Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Быстрое тестирование чувствительности к противомикробным препаратам методом стимулированной рамановской рассеянной визуализации включения дейтерия в одну бактерию

Published: February 14, 2022 doi: 10.3791/62398
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,4,5
1Department of Electrical and Computer Engineering, Boston University, 2Boston University Photonics Center, Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering, Boston University, 5Department of Chemistry, Boston University

Summary

Этот протокол представляет собой экспресс-тестирование чувствительности к противомикробным препаратам (АСТ) в течение 2,5 ч с помощью одноклеточной стимулированной комбинационной рассеянной визуализации метаболизмаD2O. Этот метод применяется к бактериям в моче или цельной кровяной среде, что является преобразующим для быстрого одноклеточного фенотипического АСТ в клинике.

Abstract

Чтобы замедлить и предотвратить распространение устойчивых к противомикробным препаратам инфекций, срочно необходимо быстрое тестирование чувствительности к противомикробным препаратам (АСТ) для количественного определения антимикробного воздействия на патогены. Обычно требуется несколько дней, чтобы завершить АСТ обычными методами, основанными на долгосрочной культуре, и они не работают непосредственно для клинических образцов. Здесь мы сообщаем о быстром методе АСТ, обеспечиваемом стимулированной рамановской рассеянием (SRS) визуализации метаболического включения оксида дейтерия (D2O). Метаболическое включениеD2Oв биомассу и ингибирование метаболической активности при воздействии антибиотиков на уровне одной бактерии контролируются с помощью визуализации SRS. Концентрация инактивации одноклеточного метаболизма (SC-MIC) бактерий при воздействии антибиотиков может быть получена в общей сложности через 2,5 ч пробоподготовки и обнаружения. Кроме того, этот быстрый метод АСТ непосредственно применим к бактериальным образцам в сложных биологических средах, таких как моча или цельная кровь. Метаболическая визуализация SRS дейтерия является преобразующей для быстрого одноклеточного фенотипического АСТ в клинике.

Introduction

Устойчивость к противомикробным препаратам (УПП) представляет собой растущую глобальную угрозу для эффективного лечения инфекционных заболеваний1. Прогнозируется, что УПП приведет к дополнительным 10 миллионам смертей в год и потере мирового ВВП в размере 100 триллионов долларов к 2050 году, если не будут приняты меры по борьбе с устойчивыми к антибиотикам бактериями 1,2. Это подчеркивает настоятельную необходимость в быстрых и инновационных методах диагностики для тестирования чувствительности к антибиотикам (АСТ) инфекционных бактерий, чтобы замедлить появление устойчивых к антибиотикам бактерий и снизить связанный с этим уровень смертности3. Чтобы обеспечить наилучший возможный клинический результат, крайне важно ввести эффективную терапию в течение 24 ч. Однако современный метод золотого стандарта, такой как диффузия диска или метод разбавления бульона, обычно требует не менее 24 ч для процедуры предварительной инкубации для клинических образцов и дополнительных 16-24 ч для получения результатов минимальной ингибирующей концентрации (MIC). В целом, эти методы отнимают слишком много времени, чтобы направлять немедленное решение о лечении инфекционных заболеваний в клинике, что приводит к появлению и распространению устойчивости к противомикробным препаратам4.

Генотипические методы АСТ, такие как методы полимеразной цепной реакции (ПЦР)5, были разработаны для быстрого обнаружения. Такие методы измеряют специфические генетические последовательности резистентности, чтобы обеспечить быстрые результаты АСТ. Они не полагаются на трудоемкую клеточную культуру; однако тестируются только конкретные известные генетические последовательности с резистентностью. Поэтому его применение ограничивается различными видами бактерий или различными механизмами резистентности. Кроме того, они не могут предоставить результаты MIC для решенийтерапии 6,7. Кроме того, для преодоления этих ограничений разрабатываются новые фенотипические методы быстрого АСТ8, в том числе микрофлюидные устройства 9,10,11,12,13, оптические приборы 14,15,16, фенотипические АСТ, количественно оценивающие число копий нуклеиновых кислот 17,18, и рамановские спектроскопические методы19, 20,21,22,23,24. Эти методы сокращают время для получения результатов АСТ, однако большинство из них применимы только к бактериальным изолятам, а не непосредственно к клиническим образцам, и по-прежнему требуют длительной преинкубации.

В данной работе представлен метод быстрого определения восприимчивости бактерий в моче и цельной крови посредством мониторинга клеточной метаболической активности методом SRS-визуализации. Вода (H2O) принимает участие в подавляющем большинстве основных процессов биомолекулярного синтеза в живых клетках. В качестве изотополога воды, посредством катализируемой ферментами реакции обмена H/D между окислительно-восстановительным активным атомом водорода в NADPH и атомом D вD2O, дейтерий может быть включен в биомассу внутри ячейки25,26. Реакция синтеза дейтерированных жирных кислот опосредована дейтерием, меченым NADPH. ВключениеD2O в реакции аминокислот (АА) приводит к получению дейтерированного белка26 (фиг.1). Таким образом, вновь синтезированные биомолекулы, содержащие связь C-D, в отдельных микробных клетках могут быть использованы в качестве общего маркера метаболической активности для обнаружения. Для считывания de novo синтезированных C-D связей рамановская спектроскопия, универсальный аналитический инструмент, предоставляющий специфическую и количественную химическую информацию биомолекул, широко используется для определения чувствительности к противомикробным препаратам и значительно сокращает время тестирования до нескольких часов 27,28,29,30 . Однако из-за присущей ему низкой эффективности процесса рамановского рассеяния спонтанная рамановская спектроскопия обладает низкой чувствительностью обнаружения. Поэтому трудно получить результаты изображения в режиме реального времени с помощью спонтанной рамановской спектроскопии. Когерентное рамановское рассеяние (CRS), включая когерентное анти-Стоксовское рамановское рассеяние (CARS) и стимулированное рамановское рассеяние (SRS), достигло высокой чувствительности обнаружения из-за когерентного светового поля, генерирующего порядки величины больше, чем у спонтанной рамановской спектроскопии, тем самым обеспечивая высокоскоростную, специфическую и количественную химическую визуализацию на уровне одной клетки 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

