Summary
극저온을 이용한 거대 분자 복합체의 구조 결정은 단백질과 복합체의 특정 클래스에 대한 일상이되었습니다. 여기서이 파이프 라인은 요약 (샘플 준비, 스크리닝, 데이터 수집 및 처리) 독자는 더 어려운 표본의 경우 변경 될 수있는 추가 상세한 자원과 변수를 향해 지시된다.
Abstract
극저온 전자 현미경 검사법(cryoEM)은 단일 입자 분석(SPA)을 통해 거대 분자 복합체의 구조 적 측정을 위한 강력한 기술입니다. 전체 공정에는 i) 극저온그리드에서 지원되는 박막에서 표본을 유리화하는 과정이 포함됩니다. ii) 입자 분포 및 얼음 품질을 평가하기 위해 표본을 선별; iii) 그리드가 적합한 경우 분석을 위해 단일 파티클 데이터 집합을 수집합니다. 및 iv) 이미지 처리는 EM 밀도 맵을 산출합니다. 이 프로토콜에서는 워크플로 중에 사용자가 수정할 수 있는 변수와 일반적인 문제의 문제 해결에 중점을 두고 이러한 각 단계에 대한 개요가 제공됩니다. 원격 현미경 작업이 많은 시설에서 표준이 됨에 따라 현미경에 대한 물리적 액세스가 제한될 때 사용자가 효율적인 작동 및 이미징을 지원하는 이미징 프로토콜의 변형을 설명합니다.
Introduction
단일 입자 CryoEM
분자 수준에서 생명을 조사하기 위해 우리는 구조를 이해해야합니다. 단백질 구조를 조사하는 많은 기술은 NMR, X 선 결정학, 질량 분광법 및 전자 현미경 검사법 (EM)과 같은 유효합니다. 현재까지, 단백질 데이터 뱅크 (PDB)에 증착된 구조물의 대다수는 엑스레이 결정학을 사용하여 해결되었습니다. 그러나, ~2012년부터, 극저온 전자 현미경검사(cryoEM)는 단백질 구조 측정을 위한 주류 기술이 되었고 그 사용은 극적으로 증가하였다. 전자 현미경 데이터 뱅크 (EMDB)에 증착 된 EM 지도의 총 수는 2012 년 1,566에 비해 13,421 (그림 1, www.ebi.co.uk)이었다. 2012년 냉동EM 밀도 맵에서 모델링된 원자 좌표의 수는 67개에 불과했지만 2020년 12월 현재 2,309개의 구조물이 35배 증가했습니다. '해상도 혁명'1이라고도 불리는 극저온 밀도 맵의 품질과 수량의 근본적인 성장은 여러 영역에서 발전의 결합에 의해 발생했습니다: 직접 전자 검출기로 알려진 이미징을 위한 새로운 카메라의 개발; 새로운 소프트웨어; 보다 안정적인 현미경2,3,4.
그림 1: 2012년부터 2020년 12월까지 EMDB에 대한 누적 제출.
단일 입자 분석(SPA)은 바이러스7,8, 멤브레인 단백질9,10, 헬리칼 어셈블리11 및 기타 동적 및 이질성 거대 분자 복합체12,13을 포함하여 격리 된 복합체의 고해상도 구조를 해명하여 다양한 샘플 유형에서 생물학적 통찰력을 생성하는 강력한 도구입니다(39kDa에서 크기)의 순서에 따라 달라지는 크기(kDa3)의 크기(kDa에서 크기)에 따라 달라지는 크기(kDa 39)의 크기(kDa에서 크기)에 따라 달라진 크기(kDa 39)의 크기(kDa에서 크기)에 따라 달라진 크기(39kDa에서 크기)에 따라 달라진 크기(kDa에서 39.kDa)의 수주에 따라 달라진 크기(kDa)의 크기(39kDa에서 의 크기)에 따라 달라진 크기(kDa 39)의 수주에 따라 달라진 크기(39kDa)의 크기(kDa에서 크기)에 따라 달라진 크기(kDa 39)의 크기(kDa에서 크기)에 따라 달라진 크기(39kDa에서 크기)에 따라 달라진 크기(39kD 14,15 ~ 수십 메가달톤). 여기서, 샘플에서 구조로 극저온 SPA에 대한 표준 파이프라인에 대한 프로토콜이 설명되어 있다.
이 파이프라인에 착수하기 전에 정제 된 샘플은 다운스트림 성공 가능성을 평가하기 위해 생화학 분석을 받아야합니다. 적합한 시료의 준비는 틀림없이 SPA에 가장 큰 장벽이며, 특히 일시적인 및 이질성 (조성 및 형태 모두) 복합체에 대한 것입니다. 거시 분자 복잡한 제제는 각 극저온EM 마이크로그래프에 많은 입자를 산출하기에 충분한 농도에서 가능한 한 적은 오염 물질을 포함해야 하며, 극저온분석에 적합한 완충조성에 있어야 한다. 자당, 글리세롤 및 높은 (~> 350mMMM의 염 농도, 시료 크기, 특성 및 기타 완충성분에 따라) 특정 완충 성분은 유리화 과정을 방해하거나 이미지의 신호 대 잡음 비율을 감소시킬 수 있어 구조 판정을 저해한다.
전형적으로, 최소크기 배제 크로마토그래피(SEC)와 SDS-PAGE 겔 분석은 샘플 순도17,18을 평가하는 데 사용해야 하지만, 원형 이색성, 기능적 분석, SEC와 다각광 산란, 열 안정성 분석 은 모두 cryoEM 분석 전에 거시분자 복합체 제제의 질적 분석을 위한 유용한 도구이다. 그러나, 이러한 생화학 적 분석에서 결과는 극저온EM 그리드에 샘플의 구조적 이질성과 행동에 약간의 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이러한 이유로, 네거티브 얼룩 EM은 조성 및 형태 이질성을 평가하기 위한 빠르고 저렴하며 강력한 도구로 일상적으로 사용되며, 따라서 정제로부터 어떤 용출 분수가 가장 유망하거나 다른 완충 조성물을 선별하는 좋은 방법입니다19,20. 유망한 샘플이 확인되면 SPA 극저온 파이프라인으로 진행할 수 있습니다. 음의 얼룩이 항상 극저온EM에서 볼 수있는 후속 결과와 일치하지 않습니다; 때로는 샘플은 부정적인 얼룩에 의해 가난한 보이지만 극저온에서 유리체 얼음에서 볼 때 개선됩니다. 대조적으로, 때때로 견본은 음극기 단계 도중 우수해 보이지만 극저온으로 진행할 때 상당한 추가 최적화가 필요합니다. 그러나, 대부분의 경우 네거티브 얼룩은 유용한 품질 관리 단계를 제공한다.
바이트로케이션
전자 현미경의 진공 시스템 내의 가혹한 환경은 고정되지 않은 생물학적 표본에 탈수 및 방사선 손상을 모두 유발합니다21. 따라서, 원어민과 같은 상태에서 샘플을 이미지하기 위해, 생물학적 표본은 이미징 전에 보존되어야 한다. 거시분자 복합체의 정제제제를 위해, 유리화는 단지의 원자적 세부사항을 보존하면서 극저온에 의한 시각화를 가능하게 하는 방안이다. 샘플 제제의 방법으로 유리화의 발견은 두보셰가 2017년 노벨 화학상에서 인정받은 생물학적 표본의 전자 현미경 검사법의 근본적인 발전이었습니다. 시료 진동은 관심 있는 표본을 포함하는 얇은 층의 용액을 만드는 것을 포함하며, 일반적으로 수십 nm 두께의 극저온그리드 지지대에서 매달려 있다. 박막은 다음 ~-175°C에서 액체 에탄과 같은 극저온에서 매우 빠르게 동결된다. 동결속도는 ~106 °C/s로, 비정질 또는 유리체 얼음 형태가 충분히 빠르며, 얇고 단단한 필름22에서 시편을 일시 중단한다.
