo. Este valor foi modificado a partir da ref.40. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Processamento automatizado de imagens e interpretação de dados. (a) Imagem SRS bruta. b) Imagem após ajuste do limiar de intensidade para determinar a área das células bacterianas. c) Pontos de dados seleccionados após a fase de análise de partículas. d) Os pontos de dados correspondentes são seleccionados na imagem bruta. e) Resultados dos pontos de dados correspondentes na imagem bruta. f) Resultados estatísticos da intensidade média dos pontos de dados após a subtração dos antecedentes. Barra de escala: 10 μm. Este valor foi modificado a partir da ref.40. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Efeito do tempo de incubação na incorporação de deutério em bactérias. (a) Medição do lapso de tempo na região C-D (2070 a 2250 cm-1) e C-H (2.800 a 3.100 cm-1) por microespectroscopia Raman espontânea (média de 20 espectros). b) Gráfico de histograma da relação de intensidade CD/CH ao longo do tempo de incubação D2O para as bactérias na alínea a). Cada ponto colorido representa uma medida de uma única bactéria. As barras de erro representam o erro padrão da média (MEV). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5. Determinação de SC-MIC usando imagens SRS da incorporação metabólica bacteriana de D2O contra antibióticos em meio normal, urina e ambiente sanguíneo. a) Imagem SRS com vibração C-D (2168 cm-1) e as imagens de transmissão correspondentes de P. aeruginosa na presença de D2O com a adição de gentamicina diluída em série em meio MHB normal. (b) Análise quantitativa da intensidade de SRS C-D de P. aeruginosa em (a). Os pontos de dados coloridos no histograma representam as diferentes bactérias individuais. A linha pontilhada indica o valor de corte em 0,60. (c) A comparação da leitura do SC-MIC com o MIC pelo método de microdiluição em caldo, e a categoria de suscetibilidade para P. aeruginosa de acordo com o CLSI. d) Imagem SRS com vibração C-D (2168 cm-1) e imagens de transmissão correspondentes de E. coli na urina após incubação em D2O com a amoxicilina diluída em série. e) Análise quantitativa da intensidade C-D do SRS em d). (f) A comparação da categoria de leitura e suscetibilidade do SC-MIC para E. coli no MHB normal e na urina. g) Imagem SRS com vibração C-D (2168 cm-1) e imagens de transmissão correspondentes de P. aeruginosa no sangue após incubação em D2O com a gentamicina diluída em série. (h) Análise quantitativa da intensidade C-D do SRS em (g). (i) A comparação da categoria de leitura e suscetibilidade do SC-MIC para P. aeruginosa no MHB normal e no sangue. S: sensível. Número de células N ≥ 10 por grupo. As barras de erro representam o SEM. Barra de escala: 10 μm. Este valor foi modificado a partir da ref.40. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Problema Possível razão Solução
Pouco ou nenhum número de células bacterianas no campo de visão de imagem A densidade bacteriana na solução é muito baixa Centrífuga por mais tempo para enriquecer ainda mais as bactérias
Fotodano das células bacterianas durante a imagem SRS A potência do laser usada é muito alta Ajuste a potência do laser para um valor apropriado
Nenhum sinal SRS é detectável A sobreposição espacial e temporal da bomba e do feixe de Stokes não é otimizada Alinhe a bomba e os feixes de Stokes usando uma amostra padrão de dimetilsulfóxido de dimetilo deteriado

Tabela 1: Tabela de solução de problemas.

Figura S1: Ensaio de toxicidade D 2 O em P. aeruginosa cultivada em meio Lauria-Bertani (LB) com diferentes concentrações de D2O. As barras de erro indicam valores de desvio padrão (número de medições = 5). Por favor, clique aqui para baixar esta Figura.

Tabela S1. Comparação de SC-MICs e MICs em MHB normal de P. aeruginosa no tratamento com antibióticos. S: sensível; R: resistente; I: Intermediário. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

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Discussion

A AST rápida pode ser obtida avaliando a resposta da atividade metabólica bacteriana ao tratamento com antibióticos usando imagens metabólicas SRS de célula única dentro de 2,5 h da amostra para os resultados da SC-MIC. A resposta da atividade metabólica bacteriana e a suscetibilidade antimicrobiana podem ser detectadas pelo monitoramento da incorporação metabólica de D2O para síntese de biomoléculas usando imagens SRS de ligações C-D. Como a água é usada de forma onipresente em células vivas, a imagem metabólica SRS fornece um método universal para AST rápida. O método AST rápido é aplicável para detectar bactérias em ambientes biológicos complexos, como urina ou sangue total, em um único nível de bactéria. A SC-MIC pode ser determinada após 1,5 h de cultura de bactérias na urina e no sangue, o que é considerado transformador para mudar o paradigma do diagnóstico de ITU e ICS de um procedimento demorado dependente da cultura para uma abordagem in situ independente da cultura. Portanto, significa uma tremenda redução no tempo de diagnóstico em comparação com o método convencional de microdiluição em caldo, que abre caminho para a tradução clínica, permitindo a identificação pontual de agentes antimicrobianos apropriados para um tratamento preciso.