Здесь, основываясь на нашей последней работе40, мы представляем протокол для быстрого определения метаболической активности и чувствительности к противомикробным препаратам путем фемтосекундной визуализации SRS C-D включения D2O бактерий в нормальную среду, мочу и цельную среду крови на уровне одной клетки. Фемтосекундная визуализация SRS облегчает мониторинг концентрации инактивации внутриклеточного метаболизма (SC-MIC) против антибиотиков на уровне одной бактерии в течение 2,5 ч. Результаты SC-MIC подтверждаются стандартным тестом MIC путем микроразбавления бульона. Наш метод применим для определения антимикробной восприимчивости бактерий к инфекции мочевыводящих путей (ИМП) и инфекции кровотока (БСИ) возбудителей с значительно уменьшенным временем анализа по сравнению с обычным методом, что открывает возможность быстрого фенотипического АСТ в клинике на одноклеточном уровне.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Использование образцов крови человека соответствует руководящим принципам IRB Бостонского университета и Национальных институтов здравоохранения (NIH). В частности, образцы взяты из банка и полностью деидентифицированы. Эти образцы не считаются человеческими субъектами офисом институционального наблюдательного совета (IRB) в Бостонском университете.

1. Приготовление раствора бактерий и антибиотиков

  1. Готовят раствор антибиотиков (гентамицина сульфата или амоксициллина) в концентрации 1 мг/мл, растворенный в стерильном 1x фосфат-буферном физиологическом растворе (PBS) или диметилсульфоксиде (DMSO) в микропробирках объемом 1,5 мл. Растворить гентамицина сульфат в стерильном растворе PBS и амоксициллин в стерильном растворителе DMSO. После этого храните раствор антибиотиков при температуре 2-8 °C, как предлагается.
  2. Чтобы получить D2O, содержащую катионную среду бульона Мюллера-Хинтона (MHB), добавьте 220 мг основания отвара MHB к 10 млD2O, чтобы получить 100%D2O-содержащую среду. Стерилизуют раствор путем фильтрации фильтрами с размером пор 200 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте этот протокол для изготовления и стерилизации растворов среды на последующих этапах.
  3. Чтобы подготовить бактериальные образцы для визуализации SRS, добавьте 2 мл нормальной среды MHB, которая не содержит дейтерия, в стерильную культуральную трубку с круглым дном, а затем предварительно прогрейте ее при 37 °C.
  4. Используйте стерильную петлю, чтобы выбрать одну бактериальную (Escherichia coli BW 25113 или Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) колонию из свежей культуры на триптической соевой агаровой пластине. Затем суспендируйте его в предварительной культуральной среде и осторожно вихрь, чтобы приготовить суспензию бактерий.
  5. Инкубируйте бактерии при 37 °C в шейкере со скоростью 200 оборотов в минуту (об/мин) до тех пор, пока они не достигнут логарифмической фазы.

2. D2O инкорпорированное лечение в присутствии антибиотиков (рисунок 2а)

  1. Проверьте концентрацию бактерий, измерив оптическую плотность (OD) с помощью фотометра на длине волны 600 нм.
  2. Разбавьте бактериальный раствор, используя нормальную среду MHB, которая не содержит дейтерия, чтобы достичь конечной концентрации клеток 8 х 105 КОЕ/мл. Вихрь осторожно, чтобы смешать бактериальные клетки.
  3. Готовят 300 мкл аликвот бактериального раствора в семи микропробирках по 1,5 мл и 600 мкл аликвот бактериального раствора в одной микропробирке объемом 1,5 мл.
  4. Добавьте 4,8 мкл исходного раствора антибиотика (гентамицина или амоксициллина) (1 мг/мл) в микропробирку, содержащую 600 мкл бактериального раствора, чтобы получить конечную концентрацию антибиотика до 8 мкг/мл.
  5. Возьмите 300 мкл раствора из 8 мкг/мл раствора бактерий, содержащего антибиотики, и добавьте еще 300 мкл бактериального раствора, чтобы получить двукратно разбавленный раствор антибиотика (4 мкг/мл), содержащий бактерии.
  6. Повторяют двукратное последовательное разведение исследуемых антибиотиков, гентамицина или амоксициллина, до тех пор, пока не будет достигнута микропробирка с самой низкой концентрацией (0,25 мкг/мл), и выбросьте из пробирки 300 мкл. Как для гентамицина, так и для амоксициллина серийные концентрации варьируются от 0,25 мкг/мл до 8 мкг/мл.
    1. Оставьте один тюбик без антибиотиков для пустого контроля. Это будет положительный контроль для проверки метаболической активности бактерий без лечения антибиотиками, но с лечениемD2O.
    2. Оставьте один пробирок без антибиотиков и безD2O для отрицательного контроля.
  7. Инкубируют бактериальную аликвоту определенным антибиотиком (гентамицином или амоксициллином), содержащим MHB-среду, в течение 1 ч.
  8. Во время инкубации готовят серийное разведение антибиотиков со 100%D2O, содержащей среду с таким же градиентом концентрации антибиотиков, приготовленных на стадии 2.6. Как для гентамицина, так и для амоксициллина серийные концентрации варьируются от 0,25 мкг/мл до 8 мкг/мл.
  9. После 1 ч лечения антибиотиками добавляют 700 мкл последовательно разбавленного антибиотика и 100%D2O-содержащей MHB среды к 300 мкл бактерий, предварительно обработанных антибиотиками, в той же концентрации антибиотика (полученной на стадии 2.6), соответственно.
    1. Например, добавляют 700 мкл 100%D2O-содержащей MHB среды (содержащей 8 мкг/мл антибиотика) к 300 мкл 8 мкг/мл бактерий, предварительно обработанных антибиотиками. Таким же образом перекладывают в соответствующие трубки следующую концентрацию, и гомогенизируют путем пипетки вверх и вниз несколько раз.
    2. Добавьте 700 мкл безантибиотиков 100%D2O-содержащей MHB среды к 300 мкл бактерий без антибиотиков (приготовленных на стадии 2.6.1) в качестве пустого контроля.
    3. Инкубировать при 37 °C в инкубационном шейкере при 200 об/мин в течение дополнительных 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе конечная концентрацияD2Oв среде для испытания составляет 70%.
  10. Сначала центрифугируют 1 мл антибиотика иD2O-обработанного бактериальным образцом при 6200 х г в течение 5 мин при 4 °C, а затем дважды промывают очищенной водой. Наконец, зафиксируйте образцы в 10% растворе формалина и храните их при 4 °C.

