Summary
Structuurbepaling van macromoleculaire complexen met behulp van cryoEM is routine geworden voor bepaalde klassen van eiwitten en complexen. Hier wordt deze pijplijn samengevat (monstervoorbereiding, screening, gegevensverzameling en -verwerking) en worden lezers gericht op verdere gedetailleerde bronnen en variabelen die kunnen worden gewijzigd in het geval van meer uitdagende exemplaren.
Abstract
Cryo-elektronenmicroscopie (cryoEM) is een krachtige techniek voor structuurbepaling van macromoleculaire complexen, via single particle analysis (SPA). Het totale proces omvat i) het verglaasen van het monster in een dunne film die wordt ondersteund op een cryoEM-raster; ii) het monster te screenen om de deeltjesverdeling en de ijskwaliteit te beoordelen; iii) indien het raster geschikt is, het verzamelen van een enkele deeltjesdataset voor analyse; en iv) beeldverwerking om een EM-dichtheidskaart te verkrijgen. In dit protocol wordt een overzicht gegeven voor elk van deze stappen, met een focus op de variabelen die een gebruiker tijdens de workflow kan wijzigen en het oplossen van veelvoorkomende problemen. Nu microscoopbediening op afstand standaard wordt in veel faciliteiten, zullen variaties op beeldvormingsprotocollen worden beschreven om gebruikers te helpen bij een efficiënte werking en beeldvorming wanneer de fysieke toegang tot de microscoop beperkt is.
Introduction
CryoEM met één deeltje
Om het leven op moleculair niveau te onderzoeken, moeten we structuur begrijpen. Er zijn veel technieken beschikbaar om de eiwitstructuur te onderzoeken, zoals NMR, röntgenkristallografie, massaspectrometrie en elektronenmicroscopie (EM). Tot op heden zijn de meeste structuren die zijn gedeponeerd bij de Protein Databank (PDB) opgelost met behulp van röntgenkristallografie. Vanaf ~ 2012 werd cryo-elektronenmicroscopie (cryoEM) echter een reguliere techniek voor het bepalen van de eiwitstructuur en nam het gebruik ervan dramatisch toe. Het totaal aantal EM-kaarten gedeponeerd bij de Electron Microscopy Databank (EMDB) (per dec 2020) was 13.421 vergeleken met 1.566 in 2012 (figuur 1, www.ebi.co.uk). In 2012 was het aantal atoomcoördinaten gemodelleerd in cryoEM-dichtheidskaarten, gedeponeerd bij de PDB, slechts 67, maar vanaf december 2020 zijn er tot nu toe 2.309 structuren afgezet, een 35-voudige toename. Deze onderliggende groei in de kwaliteit en kwantiteit van geproduceerde cryoEM-dichtheidskaarten, ook wel de 'resolutierevolutie' genoemd 1, werd veroorzaakt door een samensmelting van vooruitgang op meerdere gebieden: de ontwikkeling van nieuwe camera's voor beeldvorming die bekend staan als directe elektronendetectoren; nieuwe software; en stabielere microscopen2,3,4.
Figuur 1: Cumulatieve indieningen bij het EMDB van 2012 tot december 2020. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Single particle analysis (SPA) is een krachtig hulpmiddel om biologisch inzicht te genereren in een breed scala aan monstertypen door hoge resolutie structuren van geïsoleerde complexen op te helderen5,6 inclusief virussen7,8, membraaneiwitten9,10, spiraalvormige assemblages11 en andere dynamische en heterogene macromoleculaire complexen12,13, waarvan de grootte varieert in ordes van grootte (vanaf 39 kDa 14,15 tot tientallen megadalton). Hier wordt een protocol beschreven voor een standaard pijplijn voor cryoEM SPA van monster tot structuur.
Voordat aan deze pijpleiding wordt begonnen, moet een gezuiverd monster worden onderworpen aan biochemische analyse om de kansen op succes stroomafwaarts te beoordelen. De voorbereiding van een geschikt monster is misschien wel de grootste barrière voor SPA, met name voor voorbijgaande en heterogene (zowel compositorische als conformationele) complexen. Het macromoleculaire complexpreparaat moet zo min mogelijk verontreinigingen bevatten, in voldoende concentratie om veel deeltjes op te leveren in elke cryoEM-micrograaf en in een buffersamenstelling die zeer geschikt is voor cryoEM-analyse. Bepaalde bufferbestanddelen, waaronder sucrose, glycerol en hoge (~ > 350 mM concentraties zouten, afhankelijk van de steekproefgrootte, eigenschappen en andere bufferbestanddelen) kunnen het proces van vitrificatie verstoren of de signaal-ruisverhouding in afbeeldingen verminderen, waardoor de structuurbepaling wordt belemmerd16.
Doorgaans moeten minimaal grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en SDS-PAGE-gelanalyse worden gebruikt om de zuiverheid van het monster te beoordelen17,18, maar circulair dichroïsme, functionele assays, SEC in combinatie met multi-angle lichtverstrooiing en thermische stabiliteitstests zijn allemaal nuttige hulpmiddelen voor kwalitatieve analyse van macromoleculaire complexe preparaten voorafgaand aan cryoEM-analyse. De resultaten van deze biochemische analyses kunnen echter weinig inzicht geven in de structurele heterogeniteit van het monster en het gedrag ervan op een cryoEM-raster. Om deze reden wordt negatieve kleur EM routinematig gebruikt als een snel, goedkoop en krachtig hulpmiddel voor het beoordelen van compositorische en conformatie heterogeneiteit, en daarom een goede manier om vast te stellen welke elutiedractie van een zuivering het meest veelbelovend is, of om verschillende buffersamenstellingen te screenen19,20. Zodra een veelbelovend monster is geïdentificeerd, kunnen we doorgaan naar de SPA cryoEM-pijplijn. Negatieve vlek komt niet altijd overeen met de daaropvolgende resultaten in cryoEM; soms ziet een monster er slecht uit door negatieve vlekken, maar verbetert het wanneer het wordt gezien in glasachtig ijs in cryoEM. Daarentegen zien monsters er soms uitstekend uit tijdens negatieve vlekstappen, maar vereisen ze aanzienlijke verdere optimalisatie bij het overgaan naar cryoEM. In de meeste gevallen biedt negatieve vlek echter een nuttige kwaliteitscontrolestap.
Vitrificatie
De ruwe omgeving in het vacuümsysteem van de elektronenmicroscoop veroorzaakt zowel uitdroging als stralingsschade aan niet-gefixeerde biologische monsters21. Daarom moet het biologische exemplaar vóór beeldvorming worden bewaard om het monster in een inheemse toestand in beeld te brengen. Voor gezuiverde preparaten van macromoleculaire complexen is vitrificatie de voorkeursmethode om de visualisatie ervan door cryoEM mogelijk te maken met behoud van de atomaire details van het complex. De ontdekking van vitrificatie als een methode voor monstervoorbereiding was een fundamentele vooruitgang in elektronenmicroscopie van biologische specimens, waarvoor Dubochet werd erkend in de Nobelprijs voor de Scheikunde in 2017. Monsterverglazing omvat het creëren van een dunne laag oplossing met het monster van belang, meestal tientallen nm dik, gesuspendeerd op een cryoEM-rasterondersteuning. De dunne film wordt vervolgens extreem snel ingevroren in een cryogeen zoals vloeibaar ethaan bij ~-175 °C. De vriessnelheid is ~106 °C/s, snel genoeg dat amorf of glasachtig ijs ontstaat, waarbij het monster in een dunne, vaste film wordt gesuspendeerd22.
De eerste variabele waarmee rekening moet worden gehouden, is de gekozen cryoEM-rasterondersteuning23. Een EM-raster bestaat meestal uit een amorfe koolstoffilm met perforaties (regelmatig of onregelmatig), over een draagstructuur. De draagstructuur is meestal een cirkelvormig metalen rooster met een diameter van 3,05 mm, meestal gemaakt van koper, maar andere metalen zoals goud of molybdeen (dat de voorkeur heeft aan thermische uitzettingseigenschappen24) kunnen worden gebruikt. Soms wordt een extra dunne, continue ondersteuning over het raster aangebracht, zoals grafeen, grafeenoxide of een dunne (~ 1-2 nm) amorfe koolstoflaag. Terwijl standaard cryoEM-roosters (meestal 400-200 mesh koper met een geperforeerde (1,2 μm ronde gaten gescheiden door 1,3 μm (r1.2 /1.3), of 2 μm gescheiden door 2 μm koolstof (r2 / 2)) koolstofondersteuning - hoewel er veel verschillende patronen beschikbaar zijn) zijn gebruikt in de overgrote meerderheid van de structuren die tot nu toe zijn gerapporteerd, zijn nieuwe rastertechnologieën met verbeterde geleidbaarheid en verminderde monsterbeweging gemeld25 . Geselecteerde roosters worden onderworpen aan een gloeiende ontladings-/plasmareinigingsbehandeling om ze hydrofiel en vatbaar voor monstertoepassing te maken26.