고려해야 할 초기 변수는 cryoEM 그리드 지원선택23입니다. EM 그리드는 일반적으로 지지 구조를 통해 천공(일반 또는 불규칙)이 있는 비정질 탄소 필름으로 구성됩니다. 상기 지지 구조는 일반적으로 직경 3.05mm의 원형 금속 그리드이지만, 일반적으로 구리로 만들어지지만, 금 또는 몰리브덴(열 팽창 특성24이 선호되는)과 같은 다른 금속을 사용할 수 있다. 때로는 그래핀, 그래핀 옥사이드 또는 얇은(~1-2nm) 비정질 탄소 층과 같은 그리드 전체에 얇고 연속적인 지지가 가해질 때가 있습니다. 표준 극저온(가장 일반적으로 400-200 메쉬 구리)이 천공된 메쉬 구리(1.2 μm 원형 구멍1.3μm(r1.2/1.3)로 분리되거나 탄소 의 2μm(r2/2)로 분리된 2μm) 탄소 지지체-많은 다른 패턴이 사용 가능하지만, 대부분의 구조에서 사용되어 왔다. 전도도 향상 및 표본 이동 감소를 가진 새로운 그리드 기술이 보고되었습니다25 . 선택된 그리드는 광방전/플라즈마 세척 처리를 통해 친수성 및 시료 적용을 가능하게 합니다26.
광선 배출 에 이어 다음 단계는 박막 형성입니다. 이 박막은 가장 일반적으로 그리드에서 여분의 액체를 제거하기 위해 필터 종이를 사용하여 형성된다. 이 수동으로 수행 할 수 있지만, 플런지 동결 장치의 숫자는 비트 로봇 Mk IV (열 피셔 과학), EM GP II (라이카) 및 CP3 (가탄)를 포함하여 시판적으로 사용할 수 있습니다. 이러한 장치를 사용하면 용액의 샘플 ~3-5 μL이 EM 그리드에 적용되고 필터 용지를 사용하여 과도한 용액을 블롯합니다. 박막이 매달려 있는 그리드는 액체 질소(LN2)에 의해 냉각된 액체 에탄으로 뛰어들어 ~-175°C로 떨어지게 된다. 일단 동결되면, 그리드는 편각점(-137°C) 이하의 온도에서 유지되고, 이미징 중에 유지된다.
표본 선별 및 데이터 수집
극저온EM 그리드의 진동에 따라 다음 단계는 그리드를 스크리그하여 품질을 평가하고 그리드가 고해상도 데이터 수집을 진행하는 것이 적합한지 여부를 결정하는 것입니다. 이상적인 저온EM 그리드에는 얼음 두께가 표본의 가장 긴 치수를 수용할 수 있는 유리체 얼음(결정얼음 반대)이 있어 주변 얼음이 가능한 한 작은 소음을 냅니다. 얼음 내의 입자는 생화학과 일치하는 크기와 (알려진 경우) 모양을 가져야하며, 이상적으로 입자 배향의 임의 분포와 함께 단일 분산되어야합니다. 마지막으로 그리드는 원하는 데이터 수집 길이를 충족하기에 충분한 품질 영역을 가져야 합니다. 시편에 따라 최적의 그리드가 생성될 때까지 많은 진동 및 스크리닝이 필요할 수 있습니다. 다행히도 불행히도 극저온EM 그리드의 입자 분포를 변경하기 위해 경험적으로 테스트할 수 있는 다양한 변수가 있습니다(in16,27 검토). 본 원고에서는 막 단백질 프로젝트에 대한 대표적인 결과가 나타났다10.
적절한 그리드가 확인되면 데이터 수집이 진행될 수 있습니다. 생물학적 표본을 위한 저온 전염 전자 현미경의 몇몇 모형은 자동화된 방식으로 고해상도 데이터를 수집하기 위하여 최적화됩니다. 일반적으로 데이터는 300kV 또는 200kV 시스템에서 수집됩니다. EPU(써모 피셔 과학) 28, 레기논29, JADAS30 및 시리얼EM31,32를 포함한 소프트웨어를 사용하여 자동화된 데이터 수집을 달성할 수 있습니다. 최신 검출기가 있는 자동화된 데이터 수집은 일반적으로 24시간 동안 원시 데이터의 테라바이트(TB)를 생성합니다(평균 데이터 집합은 ~ 4TB 크기).
2020년 12월 에 위치한 COVID-19 제한으로 인해 많은 현미경 시설이 원격 액세스를 제공하기 위해 이동했습니다. 그리드가 현미경의 오토로더에 로드되면 원격으로 데이터 수집을 수행할 수 있습니다.
이미지 프로세싱 및 모델 구축
데이터 수집 세션이 일반적으로 0.5-4일 일 수 있는 경우 컴퓨팅 리소스의 가용성에 따라 후속 이미지 처리에는 몇 주 및 몇 주가 걸릴 수 있습니다. 초기 이미지 처리 단계, 즉 모션 보정 및 콘트라스트 전송 기능(CTF) 추정에 대한 표준으로 '즉석' 33,34를 수행한다. 다운스트림 처리를 위해 다양한 소프트웨어 제품군을 사용할 수 있습니다. 입자는 '수확'하고 현미경 그래프35,36에서 추출됩니다. 입자를 추출하면 표준 프로토콜은 여러 단계의 분류(두 차원(2D)와 3차원(3D) 및/또는 특정 관심 영역에 초점을 맞춘 여러 계라운드를 통해 입자를 처리하여 동질적인 입자 하위 집합에 도달하는 것입니다. 그런 다음 입자의 균일한 하위 집합은 3D 재구성을 생성하기 위해 함께 평균됩니다. 이 시점에서 데이터는 CTF 정제, 왜곡 보정37 및 Bayesian 연마38을 통해 가능한 최고 품질의 맵을 생성하기 위해 더 수정되는 경우가 많습니다. 이 이미지 처리의 결과는 관심있는 생물학적 표본의 3D 극저온맵입니다. 300kV 현미경 시스템에서 수집된 데이터는 단백질 복합체의 크기와 유연성에 따라 일반적으로 10Å와 2Å 사이인 충분한 품질의 그리드에서 '표준' 자동화된 단일 입자 실험에 도달한 해상도 범위가 있습니다. 이상적인 표본을 사용하면 이제 SPA 워크플로를 사용하여 ~1.2 Å의 해상도에 도달했습니다. 이 프로토콜은 EM 밀도 맵을 획득하는 단계를 자세히 설명하지만, 일단 이 프로토콜이 손에 들어오면 단백질 모델을 피팅하고 정제하여 추가로 해석될 수 있습니다(해상도가 3.5Å에 < 경우) 또는 건물 드 novo39. 구조 결정 실험과 관련된 데이터는 EM 밀도 맵(전자 현미경 데이터 뱅크)40, 결과 원자 좌표(단백질 데이터 뱅크) 41 및 원시 데이터 세트(전자 현미경 공공 이미지 아카이브)를 포함하여 온라인 공개 저장소에 증착될 수 있습니다.
본 프로토콜에서, 포르피로모나스 진기발리스 로부터의 외부막 단백질 복합체 라그AB(~340 kDa)는 대표적인 거대분자 복합체10 (EMPIAR-10543)으로 사용된다. 극저온에 익숙하지 않은 경우 iNEXT 디스커버리 및 지시와 같은 자금 지원 접근 체계를 통해 샘플에서 구조로 이 파이프라인을 통한 샘플을 지원할 수 있습니다.
Protocol
1. 그리드 바이트로피케이션
참고: 1단계와 2단계의 모든 단계의 경우, 모든 공구가 깨끗하고 건조하며 실온에서 LN2 온도로 냉각하여 새로 탈포된 LN2 를 사용하여 얼음 오염을 줄이십시오. 가능한 경우 습도가 < 20%의 상대 습도를 갖춘 습도 제어 환경에서 작업할 수 있습니다. 작업을 시작하기 전에 적절한 개인 보호 장비및 H&S 문서가 마련되어 있는지 확인하십시오.
- 관심 있는 표본이 시료 준비를 위한 준비가 되었는지 확인하십시오.
- 적절한 극저온EM 그리드를 선택하고 이러한 전력 병전을 통해 광방전 또는 플라즈마 처리를 사용하여 친성성으로 렌더링되었는지 확인하십시오. 프로토콜에 대한 다양한 시스템 및 변형을 사용할 수 있지만, 모든 시스템에 특정 가스 혼합물/화학 증기 또는 공기를 도입하기 전에, 원하는 진공 수준으로 챔버를 펌핑 할 프로그램을 실행하는 광선 방전 / 플라즈마 청소 시스템에 그리드를 배치포함. 전류는 가스 입자를 이온화하고 그리드의 표면을 유도하여 시스템을 통과하여 더 많은 친수성으로 렌더링됩니다.
- 뒷면의 전원 스위치를 사용하여 시스템을 켜고 터치 스크린이 로드될 때까지 기다립니다.
- 콘솔 에서 제공된 스타일러스 또는 핑거를 사용하여 챔버의 원하는 작동 온도를 설정합니다(대부분의 거대 분자4-6°C에 권장되는 범위는 4-60°C입니다).