3. Подготовка бактерий в мочевой среде (Рисунок 2б)

  1. Чтобы приготовить E. coli BW 25113 на логарифмической фазе, выполните действия, описанные в пунктах 1.4 и 1.5.
  2. Проверьте концентрацию бактерий, измерив OD фотометром на длине волны 600 нм.
  3. Чтобы имитировать клинические образцы ИМП 14,18,41, увеличьте раствор E. coli в 10 мл деидентифицированной мочи, чтобы достичь конечной концентрации клеток 10 6 КОЕ/мл.
  4. Отфильтруйте шипованную мочу E. coli с помощью фильтра 5 мкм, а затем разделите бактериальный раствор на 300 мкл аликвот на семь микропробирок 1,5 мл и 600 мкл аликвот бактериального раствора в одной микропробирке 1,5 мл.
  5. Проводят инкорпорациюD2Oв присутствии антибиотиков и забор образцов, как описано в предыдущих шагах от 2.4 до 2.10.

4. Подготовка бактерий в среде крови (рисунок 2с)

  1. Чтобы приготовить Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 на логарифмической фазе, выполните действия 1.4 и 1.5.
  2. Для имитации клинических инфекций кровотока образцы 42,43, всплеск P. aeruginosa в 1 мл деидентифицированной крови человека достигает концентрации 10 7 КОЕ/мл.
  3. Добавьте 9 мл стерильной очищенной воды для лизирования крови.
  4. Фильтруйте P. aeruginosa с шипованной кровью с помощью фильтра 5 мкм. Затем собирают бактерии до объема 1 мл путем центрифугирования при 6200 х г в течение 5 мин при 4 °C.  Добавьте 9 мл предварительно подогретого нормального MHB в раствор бактерий и осторожно вихрь. Конечная концентрация бактерий составляет 106 КОЕ/мл
  5. Разделите шипованный раствор крови P. aeruginosa на 300 мкл аликвот на семь микропробирок по 1,5 мл и 600 мкл аликвот бактериального раствора в одной микропробирке объемом 1,5 мл.
  6. Проводят инкорпорациюD2Oв присутствии антибиотиков и забор образцов, как описано в предыдущих шагах от 2.4 до 2.10.

5. SRS-визуализация метаболического включенияD2O в одну бактерию

  1. Промыть 1 мл неподвижного раствора бактерий очищенной водой, а затем центрифугу при 6200 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите супернатант. Обогатите бактериальный раствор примерно до 20 мкл.
  2. Нанесите бактериальный раствор на покрытие с поли-L-лизином. Сэндвич и запечатывание образца для визуализации SRS.
  3. Визуализируйте бактерии на вибрационной частоте C-D при 2168 см-1 с помощью микроскопа SRS.
    1. Введите и настройте длину волны насоса до 852 нм с помощью управляющего программного обеспечения на компьютере.
    2. Измерьте мощность лазера с помощью измерителя мощности. Установите мощность накачки лазера в образце на ~8 мВт, а мощность лазера Стокса на образце на ~40 мВт, отрегулировав полуволновую пластину перед выходом лазера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В микроскопе SRS перестраиваемый фемтосекундный лазер с частотой повторения 80 МГц обеспечивает возбуждение накачки (от 680 до 1300 нм) и Стокса (1045 нм).
  4. Регулируя винты зеркал отражения, пространственно выровняйте накачку и лучи Стокса и направьте два луча в вертикальный микроскоп, оснащенный зеркальной системой 2D galvo для лазерного сканирования.
    1. Используйте 60-кратный объектив погружения в воду, чтобы сфокусировать насос и лазеры Стокса на образце.
    2. Используйте масляный конденсатор для сбора сигналов от образца в прямом направлении.
    3. Используйте полосовой фильтр, чтобы отфильтровать лазер Стокса, прежде чем направить его в фотодиод.
    4. Извлеките стимулированный рамановский сигнал с помощью блокирующего усилителя и определите сигналы с помощью фотодиода.
  5. Установите каждое изображение SRS на содержание 200 x 200 пикселей и время ожидания пикселя для 30 мкс на панели управления программного обеспечения. Общее время получения одного изображения составляет ~1,2 с. Установите размер шага на 150 нм, чтобы размер изображения составлял около 30 x 30мкм2. Изображение не менее трех полей представлений для каждого образца.