Os protocolos para tratamento com antibióticos aqui descritos seguem as diretrizes do CLSI, em que o meio MHB sugerido pode ser geralmente utilizado para o cultivo de uma grande variedade de microrganismos. Um parâmetro-chave é que o número de células bacterianas usadas para testes de suscetibilidade antimicrobiana é mantido em cerca de 5 x 105 UFC/mL, conforme recomendado no CLSI. Isso é de importância crítica para a obtenção de resultados precisos e reprodutíveis. Em experimentos de tratamento com antibióticos, a concentração de bactérias é fixada em 8 x 105 UFC/mL. Maior concentração de bactérias pode levar a um aumento nos resultados da CIM. Uma vez que a suspensão bacteriana é ajustada, ela deve ser usada dentro de 30 minutos para evitar alterações na concentração de células bacterianas.

Para o teste de suscetibilidade de um antibiótico, como a daptomicina, recomenda-se suplementar 50 mg / L de cálcio na mídia. O meio MHB ajustado pelo cátion contém 20-25 mg/L de Ca2+. Portanto, certifique-se de que o meio seja suplementado com Ca2+ adicional (solubilizado em água e filtro esterilizado) na concentração de 30 mg / L.

Outro passo crítico no método apresentado é o tempo de incubação das bactérias após a exposição aos antibióticos e a incorporação de D2O. Como o tempo de geração do ciclo de vida bacteriano é de aproximadamente 30 a 60 minutos, é importante influenciar a atividade metabólica bacteriana após a exposição a antibióticos por um certo tempo. Este teste foi avaliado para uma variedade de combinações bactéria-antibiótico para exposição a antibióticos por 1 h antes do tratamento D2O 0,5 h. A primeira etapa de tratamento antibiótico de 1 h é essencial para influenciar a atividade metabólica bacteriana. Em seguida, as bactérias são incubadas com D2O-contendo e contendo antibióticos por mais 30 min. As concentrações finais de antibióticos são mantidas no mesmo nível, e a concentração final de D2O é ajustada para 70%. No geral, após 1 h de pré-cultura de antibióticos e após 0,5 h de D2O e incorporação de antibióticos, os resultados do SC-MIC são então determinados por imagens metabólicas SRS da atividade metabólica bacteriana. Este projeto minimiza o impacto da influência de D2O da atividade antimicrobiana para as bactérias e também leva a uma leitura comparável dos resultados do SC-MIC com as CIMs pelo método convencional.

Nas medições do SC-MIC, preparamos em paralelo 40 amostras, incluindo 5 antibióticos diferentes, cada um com 8 concentrações ao mesmo tempo. No entanto, como existem muitos procedimentos de operação manual, o tempo total de ensaio para detectar o AST para cinco combinações diferentes de bactérias e antibióticos é superior a 2,5 h. Em nosso método, cada imagem SRS contendo ~20 células bacterianas individuais foi obtida dentro de ~1,0 s em um único tiro a 30 μs de pixel de tempo de permanência. Estimamos que o tempo total do ensaio de AST para estudar 10 antibióticos para uma cepa bacteriana seria inferior a 2,5 h da amostra para a leitura do SC-MIC, que tem uma tremenda possibilidade de realizar medições de alto rendimento. Em trabalhos futuros, um método automatizado de preparação de amostras e aquisição de dados de imagem será empregado para melhorar ainda mais o rendimento. Os detalhes da solução de problemas são fornecidos na Tabela 1.