- 가습기 의 바닥에 고무 튜브를 통해 주사기를 사용하여 50 mL 유형 II 실험실 물로 가습기를 채웁니다. 충전하기 전에 주사기에 갇힌 공기를 제거하십시오. 가습기나 물이 챔버로 흘러 들어가는 것을 과도하게 채우지 않도록 주의하십시오. 가습기가 채워지면 주사기 플런저를 5-10mL로 다시 끌어서 진공 씰을 만듭니다.
- 콘솔에서 챔버에 대해 원하는 상대 습도를 설정하십시오(사용 가능한 범위는 0-100%, 습도95-100%는 일반적으로 사용됩니다). 챔버가 너무 젖지 않도록 그리드 만들기 직전까지 습도를 '끄기'로 설정하십시오.
- 패드에 맞게 올바른 크기로 절단된 플런지 동결 장치 핀셋 및 필터 용지를 구입하거나 스탬프를 사용하여 적절한 크기의 조리개를 자릅니다.
- 동결을 위해 극저온을 준비합니다.
- 금속 냉동 그리드 박스 홀더, 저온컵, 금속 거미의 다리를 냉각수 용기에 넣습니다.
- LN2로 외부 챔버를 채우면 용기를 식힙니다. 외부 챔버를 얹어 극저온 그리드 박스 홀더의 상단을 덮습니다. LN2 온도에 시스템의 평형을 돕기 위해 극저온 컵에 LN2를 추가1cm추가합니다.
참고: 오염 방지 링은 극저온 컵 주위의 습한 공기 응축을 제한하고 극저온 냉각수/에탄 오염으로 이어지는 데 사용할 수 있습니다. 습도 제어 환경에서는 일반적으로 필요하지 않습니다. 오염 방지 링을 사용하는 경우 LN2 로 용기를 덮치지 않도록 주의하거나 나중에 링이 용기에 밀어 넣을 때 유출될 수 있습니다. - 거미 다리의 끓는 것을 관찰하기 위해 3-5 분 기다린 다음 극저온 컵이 충분히 추워서 유리화 매체를 응축할 수 있도록 3 분 더 기다립니다.
- 극저온(액체 에탄)을 극저온 컵에 액화합니다.
- 얇은 튜브와 노즐이 있는 에탄 실린더 파이프를 타고 가스를 분배합니다. 면도날을 사용하여 바로 팁을 잘라서 개구가 열린 P200 파이펫 팁이 이상적입니다. 팁에서 에탄이 고화되고 가스의 흐름을 차단하는 데 더 넓은 조리개가 필요합니다.
- 저온질 컵에 남은 LN2가 포함되어 있지 않도록 하고, 에탄 가스 노즐을 가지고 저온질 컵 내에 놓습니다. 가스 실린더 레귤레이터를 사용하여 낮은 흐름을 시작하고 극저온 가스를 극저온 컵에 분배하여 가스를 응축시합니다. 가스가 극저온 컵의 벽에 직접 누르면 흐르는 팁을 유지하지만 표면에 대한 두드리는 움직임으로 부드럽게 앞뒤로 움직입니다. 저온유류가 극저온컵 내에서 제어된 방식으로 응축/액화되기 시작할 수 있도록 가스의 흐름을 조절한다.
- 컵을 은 거미 림 바로 아래에 채우고 가스 흐름을 중지한 다음 가스 라인을 조심스럽게 제거하여 주변 LN2 를 에탄으로 오염하지 않도록 하십시오.
- LN2로 냉각수 용기를 위로 올려 액체 에탄에 흘리지 않도록 주의하십시오.
- 액체 에탄이 충분히 차가운 온도에 평형되도록 - 3-5 분 동안 거미 다리를 배치합니다. 저온은 흐리고 약간 불투명해 보이기 시작합니다. 이는 동결 점에 가깝다는 것을 나타냅니다. 이 단계에서 는 핀셋을 사용하여 거미를 제거하십시오. LN2 가 극저온 컵을 둘러싼 용기 내에 보관되는 한, 에탄은 이제 액화되어 1-2h의 유리화에 적합합니다. 그러나, 얼음 오염을 줄이기 위해 가능한 한 빨리 절차를 완료하는 것을 목표로, 특히 비 습도 제어 실에서.
참고: 거미가 '붙어 있는' 것처럼 보이는 경우 너트와 같은 금속 물체를 사용하여 거미의 다리에 대고 약간 따뜻하게 한 다음 다리를 제거합니다.
- 시료 진동을 위해 플런지 동결 장치 및 액세서리를 준비합니다.
- 금속 냉동 그리드 박스 홀더에 그리드 스토리지 박스를 추가하고 절차 전반에 걸쳐 LN2 가 그리드 박스 의 수준 바로 위에 올려져 있는지 확인합니다(일반적으로 모든 ~ 5분).
- 플런지 동결 장치 화면에서, 프로세스 매개 변수 상자에서 선택한 매개 변수입력: blot 시간 (플런지 동결 장치 패드가 함께 올 시간), 힘 (그리드에서 블로팅 패드의 거리, 이는 얼음 형성의 그라데이션을 변경) 및 총 (블로팅 패드가 충족될 횟수). 거대 분자의 개별 급락 동결 장치 및 행동에 따라 이러한 매개 변수를 선택합니다. 일반적인 값은 0과 5 사이의 얼룩력, 1-6 s에서 의 blot 시간 및 1의 얼룩 총입니다. 일반적인 대기 시간(블롯 을 시작하는 시간, 그리고 블롯 시작 사이의 시간)과 배수 시간 (급락 하기 전에 블로팅 후 시간)는 0-2 s입니다.
참고: 사용자 선호도에 따라 옵션의 추가 옵션 , 각 프레스의 다음 단계로 이동하는 풋 페달 사용 , 그리드 전송 건너뛰기 (트위저 암이 약간 발생하는 마지막 단계를 건너뛰기), 프로세스 중 습도 끄기 (샘플이 적용되는 동안, 그리드를 보기 어렵게 만들 수 있는 챔버의 활성 가습 을 중지) 및 자동 리프트 의 활성 가습을 중지하는 등 옵션의 추가 옵션을 선택할 수 있습니다. (챔버로 들어올려지고 냉각수 용기를 올리는 핀셋의 단계를 결합하여 에 탄 용기 단계를 높 입니다). 여기서이러한 모든 옵션이 켜져 있습니다. - 냉각수 용기를 챔버 아래 움직이는 플랫폼 암에 단단히 놓습니다.
- 플라스틱 링 클립이 고정되도록 각 블로터 암에 신선한 블로팅 용지를 삽입합니다. 각 필터 용지는 16개의 블롯(팔회전 용지)을 허용합니다. 컨트롤 섹션에서 Blot 용지 재설정 버튼을 누릅니다.
- 플런지 동결 장치 진동 프로세스의 전체 주기 1개를 실행하여 각 이동 부품이 예상대로 작동하도록 합니다.
- 누릅니다(또는 풋 페달을 사용하여 새 그리드를 배치한 다음 프로세스를 시작한 다음 계속 처리합니다. 이 단계에서는 블로팅 암이 예상대로 서로 접촉하고 있는지 확인하십시오.
- 가습기를 '켜십시오'. 수증기가 생성됩니다 (설정 습도가 현재 챔버에서보다 높은 한).
- 관심있는 표본은 이제 유리화 될 수 있습니다. 풋 페달 또는 뉴 그리드 배치 를 사용하면 플런징 로드가 챔버밖으로 내려와 핀셋을 마운트에 부착할 수 있습니다.
- 플런지 동결 장치 핀셋을 사용하여, 그리드 제조업체에 따라 샘플 응용 프로그램에 사용할 올바른 측면이 무엇인지 주의하여 원하는 광선 방전/플라즈마 청소 극저온엠 그리드를 선택하십시오. 이 지원이 손상됩니다으로 핀셋과 과도 / 불필요한 접촉을 방지하기 위해주의, 림에 의해 그리드를 선택합니다. 핀셋의 능선 부분으로 검은 클립을 이동하여 핀셋의 격자를 확보합니다. 그리드를 안전하게 유지해야 하지만 클립이 블로팅 패드에 접촉하므로 너무 멀리 내려서는 안되며, 나중에 클립을 해제할 때 핀셋을 이 지점 아래에 두어야 합니다.
- 극저온EM 그리드를 들고 있는 플런지 동결 장치 핀셋을 공압 암에 놓고 올바른 면을 지배적인 손을 향하게 합니다. 플런지 동결 장치 핀셋 및 챔버의 설계는 사용자의 손에 따라 챔버의 오른쪽 또는 좌측을 통해 시료를 적용할 수 있도록 한다.