6. Обработка изображений и анализ данных (рисунок 3)

  1. Чтобы получить среднюю интенсивность сигнала C-D, открывайте и обрабатывайте изображения SRS с помощью программного обеспечения ImageJ.
  2. Сначала преобразуйте изображения SRS в изображения 8-битного типа с перевернутым цветом, щелкнув Изображение | Тип | 8-разрядный, а затем Изменить | Инвертируйте кнопки в программном обеспечении ImageJ.
  3. Затем отфильтруйте изображения с помощью размытия Гаусса, щелкнув Обработать | фильтры | Гауссовские кнопки размытия и установите для параметра Sigma (Радиус) значение 1.
  4. Используйте настройку порога изображения, чтобы выбрать бактериальную область. Нажмите | изображений Отрегулируйте | Пороговое значение для обеспечения того, чтобы выбранные размеры бактерий соответствовали размерам на исходных изображениях SRS. Устраните мелкие частицы, отрегулировав порог размера для определения частиц. Нажмите кнопку Применить.
  5. Применение | анализа Кнопки анализа частиц для маркировки и определения площади бактерий.
  6. Нажав кнопку «Показать все» в менеджере ROI на исходное необработанное изображение SRS, пометьте ту же область бактерий, определите среднюю интенсивность каждой точки данных, нажав кнопку «Измерить» в диспетчере ROI.
  7. Обведите область фона на исходном изображении SRS и измерьте среднюю интенсивность фона. Среднюю интенсивность C-D каждой бактерии получают путем вычета интенсивности фонового сигнала.

7. Количественное определение чувствительности к противомикробным препаратам с помощью SC-MIC

ПРИМЕЧАНИЕ: Пороговое значение на уровне 0,60 для определения SC-MIC установлено в соответствии со статистическим анализом интенсивностей SRS C-D условий активности метаболизма и ингибирования метаболизма для бактерий при различных концентрациях лекарственного воздействия40. Интенсивность C-D для групп, чувствительных к антибиотикам, и устойчивых к антибиотикам, была снабжена нормальным распределением.

  1. Постройте кривую рабочих характеристик приемника (ROC) и оцените порог отсечки на уровне 0,60. Исходя из этого порогового значения, SC-MIC как показатель эффективности антибиотиков может быть определен для определения метаболически неактивной и метаболически активной группы.
  2. Чтобы количественно проанализировать данные визуализации SRS, постройте гистограммы интенсивности сигнала C-D для каждой группы бактерий, получавших последовательно разбавленную концентрацию антибиотиков. Цветные точки данных обозначают разные отдельные бактерии.
  3. Нормализовать интенсивность С-D группы, получавшей антибиотики, до средней интенсивности контрольной группы без лечения антибиотиками. Определить результаты SC-MIC различных комбинаций бактерий и антибиотиков путем количественной оценки интенсивности сигнала SRS в области C-D по сравнению с различными концентрациями антибиотиков, используя пороговое значение 0,60.
  4. Проверьте и сравните показания SC-MIC с показаниями MIC, определенными с использованием обычного анализа микроразбавления бульона.
  5. По данным Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI), категория восприимчивости, основанная на результатах метаболической визуализации SRS для каждого тестируемого бактериального штамма, интерпретируется как «восприимчивая», «резистентная» или «промежуточная».

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Влияние инкубационного времени на инкорпорацию дейтерия измеряется спонтанной рамановской микроспектроскопией в области C-D (от 2070 до 2250 см-1) и C-H (от 2 800 до 3 100 см-1) (рисунок 4a). Покадровые одноклеточные рамановские спектры P. aeruginosa , культивируемые в среде, содержащей 70%D2O, показывают увеличение интенсивности CD/CH в течение времени инкубации от 0 до 180 мин. (Рисунок 4b) Увеличение содержания C-D в отдельных микробных клетках показывает, чтоD2Oвключен в дейтерированные биомолекулы внутри клетки.

МаркировкаD2O выше 50% существенно влияет на бактериальный метаболизм в течение 23 ч инкубационного периода27. Мы наблюдали ингибирование роста бактерий, когда концентрация маркировкиD2O превышает 70% в течение 25-часового инкубационного периода (рисунок S1). Мы выполнили MIC путем разбавления отвара золотого стандарта и получили результаты SC-MIC в двух штаммах P. aeruginosa (P. aeruginosa ATCC 47085 и P. aeruginosa 1133) (таблица S1). Наши текущие результаты показывают, что 70%D2O не влияет на производительность нашего метода у P. aeruginosa. Соответствие категории нашего метода SC-MIC с традиционным методом на основе культур составляет 100% для всех протестированных комбинаций P. aeruginosa и антибиотиков, как показано в таблице S1. Мы связываем это хорошее согласие с минимальной токсичностью 70% D2O на P. aeruginosa в течение 30-минутного инкубационного периода при определении SC-MIC.

Следуя протоколу, P. aeruginosa инкубировали с последовательно разбавленным гентамицином в течение 1 ч, а затем 70%D2Oв течение дополнительных 30 мин. Проводили метаболическую визуализацию SRS при ~2168 см-1 (рисунок 5a). Интенсивности C-D при лечении антибиотиками делятся на среднее значение контрольной группы, которая находится без лечения антибиотиками. Количественный статистический анализ (рисунок 5b) показал, что C-D сигналы P. aeruginosa были значительно ниже при концентрации гентамицина 2 мкг/мл или выше, чем без лечения гентамицином (0 мкг/мл). Используя порог отсечения при 0,60, P. aeruginosa метаболически ингибировали при 2 мкг/мл и более высоких концентрациях гентамицина. Пунктирная линия показывает определенное значение отсечения на уровне 0,60 на рисунке 5b. Таким образом, SC-MIC для P. aeruginosa против гентамицина в нормальной среде MHB был определен как 2 мкг/мл. Это значение SC-MIC проверяется как находящееся в пределах однократного диапазона разности с MIC (4 мкг/мл), определяемым методом микроразбавления бульона (рисунок 5c). Взятые вместе, SC-MIC, определенные нашей технологией, позволяют количественно оценить восприимчивость к противомикробным препаратам.