Na gloed-ontlading is de volgende fase dunne filmvorming. Deze dunne film wordt meestal gevormd met behulp van filterpapier om overtollige vloeistof van het rooster te verwijderen. Hoewel dit handmatig kan worden uitgevoerd, zijn er een aantal apparaten voor het invriezen in de handel verkrijgbaar, waaronder de Vitrobot Mk IV (Thermo Fisher Scientific), EM GP II (Leica) en CP3 (Gatan). Met deze apparaten wordt ~ 3-5 μL monster in oplossing op het EM-rooster aangebracht, gevolgd door het wegvegen van overtollige oplossing met behulp van filterpapier. Het rooster, met een dunne film eroverheen, wordt vervolgens ondergedompeld in vloeibaar ethaan gekoeld door vloeibare stikstof (LN2) tot ~ -175 °C. Eenmaal bevroren, wordt het rooster op een temperatuur onder het devitrificatiepunt (-137 °C) gehouden voorafgaand aan en tijdens de beeldvorming.
Monsterscreening en gegevensverzameling
Na vitrificatie van een cryoEM-raster is de volgende fase het screenen van het raster om de kwaliteit ervan te beoordelen en om te bepalen of het raster geschikt is om over te gaan tot gegevensverzameling met hoge resolutie. Een ideaal cryoEM-raster heeft glasachtig ijs (in tegenstelling tot kristallijn ijs) met de ijsdikte net voldoende om de langste afmeting van het monster te accommoderen, zodat het omringende ijs zo min mogelijk ruis bijdraagt aan het resulterende beeld. De deeltjes in het ijs moeten een grootte en (indien bekend) vorm hebben die consistent is met de biochemie, en idealiter monodisperse zijn met een willekeurige verdeling van deeltjesoriëntaties. Ten slotte moet het raster voldoende gebieden van voldoende kwaliteit hebben om aan de gewenste lengte van de gegevensverzameling te voldoen. Afhankelijk van het monster kan dit vele iteraties van vitrificatie en screening vergen totdat optimale rasters zijn geproduceerd. Zowel gelukkig als helaas zijn er een enorm scala aan variabelen die empirisch kunnen worden getest om de deeltjesverdeling op cryoEM-rasters te veranderen (besproken in16,27). In dit manuscript worden representatieve resultaten voor een membraaneiwitproject10 getoond.
Zodra een geschikt raster is geïdentificeerd, kan de gegevensverzameling doorgaan. Verschillende modellen van cryotransmissie-elektronenmicroscopen voor biologische monsters zijn geoptimaliseerd om gegevens met een hoge resolutie op een geautomatiseerde manier te verzamelen. Doorgaans worden gegevens verzameld op 300 kV- of 200 kV-systemen. Geautomatiseerde gegevensverzameling kan worden bereikt met behulp van software zoals EPU (Thermo Fisher Scientific)28, Leginon29, JADAS30 en SerialEM31,32. Een geautomatiseerde gegevensverzameling met moderne detectoren resulteert meestal in terabytes (TB) aan onbewerkte gegevens in een periode van 24 uur (gemiddelde datasets zijn ~ 4 TB groot).
Vanwege de COVID-19-beperkingen die op een groot deel van de wereld van kracht zijn (op het moment van schrijven december 2020), zijn veel microscopiefaciliteiten overgestapt op het aanbieden van toegang op afstand. Zodra de roosters in de autoloader van een microscoop zijn geladen, kan gegevensverzameling op afstand worden uitgevoerd.
Beeldverwerking en modelbouw
Wanneer een gegevensverzamelingssessie doorgaans 0,5-4 dagen kan duren, kan de daaropvolgende beeldverwerking vele weken en maanden duren, afhankelijk van de beschikbaarheid van computerbronnen. Het is standaard voor initiële beeldverwerkingsstappen, namelijk bewegingscorrectie en contrastoverdrachtsfunctie (CTF) schatting om 'on the fly' plaats te vinden 33,34. Voor downstream-verwerking zijn er een overvloed aan softwaresuites beschikbaar. Deeltjes worden 'geplukt' en geëxtraheerd uit micrografieën35,36. Zodra deeltjes zijn geëxtraheerd, zou een standaardprotocol zijn om de deeltjes te verwerken door middel van verschillende classificatierondes (in zowel twee dimensies (2D) als drie dimensies (3D) en / of gericht op specifieke interessegebieden) om een homogene deelverzameling van deeltjes te bereiken. Deze homogene deelverzameling van deeltjes wordt vervolgens samen gemiddeld om een 3D-reconstructie te produceren. Op dit punt worden gegevens vaak verder gecorrigeerd om de hoogst mogelijke kwaliteit kaart te produceren, bijvoorbeeld door CTF-verfijning, vervormingscorrecties37 en Bayesiaanse polijsting38 . Het resultaat van deze beeldverwerking is een 3D cryoEM-kaart van het biologische specimen van belang. Het resolutiebereik dat wordt bereikt in een 'standaard' geautomatiseerd enkel deeltjesexperiment van een raster van voldoende kwaliteit, met gegevens verzameld op een 300 kV microscoopsysteem, ligt meestal tussen 10 Å en 2 Å, afhankelijk van de grootte en flexibiliteit van het eiwitcomplex. Met een ideaal exemplaar zijn nu resoluties van ~1,2 Å bereikt met behulp van SPA-workflows5. Hoewel dit protocol stappen beschrijft in de richting van het verkrijgen van een EM-dichtheidskaart, kan dit, zodra dit in de hand is, verder worden geïnterpreteerd door het aanbrengen en verfijnen van een eiwitmodel (als de resolutie < 3,5 Å is) of het bouwen van de novo39. Gegevens in verband met structuurbepalingsexperimenten kunnen worden gedeponeerd in online openbare opslagplaatsen, waaronder EM-dichtheidskaarten (Electron Microscopy Data Bank)40, resulterende atoomcoördinaten (Protein Data Bank)41 en ruwe datasets (Electron Microscopy Public Image Archive)42.
In dit protocol wordt het buitenmembraaneiwitcomplex RagAB (~340 kDa) uit Porphyromonas gingivalis gebruikt als voorbeeld macromoleculair complex10 (EMPIAR-10543). Voor degenen die nieuw zijn bij cryoEM, is ondersteuning voor monsters via deze pijplijn van monster tot structuur beschikbaar, onder voorbehoud van peer review, via gefinancierde toegangsregelingen zoals iNEXT Discovery en Instruct.
Protocol
1. Raster vitrificatie
OPMERKING: Zorg er voor alle stappen in stap 1 en 2 voor dat alle gereedschappen schoon, droog en op kamertemperatuur zijn voordat u ze afkoelt tot LN2-temperatuur , met behulp van vers gedecanteerde LN2 om ijsverontreiniging te verminderen. Werk waar mogelijk in een vochtigheidsgecontroleerde omgeving met < 20% relatieve vochtigheid. Zorg ervoor dat de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en H&S-documentatie aanwezig zijn voordat u met de werkzaamheden begint.
- Zorg ervoor dat het specimen van belang klaar is voor monstervoorbereiding.
- Kies de juiste cryoEM-roosters en zorg ervoor dat deze hydrofiel zijn gemaakt met behulp van gloemontlading of plasmabehandeling. Een breed scala aan systemen en variaties op het protocol zijn beschikbaar, maar ze omvatten allemaal het plaatsen van de roosters in een gloethenontlading / plasmareinigingssysteem en het uitvoeren van een programma dat de kamer naar een gewenst vacuümniveau pompt, voordat een specifiek gasmengsel / chemische damp of lucht in het systeem wordt geïntroduceerd. Een elektrische stroom wordt door het systeem geleid, ioniseert de gasdeeltjes en zorgt ervoor dat het oppervlak van de roosters meer hydrofiel wordt gemaakt.
- Start het apparaat voor het invriezen van het net op door het systeem in te schakelen met de aan /uit-schakelaar aan de achterkant en wacht tot het aanraakscherm is geladen.
- Stel met behulp van de meegeleverde stylus of vingers in Console de gewenste werktemperatuur van de kamer in (beschikbaar bereik is 4-60 ° C, aanbevolen voor de meeste macromoleculen 4-6 ° C).
- Vul de luchtbevochtiger met 50 ml laboratoriumwater type II met behulp van een spuit, via de rubberen slang aan de onderkant van de luchtbevochtiger. Zorg ervoor dat u alle opgesloten lucht in de spuit verwijdert voordat u deze vult. Zorg ervoor dat u de luchtbevochtiger niet te veel vult, anders komt er water in de kamer. Zodra de luchtbevochtiger is gevuld, trekt u de zuiger van de spuit 5-10 ml terug om een vacuümafdichting te creëren.
- Stel in Console de gewenste relatieve vochtigheid voor de kamer in (beschikbaar bereik is 0-100%, vochtigheid van 95-100% wordt meestal gebruikt). Laat de luchtvochtigheid op 'uit' staan tot vlak voor het maken van het rooster, zodat de kamer niet te nat wordt.
- Verkrijg het pincet van het plunge freezing-apparaat en filterpapier dat op de juiste maat is gesneden om op de pads te passen, gekocht of met behulp van een stempel om een opening van de juiste grootte te snijden.