참고: 동일한 블로팅 매개 변수로 다른 측면에 샘플을 적용하면 비교 결과가 거의 발생하지 않으므로 왼손잡이 연구원은 오른손잡이 동료와 독립적으로 블로팅 매개 변수를 조정해야 할 수 있습니다. - 프레스 스타트 프로세스 와 핀셋에 보관된 그리드는 챔버로 이동하여 냉각수 용기가 들어올 것입니다.
- 프레스 프로세스 와 핀셋은 파이펫을 사용하여 시편을 그리드에 적용할 수 있는 위치로 그리드를 이동합니다. 그리드의 올바른 측면을 향한 측면 포트를 열고 파이펫팅으로 샘플을 적용하여 파이펫 팁이 그리드 지지/구부러짐의 손상으로 이어질 수 있으므로 그리드에 닿지 않도록 하지만 액적이 그리드에 분배되도록 액체를 충분히 가까이 분배합니다. 일반적으로 3-5 μL이 적용됩니다.
- 계속 및 사용자 미리 정의된 매개 변수는 그리드를 얼룩진 다음 샘플 진동을 위해 냉각수 컵에 장착된 그리드로 핀셋을 급락시합니다. 핀셋은 냉각수 용기와 냉각수를 들고 있는 팔과 함께 하강하여 극저온에 그리드를 침수합니다.
- 극저온 컵에서 LN2에 잠긴 그리드 스토리지 박스로 그리드를 전송합니다.
- 핀셋을 핀셋팔에서 분리하고, 극저온 컵의 측면과 유리화 격자에 연락하지 않도록 세심한 주의를 기울입니다. 핀셋을 편안하게 유지되도록 그립을 조정합니다. 가능한 한 빠르고 신중하게 그리드를 극저온에서 LN2 로 이동합니다. 한 손으로는 핀셋을 손가락으로 닫고 다른 손으로 는 검은 색 클립을 길에서 위쪽으로 밀어 핀셋을 닫습니다. 그립을 재조정하고 그리드 스토리지 상자에 그리드를 조작합니다.
- 모든 그리드가 만들어질 때까지 1.10-1.19 단계를 반복합니다(일반적인 세션에는 4-12 그리드 만들기가 포함됩니다). 다음 단계까지 LN2 디워에 그리드가 포함된 모든 그리드 스토리지 박스를 저장합니다.
2. 자동 로더 현미경으로 로딩을위한 그리드 클리핑
- 이전에 설명된 프로토콜 (28)에 따라 자동 그리드 어셈블리로 그리드를 클립합니다.
3. 현미경에 원격 로그인 을 보안
참고: COVID-19는 글을 쓰는 시점에 제어할 수 있지만 해외 여행과 관련된 환경 적 문제로 인해 사용자가 원격으로 운영되는 서비스를 제공하는 더 많은 현미경 시설이 있습니다. 이를 위한 구현 방법은 각 시설의 로컬 IT 구성 및 내부 및 외부 사용자 커뮤니티의 요구에 따라 달라집니다. 여기서 eBIC에서 극저온에 원격으로 액세스하고 EPU 소프트웨어를 통해 현미경을 제어하는 과정이 설명되어 있습니다.
- 극저온에 원격으로 로그인합니다. 원격 로그온은 NoMachine 소프트웨어를 통해 현미경 지원 PC에 액세스하도록 중재되며 사용자 FedID 로그온 자격 증명을 통해 방문시 등록된 사용자에게만 액세스할 수 있도록 구성됩니다. 세션 기간 동안만 액세스가 활성 상태로 유지됩니다.
- NoMachine을 열고 암호 인증으로 nx-cloud.diamond.ac.uk 대한 새로운 NX 연결을 시작합니다.
- 연결을 열고 사용자 이름 fedid@fed.cclrc.ac.uk 및 FedID 암호로 로그인합니다. 사용 가능한 옵션에서 관련 현미경에 해당하는 아이콘을 두 번 클릭하여 관련 지원 PC에 대한 연결을 엽니다.
- Windows 로그온 화면에서 사용자 이름 clrc\FedID및 암호를 입력합니다.
- 데스크톱 아이콘에서 TeamViewer 소프트웨어를 열고 제공된 암호가 있는 파트너ID: TEM에 연결합니다. 이렇게 하면 지원 PC에서 TEM PC로의 연결이 설정됩니다. TeamViewer 리본의 다음 모니터 버튼을 사용하여 현미경 사용자 인터페이스와 EPU 창 사이를 전환할 수 있습니다.
- 현미경 기능은 EPU 인터페이스를 통해 사용자가 직접 제어할 수 있습니다.
4. 샘플을 자동 로더 현미경으로 적재하고 얼음 및 샘플 품질을 위한 스크리닝
참고: 이 섹션에서는 자동 로더 및 EPU 소프트웨어가 있는 현미경이 샘플 스크리닝에 사용되지만 다른 소프트웨어 및 측면 진입 시스템 및 다른 제조업체의 저온을 사용하여 이를 달성할 수 있습니다.
- 이전에 설명된 바와 같이 하중은 현미경 자동 로더에 그리드를 클리핑28.
- 현미경 사용자 인터페이스의 자동 로더 탭에서 화살표를 사용하여 옵션 대화를 탭하고 인벤토리 버튼을 누릅니다. 이렇게 하면 카세트의 각 위치를 순차적으로 검사하여 카트리지가 있는지 확인합니다. 점유 슬롯은 파란색으로 표시됩니다. 점유된 슬롯이 모두 매핑된 경우 인벤토리 버튼을 다시 눌러 현재 위치 후에 중지하고, 점유된 모든 슬롯이 매핑될 때까지 실행 상태로 둡니다. 제공된 상자에 샘플 세부 정보가 있는 모든 점유 슬롯에 레이블을 지정합니다.
- 현미경 열로 전송할 그리드를 강조 표시하고 로드를 클릭 합니다. 그리드가 성공적으로 스테이지에 로드되면 슬롯 레이블이 파란색에서 노란색으로 바뀝니다. 그리드를 스크리고 진행합니다.
- EPU 소프트웨어를 엽니다. 준비 페이지에서 획득 광학 및 설정을 선택한 다음 드롭다운 메뉴에서 Atlas 사전 설정을 선택합니다. 적절한 빔 설정 사전 설정(예: 64x 명목 매그, 스팟 크기 5, Microprobe, 팔콘 검출기의 병렬 범위에 조명 된 영역을 선택하십시오-빔 설정 사전 설정 see28을 선택하는 추가 정보를 위해). 매개 변수를 현미경으로 밀어 넣도록 설정 서를 누릅니다.
- 열 밸브를 열고 FluScreen을 삽입합니다. 빔이 표시되고 충분히 확산되고 검출기를 덮을 중앙에 있는지 확인합니다. 필요한 경우 조이스틱 또는 스테이지 메뉴를 사용하여 그리드의 더 얇은 영역으로 이동하여 X및 Y의 스테이지 이동을 제어합니다.
- FluScreen을 들어 올리고 EPU의 미리 보기 버튼을 사용하여 이미지를 찍습니다. 획득된 이미지에 기초하여, 더 낮은 수 스팟 크기로 이동하여 용량을 증가시킬 수 있으며, 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
- EPU에서 아틀라스 페이지로 이동하여 새 세션을 누릅니다. MRC 이미지 형식을 선택하고 스크리닝 세션을 저장하기 위한 적절한 폴더 이름과 위치를 입력한 다음 적용을 클릭합니다.
- 왼쪽의 메뉴에서 스크리닝 을 선택합니다. 각 그리드 옆에 있는 확인란을 선택하여 아틀라스 몽타주를 획득합니다. EPU에서 스크리닝 세션을 시작합니다 . 각 확인 그리드에 대해 아틀라스가 획득되며 완료 시 사용 가능한 여러 그리드 사각형이 나열됩니다. 각 아틀라스는 스크리닝 페이지에서 강조 표시하여 볼 수 있으며, 색상별로 그룹화된 유사한 예상 얼음 두께로 그리드 사각형을 표시하는 마크업이 완료됩니다.
- 완료되면 수집된 아틀라스를 검토하고 더 높은 배율에서 샘플 품질을 평가하는 데 적합한 그리드를 식별합니다(즉, 두꺼운 얼음으로 건조하거나 가려지지 않는 적절한 수의 그리드 사각형을 가진 그리드 제곱). EPU 스크리닝 메뉴에서 선택한 그리드를 강조 표시하고 로드 샘플을 클릭합니다.