Чтобы изучить потенциал быстрого АСТ с помощью SRS-визуализации метаболического включения дейтерия для клинических применений, особенно для наиболее распространенной инфекции ИМП, мы протестировали образец мочи с шипами бактерий с использованием E. coli, наиболее распространенного патогена, вызывающего инфекцию ИМП44. Чтобы имитировать клинические образцы ИМП при относительной бактериальной концентрации, E. coli добавляют в деидентифицированную мочу до конечной концентрации 106 КОЕ/мл. После очистки образцов образцы мочи инкубировали с амоксициллином иD2O. Чистый фон на изображениях SRS показал, что протокол подготовки образца применим для быстрого измерения AST (рисунок 5d). SC-MIC для образца мочи с шипами E. coli против амоксициллина было определено как 4 мкг/мл (рисунок 5e), который имеет такое же считывание восприимчивости с MIC (8 мкг/мл) обычным методом разбавления бульона для чистой кишечной палочки в нормальной среде MHB (рисунок 5f). Эти результаты в совокупности показали, что быстрая визуализация АСТ с помощью SRS метаболического включения дейтерия имеет большой потенциал для клинической диагностики инфекционных патогенов ИМП.

По сравнению с инфекцией ИМП, быстрый АСТ для патогенов BSI гораздо сложнее для изучения in situ бактериальной метаболической активности, так как в крови присутствует много клеток крови. Чтобы исследовать применимость быстрого АСТ с помощью SRS-визуализации метаболического включения D2O для клинических образцов BSI, был обнаружен всплеск P. aeruginosa в деидентифицированной крови человека. Как показано на рисунке 5g, в интенсивности C-D изображения SRS при 2168 см-1 преобладали бактериальные сигналы. Поскольку эритроциты не обладают метаболической активностью для поглощенияD2O для дальнейшего биосинтеза, сигналы C-D возникли из метаболического дейтериевого включения живых бактерий. Кроссфазная модуляция или фототермический сигнал мусора или эритроцитов способствовали слабым фоновым сигналам, не влияя на количественный анализ SC-MIC. Результат SC-MIC для P. aeruginosa в крови был определен как 2 мкг/мл (рисунок 5h), что хорошо согласуется с обычным стандартным результатом MIC для P. aeruginosa в нормальной питательной среде (рисунок 5i). Взятые вместе, эти результаты показали, что метаболическая визуализация SRS метаболического включения дейтерия может быть быстрым методом АСТ для определения SC-MIC для бактерий при инфекциях BIS.

Figure 1
Рисунок 1: Схема включенияD2O в дейтерированные липиды и белки25,26. Дейтерий может быть включен в биомассу внутри клетки посредством катализируемой ферментами реакции обмена H/D между окислительно-активным атомом водорода в NADPH и атомом D вD2O. Реакция синтеза дейтерированных жирных кислот опосредована дейтерием, меченым NADPH. ВключениеD2O в реакции аминокислот приводит к образованию дейтерированных белков. Эта цифра была изменена по сравнению со ссылкой 40. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Рабочий процесс быстрого АСТ с помощью метаболической визуализации SRS дейтерия. (a)D2O инкорпорированное лечение в присутствии антибиотиков в среде MHB и следующие процедуры визуализации SRS. b) подготовка бактерий в среде мочи. c) подготовка бактерий в среде крови. Эта цифра была изменена по сравнению со ссылкой 40. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Автоматизированная обработка изображений и интерпретация данных. а) Необработанное изображение СГД. b) изображение после корректировки порога интенсивности для определения площади бактериальных клеток. с) точки данных, выбранные после этапа анализа частиц. d) на необработанном изображении выбираются соответствующие точки данных. e) результаты соответствующих точек данных на необработанном изображении. f) статистические результаты средней интенсивности точек данных после вычитания фона. Шкала: 10 мкм. Эта цифра была изменена по сравнению со ссылкой 40. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4. Влияние инкубационного времени на включение дейтерия в бактерии. а) покадровое измерение в области С-D (2070-2250 см-1) и С-Н (2 800-3 100 см-1) с помощью спонтанной рамановской микроспектроскопии (в среднем от 20 спектров). b) График гистограммы соотношения интенсивности CD/CH за время инкубацииD2O для бактерий в подпункте а). Каждая цветная точка обозначает измерение от одной бактерии. Полосы погрешностей представляют стандартную погрешность среднего значения (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5. Определение SC-MIC с использованием SRS-визуализации бактериальной метаболической инкорпорацииD2Oпротив антибиотиков в нормальной среде, моче и кровяной среде. (a) визуализация SRS при вибрации C-D (2168 см-1) и соответствующие изображения передачи P. aeruginosa в присутствииD2Oс добавлением последовательно разбавленного гентамицина в нормальной среде MHB. b) Количественный анализ интенсивности С-D СГД P. aeruginosa в подпункте а). Цветные точки данных в гистограмме обозначают различные отдельные бактерии. Пунктирная линия указывает на пороговое значение 0,60. с) сопоставление показаний SC-MIC с показаниями MIC методом микроразбавления бульона и категории восприимчивости для P. aeruginosa в соответствии с CLSI. d) визуализация SRS при вибрации C-D (2168 см-1) и соответствующие изображения передачи кишечной палочки в моче после инкубации вD2Oс последовательно разбавленным амоксициллином. е) Количественный анализ интенсивности С-D СГД в подпункте d). f) сопоставление показаний SC-MIC и категории восприимчивости для E. coli в нормальном MHB и в моче. g) визуализация SRS при вибрации C-D (2168 см-1) и соответствующие изображения передачи P. aeruginosa в крови после инкубации вD2Oс последовательно разбавленным гентамицином. h) Количественный анализ интенсивности С-D СГД в г). i) Сравнение считывания SC-MIC и категории восприимчивости для P. aeruginosa в нормальном MHB и в крови. S: чувствительный. Количество клеток N ≥ 10 на группу. Полосы погрешностей представляют собой SEM. Шкала: 10 мкм. Эта цифра была изменена по сравнению со ссылкой 40. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Проблема Возможная причина Решение
Небольшой или отсутствующий номер бактериальных клеток в поле зрения визуализации Плотность бактерий в растворе слишком низкая Центрифуга на более длительное время для дальнейшего обогащения бактерий
Фотоповреждение бактериальных клеток во время визуализации SRS Используемая мощность лазера слишком высока Настройте мощность лазера на соответствующее значение
Сигнал SRS не обнаруживается Пространственное и временное перекрытие насоса и балки Стокса не оптимизировано Выравнивание насоса и пучков Стокса с использованием стандартного образца дейтерированного диметилсульфоксида