- Bereid het cryogene middel voor op het invriezen.
- Plaats de metalen cryo-grid boxhouder, cryogene beker en metalen spinnenpoten in de koelvloeistofcontainer.
- Laat de container afkoelen door de buitenkamer te vullen met LN2. Houd de buitenste kamer bijgevuld om de bovenkant van de cryo-grid boxhouder te bedekken. Voeg ~ 1 cm extra LN2 toe aan de cryogene beker om de evenwichtsbalans van het systeem naar de LN2-temperatuur te vergemakkelijken.
OPMERKING: De anti-contaminatiering kan worden gebruikt om vochtige luchtcondensatie rond de cryogene beker te beperken en te leiden tot cryo-koelvloeistof / ethaanbesmetting. Dit is over het algemeen niet vereist in een vochtigheidsgecontroleerde omgeving. Als u de anti-contaminatiering gebruikt, moet u ervoor zorgen dat u de container niet overvult met LN2 , anders kan deze morsen wanneer de ring later in het proces in de container wordt gedrukt. - Wacht 3-5 minuten om het koken van de spinnenpoten te observeren en wacht vervolgens nog eens 3 minuten om ervoor te zorgen dat de cryogene beker voldoende koud is om het verglazingsmedium te condenseren.
- Maak het cryogene (vloeibare ethaan) vloeibaar in de cryogene beker.
- Neem de ethaancilinderpijp met dunne slang en een mondstuk om het gas af te geven. Een P200 pipetpunt met de opening geopend door de punt af te snijden met een scheermesje is hier ideaal. Een grotere opening is nodig om te voorkomen dat ethaan aan de punt stolt en de gasstroom blokkeert.
- Zorg ervoor dat de cryogene beker geen resterende LN2 bevat, neem het ethaangasmondstuk en plaats het in de cryogene beker. Gebruik de gasflesregelaar om een laag debiet te starten en cryogene gas in de cryogene beker te doseren om het gas te condenseren. Houd de punt waaruit het gas stroomt direct tegen de wand van de cryogene beker gedrukt, maar beweeg deze zachtjes heen en weer in een tikkende beweging tegen het oppervlak. Regel de stroom van het gas om een lage, gestage stroom te laten condenseren / vloeibaar worden op een gecontroleerde manier in de cryogene beker.
- Vul de beker tot net onder de zilveren spinrand en stop de gasstroom en verwijder vervolgens de gasleiding voorzichtig om te voorkomen dat de omringende LN2 met ethaan wordt verontreinigd.
- Vul de koelvloeistofcontainer aan met LN2 en pas op dat er geen in het vloeibare ethaan wordt gemorst.
- Laat de poten van de spinnen ~ 3-5 minuten op hun plaats om ervoor te zorgen dat het vloeibare ethaan op een voldoende koude temperatuur wordt gebracht. Het cryogene middel begint er troebel/licht ondoorzichtig uit te zien. Dit geeft aan dat het dicht bij het vriespunt is. Gebruik in dit stadium een pincet om de spin te verwijderen. Zolang de LN2 in de container rond de cryogene beker wordt bewaard, blijft het ethaan nu vloeibaar en geschikt voor vitrificatie gedurende 1-2 uur. Probeer de procedure echter zo snel mogelijk te voltooien, vooral in niet-vochtigheidsgecontroleerde ruimtes, om ijsverontreiniging te verminderen.
OPMERKING: Als de spin 'vast' lijkt te zitten, gebruik dan een metalen voorwerp zoals een moer en houd ze tegen de poten van de spin om ze iets op te warmen en verwijder vervolgens de poten.
- Bereid het dompelkoelapparaat en de accessoires voor op vitrificatie van het monster.
- Voeg rasteropslagdozen toe aan de metalen cryo-grid boxhouder en zorg er gedurende de hele procedure voor dat de LN2 wordt bijgevuld tot net boven het niveau van de rasterboxen (meestal elke ~ 5 min).
- Voer op het scherm van het dompelbevriezingsapparaat in het vak Procesparameters de gekozen parameters in, waaronder: vlektijd (de tijd dat de pads van het duikbevriezingsapparaat samenkomen), kracht (de afstand van de vloeipads tot het raster, die de gradiënt van ijsvorming verandert) en totaal (aantal keren dat de vloeipads binnenkomen om elkaar te ontmoeten). Kies deze parameters op basis van het individuele vriesapparaat en het gedrag van het macromolecuul. Typische waarden zijn een vlekkracht tussen 0 en 5, de vlektijd van 1-6 s en een vlektotaal van 1. Typische wachttijd (tijd tussen het initiëren van de vlek en het begin van de vlek) en afvoertijd (tijd na het dempen voordat je gaat ploffen) is 0-2 s.
OPMERKING: Afhankelijk van de voorkeuren van de gebruiker kunnen extra opties in het gedeelte Opties, Diversen worden geselecteerd, waaronder Voetpedaal gebruiken om naar de volgende stap te gaan bij elke druk, Rasteroverdracht overslaan (slaat de laatste stap over waarbij de pincetarm iets wordt verhoogd), schakel vochtigheid uit tijdens het proces (terwijl het monster wordt aangebracht, stopt actieve bevochtiging van de kamer waardoor het moeilijker kan worden om het raster te zien) en Autoraise Ethanelift (combineert de stap van pincet die in de kamer wordt geheven en het verhogen van de koelvloeistofcontainer - skips Verhoog ethaancontainerstap ). Hier zijn al deze opties ingeschakeld. - Plaats de koelvloeistofcontainer veilig op de bewegende platformarm onder de kamer
- Plaats vers vloeipapier op elke blotterarm en zorg ervoor dat plastic ringclips zijn bevestigd. Elk filterpapier laat 16 vlekken toe (armen draaien vloeipapier). Druk op de knop Vlekkenpapier opnieuw instellen in het gedeelte Besturingselementen .
- Voer 1 volledige cyclus van het vitrificatieproces van het dompelbevriezingsapparaat uit om ervoor te zorgen dat elk bewegend onderdeel zich gedraagt zoals verwacht.
- Druk (of gebruik het voetpedaal) om een nieuw raster te plaatsen, vervolgens op Proces starten en vervolgens op Verwerken en vervolgens op Doorgaan. Let er in dit stadium op of de vloeiarmen zoals verwacht contact met elkaar maken.
- Zet de luchtbevochtiger 'aan'. Er wordt waterdamp geproduceerd (zolang de ingestelde luchtvochtigheid hoger is dan nu in de kamer).
- Het specimen van belang kan nu worden verglaasd. Gebruik het voetpedaal of Place New Grid en de stortstang zal uit de kamer dalen waardoor het pincet in de houder kan worden bevestigd.
- Met behulp van het pincet van het plunge freezing-apparaat, pak het gewenste gloed ontladen / plasma gereinigde cryoEM-raster op, waarbij u ervoor zorgt dat u noteert welke kant de juiste kant is om te worden gebruikt voor monstertoepassing volgens de rasterfabrikant. Pak het rooster bij de rand op en zorg ervoor dat overmatig / onnodig contact met het pincet wordt vermeden, omdat dit de ondersteuning zal beschadigen. Zet het rooster vast in het pincet door de zwarte clip naar beneden te verplaatsen naar het geribbelde deel van het pincet. Het rooster moet stevig worden vastgehouden, maar de clip mag niet te ver naar beneden zijn, omdat deze contact maakt met de vloeipads, wat leidt tot onherleidbare vulling en later moet het pincet onder dit punt worden gehouden bij het loslaten van de clip.
- Plaats het pincet met het vriesapparaat dat het cryoEM-rooster vasthoudt op de pneumatische arm met de juiste kant naar uw dominante hand gericht. Het ontwerp van het pincet en de kamer van het plunge freezing-apparaat zijn zodanig dat het monster door de rechter- of linkerkant van de kamer kan worden aangebracht, afhankelijk van de handigheid van de gebruiker.
OPMERKING: Het toepassen van het monster aan verschillende zijden met dezelfde blottingparameters resulteert zelden in vergelijkbare resultaten, dus linkshandige onderzoekers moeten mogelijk hun blottingparameters onafhankelijk van hun rechtshandige collega's afstemmen. - Druk op Start proces en het rooster in het pincet wordt in de kamer gebracht en de koelvloeistofcontainer wordt verhoogd.
- Druk op Process en het pincet verplaatst het rooster naar de positie waar een pipet kan worden gebruikt om het monster op het rooster aan te brengen. Open de zijpoort naar de juiste kant van het rooster en breng het monster aan door te pipetteren, zorg ervoor dat de pipetpunt het rooster niet raakt, omdat dit kan leiden tot beschadiging van de roostersteun / het buigen van het rooster, maar geef de vloeistof dicht genoeg af zodat de druppel op het rooster terechtkomt. Meestal wordt 3-5 μL toegepast.