- 빔 설정 사전 설정(각 스테이지에 원하는 빔 설정 사전 설정에 대한 설명 28 참조)과 미리 보기 기능을 사용하여 원하는 그리드 사각형을 보다 자세하게 검사합니다.
- 아틀라스 스크리닝 메뉴에서 현재 로드된 그리드를 선택하고 그리드 이미지의 원하는 위치를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 그리드 사각형으로 이동을 선택하여 채워진 구멍이 포함된 그리드 사각형으로 스테이지를 이동합니다.
- EPU, 준비 페이지로 돌아가그리드스퀘어 사전 설정을 선택합니다.
- EPU, 자동 함수 페이지를 열고 GridSquare 사전 설정으로 단계 기울기로 자동 유중심을 실행하여 샘플을 동심 높이로 이동합니다.
참고: 빔 기울기에 의한 자동 유중심성도 사용할 수 있으며, 이는 스테이지 기울기에 의한 자동 유중심보다 빠르지만 일반적으로 덜 정확합니다. - EPU에서 준비, 새로운 GridSquare 미리 보기 이미지를 가져 가라. 다른 얼음 두께를 나타내는 다른 구멍에 걸쳐 다른 회색 값을 유의하십시오. 오른쪽 클릭을 사용하여 구멍 위로 스테이지를 이동> 여기로 이동합니다. 구멍/유중심 높이 사전 설정 및 미리 보기를 선택합니다.
참고: 관심 있는 입자의 분자량 및 형상에 따라 구멍/유중심 높이 배율에서 이를 식별할 수 있습니다. - 데이터 수집 사전 설정을 선택하고 파티클을 쉽게 식별할 수 있는 배율을 설정합니다(일반적으로 <2å/pixel의 개체 샘플링에 해당). defocus 오프셋을 ~-40-80 e-/Å2의 노출 전자 용량으로 ~-3 ~ -5 μm로 설정합니다.
- 4.4의 단계를 반복하여 그리드 전체의 입자 분포, 방향 및 오염에 대한 다양한 얼음 두께를 평가합니다. 파티클 분포는 구멍의 중심에 비해 가장자리에 가깝게 다를 수 있으므로 구멍이 있는 다른 위치를 조사하는 것이 중요합니다.
- 아틀라스의 약속을 표시하는 모든 그리드를 충분한 그리드 사각형을 갖는 것으로 화면. 현미경에 이들을 유지하고 EPU를 사용하여 데이터 수집을 진행하거나, 현미경에서 샘플을 언로드하고 데이터 수집이 예약될 때까지 LN2 아래에 저장합니다.
5. 단일 입자 극저온 데이터 수집(원격 작업에 중점을 둔)
참고: EPU를 사용하여 데이터 수집을 위한 자세한 프로토콜은 제조업체 매뉴얼 및 기타 28에 설명되어 있습니다. 원격 작업을 위한 이 프로토콜의 수정(즉, 작업을 수행하기 위해 손 패널의 사용을 줄이고 소프트웨어 기반 대안을 사용하는 경우)이 강조 표시됩니다.
- 세션 중에 이미 수집되지 않는 한 그리드에 대한 아틀라스를 수집합니다.
- 프로젝트의 실험 적 요구에 따라 각 빔 설정 사전 설정을 정의합니다.
- 이미지 시프트 보정28을 수행합니다.
- EPU 세션을 설정합니다.
- EPU에서 세션 설정 후 EPU 페이지를 선택하고 새 세션을 선택한 다음 기본 설정에서 새 세션을 선택합니다.
- 이전 설정을 사용할 수 있는 옵션을 제공하는 팝업이 나타납니다 새 세션을 선택합니다. 예 는 이전 EPU(예: 시편 캐리어, 디포커스 범위, 자동 초점 설정, 그리드 유형)에서 현재 EPU 세션에 설정을 자동으로 로드합니다. 기본 설정에서 새 를 선택하면 사용자가 저장된 기본 설정(예: 디포커스 범위, 자동 초점 설정, 그리드 유형)이 있는 파일을 선택할 수 있으며 이 정보는 EPU로 미리 로드됩니다.
- 세션 이름을 유익한 것으로 채웁니다. 현지 시설에서 명명 규칙을 제안할 수 있습니다.
- 유형에서 수동을 선택합니다.
- 획득 모드의 경우 정확한 구멍 센터링 또는 빠른 획득을 선택합니다.
- 이미지 형식으로 원하는 형식을 선택합니다.
- 적절한 저장소 폴더 를 선택하고 EPU는 세션 이름으로 디렉터리를 만듭니다.
- 사용되는 그리드 유형 및 구멍 간격(예: 콴티포일 1.2/1.3)에 따라 적절한 시편 캐리어를 선택하고 적용을 누릅니다. 이 프로토콜은 일반 구멍 배열에 대한 템플릿을 생성하는 프로세스를 설명합니다.
- 초기 그리드 정사각형을 선택하고 획득 템플릿을 설정합니다.
- 사각형 선택 이동, 모든 사각형이 녹색인 경우 왼쪽 상단에 있는 모든 선택 취소를 클릭합니다.
- 타일 열기(우측 클릭 > 열린 타일). 사각형을 선택합니다(마우스 오른쪽 클릭 > 추가, 마우스 오른쪽 클릭 > 그리드 정사각형으로 스테이지 이동).
- 구멍 선택으로 이동하여 자동 유중심을 누릅니다. 이 완료 되 고 그리드 사각형 이미지를 촬영 될 때까지 기다립니다. 자동 기능이 실패하면 높이가 크게 꺼져 있기 때문일 수 있습니다. 그렇다면 그리드 스퀘어 배율에서 FluScreen을 사용하여 수동으로 조정할 수 있습니다.
- 구멍 크기를 측정합니다. 노란색 원을 이동하고 조정하여 올바른 크기와 간격으로 구멍 위에 있습니다.
- 구멍을 찾기 를 누릅니다. 구멍이 올바르게 발견되었는지 확인합니다. 구멍 크기를 변경하지 않고 구멍을 다시 찾을 수 없습니다. 구멍을 올바르게 찾을 때까지 이 것을 반복합니다. 일관되게 실패하면 그리드 제곱 배율에서 더 낮은 숫자(밝은) 스팟 크기로 이동하는 것이 좋습니다.
- 오른쪽의 필터 얼음 품질 히스토그램을 사용하여 구멍 선택을 조정합니다. 이것은 두꺼운 얼음과 얇은 얼음이있는 영역을 제외하는 데 유용 할 수 있습니다. 이 세션 중에 선택한 향후 그리드 사각형에 대해 기억됩니다.
- 상단의 선택 메뉴의 도구로 구멍 선택을 최적화합니다. 예를 들어 그리드 막대 근처의 구멍 제거를 클릭합니다.
- 템플릿 정의로 이동하여 획득을 누릅니다.
- 찾기 및 중앙 구멍을 클릭합니다. 이제 구멍 주위에 노란색 원이 있는 구멍의 이미지가 표시됩니다.
참고: 구멍을 찾기 위해 고군분투하는 경우 목표 조리개를 삽입합니다. 여전히 구멍을 찾을 수 없는 경우 구멍/유중심 높이 사전 설정에 대한 노출 시간을 늘리거나 이 사전 설정에 대한 디포커스를 늘리거나 이미지를 비우십시오. 큰 디포커스 변경은 이미지 시프트 선형을 변경할 수 있습니다. - 단계 이동 후 지연을 변경하고 이미지 시프트 후 지연 시간을 1-5로 변경합니다.
- 최대 이미지 이동 값(옵션을 사용할 수 있는 경우)이 원하는 대로 확인합니다. 수차 없는 이미지 시프트 컬렉션을 사용하는 경우 이 값은 EPU 구성 파일에 정의되며 그렇지 않으면 5 μm이 표준 값입니다.
- 획득 영역 추가를 클릭한 다음 이미지의 어느 곳을 클릭합니다. 획득 영역을 원하는 위치(즉, 구멍 가장자리)로 이동하여 획득 영역이 빔으로 이중으로 노출되지 않도록 합니다(녹색 원의 사각형은 검출기 영역을 나타내고, 녹색 원은 빔 직경입니다).
- 오른쪽 상단에 디포커스 범위를 추가합니다. 그런 다음 다른 획득 영역을 추가합니다. 멤브레인 단백질 프로젝트의 전형적인 디포커스 목록은 -0.8 ~ -3 μm 디포커스이다.