Таблица 1: Таблица устранения неполадок.

Рисунок S1: Испытание токсичностиD2O на P. aeruginosa, культивируемой в среде Лаурии-Бертани (LB) с различными концентрациямиD2O. В строках ошибок указаны значения стандартного отклонения (количество измерений = 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.

Таблица S1. Сравнение SC-MICs и MIC в нормальном MHB P. aeruginosa при лечении антибиотиками. S: чувствительный; R: устойчивый; I: Промежуточный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Быстрый АСТ может быть получен путем оценки ответа бактериальной метаболической активности на лечение антибиотиками с использованием одноклеточной метаболической визуализации SRS в течение 2,5 ч от образца до результатов SC-MIC. Реакция бактериальной метаболической активности и антимикробная восприимчивость могут быть обнаружены путем мониторинга метаболического включенияD2O для синтеза биомолекул с использованием SRS-визуализации C-D связей. Поскольку вода повсеместно используется в живых клетках, метаболическая визуализация SRS обеспечивает универсальный метод быстрого АСТ. Быстрый метод АСТ применим для обнаружения бактерий в сложных биологических средах, таких как моча или цельная кровь на уровне одной бактерии. SC-MIC может быть определен после 1,5-часовой культуры бактерий в моче и крови, что считается преобразующим для смещения парадигмы диагностики ИМП и BSI от трудоемкой культурозависимой процедуры к культурально-независимому подходу in situ . Таким образом, это означает значительное сокращение времени диагностики по сравнению с обычным методом микроразбавления отвара, который прокладывает путь к клиническому переводу, позволяя своевременно идентифицировать соответствующие противомикробные средства для точного лечения.

Протоколы лечения антибиотиками, описанные здесь, следуют рекомендациям CLSI, в которых предлагаемая среда MHB может быть обычно использована для культивирования широкого спектра микроорганизмов. Ключевым параметром является то, что количество бактериальных клеток, используемое для тестирования чувствительности к противомикробным препаратам, поддерживается на уровне примерно 5 x 105 КОЕ/мл, как рекомендуется в CLSI. Это имеет решающее значение для получения точных и воспроизводимых результатов. В экспериментах по лечению антибиотиками концентрация бактерий устанавливается на уровне 8 х 105 КОЕ/мл. Более высокая концентрация бактерий может привести к увеличению результатов MIC. После того, как бактериальная суспензия отрегулирована, ее необходимо использовать в течение 30 минут, чтобы избежать изменений концентрации бактериальных клеток.

Для тестирования чувствительности антибиотика, такого как даптомицин, рекомендуется добавлять 50 мг / л кальция в средах. Катионно-скорректированная среда MHB содержит 20-25 мг/л Ca2+. Поэтому убедитесь, что среда дополнительно дополняется дополнительнымCa2+ (солюбилизированным в воде и стерилизованным фильтром) в концентрации 30 мг/л.

Другим важным этапом в представленном способе является время инкубации бактерий при воздействии антибиотиков и включенииD2O. Поскольку время генерации бактериального жизненного цикла составляет примерно от 30 до 60 минут, важно влиять на метаболическую активность бактерий при воздействии антибиотиков в течение определенного времени. Этот тест был оценен для различных комбинаций бактерий и антибиотиков с воздействием антибиотиков в течение 1 ч до 0,5 ч D2O лечения. Первый 1-часовой этап лечения антибиотиками необходим для влияния на метаболическую активность бактерий. Далее бактерии инкубируют сD2O-содержащей и антибиотикосодержащей средой в течение дополнительных 30 мин. Конечные концентрации антибиотиков поддерживают на прежнем уровне, а конечную концентрациюD2Oкорректируют до 70%. В целом, после 1 ч прекультуры антибиотиков и после 0,5 чD2O и включения антибиотиков результаты SC-MIC затем определяются метаболической визуализацией SRS бактериальной метаболической активности. Такая конструкция минимизирует влияниеD2Oна антимикробную активность на бактерии, а также приводит к сопоставимому считыванию результатов SC-MIC с МИК обычным методом.

В измерениях SC-MIC мы готовим параллельно 40 образцов, включая 5 различных антибиотиков, каждый с 8 концентрациями одновременно. Однако, поскольку существует множество процедур ручной работы, общее время анализа для обнаружения АСТ для пяти различных комбинаций бактерий и антибиотиков составляет более 2,5 ч. В нашем методе каждое изображение SRS, содержащее ~20 отдельных бактериальных клеток, было получено в течение ~1,0 с за один снимок при времени выдержки пикселя 30 мкс. По нашим оценкам, общее время анализа AST для изучения 10 антибиотиков для одного бактериального штамма составит менее 2,5 ч от образца до считывания SC-MIC, что имеет огромную возможность для выполнения измерения высокой пропускной способности. В будущей работе будет использоваться автоматизированный метод подготовки образцов и сбора данных визуализации для дальнейшего повышения пропускной способности. Сведения об устранении неполадок приведены в таблице 1.