- Druk op Doorgaan en de vooraf gedefinieerde parameters van de gebruiker deppen het rooster en vervolgens het pincet met rooster gemonteerd in de koelvloeistofbeker storten voor monsterverglazing. Pincetten dalen af in combinatie met de arm die de koelvloeistofcontainer en koelvloeistof vasthoudt, waardoor het rooster ondergedompeld blijft in het cryogene.
- Breng het rooster over van de cryogene beker naar de roosteropslagbox ondergedompeld in LN2.
- Maak het pincet los van de pincetarm en zorg ervoor dat u niet in contact komt met het verglaasde rooster met de zijkanten van de cryogene beker. Stel de grip zo in dat het pincet comfortabel wordt vastgehouden. Verplaats het rooster zo snel en voorzichtig mogelijk van het cryogene naar het LN2. Houd met je vingers met je vingers het pincet dicht en schuif met de andere hand de zwarte clip omhoog uit de weg en houd het pincet dicht. Stel de grip opnieuw in en manipuleer het raster in de rasteropslagbox.
- Herhaal stap 1.10-1.19 totdat alle rasters zijn gemaakt (een typische sessie omvat het maken van 4-12 rasters). Bewaar alle grid storage boxen met roosters in LN2 dewar tot de volgende fasen.
2. Clipping rasters voor het laden in een autoloader microscoop
- Clip rasters in autogrid assembly volgens het eerder beschreven protocol 28.
3. Veilig inloggen op afstand bij microscopen
OPMERKING: Met COVID-19-controles op het moment van schrijven, maar ook met milieuproblemen in verband met internationale reizen, hebben meer microscopiefaciliteiten diensten aangeboden waarbij de gebruiker op afstand werkt. De implementatiemethode hiervoor zal variëren afhankelijk van de lokale IT-configuratie van elke faciliteit en de behoeften van de interne en externe gebruikersgemeenschap. Hier wordt het proces beschreven voor het op afstand benaderen van cryo-em's bij eBIC en het besturen van de microscoop via EPU-software.
- Log op afstand in op cryoEM's. Inloggen op afstand wordt gemedieerd via NoMachine-software om toegang te krijgen tot de microscoopondersteunings-pc en is geconfigureerd om alleen toegang te verlenen aan gebruikers die bij een bezoek zijn geregistreerd via de FedID-inloggegevens van de gebruiker. Access blijft alleen actief voor de duur van de sessie.
- Open NoMachine en start een nieuwe NX-verbinding met nx-cloud.diamond.ac.uk met wachtwoordverificatie.
- Open de verbinding en log in met de gebruikersnaam fedid@fed.cclrc.ac.uk en FedID-wachtwoord. Dubbelklik op het pictogram dat overeenkomt met de relevante microscoop uit de beschikbare opties om een verbinding met de relevante ondersteunings-pc te openen.
- Voer gebruikersnaam clrc\FedID en wachtwoord in het aanmeldingsscherm van Windows in.
- Open TeamViewer-software vanaf het bureaubladpictogram en maak verbinding met PartnerID: TEM met het opgegeven wachtwoord. Hiermee wordt de verbinding van de ondersteunings-pc naar de TEM-pc tot stand gebracht. De knop Next Monitor in het TeamViewer-lint kan worden gebruikt om te schakelen tussen de gebruikersinterface van de microscoop en het EPU-venster.
- Microscoopfuncties kunnen vervolgens door gebruikers rechtstreeks via de EPU-interface worden bediend.
4. Het laden van monsters in een autoloader microscoop en screening op ijs en monsterkwaliteit
OPMERKING: In deze sectie wordt een microscoop met een autoloader en EPU-software gebruikt voor monsterscreening, maar dit kan worden bereikt met behulp van andere software en een side entry-systeem en cryo-EM's van andere fabrikanten.
- Laad geknipte rasters in de microscoop autoloader zoals eerder beschreven28.
- Ga op het tabblad autoloader van de gebruikersinterface van de microscoop met de knop Naar het dialoogvenster Opties en druk op de knop Inventaris . Hiermee wordt achtereenvolgens elke positie in de cassette gecontroleerd om te bepalen of er een cartridge aanwezig is. Bezette slots worden blauw gelabeld. Als alle bezette slots zijn toegewezen, drukt u nogmaals op de knop Inventaris om te stoppen na de huidige positie, anders laat u de uitvoering uitvoeren totdat alle bezette slots zijn toegewezen. Label alle bezette slots met de voorbeelddetails in de meegeleverde dozen.
- Markeer het raster dat naar de microscoopkolom moet worden overgebracht en klik op Laden. Het slotlabel verandert van blauw naar geel zodra het raster met succes op het podium is geladen. Ga verder met het screenen van de rasters.
- Open EPU-software. Selecteer op de pagina Voorbereiding de optie Acquisitieoptiek en -instellingen en selecteer vervolgens de Atlas-voorinstelling in het vervolgkeuzemenu. Kies de juiste voorinstellingen voor de bundelinstelling (bijv. 64x nominaal mag, spotmaat 5, Microprobe, met een verlicht gebied in het parallelle bereik voor Falcon-detector - voor meer informatie over het kiezen van voorinstellingen voor het instellen van de bundel zie28). Druk op Set om de parameters naar de microscoop te duwen.
- Druk op kolomkleppen openen en plaats het FluScreen. Controleer of een straal zichtbaar en voldoende verspreid en gecentreerd is om de detector te bedekken. Navigeer indien nodig naar een dunner gebied van het raster met behulp van de joystick of het werkgebiedmenu om podiumbewegingen in X en Y te regelen.
- Til het FluScreen op en maak een afbeelding met de knop Voorbeeld in EPU. Op basis van het verkregen beeld kan de dosis worden verhoogd door naar een lagere plaatsgrootte te gaan en vice versa.
- Ga in EPU naar de Atlas-pagina en druk op Nieuwe sessie. Selecteer MRC-afbeeldingsindeling, voer een geschikte mapnaam en -locatie in voor het opslaan van de screeningsessie en klik vervolgens op Toepassen.
- Selecteer Screening in het menu aan de linkerkant. Vink de selectievakjes naast elk raster aan om een atlasmontage te verkrijgen. Start de screening sessie in EPU. Voor elk gecontroleerd raster wordt een atlas verkregen, met een aantal beschikbare rastervierkanten die na voltooiing worden vermeld. Elke atlas kan worden bekeken door deze op de screeningspagina te markeren, compleet met een markering met rastervierkanten met een vergelijkbare voorspelde ijsdikte gegroepeerd op kleur.
- Bekijk na voltooiing de verzamelde atlassen en identificeer de rasters die geschikt zijn voor het beoordelen van de monsterkwaliteit bij hogere vergrotingen (d.w.z. die met een passend aantal rastervierkanten die niet droog zijn of worden verduisterd door dik ijs). Markeer het gekozen raster in het EPU-screeningsmenu en klik op Voorbeeld laden.
- Gebruik de voorinstellingen voor het instellen van de bundel (zie 28 voor uitleg over de voorinstellingen voor het instellen van de bundel die voor elke fase gewenst zijn) en de voorbeeldfunctie om de gewenste rastervierkanten in meer detail te onderzoeken.
- Selecteer in het menu Atlas-screening het raster dat momenteel is geladen en verplaats het werkgebied naar een rastervierkant met gevulde gaten door met de rechtermuisknop op de gewenste locatie in de rasterafbeelding te klikken en verplaatsen naar rastervierkant te selecteren.
- Ga terug naar de pagina EPU, Voorbereiding en selecteer de gridsquare-voorinstelling .
- Open de pagina EPU, Automatische functies en voer Auto-eucentric by stage tilt uit met de GridSquare-voorinstelling om het monster naar eucentrische hoogte te verplaatsen.
OPMERKING: Auto-eucentrisch door bundelkanteling is ook beschikbaar, wat sneller maar meestal minder nauwkeurig is dan auto-eucentrisch door fasekanteling. - Maak in EPU, Voorbereiding een nieuwe GridSquare Preview-afbeelding . Let op de verschillende grijswaarden over verschillende gaten die wijzen op verschillende ijsdiktes. Verplaats het werkgebied over een gat met de rechtermuisknop > verplaats het podium hier. Selecteer de vooraf ingestelde gat/eucentrische hoogte en voorvertoning.
OPMERKING: Afhankelijk van het molecuulgewicht en de vorm van het deeltje van belang, kan het mogelijk zijn om het te identificeren bij vergroting van de gat / eucentrische hoogte. - Selecteer de voorinstelling Gegevensverzameling en stel een vergroting in waarmee de deeltjes eenvoudig kunnen worden geïdentificeerd (overeenkomend met een objectbemonstering van over het algemeen <2 Å/pixel). Stel de onscherpteverschuiving in op ~-3 tot -5 μm met een blootstellingselektronendosis van ~40-80 e-/ Å2.
- Herhaal de stappen in 4.4 om een reeks ijsdiktes te beoordelen voor deeltjesverdeling, oriëntatie en verontreiniging over het raster. De deeltjesverdeling kan variëren dicht bij de randen versus het midden van het gat en daarom is het belangrijk om verschillende locaties met het gat te onderzoeken.