- 자동 초점 추가 영역을 클릭하고 이미지의 어느 곳을 클릭합니다. 자동 초점 영역을 구멍을 둘러싼 탄소로 이동합니다. 표준 관행은 제곱편의 z 높이 변화에 따라 AFIS 또는 5-15 μm마다 중앙 집중 후 자동 초점입니다.
- 0.05 nm/s의 설정된 임계값을 가진 드리프트 측정 영역을 클릭하면 그리드 정사각형당 한 번 수행되는 드리프트 측정값이 표준 설정입니다. 드리프트 측정 영역은 자동 초점 영역과 직접 겹칠 수 있습니다(그리고 좋은 생각입니다). 드리프트 나 자동 초점 영역이 획득 영역과 겹치지 않도록 하십시오.
참고: 템플릿 실행 함수를 사용하여 템플릿을 확인할 수 있습니다. 이것은 획득 영역이 이동해야하는 지 확인하는 것이 좋습니다 (예 : 이미지에 너무 많고 탄소가 충분하지 않음) 필요하지 않습니다. - 다시 정사각형 선택으로 이동하고 그리드에서 수집을 위한 사각형을 선택합니다. 수집 영역 수와 예상 데이터 수집 률(검출기 및 실험 설정 기반 시설)을 사용하여 필요한 수집 영역 수를 예측합니다.
- 원하는 사각형을 모두 선택하면 모든 사각형 준비를 누릅니다.
- 각 사각형이 수집되면 그리드 사각형 사이를 탐색하고 선택 브러시를 사용하여 구멍을 미세 조정합니다.
- 시편을 통해 스테이지 위치로 이동하고 자동 기능을 사용하여 연동성 높이를 설정합니다. 이전에 설명한 대로 현미경 정렬을 수행28, 하지만 코마 없는 정렬을 수행 하 고 수동으로 객관적인 난시에 대 한 수정, 소프트웨어 내에서 정렬 도구를 사용 하 여. 간단히, 집합 획득 빔 조건, 목표 조리개 (OA)를 제거하고 단계는 유중심 높이에 표본의 빔 안정 영역 위에 위치되어 있는지 확인합니다. OA를 다시 삽입및 중심으로 하고 EPU로 객관적인 렌즈 난시를 수정하기 전에 자동 기능 내에서 혼수 상태에 관계없이 정렬을 수행합니다. 두 정렬이 적절한 값(<150nm의 혼수 상태에 수렴되고 난시가 0에 가깝게 수렴되는지 확인합니다.
- 자동 인수 실행을 시작하기 전에 오토로더 터보 펌프가 꺼지고 목표 조리개가 삽입되었는지 확인합니다.
- 자동 인수에서 시작을 눌러 자동화된 데이터 수집을 시작합니다.
6. EM 밀도 맵을 산출하는 이미지 처리
참고: 극저온시설의 대부분은 '즉석에서' 마이크로그래프 영화를 사전 처리합니다. RELION 파이프라인28,33, cryoSPARC43, Scipion34 및 WarpEM44를 포함하여 다양한 소프트웨어 패키지및 접근 방식이 있습니다. RELION 기반 파이프라인은 여기에 설명되어 있으며 사용자가 계산 리소스에 액세스할 수 있는 적절한 저장소 위치로 현미경 그래프 영화를 이동했다고 가정합니다. 멤브레인 단백질 프로젝트에 대한 공정 및 대표 결과에 대한 개요가 제공되며, 자세한 설명 및 단계별 튜토리얼은 리리온 홈페이지에서 찾을 수 있습니다: https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion.
- 현미경 동작 보정 및 CTF 추정에 대한 '즉석' 분석을 수행합니다. 프로젝트 디렉터리 내에서 리릴리온을 시작합니다. 가져오기, 모션 보정 및 CTF 추정 작업을 데이터 수집 및 전송과 동시에 반복하도록 예약합니다. 마이크로그래프 분석 script28은 난시에 대한 실시간 시각적 피드백과 예상 디포커스 값(대표 결과 참조)을 제공합니다.
- 미리 처리된 현미경 그래프에서 파티클을 선택합니다. 선택할 수 있는 자동화된 파티클 따기 소프트웨어 패키지가 많이 있습니다. RELION37의 자동 따기 탭 내에서 참조 무료 및 템플릿 기반 선택 옵션을 사용할 수 있습니다. 다른 프로그램은 입자 따기35에 crYOLO를 사용하여 다양한 단계에 사용될 수있다.
- CTF 교정 된 현미경 그래프에서 입자를 추출합니다.
참고: 조기 '정리'에 필요한 계산 시간을 줄이기 위해 단계 처리를 처리하고 추출 시 입자를 축소/bin합니다. 추출 작업을 실행하는 방법에 대한 자세한 내용은 RELION 3.1 자습서에서 찾을 수 있습니다. 이 프로젝트의 경우 파티클은 처음에 2의 계수로 비닝되었습니다. - 2D 클래스 평균을 수행합니다. 100-200개 클래스에서 분류하면 파티클 ≥ 포함하는 대부분의 데이터 집합에 적합합니다. 샘플에 대칭이 높은 경우(즉, icosahedral 바이러스)가 없는 한 데이터 집합이 작은 경우에도 200개 이상의 클래스 또는 50개 미만의 클래스를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 마스크 직경을 충분히 크게 설정하여 파티클의 가장 긴 치수를 수용할 수 있지만 인접한 파티클을 제외할 만큼 충분히 단단합니다(일부 시행 착오가 필요할 수 있음).
- 하위 집합 선택 작업을 사용하여 좋은 클래스(즉, 구조적 세부 정보가 있는 클래스)를 선택합니다. 양호하고 나쁜 2D 클래스 평균의 예는 대표 결과 섹션에서 찾을 수 있습니다.
- RELION의 3D 초기 모델 작업을 사용하여 데이터에서 초기 모델 드 노보 를 생성합니다.
참고: 덜 깨끗한 입자 스택은 정크/하위 최적 입자를 선별할 수 있는 추가 기회를 제공하기 때문에 다중 참조 ab initio SGD(스토세스 그라데이션 하강) 미세 조정의 이점을 누릴 수 있습니다. 관심 있는 파티클을 수용할 수 있는 마스크 직경을 선택하고 이러한 성능이 일상적으로 잘 수행되므로 'SGD' 탭의 필드의 기본 값을 그대로 둡니다. 초기 모델이 Chimera(또는 다른 적절한 시각화 프로그램)에서 합리적으로 보이는지 확인합니다(대표 결과 참조). - 3D 분류를 수행하여 6.6 단계의 출력을 참조 모델로 사용하여 데이터에서 이질성을 해결합니다. 키메라의 결과 맵을 평가합니다. 고유한 형태 상태에 해당하는 공정 입자 스택은 독립적으로 처리합니다. 하위 집합 선택 작업을 사용하여 관심 있는 클래스/클래스를 선택하고 관련 파티클 스택에 대해 particle.star 파일을 생성합니다.
- 3D 자동 개선 실행. 이전 단계에서 얻은 3D 클래스 평균을 해당 파티클 스택의 구체화를 위한 참조로 사용합니다. 구체화의 해상도가 데이터의 나이퀴스트 한계에 가까워지면 축소 없이 파티클을 다시 추출합니다. 다시 추출한 후 비통형 입자 스택을 통해 3D 자동 정제 작업을 반복합니다. 이 경우 3D 참조 모델은 픽셀 및 상자 크기가 다시 추출된 파티클 이미지의 크기와 일치하므로 다시 조정되어야 합니다. relion_image_handler 명령줄 도구를 사용하여 이 작업을 수행합니다.
- 적절한 경우 정교하게 대칭을 활용하십시오. 재구성된 맵에 대칭이 있는 경우 relion_align_symmetry 명령줄 도구를 사용하여 적절한 대칭 축에 맵을 정렬합니다. 결과 정렬된 맵을 참조 탭에 지정된 적절한 대칭 연산자가 새 3D 자동 수정 작업에서 참조로 사용합니다.
- 3D 자동 개선에서 맵을 선명하게 합니다. 이 작업은 RELION에서 후처리 작업을 사용하여 수행되지만 먼저 정제된 맵에서 적합한 마스크를 만들어야 합니다. 마스크 생성 및 후처리 단계는 RELION 자습서에 자세히 설명되어 있습니다(대표적인 결과 참조).
참고: 리온의 베이지안 연마 및 CTF 정제 기능을 사용하여 많은 재건의 해상도를 더욱 개선할 수 있습니다. CTF 정제 작업 유형을 사용하여 더 높은 수차(빔 기울기, 트레포일 수차 및 4차 수차)를 추정하고 수정하고 별도의 작업, 위행성 배율 및 입자당 디포커스로 보정합니다. 이에 따라 Bayesian 연마 작업(숙련된 값 또는 기본 값)을 사용하여 입자당 빔 유도 모션을 해결합니다. RELION 3.1 자습서에서 언급된 바와 같이, 이러한 작업은 반복적 인 접근 방식 (CTF- 정제 → 베이지안 연마 → 3D 자동 정제 → 후처리 → 혜택을 누릴 수 있습니다 ... 루프) 둘 다 고해상도 모델의 이점을 누릴 수 있기 때문에. - 필요한 경우 EM 밀도 맵의 핸드를 수정합니다. 맵을 검사하여 기존 원자 모델에 맞게 시도하거나 알파 헬리칼 영역의 손수를 평가하여 손이 올바른지 여부를 결정합니다. 필요한 경우 'vop zflip' 명령을 사용하여 UCSF Chimera45의 z축을 따라 맵을 뒤집습니다.
Representative Results
스크리닝할 때, 그리드는 낮은 배율로 해결된 피쳐가 데이터 수집에 적합하지 않은 그리드를 표시하는 아틀라스 단계에서 버릴 수 있습니다. 예를 들어, 그리드가 대부분의 그리드 사각형이 파손된 경우(그림 2A) 또는 그리드가 유리체 얼음이 없는 '건조'한 것으로 보이는 경우(그림 2B). 이러한 그리드는 일반적으로 그리드 사각형의 가장자리가 선명하고 뚜렷하게 나타나기 때문에 식별할 수 있습니다. 플런지 동결 장치를 사용하여 만들어진 대부분의 그리드에서 얼음 그라데이션이 관찰됩니다(그림 2C,D). 입자 분포는 관심 있는 표본에 따라 얼음 두께에 따라 크게 달라질 수 있으므로 입자 분포를 평가하기 위해 다양한 그리드 사각형을 스크리닝하는 것이 좋습니다. 사용자가 유사하거나 다른 얼음 두께의 그리드 사각형을 식별하는 데 도움이 되는 아틀라스 스크리닝 단계에서 EPU 소프트웨어 내에서 도구가 구현되었으며, 극저온엠 그리드(그림 2E, F)를 검사하는 데 특히 유용할 수 있습니다.
그림 2: 검사 세션에서 낮은 배율 '아틀라스'몽타주를 예로 들 수 있습니다. A) 대부분의 그리드 사각형이 파손되어 상당한 피해를 입은 그리드 - 수집에 적합하지 않습니다. B) 유리체 얼음이 없는 드라이 그리드 - 수집에 적합하지 않습니다. C) 그리드의 50%를 사용할 수 있는 얼음 그라데이션을 보여주는 그리드입니다. D) 그리드의 ~ 33%가 사용 가능한 얼음 그라데이션입니다. C 와 D 는 사용 가능한 그리드 사각형이 수집에 적합한 얼음 두께를 갖는 경우 데이터 수집에 적합하며 수집의 최소 지속 시간을 만족시키기에 충분한 획득 영역(예: 24h) E) 얼음 두께의 범위가 있는 예제 아틀라스가 있습니다. F) E에 제시된 것과 동일한 아틀라스이지만, 얼음 두께에 따라 EPU 소프트웨어로 분류되고 착색된 그리드 사각형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
입자 분포를 선별할 때 배율 및 총 전자 용량과 같은 이미징 매개 변수가 예상 결과에 대한 정확한 그림을 제공하기 위해 데이터 수집 중에 사용될 것으로 예상되는 것과 유사합니다. 스크리닝 하는 동안 이상적인 입자 분포는 다양한 입자 배향이 보이는 단일 분산(표본 및 입자 의 형태에 대한 기존 지식에 따라 확인하기가 어려울 수 있음)(그림 3A). 얼음이 너무 얇으면 전자 빔으로 비춰질 때 녹을 수 있는 가장 큰 차원의 입자를 수용하면서 얼음은 가능한 한 얇아야 합니다. 이로 인해 현미경 검사에서 과도한 움직임이 발생하며 이 특성을 표시하는 영역은 피해야 합니다(그림 3B). 집단 경험에서, 이 효력은 완충에 세제가 있을 때 가장 일반적으로 관찰됩니다. 이로 인해 구멍 중앙에 매우 얇은 얼음이 생길 수 있으므로 입자를 물리적으로 배제하고 가장자리를 향해 강제로 만들 수 있습니다. 이 효과는 그림 3C에서 관찰되지만 이 경우 극단적인 예가 아니며 이러한 이미지는 여전히 데이터 집합에 유용하게 기여합니다. 마지막으로, 얼음은 유리체가 되어야 합니다. 촬영한 이미지의 대부분 또는 전부가 데이터 수집에서 결정적 얼음(그림 3D)을 표시하는 그리드(또는 그리드)의 영역을 제외합니다. 종종, 비 유리체 얼음그리드 사각형의 가장자리에서 관찰된다. 독자는 그리드 바이트화16 중에 변경할 수 있는 변수에 대한 자세한 리뷰와 박막 환경에서입자 동작에 대한 설명을 추가로 참조합니다46,47.
그림 3: 다른 입자 분포를 보여주는 대표적인 현미경 사진입니다. A) 다양한 방향을 채택하는 단분산 입자의 '이상적인' 분포입니다. B) 전자 빔에 노출되면 변형되는 구멍 중간에 지나치게 얇은 얼음이 현미경 그래프에서 과도한 움직임을 일으킨다. 이 효과는 버퍼 C에 세제가 있을 때 가장 자주 관찰됩니다) 얼음이 구멍 중앙에 얇아지는 경우, 이것은 물리적으로 중앙에서 입자를 배제하여 구멍 가장자리를 향해 입자의 혼잡을 일으킵니다. 이 경우 이러한 이미지가 유용하지 않도록 충분히 극단적이지 않지만 약간 두꺼운 영역을 선별 할 가치가 있음을 시사합니다. D) 얼음은 유리체가 아니며, 이 예 현미경 과 같은 부위에 데이터를 수집해서는 안됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
즉석 이미지 처리는 데이터 수집에 대한 오류 및 문제를 해결하는 데 도움이 되므로 가능한 경우 항상 권장됩니다. 예를 들어, 마이크로그래프 내의 과도한 움직임은 자동 로더 터보 펌프가 활성화되어 있거나 전자 빔에서 얼음이 크게 움직이는 금이 간 그리드 사각형에서 데이터가 수집되고 있음을 나타낼 수 있으며, 이는 그리드 사각형을 건너뛸 것임을 나타낸다. 즉석에서 CTF 추정은 양초점점(디포커스가 아닌)이 적용되는 상황(CTF 추정 프로그램 및 매개 변수가 이러한 점을 찾는 경우) 및 Volta phase plate48이 사용되는 위상 시프트를 결정할 수 있습니다. 플라이 이미지 처리 파이프라인에는 사용자가 micrograph 품질을 신속하게 평가하고 데이터 수집 수정이 필요한지 여부를 쉽게 결정할 수 있도록 데이터의 그래픽 요약(그림 4A)이 포함되어 있는 경우가 많습니다.
미생물 그래프에서 입자를 선택하는 것은 오염 이나 그리드 지지 필름과 같은 '거짓 긍정'을 피하면서 최적화가 필요할 수 있습니다. 그러나 crYOLO와 같은 파티클 피커는 데이터의 '첫 번째 패스'(그림 4B)에 대한 기본 매개 변수를 사용하여 충분히 잘 작동하므로 데이터의 품질과 다운스트림 성공 가능성을 보다 쉽게 평가할 수 있는 2D 클래스 평균으로 진행이 가능합니다. 대부분의 프로젝트에서 ~ > 10k 입자의 2D 분류는 이차 구조 세부 사항이있는 클래스를 공개하기 시작해야합니다. 3D로 진행하려면 2D 분류 단계는 일반적으로 다양한 파티클 방향을 나타내는 클래스를 표시해야 합니다. 바람직한 방향이 드러나면, 기울어진 시료를 사용하여 샘플 준비16 또는 추가 데이터 수집의 더 많은 반복이 필요할 수 있다49. '정크' 파티클은 폐기되는 동안 보조 구조 세부 사항을 표시하는 모든 클래스를 선택하여 3D 분석을 수행해야 합니다(그림 4C).