В обычных методах АСТ на основе культур для получения бактериальных изолятов для дальнейших измерений необходимо предварительно инкубировать клинические образцы в течение нескольких часов. Передовые методы АСТ для клинического образца ИМП, такие как рамановская спектроскопия29, нанолитровый массив6 и цифровая количественная оценка нуклеиновых кислот18, были разработаны для избавления от длительной прединкубации. По сравнению с ИМП инфекция, БСИ или сепсис гораздо более опасны для жизни18,45, где быстрый АСТ срочно необходим для точной диагностики в клинике. Сообщалось, что метод микроскопической визуализации для измерения образования бактериальных колоний из положительных культур крови обеспечивает результаты MIC46. Тем не менее, для выращивания бактерий требуется не менее 6 часов для проведения анализа AST. Кроме того, коммерческие автоматические системы47 и стратегии масс-спектрометрии48,49 могут обеспечить считывание АСТ из положительных культур крови. Тем не менее, результаты MIC для клинического решения не могут быть предоставлены. Результаты АСТ и показания MIC имеют важное значение для предотвращения избыточной дозировки антибиотиков для пациентов, чтобы вызвать потенциальные побочные эффекты в клиниках, замедлить и предотвратить распространение устойчивых к противомикробным препаратам инфекций50,51. По сравнению с существующими методами АСТ, основанными на спонтанной рамановской микроскопии, наша технология значительно сокращает время сбора данных (примерно в 600 раз меньше) за счет усиления сигнала на порядки величины. В этой работе мы демонстрируем быструю визуализацию АСТ с помощью SRS метаболизма дейтерия у отдельных бактерий при клинически значимой бактериальной концентрации (105 ~ 106 КОЕ / мл) в моче или цельной кровяной среде. Как показано в предыдущих результатах, результаты МИК определяются после 1 ч лечения антибиотиками и 30 мин смесиD2Oи инкубации антибиотиков в бактерии в моче и крови. Наш метод может обеспечить классификацию микросхем и восприимчивости для каждой комбинации штамм-антибиотик в течение 2,5 ч и, следовательно, открывает новый путь к клиническому переводу. Подводя итог, можно сказать, что без необходимости предварительного культивирования и бактериального деления наш метод обладает огромным потенциалом в области быстрого и высокопроизводительного АСТ при инфекционных заболеваниях.