- Scherm alle rasters die belofte van atlassen laten zien als voldoende rastervierkanten. Bewaar deze in de microscoop en ga verder met gegevensverzameling met behulp van EPU, of haal de monsters uit de microscoop en sla deze op onder LN2 totdat de gegevensverzameling is gepland.
5. CryoEM-gegevensverzameling met één deeltje (met een focus op bediening op afstand)
OPMERKING: Een gedetailleerd protocol voor gegevensverzameling met EPU wordt beschreven in de handleiding van de fabrikant en elders28. Hier worden wijzigingen van dit protocol voor bediening op afstand (namelijk het verminderen van het gebruik van de handpanelen om taken uit te voeren en het gebruik van softwaregebaseerde alternatieven) benadrukt.
- Tenzij er al een is verzameld tijdens de sessie, verzamel dan een Atlas voor het raster.
- Definieer elk van de voorinstellingen voor de bundelinstelling op basis van de experimentele behoeften van het project.
- Voer kalibraties voor beeldverschuiving uit28.
- Stel de EPU-sessie in.
- Selecteer in EPU de EPU-pagina en vervolgens Sessie-instelling, selecteer Nieuwe sessie en vervolgens Nieuw in de voorkeuren.
- Selecteer Nieuwe sessie er verschijnt een pop-up met een optie om eerdere instellingen te gebruiken. Ja laadt automatisch de instellingen van de vorige EPU (d.w.z. monsterdrager, onscherptebereik, autofocusinstellingen, rastertype) in de huidige EPU-sessie. Als u Nieuw selecteert in de voorkeuren, kan de gebruiker een bestand kiezen met opgeslagen voorkeuren (d.w.z. onscherpbereik, autofocusinstellingen, rastertype) en deze informatie wordt vooraf in de EPU geladen.
- Vul de naam van de sessie in met iets informatiefs. De lokale faciliteit kan een naamgevingsconventie voorstellen.
- Selecteer bij Type de optie Handmatig.
- Selecteer voor acquisitiemodus nauwkeurige gatcentrering of snellere acquisitie.
- Selecteer in Afbeeldingsindeling de gewenste indeling.
- Selecteer een geschikte opslagmap en EPU maakt een map met de sessienaam.
- Selecteer de juiste specimendrager volgens het rastertype en de gatafstand die worden gebruikt (bijv. Quantifoil 1.2/1.3) en druk op Toepassen. Dit protocol beschrijft het proces voor het genereren van een sjabloon voor een regelmatige reeks gaten
- Selecteer een eerste rastervierkant en stel een acquisitiesjabloon in.
- Ga vierkant selecteren, als alle vierkanten groen zijn, klikt u linksboven op Alles deselecteren.
- Tegels openen (klik met de rechtermuisknop > tegel openen). Selecteer een vierkant (klik met de rechtermuisknop > voeg toe, klik met de rechtermuisknop > Verplaats werkgebied naar rastervierkant).
- Ga naar Hole selection en druk op Auto Eucentric. Wacht tot dit is voltooid en er een Grid Square-afbeelding is gemaakt. Als de automatische functie uitvalt, kan dit zijn omdat de hoogte aanzienlijk afwijkt; als dat zo is, kan het handmatig worden aangepast met behulp van het FluScreen bij Grid Square-vergroting.
- Meet de grootte van het gat. Verplaats en pas de gele cirkels aan zodat ze over de gaten met de juiste grootte en afstand zijn.
- Druk op Gaten zoeken. Controleer of de gaten correct zijn gevonden. Zo niet, verander dan de grootte van het gat en zoek opnieuw gaten. Herhaal dit totdat het het gat correct vindt. Als het consequent mislukt, overweeg dan om naar een lager getal (helderder) te gaan bij rastervierkantvergroting.
- Gebruik het histogram Filterijskwaliteit aan de rechterkant om de selectie van gaten aan te passen. Dit kan handig zijn om gebieden met dik ijs en dun ijs uit te sluiten. Dit zal worden onthouden voor toekomstige rastervierkanten die tijdens deze sessie worden geselecteerd.
- Optimaliseer de gatselectie met de gereedschappen in het menu Selecteren bovenaan. Klik bijvoorbeeld op Gaten dicht bij de rasterbalk verwijderen.
- Ga naar Sjabloondefinitie en druk op Verwerven.
- Klik op Zoeken en centreer het gat. Er komt nu een afbeelding van een gat met een gele cirkel om het gat.
OPMERKING: Als het moeilijk is om het gat te vinden, plaatst u het objectiefopening. Als het gat nog steeds niet kan worden gevonden, probeer dan de belichtingstijd voor de vooraf ingestelde gat / eucentrische hoogte te verhogen of de onscherpte voor deze voorinstelling te vergroten of de afbeelding te verwijderen. Een grote onscherpteverandering kan de uitlijning van de beeldverschuiving veranderen. - Wijzig de vertraging na faseverschuiving en de vertraging na beeldverschuiving in 1-5 s.
- Vink de waarde voor Maximale verschuiving van afbeelding aan (als de optie beschikbaar is) is naar wens. Als aberratievrije image shift-verzameling wordt gebruikt, wordt deze waarde gedefinieerd in het EPU-configuratiebestand, anders is 5 μm een standaardwaarde.
- Klik op Acquisitiegebied toevoegen en klik vervolgens ergens op de afbeelding. Verplaats het acquisitiegebied naar de gewenste locatie (d.w.z. aan de rand van een gat) zodat acquisitiegebieden niet dubbel worden blootgesteld met de straal (het vierkant in de groene cirkel vertegenwoordigt het detectorgebied, de groene cirkel is de bundeldiameter).
- Voeg rechtsboven het onscherptebereik toe. Voeg vervolgens andere acquisitiegebieden toe. Een typische defocuslijst voor een membraaneiwitproject is -0,8 tot -3 μm onscherpte.
- Klik op Autofocusgebied toevoegen en klik ergens op de afbeelding. Verplaats het autofocusgebied naar de koolstof rond een gat. Standaardpraktijk is om autofocus na centreren bij gebruik van AFIS, of elke 5-15 μm, afhankelijk van de z-hoogtevariatie over het vierkant.
- Klik op Driftmeetgebied toevoegen, driftmeting eenmaal per rastervierkant uitgevoerd, waarbij een ingestelde drempel van 0,05 nm/s een standaardinstelling is. Het driftmeetgebied kan (en het is een goed idee om dat te doen) direct overlappen met het autofocusgebied. Zorg ervoor dat drift noch autofocusgebied overlappen met een acquisitiegebied.
OPMERKING: De sjabloon kan worden gecontroleerd met behulp van de sjabloonuitvoeringsfunctie. Dit is een goed idee om te zien of acquisitiegebieden moeten worden verplaatst (bijvoorbeeld te veel / niet genoeg koolstof in afbeeldingen), maar is niet nodig. - Ga terug naar Vierkantselectie en selecteer in het raster de vierkanten voor acquisitie. Gebruik het aantal acquisitiegebieden en de verwachte data-acquisitiesnelheid (van faciliteit op basis van detectoren en experimentele opstelling) om te voorspellen hoeveel acquisitiegebieden nodig zijn.
- Wanneer alle gewenste vierkanten zijn geselecteerd, drukt u op Alle vierkanten voorbereiden.
- Zodra elk vierkant is verzameld, navigeert u tussen de rastervierkanten en stemt u de gaten af met het selectiepenseel.
- Ga naar een podiumlocatie boven het monster en gebruik automatische functies om de eucentrische hoogte in te stellen. Voer microscoopuitlijningen uit zoals eerder beschreven28, maar in plaats van coma-vrije uitlijning en correctie voor objectief astigmatisme handmatig uit te voeren, maakt u gebruik van uitlijningstools in de software. Stel kortom de omstandigheden van de acquisitiebundel in, zorg ervoor dat de objectiefopening (OA) wordt verwijderd en dat het podium op eucentrische hoogte over een balk stabiel gebied van het monster wordt geplaatst. Voer coma-vrije uitlijning uit binnen de automatische functies voordat u de OA opnieuw plaatst en centreert en het astigmatisme van de objectieve lens corrigeert met EPU. Zorg ervoor dat beide uitlijningen convergeren naar geschikte waarden (< 150 nm coma en bijna nul astigmatisme.
- Voordat u de geautomatiseerde acquisitierun start, moet u ervoor zorgen dat de turbopomp van de autoloader is uitgeschakeld en dat het objectiefopening is geplaatst.
- Druk in Geautomatiseerde acquisitie op Start uitvoeren om te beginnen met geautomatiseerde gegevensverzameling.
6. Beeldverwerking om EM-dichtheidskaart te produceren
OPMERKING: De meeste cryoEM-faciliteiten bieden voorbewerking van micrografische films 'on the fly'. Hiervoor is een breed scala aan softwarepakketten en benaderingen beschikbaar, waaronder RELION-pijplijnen28,33, cryoSPARC43, Scipion34 en WarpEM44. Een relion gebaseerde pijplijn wordt hier beschreven en er wordt aangenomen dat de gebruiker de micrografische films heeft verplaatst naar een geschikte opslaglocatie met toegang tot computerbronnen. Een overzicht van het proces en representatieve resultaten voor een membraaneiwitproject worden gegeven, een gedetailleerde beschrijving en een stapsgewijze tutorial zijn te vinden op de RELION homepage: https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion.