그림 4: 초기 이미지 처리 단계입니다. A) '즉석' 이미지 프로세싱 스크립트의 출력. B) crYOLO 일반 모델을 사용하여 식별된 적절하게 자동 고른 입자가 있는 예(왼쪽)는(오른쪽, 적색 사각형으로 경계하는 입자) 스케일 바(흰색)는 50nm이다. C) 빨간색 사각형에서 버려진 클래스를 보여주는 2D 분류 및 녹색으로 추가 처리를 위해 파티클을 선택한 클래스의 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
작은 입자 하위 집합을 사용하여 초기 모델을 생성할 수 있습니다(그림 5A). 그런 다음 이 초기 모델을 3D 분류 및 개선의 시작 모델로 사용할 수 있습니다. RagAB의 경우 데이터 집합에는 3D 분류 중에 분리할 수 있는 세 가지 고유한 순응체가 포함되어 있습니다(그림 5B). 그런 다음 이러한 각 클래스에 기여하는 파티클을 독립적으로 처리하고 EM 밀도 맵을 구체화하는 데 사용할 수 있으며, 이를 통해 추가 해석 및 모델 구성의 적용을 받을 수 있습니다.
그림 5: 3D EM 밀도 맵 생성. A) RELION을 사용하여 생성된 일반적인 초기 모델. B) 3개의 별개의 형태 상태로 입자를 분리하는 것을 보여주는 5개 클래스를 넘는 3D 분류: 개방(녹색), 열린 폐쇄(파란색), 닫힌 폐쇄(보라색). C) 마스크 생성 과정. 3D 세련미(왼쪽)의 맵은 키메라에서 시각화되어야 합니다. 그런 다음 볼륨 뷰어를 사용하여 맵이 분리되고 시끄러운 밀도(가운데)가 없는 가장 낮은 임계값을 식별할 수 있습니다. 이 임계값은 RELION 마스크 생성 작업의 초기 바이나화 임계값으로 입력됩니다. 예를 들어 마스크 출력이 회색(오른쪽)으로 표시됩니다. D) 라그AB(EMD-10245)의 개방형 폐쇄 상태의 고해상도 EM 밀도 맵을 필터링하고 로컬 해상도(Å)로 채색합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜에서 우리는 일상적인 SPA에 적합한 표본에 적용되는 기본 파이프 라인을 설명했습니다. 박막 형성 및 유리화의이 필터 종이 블로팅 방법은 의심 할 여지없이 현재까지 SPA 프로젝트의 대부분에 사용 주어진 성공이지만, 그것은 단점의 숫자와 함께 제공됩니다. 여기에는 시료 낭비, 박막을 형성하고 시편을 동결하는 데 필요한 느린 시간 척도(초)가 포함되며, 불경정성을 보고하고 필터 용지를 사용하여 과잉 액체50을 멀리 하는 부정적인 효과를 보고하였다. 최근에는 박막 제작의 재현성을 높이기 위해 신기술이 개발되었다51,52. 샘플 응용 분야와 바이트로피화 53,54,55 사이의 시간을 줄이는 다른 기술이 개발되었습니다. 박막 형성을 위한 필터 종이 기반 방법은 작성 시 SPA 극저온 샘플 제제의 가장 유비쿼터스 방법이지만, 이러한 새로운 기술은 그리드 바이트로화의 효율성과 재현성 측면에서 다양한 이점을 가져올 뿐만 아니라, 진동 화 전에 시간 해결 및 신속한 혼합과 같은 추가적인 실험 차원을 가져올 수 있는 새로운 기회를 창출할 수 있다.
대부분의 사용자에 대한 그리드 스크리닝 과정은 현재 낮은 배율 아틀라스를 획득한 다음 그리드 전체에서 높은 배율 이미지를 사용하여 입자 분포를 평가하는 질적 프로세스입니다. 이것은 몇몇 유형의 견본을 위한 충분히 견고한 접근이지만, 표본이 실제로 연구원이 이미지에 바라고 있는 무슨또는 선호하는 방향을 가지고 있는지, 예를 들면 작은 (<200 kDa) 견본을 가진 또는 저해상도 형태학이 입자 분포의 범위가 존재하는 경우에 눈으로 확인하기 어렵게 만드는 경우에 눈으로 평가하기 어려울 수 있습니다. 일부 프로젝트의 경우, 시편이 원하는 지 여부를 결정하는 것은 불가능하며, 예를 들어 리간드가 결합되어 있거나 샘플이 스크리밍되는 위치가 작은(예를 들어, 10kDa) 하위 단위가 여전히 복합체와 연계되어 있는지 여부를 평가하는 것이 불가능합니다. 이러한 프로젝트의 경우 데이터 분석을 위한 완전 자동화된 파이프라인과 '짧은' 0.5- 1-h 컬렉션이 결합되어 이미지 처리 단계를 통해 2D 분류 또는 3D 분류 및 개선으로 진행할 수 있어 더 긴 컬렉션이 보증되는지 여부를 효율적으로 결정하는 데 도움이 됩니다. 이러한 파이프라인은 아직 개발 중이며 현재 널리 구현되지는 않지만, 특히 까다로운 표본의 경우 극저온 그리드 스크리닝의 효율성을 향상시킬 수 있습니다.
직접 전자 검출기의 개선뿐만 아니라 이미지 시프트 데이터 수집과 같은 이미지 처리의 발전과 결합된 현미경 검사법의 수정은 데이터 수집 중에 생성된 이미지의 처리량과 품질을 증가시켰습니다. 수집되는 데이터의 비율이 증가하는 것은 많은 TB의 데이터를 수집하기 전에 극저온그리드를 철저히 검사해야 할 필요성을 강조합니다.
CryoEM SPA는 진정으로 주류 구조 생물학 기술이되었으며, 많은 경우에 이질성 및 음순 거대 분자 복합체와 같은 일부 종류의 표본에 대한 '이동'접근 방식이 되었습니다. 여기에 프로토콜은 SPA 파이프 라인의 기본 개요를 설명하는 동안, 여기에 적용되는 각 섹션 (그리드 바이크리제이션 및 스크리닝, 극저온 EM 및 이미지 처리) SPA 프로젝트의 개발 중에 탐구의 그 자체로 가치가있는 주제입니다. 샘플 준비 및 현미경 기술이 발전하고 새로운 이미지 처리 알고리즘과 접근 방식이 온라인상태가 됨에 따라 SPA는 복잡한 생물학적 시스템에 대한 통찰력을 얻기 위해 연구자들이 지속적으로 파이프라인으로 발전할 것입니다.
Disclosures
이해 상충이 보고되지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 유럽 위원회의 호라이즌 2020 프로그램에 의해 투자 iNEXT-디스커버리 (그랜트 871037)에 의해 지원되었다. J B. R. 화이트는 웰컴 트러스트(215064/Z/18/Z)의 자금을 지원받습니다. FEI 티탄 크리오스 현미경은 리즈 대학 (UoL ABSL 상)과 웰컴 트러스트 (108466/ Z / 15 / Z)에 의해 투자되었다. 우리는 그의 현미경 분석 스크립트의 사용에 대한 M Iadanza 감사합니다. 우리는 웰컴 트러스트, MRC 및 BBRSC가 지원하는 영국 국립 전자 바이오 이미징 센터 (eBIC)에서 저온-EM 시설에 대한 액세스 및 지원을 위한 다이아몬드 광원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt tweezers | Agar Scientific | AGT5022 | |
| Cryo EM round storage box | Agar Scientific | AGG3736 | |
| CryoEM autogrid boxes | ThermoFisher Scientific | 1084591 | |
| CryoEM grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Ethane gas | Boc | 270595-F | |
| LN2 foam dewar | Agar Scientific | AG81760-500 | |
| LN2 storage dewar | Worthington industries | HC 34 | |
| Pipette | Gilson | 10082012 | |
| Pipette tips | Star labs | s1111-1706 | |
| Syringe | BD | BD 300869 | |
| Type II lab water | Suez | select fusion | |
| Vitrobot | ThermoFisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot filter paper | Whatman | 1001-055 | |
| Vitrobot styrophome container assembly | ThermoFisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot tweesers | ThermoFisher Scientific | 72882-D | |
| Software | |||
| EPU | ThermoFisher Scientific | 2.8.1.10REL | |
| TEM server | ThermoFisher Scientific | 6.15.3.22415REL | |
| Tia | ThermoFisher Scientific | 5.0.0.2896REL | |
| Titan krios microscope | ThermoFisher Scientific | Titan Krios G2 |
References
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