Nos métodos convencionais de AST baseados em cultura, para obter isolados bacterianos para medições adicionais, é necessário pré-incubar amostras clínicas por horas. Métodos avançados de AST para amostras clínicas de ITU, como espectroscopia Raman29, matriz de nanolitros 6 e quantificação de ácido nucleico digital18, foram desenvolvidos para se livrar da pré-incubaçãode longa duração. Em comparação com a infecção por ITU, o BSI ou sepse é muito mais fatal18,45, onde a AST rápida é urgentemente necessária para diagnósticos precisos na clínica. Um método de imagem microscópica para medir a formação de colônias bacterianas a partir de hemoculturas positivas tem sido relatado para fornecer resultados de CIM46. No entanto, leva pelo menos 6 h para cultivar bactérias para conduzir o ensaio AST. Além disso, as estratégias de sistemas automáticos comerciais 47 e espectrometria de massas 48,49 podem fornecer leitura de AST a partir de hemoculturas positivas. No entanto, os resultados da CIM para a decisão clínica não podem ser fornecidos. Os resultados da AST e a leitura da CIM são significativos para evitar o excesso de dosagem de antibióticos aos pacientes para causar potenciais efeitos colaterais nas clínicas, retardar e prevenir a disseminação das infecções resistentes aos antimicrobianos50,51. Em comparação com os métodos AST baseados em microscopia Raman espontânea existentes, nossa tecnologia reduz tremendamente o tempo de aquisição de dados (cerca de 600 vezes menos) devido ao aprimoramento do sinal de ordens de magnitude. Neste trabalho, demonstramos AST rápida por imagem SRS do metabolismo do deutério em uma única bactéria a uma concentração bacteriana clinicamente relevante (105 ~ 106 UFC / ml) na urina ou no ambiente de sangue total. Como mostrado em resultados anteriores, os resultados da CIM são determinados após 1 h de tratamento antibiótico e 30 min de mistura de D2O e incubação de antibióticos em bactérias na urina e no sangue. Nosso método pode fornecer CIMs e classificação de suscetibilidade para cada combinação cepa-antibiótico dentro de 2,5 h e, portanto, abre um novo caminho para a tradução clínica. Para resumir, sem a necessidade de precultura e divisão bacteriana, nosso método tem um enorme potencial no campo da AST rápida e de alto rendimento em doenças infecciosas.

Nosso método SC-MIC por imagem metabólica SRS é aplicável para detectar CIMs e fornecer classificação de suscetibilidade para patógenos infecciosos ao lidar com variedades abundantes de combinações de cepa-antibiótico para uso clínico. O SC-MIC é determinado após 30 min de incorporação de D2O em bactérias na urina e no sangue, o que significa uma tremenda redução no tempo de diagnóstico em comparação com o método convencional de diluição em caldo, que custa de 16 a 24 h para pré-incubação. Para fornecer informações de identificação de patógenos para a tomada de decisão clínica, a tecnologia de imagem metabólica SRS pode ser ainda mais integrada a plataformas diagnósticas capazes de identificação rápida de patógenos, como a espectrometria de massa de ionização por tempo de voo por dessorção a laser assistida por matriz 49,52,53. A combinação da identificação in situ de patógenos e do diagnóstico rápido de AST pode ser de grande potencial para a tradução para a clínica, o que permite a identificação pontual de agentes antimicrobianos apropriados para um tratamento preciso.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01AI141439 a J.-X.C e M.S, e R35GM136223 a J.-X.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acousto-optic modulation Gooch&Housego R15180-1.06-LTD Modulating stokes laser beam
Amoxicillin Sigma Aldrich A8523-5G
Bandpass filter Chroma HQ825/150m Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride Sigma Aldrich C1016-100G Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth Fisher Scientific B12322 Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge Thermo Scientific 75002542
Cover Glasses VWR 16004-318
Culture tube with snap cap Fisher brand 149569B
Daptomycin Acros A0386346
Deuterium oxide 151882 Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6 Sigma Aldrich 156914 Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113 The Coli Genetic Stock Center 7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher brand 05-408-129
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters Millipore-Sigma SLSV025NB pore size 5 µm
ImageJ software NIH Version: 2.0.0-rc-69/1.52t Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C VWR 97009-890
Inoculation loop Sigma BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser Spectra-Physics Model: insight X3 Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI Demodulate the SRS signals
Oil condenser Olympus U-AAC NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) American Type Culture Collection ATCC 47085
Photodiode Hamamatsu S3994-01 Detector
Polypropylene conical tube 15 mL Falcon 14-959-53A
Polypropylene filters Thermo Scientific 726-2520 pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes Corning 07-202-031
Syringe 10 mL Fisher brand 14955459
UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter Model: DU 530 Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer VWR 97043-562
Water objective Olympus UPLANAPO/IR 60×, NA 1.2

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Teste Rápido de Suscetibilidade a Antimicrobianos por Imagem de Dispersão Raman Estimulada da Incorporação de Deutério em uma Única Bactéria
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Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J. X. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (180), e62398, doi:10.3791/62398 (2022).

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