- Voer 'on the fly' analyse uit van micrografische bewegingscorrectie en CTF-schatting. Start RELION binnen de projectdirectory. Plan import-, bewegingscorrectie- en CTF-schattingstaken om te herhalen zodat ze gelijktijdig zijn met het verzamelen en overdragen van gegevens. Een micrograafanalysescript28 biedt real-time visuele feedback over astigmatisme en geschatte onscherptewaarden (zie representatieve resultaten).
- Pluk deeltjes uit voorbewerkte microfoto's. Er zijn een aantal geautomatiseerde deeltjesverzamelsoftwarepakketten om uit te kiezen. Referentievrije en op sjablonen gebaseerde orderverzamelopties zijn beschikbaar op het tabblad Auto-picking van RELION37. Andere programma's kunnen worden gebruikt voor verschillende stappen, bijvoorbeeld het gebruik van crYOLO voor deeltjespicking35.
- Extraheer deeltjes uit de CTF-gecorrigeerde micrografieën.
OPMERKING: Om de rekentijd te verkorten die nodig is voor vroege, 'opruiming', verwerkingsstappen, de deeltjes bij extractie naar beneden schalen / weggooien. Details over hoe de extracttaak wordt uitgevoerd, zijn te vinden in de RELION 3.1-zelfstudie. Voor dit project werden deeltjes in eerste instantie met een factor 2 weggegooid. - Voer 2D-klassegemiddelden uit. Classificeren over 100-200 klassen werkt goed voor de meeste datasets met ≥ 100.000 deeltjes. Het wordt niet aanbevolen om veel meer dan 200 klassen of minder dan 50 klassen te gebruiken, zelfs als datasets klein zijn, tenzij de steekproef een hoge symmetrie heeft (d.w.z. icosaëdraal virus), in welk geval minder dan 50 klassen nog steeds een goed resultaat kunnen geven. Stel de maskerdiameter groot genoeg in om de langste afmeting van het deeltje te huisvesten, maar strak genoeg om naburige deeltjes uit te sluiten (dit kan wat vallen en opstaan vereisen).
- Selecteer goede klassen (d.w.z. klassen met structurele details) met behulp van de subsetselectietaak. Voorbeelden van goede en slechte 2D-klassegemiddelden zijn te vinden in de sectie representatieve resultaten.
- Genereer een eerste model de novo uit de gegevens met behulp van de 3D initiële modeltaak in RELION.
OPMERKING: Minder schone deeltjesstapels kunnen baat hebben bij multi-referentie ab initio SGD (stochastische gradiëntafdaling), omdat dit een extra mogelijkheid biedt om rommel / suboptimale deeltjes uit te zeven. Selecteer een maskerdiameter die geschikt is voor het deeltje van belang en laat de standaardwaarden voor velden op het tabblad 'SGD' staan, omdat deze routinematig goed presteren. Zorg ervoor dat het eerste model er redelijk uitziet in Chimera (of een ander geschikt visualisatieprogramma) (zie representatieve resultaten). - Voer 3D-classificatie uit om heterogeniteit in de gegevens aan te pakken met behulp van de uitvoer uit stap 6.6 als referentiemodel. Beoordeel de resulterende kaarten in Chimera. Verwerk deeltjesstapels die onafhankelijk van elkaar overeenkomen met unieke conformatietoestanden. Gebruik de subsetselectietaak om een interessante klasse/klassen te selecteren en particles.star-bestanden te genereren voor de bijbehorende deeltjesstapels.
- Voer automatische 3D-verfijning uit. Gebruik de 3D-klassegemiddelden die in de vorige stap zijn verkregen als referenties voor verfijning van hun overeenkomstige deeltjesstapels. Als de resolutie van de verfijning de Nyquist-limiet van de gegevens nadert, extraheert u de deeltjes opnieuw zonder te schalen. Herhaal na het opnieuw extraheren de automatische 3D-verfijningstaak met de niet-gekoppelde deeltjesstapel. In dit geval moeten de 3D-referentiemodellen zodanig worden geschaald dat de pixel- en doosgrootten consistent zijn met die van de opnieuw geëxtraheerde deeltjesafbeeldingen. Gebruik het opdrachtregelprogramma relion_image_handler om deze bewerking uit te voeren.
- Gebruik symmetrie in verfijning indien van toepassing. Als een gereconstrueerde kaart symmetrie bezit, lijnt u de kaart uit op de juiste symmetrie-as met behulp van het opdrachtregelprogramma relion_align_symmetry. Gebruik de resulterende uitgelijnde kaart als referentie in een nieuwe 3D-taak voor automatische verfijning met de juiste symmetrieoperator die is opgegeven op het referentietabblad.
- Verscherp kaarten vanuit automatische 3D-verfijning. Dit gebeurt met behulp van de nabewerkingstaak in RELION, maar eerst moet een geschikt masker worden gemaakt van de verfijnde kaart. De stappen voor het maken en nabewerken van maskers worden beschreven in de RELION-zelfstudie (zie ook representatieve resultaten).
OPMERKING: De resolutie van veel reconstructies kan verder worden verbeterd met behulp van de Bayesiaanse polijst- en CTF-verfijningsfunctionaliteiten in RELION. Gebruik het CTF-verfijningstaaktype om te schatten en te corrigeren voor aberraties van hogere orde (beam tilt, trefoil aberraties en 4e orde aberraties) en, als afzonderlijke taken, anisotrope vergroting en onscherpte per deeltje. Gebruik hierna de Bayesiaanse polijsttaak (getraind of met standaardwaarden) om door bundels geïnduceerde beweging per deeltje aan te pakken. Zoals besproken in de RELION 3.1-zelfstudie, zullen deze taken waarschijnlijk profiteren van een iteratieve benadering (CTF-verfijning → Bayesiaanse polijst- → 3D-automatische verfijning → nabewerking → ... loop) omdat beide profiteren van modellen met een hogere resolutie. - Corrigeer indien nodig de handigheid van EM-dichtheidskaarten. Onderzoek de kaarten om te bepalen of de handvaardigheid correct is, hetzij door te proberen een bestaand atoommodel te passen, hetzij door de handvaardigheid van de alfa-spiraalvormige gebieden te beoordelen. Draai de kaart waar nodig om langs de z-as in UCSF Chimera45 met het commando 'vop zflip'.
Representative Results
Bij het screenen kunnen rasters worden weggegooid in het atlasstadium, waar functies die bij lage vergroting zijn opgelost, het raster markeren als niet geschikt voor gegevensverzameling. Bijvoorbeeld als een raster aanzienlijke mechanische schade heeft opgelopen waarbij de meeste rastervierkanten zijn gebroken (figuur 2A), of als het raster 'droog' lijkt te zijn, zonder glasachtig ijs (figuur 2B). Dergelijke rasters zijn meestal identificeerbaar omdat de randen van de rastervierkanten scherp en duidelijk lijken. Over de meeste roosters die zijn gemaakt met behulp van het plunge freezing-apparaat, wordt een gradiënt van ijs waargenomen (figuur 2C, D). Deeltjesverdeling, afhankelijk van het specimen van belang, kan dramatisch variëren met de ijsdikte en daarom wordt het screenen van een reeks rastervierkanten om de deeltjesverdeling te beoordelen aanbevolen. Tijdens de atlasscreeningstap zijn hulpmiddelen geïmplementeerd in EPU-software om de gebruiker te helpen rastervierkanten van vergelijkbare of verschillende ijsdikte te identificeren, wat vooral handig kan zijn voor gebruikers die nieuw zijn in het onderzoeken van cryoEM-rasters (figuur 2E, F).
Figuur 2: Voorbeeld lage vergroting 'atlas' montages uit screening sessies. A) Een raster dat aanzienlijke schade heeft opgelopen met de meerderheid van de rastervierkanten gebroken - ongeschikt voor verzameling. B) Een droog rooster zonder glasachtig ijs - ongeschikt voor verzameling. C) Een raster dat een ijsgradiënt aangeeft met ~ 50% van het raster bruikbaar. D) Een ijsgradiënt met ~ 33% van het raster bruikbaar. Zowel C als D zijn geschikt voor gegevensverzameling als de bruikbare rastervierkanten een ijsdikte hebben die geschikt is voor verzameling, en er voldoende acquisitiegebieden zijn om te voldoen aan de minimale duur van een verzameling (bijv. 24 uur) E) Een voorbeeldatlas met bereik van ijsdiktes. F) Dezelfde atlas gepresenteerd in E, maar met rastervierkanten gecategoriseerd en gekleurd door EPU-software op basis van ijsdikte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Zorg er bij het screenen van deeltjesverdeling voor dat beeldvormingsparameters, zoals vergroting en totale elektronendosis, vergelijkbaar zijn met die welke naar verwachting zullen worden gebruikt tijdens gegevensverzameling om een nauwkeurig beeld te geven van de verwachte resultaten. Tijdens de screening is een ideale deeltjesverdeling monodisperse met een reeks deeltjesoriëntaties zichtbaar (afhankelijk van het monster en de bestaande kennis van de morfologie van het deeltje kan dit een uitdaging zijn om vast te stellen) (figuur 3A). Het ijs moet zo dun mogelijk zijn terwijl het de grootste dimensie van de deeltjes herbergt, als het ijs te dun is, kan het smelten wanneer het wordt verlicht met de elektronenbundel. Dit veroorzaakt overmatige beweging in de micrograaf en gebieden die deze eigenschap vertonen, moeten worden vermeden (figuur 3B). Uit collectieve ervaring wordt dit effect het meest waargenomen wanneer er wasmiddel in de buffer zit. Dit kan resulteren in zeer dun ijs in het midden van het gat en dus kunnen deeltjes fysiek worden uitgesloten en naar de rand worden geduwd. Dit effect wordt waargenomen in figuur 3C, maar in dit geval is het geen extreem voorbeeld en zouden deze afbeeldingen nog steeds nuttig bijdragen aan een dataset. Ten slotte moet het ijs glasachtig zijn; gebieden van het raster (of rasters) waar de meerderheid of alle gemaakte beelden kristallijn ijs tonen (figuur 3D) uitsluiten van gegevensverzameling. Vaak wordt niet-glasachtig ijs waargenomen aan de rand van rastervierkanten. Lezers worden verwezen naar gedetailleerde beoordelingen van de variabelen die kunnen worden gewijzigd tijdens rasterverglazing16 en beschrijvingen van deeltjesgedrag in de dunnefilmomgeving46,47 voor meer informatie.
Figuur 3: Representatieve micrografieën die verschillende deeltjesverdelingen laten zien. A) Een 'ideale' verdeling van monodisperse deeltjes die een reeks oriëntaties aannemen. B) Te dun ijs in het midden van het gat dat het vervormt bij blootstelling aan de elektronenbundel waardoor overmatige beweging in de micrograaf ontstaat. Dit effect wordt meestal waargenomen wanneer wasmiddel aanwezig is in de buffer C) Waar ijs dunner is in het midden van het gat, sluit dit fysiek deeltjes uit het midden uit, waardoor deeltjes naar de rand van het gat worden verdrongen. In dit geval is het niet extreem genoeg om te voorkomen dat deze afbeeldingen nuttig zijn, maar het suggereert dat het de moeite waard is om iets dikkere gebieden te screenen. D) IJs is geen glasachtig, er mogen geen gegevens worden verzameld over gebieden die op deze voorbeeldmicrograaf lijken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
On-the-fly beeldverwerking kan helpen om fouten en problemen met gegevensverzameling op te sporen en wordt daarom altijd aanbevolen waar mogelijk. Overmatige beweging binnen micrografieën kan er bijvoorbeeld op wijzen dat de autoloader turbopomp actief is, of dat gegevens worden verzameld op een gebarsten rastervierkant waar ijs aanzienlijk beweegt in de elektronenbundel, wat aangeeft dat het rastervierkant moet worden overgeslagen. On the fly kan CTF-schatting omstandigheden onthullen waarin een positief focuspunt (in plaats van onscherpte) wordt toegepast (waar CTF-schattingsprogramma's en parameters om deze punten te vinden worden gebruikt) en de faseverschuiving bepalen waar een Volta-faseplaat48 wordt gebruikt. On-the-fly beeldverwerkingspijplijnen bevatten vaak een grafische samenvatting van de gegevens (figuur 4A) om het voor gebruikers gemakkelijker te maken om de kwaliteit van micrografieën snel te beoordelen en te beslissen of wijzigingen in de gegevensverzameling nodig zijn.
Selectie van deeltjes uit micrografieën, terwijl 'valse positieven' zoals verontreiniging of de rasterondersteuningsfilm worden vermeden, kan optimalisatie vereisen. Deeltjeskiezers zoals crYOLO werken echter vaak voldoende goed met behulp van standaardparameters voor een 'first pass' van de gegevens (figuur 4B), waardoor progressie naar 2D-klassegemiddelde mogelijk is, waar het gemakkelijker kan zijn om de kwaliteit van de gegevens en de waarschijnlijkheid van downstream-succes te beoordelen. Voor de meeste projecten zou de 2D-classificatie van ~ > 10k-deeltjes klassen moeten onthullen die secundaire structuurdetails hebben. Om over te gaan tot 3D, moet de 2D-classificatiefase meestal klassen onthullen die een reeks deeltjesoriëntaties vertegenwoordigen. Als een voorkeursoriëntatie wordt onthuld, kunnen meer iteraties van monstervoorbereiding16 of verdere gegevensverzameling met het monster gekanteld nodig zijn49. Alle klassen die secundaire structuurdetails vertonen, moeten worden gekozen om door te gaan naar 3D-analyse, terwijl 'rommel'-deeltjes worden weggegooid (figuur 4C).
Figuur 4: Eerste beeldverwerkingsstappen. A) Uitvoer van een 'on the fly' beeldverwerkingsscript. B) Voorbeeld micrograaf (links) met correct automatisch geplukte deeltjes geïdentificeerd met behulp van het crYOLO algemene model (rechts, met deeltjes begrensd door rode vierkanten) Schaalbalken (wit) zijn 50 nm. C) Resultaten van 2D-classificatie met klassen die in het rode vierkant zijn weggegooid en klassen waaruit deeltjes zijn geselecteerd voor verdere verwerking in groen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een kleine subset van deeltjes kan worden gebruikt om een initieel model te genereren (figuur 5A). Dit eerste model kan vervolgens worden gebruikt als startmodel in 3D-classificatie en verfijning. In het geval van RagAB bevatte de dataset drie verschillende conformers die tijdens 3D-classificatie kunnen worden gescheiden (figuur 5B). Deeltjes die bijdragen aan elk van deze klassen kunnen vervolgens onafhankelijk worden behandeld en worden gebruikt om een EM-dichtheidskaart te verfijnen die vervolgens kan worden onderworpen aan verdere interpretatie en modelbouw.
Figuur 5: Het genereren van 3D EM dichtheidskaart. A) Typisch initieel model gegenereerd met RELION. B) 3D-classificatie over 5 klassen die de scheiding van deeltjes in drie verschillende conformatietoestanden laten zien: open-open (groen), open-gesloten (blauw), gesloten-gesloten (paars). C) Proces van het maken van maskers. De kaart van 3D-verfijning (links) moet worden gevisualiseerd in chimaera. De volumeviewer kan vervolgens worden gebruikt om de laagste drempel te identificeren waarbij de kaart vrij is van onsamenhangende, luidruchtige dichtheid (midden). Deze drempelwaarde wordt ingevoerd als initiële binarisatiedrempel in de relion-maskercreatietaak. Een voorbeeldmaskeruitvoer wordt grijs weergegeven (rechts). D) Hoge resolutie EM-dichtheidskaart van de open-gesloten toestand van RagAB (EMD-10245), gefilterd en gekleurd door lokale resolutie (Å). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
In dit protocol hebben we een basispijplijn beschreven die van toepassing is op specimens die vatbaar zijn voor routinematige SPA. Hoewel deze filterpapiervlottmethode van dunne filmvorming en vitrificatie ongetwijfeld succesvol is gezien het gebruik ervan in de overgrote meerderheid van SPA-projecten tot nu toe, heeft het een aantal nadelen. Deze omvatten monsterverspilling, de langzame tijdschalen (seconden) die nodig zijn om de dunne film te vormen en het monster te bevriezen, gerapporteerde onreproduceerbaarheid27 en gerapporteerde negatieve effecten van het gebruik van filterpapier om overtollige vloeistof weg te vegen50. Onlangs zijn nieuwe technologieën ontwikkeld om de reproduceerbaarheid van dunnefilmproductie te verbeteren51,52. Er zijn andere technologieën ontwikkeld die de tijd tussen monstertoepassing en vitrificatie verkorten53,54,55. Hoewel op filterpapier gebaseerde methoden voor dunnefilmvorming op het moment van schrijven de meest alomtegenwoordige methode van SPA cryoEM-monstervoorbereiding blijven, kunnen deze nieuwe technologieën een reeks voordelen opleveren in termen van efficiëntie en reproduceerbaarheid van rasterverglazing, evenals het creëren van nieuwe mogelijkheden om extra experimentele dimensies in te brengen, zoals tijdresolutie en snel mengen voorafgaand aan vitrificatie.
Het proces van rasterscreening voor de meeste gebruikers is momenteel een kwalitatief proces waarbij atlassen met een lage vergroting worden verkregen, gevolgd door het maken van afbeeldingen met een hoge vergroting over het raster om de deeltjesverdeling te beoordelen. Hoewel dit een voldoende robuuste benadering is voor sommige soorten specimens, kan het moeilijk zijn om met het oog te beoordelen of het specimen inderdaad is wat de onderzoeker hoopt in beeld te brengen of een voorkeursoriëntatie heeft, bijvoorbeeld met kleine (<200 kDa) monsters of waar de morfologie met lage resolutie het moeilijk maakt om met het oog te identificeren of er een reeks deeltjesverdelingen aanwezig zijn. Voor sommige projecten is het onmogelijk om te bepalen of het monster naar wens is, bijvoorbeeld waar een ligand is gebonden of waar het monster wordt gescreend om te beoordelen of een kleine (bijv. 10 kDa) subeenheid nog steeds aanwezig is in combinatie met een complex. Voor deze projecten zouden volledig geautomatiseerde pijplijnen voor data-analyse in combinatie met een 'korte' 0,5 - 1-uurs collecties, die door beeldverwerkingsstappen naar 2D-classificatie of zelfs 3D-classificatie en verfijning kunnen gaan, helpen om efficiënt te bepalen of een langere verzameling gerechtvaardigd is. Deze pijpleidingen zijn nog in ontwikkeling en worden momenteel niet op grote schaal geïmplementeerd, maar ze hebben het potentieel om de efficiëntie van cryoEM-rasterscreening te verbeteren, vooral voor uitdagende monsters.
Verbeteringen in directe elektronendetectoren, evenals aanpassingen in microscopie in combinatie met vooruitgang in beeldverwerking zoals het verzamelen van beeldverschuivingsgegevens, hebben de doorvoer en kwaliteit van beelden die tijdens gegevensverzameling worden geproduceerd, verhoogd. Deze toename van de snelheid waarmee gegevens worden verzameld, benadrukt de noodzaak van grondige screening van cryoEM-rasters voordat veel TB aan gegevens worden verzameld.
CryoEM SPA is een echt mainstream structurele biologietechniek geworden, en in veel gevallen de 'go to'-benadering voor sommige klassen van specimens, zoals heterogene en labiele macromoleculaire complexen. Hoewel het protocol hier een basisoverzicht van de SPA-pijplijn beschrijft, is elke sectie die hier wordt behandeld (rasterverglazing en -screening, cryoEM en beeldverwerking) een onderwerp op zich en het waard om te verkennen tijdens de ontwikkeling van een SPA-project. Naarmate de technologieën voor monstervoorbereiding en microscopie vorderen en nieuwe beeldverwerkingsalgoritmen en -benaderingen online komen, zal SPA zich blijven ontwikkelen als een pijplijn, waardoor onderzoekers inzicht krijgen in complexe biologische systemen.
Disclosures
Er worden geen belangenconflicten gemeld.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de iNEXT-Discovery (Grant 871037) gefinancierd door het Horizon 2020-programma van de Europese Commissie. J B. R. White wordt gefinancierd door de Wellcome Trust (215064/Z/18/Z). De FEI Titan Krios microscopen werden gefinancierd door de Universiteit van Leeds (UoL ABSL award) en Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). We bedanken M Iadanza voor het gebruik van zijn micrograafanalysescript. We erkennen Diamond Light Source voor toegang tot en ondersteuning van de cryo-EM-faciliteiten in het nationale Electron Bio-imaging Centre (eBIC) van het Verenigd Koninkrijk, gefinancierd door de Wellcome Trust, MRC en BBRSC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt tweezers | Agar Scientific | AGT5022 | |
| Cryo EM round storage box | Agar Scientific | AGG3736 | |
| CryoEM autogrid boxes | ThermoFisher Scientific | 1084591 | |
| CryoEM grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Ethane gas | Boc | 270595-F | |
| LN2 foam dewar | Agar Scientific | AG81760-500 | |
| LN2 storage dewar | Worthington industries | HC 34 | |
| Pipette | Gilson | 10082012 | |
| Pipette tips | Star labs | s1111-1706 | |
| Syringe | BD | BD 300869 | |
| Type II lab water | Suez | select fusion | |
| Vitrobot | ThermoFisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot filter paper | Whatman | 1001-055 | |
| Vitrobot styrophome container assembly | ThermoFisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot tweesers | ThermoFisher Scientific | 72882-D | |
| Software | |||
| EPU | ThermoFisher Scientific | 2.8.1.10REL | |
| TEM server | ThermoFisher Scientific | 6.15.3.22415REL | |
| Tia | ThermoFisher Scientific | 5.0.0.2896REL | |
| Titan krios microscope | ThermoFisher Scientific | Titan Krios G2 |
References
- Kuehlbrandt, W.
- McMullan, G., Faruqi, A. R., Henderson, R.
- Elmlund, D., Le, S. N., Elmlund, H. High-resolution cryo-EM: the nuts and bolts. Current Opinion in Structural Biology. , (2017).
- Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. , (2020).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. , (2020).
- Conley, M. J., et al. Calicivirus VP2 forms a portal-like assembly following receptor engagement. Nature. 565 (7739), 377-381 (2019).
- Hesketh, E. L., et al. The 3.3 Å structure of a plant geminivirus using cryo-EM. Nature communications. 9 (1), 2369 (2018).
- Malone, L. A., et al. Cryo-EM structure of the spinach cytochrome b6 f complex at 3.6 A resolution. Nature. 575 (7783), 535-539 (2019).
- Madej, M., et al. Structural and functional insights into oligopeptide acquisition by the RagAB transporter from Porphyromonas gingivalis. Nature Microbiology. , (2020).
- Gallardo, R., et al. Fibril structures of diabetes-related amylin variants reveal a basis for surface-templated assembly. Nature Structural and Molecular Biology. , (2020).
- Scarff, C., et al.
- Scarff, C. A., et al. Structure of the protective nematode protease complex H-gal-GP and its conservation across roundworm parasites. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008465 (2020).
- Wu, M., Lander, G. C. How low can we go? Structure determination of small biological complexes using single-particle cryo-EM. Current Opinion in Structural Biology. , (2020).
- Khoshouei, M., Radjainia, M., Baumeister, W., Danev, R. Cryo-EM structure of haemoglobin at 3.2 Å determined with the Volta phase plate. Nature Communications. , (2017).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 74, Pt 6 560-571 (2018).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadanza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological procedures online. 6, 23-34 (2004).
- Baker, L. A., Rubinstein, J. L.
- Dubochet, J., et al.
- Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM. Methods in enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing ‘standard’ sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. , (2019).
- Sgro, G. G., Biosciences, T. R. D. C. F. 2018 Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis. researchgate.net. , Available from: http://www.researchgate.net/profile/Tiago_Costa12/publication/326710861_Cryo-EM_Grid_Preparation_of_Membrane_Protein_Samples_for_Single_Particle_Analysis/links_EM-Grid-Preparation-of-Membrane-Protein-Samples-for-Single-Parti (2018).
- Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with sub-1 Å specimen movement. Science. , (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM. Methods in Enzymology. , (2016).
- Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: the new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. , (2009).
- Mastronarde, D. N. SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position. Microscopy and Microanalysis. , (2003).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. , (2019).
- Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 73, Pt 6 496-502 (2017).
- Gómez-Blanco, J., et al. Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities. Journal of Structural Biology. , (2018).
- Wagner, T., et al. SPHIRE-crYOLO is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM. Communications biology. 2 (1), 213-218 (2019).
- Bepler, T., et al. TOPAZ: A Positive-Unlabeled Convolutional Neural Network CryoEM Particle Picker that can Pick Any Size and Shape Particle. Microscopy and Microanalysis. , (2019).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 163 (2018).
- Zivanov, J., Nakane, T., Scheres, S. H. W. A Bayesian approach to beam-induced motion correction in cryo-EM single-particle analysis. IUCrJ. , (2019).
- Cianfrocco, M. A., Kellogg, E. H. What Could Go Wrong? A Practical Guide to Single-Particle Cryo-EM: From Biochemistry to Atomic Models. Journal of Chemical Information and Modeling. , (2020).
- Tagari, M., Newman, R., Chagoyen, M., Carazo, J. M., Henrick, K. New electron microscopy database and deposition system. Trends in Biochemical Sciences. , (2002).
- Berman, H. M., et al.
- Iudin, A., Korir, P. K., Salavert-Torres, J., Kleywegt, G. J., Patwardhan, A. EMPIAR: A public archive for raw electron microscopy image data. Nature Methods. , (2016).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. , (2017).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. , (2019).
- Goddard, T. D., et al. UCSF ChimeraX: Meeting modern challenges in visualization and analysis. Protein Science. 27 (1), 14-25 (2018).
- Klebl, D. P., et al. Need for Speed: Examining Protein Behavior during CryoEM Grid Preparation at Different Timescales. Structure. , (2020).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 32 (2018).
- Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Zi Tan, Y., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EMthrough tilting. Nature Methods. , (2017).
- Armstrong, M., Han, B. -G., Gomez, S., Turner, J., Fletcher, D. A., Glaeser, R. M. Microscale Fluid Behavior during Cryo-EM Sample Blotting. Biophysical Journal. 118 (3), 708-719 (2020).
- Arnold, S. A., et al. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts. Journal of Structural Biology. , (2017).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. , (2018).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 75, Pt 12 1063-1070 (2019).
- Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation. bioRxiv. , (2020).
- Klebl, D. P., et al. Sample deposition onto cryo-EM grids: From sprays to jets and back. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2020).