Наш метод SC-MIC с помощью метаболической визуализации SRS применим для обнаружения МИК и обеспечения классификации восприимчивости для инфекционных патогенов при работе с обильными разновидностями комбинаций штамм-антибиотик для клинического использования. SC-MIC определяется после 30-минутного включенияD2O в бактерии в моче и крови, что означает значительное сокращение времени диагностики по сравнению с обычным методом разбавления отвара, стоимостью от 16 до 24 ч для предварительной инкубации. Для предоставления информации об идентификации патогенов для принятия клинических решений технология метаболической визуализации SRS может быть дополнительно интегрирована с диагностическими платформами, способными к быстрой идентификации патогенов, такими как масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией ионизации во время полета 49,52,53. Сочетание идентификации патогенов in situ и быстрой диагностики АСТ может иметь большой потенциал для перевода в клинику, что позволяет своевременно идентифицировать соответствующие противомикробные средства для точного лечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH R01AI141439 для J.-X.C и M.S, и R35GM136223 для J.-X.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acousto-optic modulation Gooch&Housego R15180-1.06-LTD Modulating stokes laser beam
Amoxicillin Sigma Aldrich A8523-5G
Bandpass filter Chroma HQ825/150m Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride Sigma Aldrich C1016-100G Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth Fisher Scientific B12322 Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge Thermo Scientific 75002542
Cover Glasses VWR 16004-318
Culture tube with snap cap Fisher brand 149569B
Daptomycin Acros A0386346
Deuterium oxide 151882 Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6 Sigma Aldrich 156914 Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113 The Coli Genetic Stock Center 7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher brand 05-408-129
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters Millipore-Sigma SLSV025NB pore size 5 µm
ImageJ software NIH Version: 2.0.0-rc-69/1.52t Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C VWR 97009-890
Inoculation loop Sigma BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser Spectra-Physics Model: insight X3 Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI Demodulate the SRS signals
Oil condenser Olympus U-AAC NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) American Type Culture Collection ATCC 47085
Photodiode Hamamatsu S3994-01 Detector
Polypropylene conical tube 15 mL Falcon 14-959-53A
Polypropylene filters Thermo Scientific 726-2520 pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes Corning 07-202-031
Syringe 10 mL Fisher brand 14955459
UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter Model: DU 530 Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer VWR 97043-562
Water objective Olympus UPLANAPO/IR 60×, NA 1.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. The review on Antimicrobial Resistance. , (2016).
  2. Sugden, R., Kelly, R., Davies, S. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology. 1 (10), 16187 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  5. Frickmann, H., Masanta, W. O., Zautner, A. E. Emerging rapid resistance testing methods for clinical microbiology laboratories and their potential impact on patient management. BioMed Research International. 2014, 375681 (2014).
  6. Avesar, J., et al. Rapid phenotypic antimicrobial susceptibility testing using nanoliter arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (29), 5787-5795 (2017).
  7. Schoepp, N. G., et al. Digital quantification of DNA replication and chromosome segregation enables determination of antimicrobial susceptibility after only 15 minutes of antibiotic exposure. Angewandte Chemie International Edition. 55 (33), 9557-9561 (2016).
  8. van Belkum, A., et al. Innovative and rapid antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 299-311 (2020).
  9. Hou, Z., An, Y., Hjort, K., Sandegren, L., Wu, Z. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Choi, J., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing by tracking single cell growth in a microfluidic agarose channel system. Lab on a Chip. 13 (2), 280-287 (2013).
  11. Lu, Y., et al. Single cell antimicrobial susceptibility testing by confined microchannels and electrokinetic loading. Analytical Chemistry. 85 (8), 3971-3976 (2013).
  12. Kim, S. C., Cestellosblanco, S., Inoue, K., Zare, R. N. Miniaturized antimicrobial susceptibility test by combining concentration gradient generation and rapid cell culturing. Antibiotics. 4 (4), 455-466 (2015).
  13. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  14. Baltekin, Ö, Boucharin, A., Tano, E., Andersson, D. I., Elf, J. Antibiotic susceptibility testing in less than 30 min using direct single-cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (34), 9170-9175 (2017).
  15. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  16. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  17. Barczak, A. K., Hung, D. T. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  18. Schoepp, N. G., et al. Rapid pathogen-specific phenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMP quantification in clinical samples. Science Translational Medicine. 9 (410), (2017).
  19. Novelli-Rousseau, A., et al. Culture-free antibiotic-susceptibility determination from single-bacterium Raman spectra. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  20. Schröder, U. -C., et al. Detection of vancomycin resistances in enterococci within 3 1/2 hours. Scientific Reports. 5, 8217 (2015).
  21. Liu, C. -Y., et al. Rapid bacterial antibiotic susceptibility test based on simple surface-enhanced Raman spectroscopic biomarkers. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
  22. Chang, K. -W., et al. Antibiotic susceptibility test with surface-enhanced raman scattering in a microfluidic system. Analytical Chemistry. 91 (17), 10988-10995 (2019).
  23. Galvan, D. D., Yu, Q. surface-enhanced raman scattering for rapid detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria. Advanced Healthcare Materials. 7 (13), 1701335 (2018).
  24. Kirchhoff, J., et al. Simple ciprofloxacin resistance test and determination of minimal inhibitory concentration within 2 h using raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (3), 1811-1818 (2018).
  25. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  26. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  27. Berry, D., et al. Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 194-203 (2015).
  28. Tao, Y., et al. Metabolic-activity-based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled single-cell raman microspectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (7), 4108-4115 (2017).
  29. Yang, K., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing of pathogenic bacteria using heavy water-labeled single-cell raman spectroscopy in clinical samples. Analytical Chemistry. 91 (9), 6296-6303 (2019).
  30. Song, Y., et al. Raman-Deuterium Isotope Probing for in-situ identification of antimicrobial resistant bacteria in Thames River. Scientific reports. 7 (1), 16648 (2017).
  31. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  32. Cheng, J. -X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  33. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 415-445 (2015).
  34. Yue, S., Cheng, J. -X. Deciphering single cell metabolism by coherent Raman scattering microscopy. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 46-57 (2016).
  35. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  36. Ji, M., et al. Rapid, Label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  37. He, R., Liu, Z., Xu, Y., Huang, W., Ma, H., Ji, M. Stimulated Raman scattering microscopy and spectroscopy with a rapid scanning optical delay line. Optics Letters. 42 (4), 659-662 (2017).
  38. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  39. Camp, C. H., et al. High-Speed Coherent Raman Fingerprint Imaging of Biological Tissues. Nature Photonics. 8, 627-634 (2014).
  40. Zhang, M., et al. Rapid determination of antimicrobial susceptibility by stimulated raman scattering imaging of D2O metabolic incorporation in a single bacterium. Advanced Science. 7 (19), 2001452 (2020).
  41. Michael, I., et al. A fidget spinner for the point-of-care diagnosis of urinary tract infection. Nature Biomedical Engineering. 4 (6), 591-600 (2020).
  42. Bhattacharyya, R. P., et al. Simultaneous detection of genotype and phenotype enables rapid and accurate antibiotic susceptibility determination. Nature Medicine. 25 (12), 1858-1864 (2019).
  43. Stupar, P., et al. Nanomechanical sensor applied to blood culture pellets: a fast approach to determine the antibiotic susceptibility against agents of bloodstream infections. Clinical Microbiology and Infection. 23 (6), 400-405 (2017).
  44. Barber, A. E., Norton, J. P., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  45. Cohen, J., et al. Sepsis: a roadmap for future research. The Lancet Infectious Diseases. 15 (5), 581-614 (2015).
  46. Choi, J., et al. rapid antimicrobial susceptibility test from positive blood cultures based on microscopic imaging analysis. Scientific Reports. 7 (1), 1148 (2017).
  47. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 72 (1), 20-31 (2012).
  48. Machen, A., Drake, T., Wang, Y. F. Same day identification and full panel antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood culture bottles made possible by a combined lysis-filtration method with MALDI-TOF VITEK mass spectrometry and the VITEK2 system. Plos One. 9, 87870 (2014).
  49. Simon, L., et al. Direct identification of 80 percent of bacteria from blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry using a 10-minute extraction protocol. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01278 (2019).
  50. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  51. Johnson, L., et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in outpatient urinary Escherichia coli isolates. The American Journal of Medicine. 121 (10), 876-884 (2008).
  52. Van Belkum, A., et al. Developmental roadmap for antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 51-62 (2019).
  53. Dubourg, G., Lamy, B., Ruimy, R. Rapid phenotypic methods to improve the diagnosis of bacterial bloodstream infections: meeting the challenge to reduce the time to result. Clinical Microbiology and Infection. 24 (9), 935-943 (2018).

Tags

Биология выпуск 180
Быстрое тестирование чувствительности к противомикробным препаратам методом стимулированной рамановской рассеянной визуализации включения дейтерия в одну бактерию
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J.… More

Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J. X. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (180), e62398, doi:10.3791/62398 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter