Summary
Syntetisk cystisk fibrose spyt medium (SCFM2) kan udnyttes i kombination med både konfokal laser scanning mikroskopi og fluorescens-aktiveret celle sortering til at observere bakterielle aggregater ved høj opløsning. Dette dokument beskriver metoder til at vurdere samlede populationer under antimikrobiel behandling som en platform for fremtidige undersøgelser.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (Pa) er en af de mest almindelige opportunistiske patogener forbundet med cystisk fibrose (CF). Når Pa kolonisering er etableret, en stor del af de inficerende bakterier danner biofilm i luftvejene spyt. Pa biofilm isoleret fra CF spyt har vist sig at vokse i små, tætte aggregater på ~ 10-1.000 celler, der er rumligt organiseret og udviser klinisk relevante fænotyper såsom antimikrobiel tolerance. En af de største udfordringer ved at studere, hvordan Pa aggregater reagerer på det skiftende spyt miljø er manglen på ernæringsmæssigt relevante og robuste systemer, der fremmer den samlede dannelse. Ved hjælp af en syntetisk CF spyt medium (SCFM2), levetiden af Pa aggregater kan observeres ved hjælp af confocal laser scanning mikroskopi (CLSM) og billedanalyse ved opløsningen af en enkelt celle. Dette in vitro-system gør det muligt at observere tusindvis af aggregater af varierende størrelse i realtid, tre dimensioner og på mikronskalaen. På individ- og befolkningsniveau gør det lettere at differentiere observationen af aggregater på forskellige udviklingsstadier, når de har evnen til at gruppere aggregater efter fænotype og position, og deres reaktion på ændringer i mikromiljøet, såsom antibiotikabehandling.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa (Pa) er et opportunistisk patogen, der etablerer kroniske infektioner hos immun-kompromitterede personer. For dem med den genetiske sygdom cystisk fibrose (CF), disse infektioner kan spænde over løbet af livet. CF forårsager ophobning af et tyktflydende, næringsrigt spyt i luftvejene, som bliver koloniseret af en række mikrobielle patogener over tid. Pa er en af de mest udbredte CF patogener, kolonisere luftvejene i den tidlige barndom og etablere vanskelige at behandle infektioner1. Pa er fortsat et betydeligt klinisk problem og betragtes som en førende årsag til dødelighed hos dem med CF, på trods af forbedrede behandlingsregimer i de seneste år2,3. Denne persistens fænotype og stigende antibiotika tolerance har tjent Pa en plads i en gruppe af patogener identificeret af både Centers for Disease Control (CDC) og Verdenssundhedsorganisationen (WHO) som forskningsprioriteter for udviklingen af nye terapeutiske strategier-ESKAPE patogener4.
Ligesom andre ESKAPE patogener, erhvervet antibiotikaresistens er almindelig i Pa, men der er også mange iboende egenskaber, der bidrager til Pa antimikrobiel tolerance. Blandt disse er Pa's evne til at danne aggregater meget tætte klynger af ~ 10-1.000 celler, som kan observeres i flere infektioner, herunder CF-patient spyt5,6. I lighed med Pa undersøgt i andre biofilm systemer, Pa aggregater vise klinisk relevante fænotyper såsom øget resistens over for antibiotika og aktivering af celle-celle kommunikation (quorum sensing (QS)). For eksempel har aggregater af Pa vist sig at bruge QS-regulerede adfærd til at bekæmpe andre mikrober samt tolerere antimikrobielle behandlinger såsom produktion af pyocyanin7. Evnen til at studere en sådan adfærd giver et spændende indblik i bakterielle økosystemer i et miljø, der ligner det, hvor de findes i menneskekroppen.
En af de største udfordringer ved at studere, hvordan Pa aggregater reagerer på det skiftende spyt miljø er manglen på ernæringsmæssigt relevante og robuste systemer, der fremmer den samlede dannelse. Meget af det, der er kendt om Pa er blevet opdaget ved hjælp af in vitro-systemer, hvor celler vokser planktonically eller i en karakteristisk overflade-vedhæftet, "champignon" arkitektur, der ikke er blevet observeret in vivo8. Mens klassiske biofilm vækstmodeller, såsom flowceller eller solid agar, har givet omfattende og værdifuld viden om bakteriel adfærd og mekanismer af antibiotika tolerance, disse resultater ikke altid oversætte in vivo. Mange in vitro-modeller har en begrænset evne til at efterligne vækstmiljøet på det menneskelige infektionssted, hvilket nødvendiggør dyre in vivo-undersøgelser. Til gengæld mangler mange in vivo-modeller den fleksibilitet og opløsning, som in vitro-teknikker giver.
Syntetisk cystisk fibrose spyt (SCFM2) er designet til at give et miljø for Pa vækst svarende til den, der opleves under kronisk infektion i CF lunge. SCFM2 omfatter ernæringsmæssige kilder identificeret i ekselleret CF sputa ud over mucin, lipider og DNA. Pa vækst i SCFM2 kræver en næsten identisk gen indstillet til den, der kræves for vækst i faktiske spyt og understøtter naturlige Pa aggregeret dannelse9,10. Efter podning danner planktoniske celler aggregater, der øges i størrelse gennem ekspansion. Individuelle celler (kaldet migranter) frigives fra aggregater, migrerer til ikke-kølloniserede områder og danner nye aggregater10. Denne livshistorie kan observeres ved hjælp af CLSM og billedanalyse ved opløsningen af en enkelt celle. Granulater af Pa dannet i SCFM2 er af samme størrelse som dem, der er observeret i CF lunge10. Denne model gør det muligt at observere flere aggregater af varierende størrelse i realtid og i tre dimensioner på mikronskalaen. Time-lapse mikroskopi tillader sporing af tusindvis (~ 50.000) af aggregater i et eksperiment. Brugen af billedanalysesoftware gør det muligt at kvantificere samlede fænotyper fra mikrografer, herunder samlet volumen, overfladeareal og placering i tre dimensioner til nærmeste 0,1 μm, både på de enkelte aggregat- og befolkningsniveauer. At have evnen til at gruppere aggregater efter fænotype og position gør det muligt at differentiere aggregater på forskellige udviklingsstadier med præcision samt deres reaktion på et skiftende mikromiljø6,11.
Anvendelsen af SCFM2 til at studere Pa aggregater i lav volumen og high-throughput assays gør det til en fleksibel, omkostningseffektiv model. Som et defineret medium tilbyder SCFM2 ensartethed og reproducerbarhed på tværs af flere platforme, hvilket giver en ernæringsmæssigt og fysisk relevant metode til at studere Pa aggregater in vitro9. Applikationer omfatter dens anvendelse i kombination med CLSM til at observere rumlig organisation og antibiotika tolerance ved høj opløsning (som beskrevet i denne metode papir). Evnen til at udføre eksperimenter, der giver realtidsdata i mikronskala, gør det muligt at studere interaktioner inden for arter og mellem arter, da de kan forekomme in vivo. For eksempel er SCFM2 tidligere blevet brugt til at studere den rumlige dynamik i cellecellekommunikation i samlede populationer via et netværk af systemer, der anvendes af Pa til at regulere flere gener, der bidrager til virulens og patogenese6.
Figur 1: Grafisk skildring af de vigtigste eksperimentelle trin. (A) SCFM2 podes med Pa-celler og får lov til at danne aggregater i en glasbundet kulturskål. (B) Aggregater overføres til det konfokale mikroskop, og der tilsættes antibiotika. Afbildet er tre tekniske kopier (kamre 1-3) og en kontrol brønd (4) af podet SCFM2 uden antibiotikabehandling. Aggregater afbildes ved hjælp af CLSM i løbet af 18 timer (C) Efter den første 18-timers billeddannelse behandles aggregater med propidiumododi for at visualisere døde celler og afbildes ved hjælp af CLSM (D) Aggregater med ønsket fænotype adskilles fra SCFM2 ved hjælp af FACS. Forkortelser: SCFM2 = syntetisk cystisk fibrose spyt medium; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = konfokal laserscanningsmikroskopi; FACS = fluorescensaktiveret cellesortering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Her demonstreres nytten af SCFM2 til at undersøge virkningen af antibiotikabehandling på pa aggregater i realtid, efterfulgt af brugen af en cellesorteringsmetode til at isolere populationer af aggregater med forskellige fænotyper til downstream-analyse (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered syntetisk cystisk fibrose medium (SCFM2)
BEMÆRK: Forberedelsen af SCFM2 omfatter tre hovedfaser, der er beskrevet nedenfor (figur 2). Yderligere oplysninger og referencer finder du under9,10,12.
Figur 2: Forberedelse og podning af SCFM2 medium. (A) Bufferbunden fremstilles ved hjælp af salte og aminosyrer, der er anført i tabel 1 og tabel 2. Bufferbunden kan opbevares ved 4 °C i op til 30 dage, men skal beskyttes mod lyseksponering. (B) Mucin og DNA tilsættes en aliquot af buffered base og opløses i opløsning natten over ved 4 °C. (C) Lipid og yderligere lagre tilsættes natten opløsning og inkuberes ved 37 °C med agitation ved 250 o/min. SFCM2 podes derefter med vaskede, log fase celler ved en OD600 = 0,05. Forkortelser: SCFM2 = syntetisk cystisk fibrose spyt medium. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Sterilisering af svin mucin
- Steril mucin forberedes i en endelig koncentration på 5 mg/mL i SCFM2. For eksempel vejer 25 mg type II mucin i en steril petriskål for en 5 mL volumen SCFM2 i en steril petriskål og placeres i en ultraviolet (UV) sterilisator i 4 timer, forsigtigt ophidsende hver time.
- Efter 4 timer overføres den UV-behandlede mucin til autoklavede 1,7 mL-rør under sterile forhold og opbevares ved -20 °C.
- For at bekræfte fuldstændig sterilisering opløses en prøve af mucin i en steril væske, såsom vand eller Luria Bertani (LB) bouillon, og observeres under et mikroskop.
BEMÆRK: Steriliseret mucin kan opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder.
- Udarbejdelse af bufferbund
- Tilbered salt - og aminosyrelageropløsninger ved at tilsætte de relevante mængder efter vægt til deioniseret vand som anført i tabel 1. Filtersterilalisere alle lageropløsninger ved hjælp af et 0,22 μm filter, wrap i folie for at beskytte mod lysforringelse og opbevares ved 4 °C i op til en måned.
- Tilbered bufferbunden ved at kombinere 190 mL deioniseret vand med aminosyre- og saltlageropløsninger efter volumener, der er anført i tabel 1. Juster opløsningen til pH 6.8, og forøg til et endeligt volumen på 250 mL. Filtersteriliseres ved hjælp af et 0,22 μm filter og opbevares ved 4 °C i op til 30 dage.
- Om aftenen før forsøget, aliquot den ønskede mængde buffered base i et glas kultur kolbe, og tilsæt mucin (5 mg/mL som beskrevet i trin 1.1.1) og renset laks sperm DNA (0,6 mg/mL). Omrør forsigtigt, pakk folie ind, og lad det være ved 4 °C natten over, så mucin og DNA kan opløses i opløsning.
BEMÆRK: Laksesæd DNA aliquots bør optøs på is, hvirvlede, og føjes til buffered base og mucin. Tryptofan,asparagine og tyrosinbestandsløsninger skal fremstilles i løsninger af NaOH (se tabel 1 for koncentrationer) i stedet for deioniseret vand. Hold buffered base og alle lagerløsninger indpakket i folie for at beskytte mod lyseksponering. De fleste aktier vil være stabile i op til en måned. Lagre, der bliver misfarvede, bør ikke anvendes og bør udskiftes før brug.
- Tilføjelse af supplerende lagre
- På dagen for forsøget skal de lagre, der er anført i tabel 2, føjes til den bufferede base, der indeholder mucin og DNA.
BEMÆRK: Forbered en frisk FeSO4-opløsning på dagen for forsøget, men alle andre lagre kan laves i forvejen og opbevares i 30 dage ved 4 °C. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DOPC) indeholder kloroform. Håndter med forsigtighed, og brug ikke i nærheden af åben ild. Efter tilsætning af DOPC inkuberes SCFM2 ved 37 °C med rystelser (250 omdr./min.) i mindst 20 min (for 5 mL-kultur). Denne inkubationsperiode gør det muligt for kloroformen i DOPC at fordampe. Kolben må ikke være lufttæt. Dæk i stedet kolbens åbning løst med folie.
- På dagen for forsøget skal de lagre, der er anført i tabel 2, føjes til den bufferede base, der indeholder mucin og DNA.
2. Realtidsvurdering af antimikrobiel tolerance i bakterielle aggregater
- Forbered overnatning kulturer
- Om aftenen før eksperimentet, pode 5 mL LB bouillon med flere kolonier af Pa PAO1-pMRP9-113 fra en LB agar plade indeholdende antibiotikum (carbenicillin 300 μg/mL). Vokse natten over ved 37 °C med omrøring ved 250 omdrejninger.
BEMÆRK: Grow overnight kulturer med tilsætning af antibiotika, der kræves for udvælgelsen af nødvendige plasmider (her, den grønne fluorescerende protein (GFP) udtryk plasmid, pMRP9-1). Bemærk, at Pa celler skal vaskes, før SCFM2 er podet. LB kan erstatte andre rige laboratoriemedier med overnatningskulturer. Alle bakterieisolater skal håndteres ved hjælp af passende BSL-2 retningslinjer i hele denne protokol.
- Om aftenen før eksperimentet, pode 5 mL LB bouillon med flere kolonier af Pa PAO1-pMRP9-113 fra en LB agar plade indeholdende antibiotikum (carbenicillin 300 μg/mL). Vokse natten over ved 37 °C med omrøring ved 250 omdrejninger.
- Pod sCFM2
- På dagen for eksperimentet, tilbage-fortyndet natten kulturer Pa 1:10 (kultur: flydende medier) ved at pode 500 μL i 5 mL frisk LB bouillon. Knyt cellerne indtil logfasen (60-90 min) ved 37 °C med omrøring ved 250 omdrejninger.
- Centrifuge log fase kulturer på 10.000 × g i 5 min. Cellerne vaskes ved at fjerne supernatanten og genoplivningen i 3 mL filtersteriliseret fosfatbuffered saltvand (PBS, pH 7.0). Gentag to gange, og genbrug pellet i et sidste volumen på 1 mL PBS.
- Absorbansen af de vaskede celler ved hjælp af et spektrofotometer ved 600 nm (OD600),og beregn den kulturmængde, der er nødvendig for en start OD600 på 0,05 i 5 mL SCFM2. Pod Pa ind i SCFM2, og hvirvle forsigtigt at distribuere celler hele vejen igennem. Pipette 1 mL af den podede SCFM2 i hvert kammer af en 4-brønd, glasbund, optisk skål og inkubation i 4 timer statisk ved 37 °C.
BEMÆRK: Fordoblingstiden for Pa kulturer er afhængig af stammen og tilgængeligheden af ilt. I SCFM2, under de betingelser, der er beskrevet her, er fordoblingstiden for Pa ~ 1,4 h10.
3. Visualisering af granulater under antibiotikabehandling med konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM)
BEMÆRK: I dette afsnit beskrives brugen af konfokal laserscanningsmikroskop og billedoptagelsessoftware til billedbehandling af Pa-aggregater i SCFM2. Målet er at observere og karakterisere den resterende (tolerante) bakteriebiomasse efter behandling med antibiotika. De skitserede trin kan udføres med succes på andre konfokale mikroskoper, selv om der henvises til instrumentdriftsmanualen til specifik vejledning.
- Billede Pa kulturer ved hjælp af enten et opvarmet kammer eller en opvarmet mikroplade monteret på mikroskop fase for at opretholde en omgivelsestemperatur på 37 °C. Start inkubationsmodulet mindst 2 timer før eksperimentets begyndelse for at gøre det muligt for alle apparater at nå den ønskede temperatur og reducere yderligere ekspansion og bevægelse under dataindsamlingen.
- Efter 4 timer overføres SCFM2-kulturer, der indeholder Pa-celler, til det opvarmede mikroskopstadium. Udpege 3 ud af 4 brønde som tekniske kopier til antibiotikabehandling, og overveje 4th samt en no-behandling kontrol, der kun indeholder Pa celler i SCFM2, uden antibiotika. Identificer aggregater ved hjælp af brightfield mikroskopi under fanen Find forud for enhver excitation af fluorescerende journalister. Definer et område til billedbehandling i hver brønd, og gem dets position (x-y-z koordinater) ved hjælp af positionsmodulet i billedsoftwaren.
- Brug en 63x olie-nedsænkning mål at visualisere Pa kulturer, der indeholder GFP udtryk plasmid pMRP9-1 i SCFM2 med en excitation bølgelængde på 488 nm og emission bølgelængde på 509 nm. Tag billeder ved hjælp af z-stack-indstillingen i modulet Anskaffelse med 1 μm intervaller (i alt 60 skiver). Brug line-gennemsnit modulet til at reducere baggrundslyscens i GFP-kanalen inden for det samlede volumen af 60 μm z-stack billeder (1.093,5 mm3). Tag kontrolbilleder af uinokuleret SCFM2 ved hjælp af identiske indstillinger for at bestemme baggrunden fluorescens til billedanalyse.
BEMÆRK: Billeder hentes ved at producere 512 pixels x 512 pixels (0,26 μm x 0,26 μm pixels) 8-bit z-stack billeder, der er 60 μm fra bunden af coverlip. - Brug tidsserieindstillingen i billedsoftwaren til at fange 60 skiver på hver position (brønd) med 15 minutters intervaller over en periode på 18 timer. Brug den konkrete fokusstrategi i softwaren til at gemme et fokusplan for hver position, som returneres til hvert gang i eksperimentet.
- Efter i alt 4,5 timers inkubation, billede hver position ved hjælp af ovenstående indstillinger til at bestemme den samlede biomasse inden for hver af de fire brønde før tilsætning af antibiotika.
- Efter 6 timers total inkubation tilsættes antibiotikum ved 2x-under minimumshæmning (MIC) til hver replikation. Pipette direkte og forsigtigt ind i midten af brønden, lige under luft-flydende interfase. Vedligehold alle kulturer i det opvarmede konfokale kammer.
BEMÆRK: Her blev colistin sulfat i en koncentration på 140 μg/mL anvendt. - Begynd billeddannelse efter antibiotikabehandling ved at klikke på indstillingen Start eksperiment inden for billedbehandlingsprogrammet.
BEMÆRK: Antibiotika koncentration anvendes er afhængig af antibiotika, Pa isolere, og om brugeren ønsker at undersøge drab eller tolerance virkninger. Dette eksperiment bruger en enkelt dosis. Yderligere doser kan tilføjes uden at forstyrre kulturer, hvis det er nødvendigt.
4. Propidium jod farvning af Pa aggregater
BEMÆRK: Propidium jod (PI) er almindeligt anvendt som en farvning reagens til at identificere ikke-levedygtige (døde) bakterieceller i kultur. Her bruges det til at identificere aggregater, der er følsomme over for antibiotikabehandling, der anvendes i afsnit 3. I hele denne protokol bruges udtrykket og detektionen af GFP i Pa-celler som den vigtigste proxy for celle levedygtighed. Dette sidste trin gør det muligt igen at bruge konfokal billeddannelse til at identificere den rumlige positionering af levende/døde aggregater i forhold til hinanden. Derudover identificeres aggregater som levende/døde til yderligere cellesortering i afsnit 5.
- Efter 18 timer tilsættes PI til hver brønd i den firekammeropdelte optiske bundskål, der indeholder SCFM2-kulturer. Følg producentens anvisninger for mængden af PI og inkubationstid (f.eks.~2 μL pr. minut kultur, ~20-30 min).
5. Isolering af levende celler fra aggregater ved hjælp af en FACS-tilgang
BEMÆRK: FACS præsenterer en kraftfuld platform til at sortere og isolere grupper af celler i henhold til en fluorescerende mærket fænotype. Her bruges FACS til at isolere levende (antibiotikatolerante) aggregater fra ikke-levedygtige aggregater.
- Efter farvning med propidium jod fjernes kulturerne fra inkubation og overføres til et FACS-instrument i en isoleret beholder for at opretholde 37 °C.
- Kør 1 mL aliquots af SCFM2 indeholder Pa aggregater med den laveste strømningshastighed.
BEMÆRK: Hver aliquot vil indeholde ~ 15.000 aggregater. - Hvis du vil registrere GFP, skal du belyse cellerne med en laser på 488 nm og registrere den fluorescerende signalhøjde ved 530/30 nm. Visualiser PI-farvningen ved excitation med en 561 nm laser, og registrer den fluorescerende signalhøjde ved 610/20 nm. Udfør sortering ved hjælp af en 70-u dyse.
BEMÆRK: Sorterede aggregater kan samles på flere måder afhængigt af brugerens program. I dette tilfælde blev FACS anvendt til at sortere levedygtige Pa aggregater for downstream RNA sekventering. Alternative ansøgninger diskuteres nedenfor.
6. Billedanalyse
BEMÆRK: Time-lapse mikroskopi genererer store mængder data. En 18-timers eksperiment til observation af Pa aggregater i SCFM2 identificerer ~ 50.000 aggregater over tid, som har potentiale til at blive karakteriseret for volumen og rumlig positionering. Brug en billedanalysesoftware til at kvantificere den samlede dynamik i SCFM2:
- For aggregerede undersøgelser i SCFM2, kvantificere baggrunden GFP fluorescens ved at skabe et histogramme af tæller i GFP-kanalen, der er produceret for uinokuleret SCFM2 og SCFM2 podet med Pa stamme PAO1 transporterer pMRP9-1. For at sikre, at påviste GFP voxels korrelerer til Pa biomasse, definere en GFP + voxel som ≥1,5x GFP baggrund tælle værdi.
BEMÆRK: Baggrunden fluorescens er defineret som den højeste voxel værdi af tre tilfældigt udvalgte positioner, gennemsnit. Baggrundstællinger trækkes som standardmål fra alle pixel i eksperimentelle billeder af billedanalysesoftwaren. - Efter baggrundsfratrækning i modulet Overhæld, producere isosurfaces for alle resterende voxels.
- Hvis du vil registrere individuelle aggregater, skal du aktivere indstillingen Opdel objekter og definere aggregater som objekter med diskenheder på ≥ 5 μm3. Brug Modulet Vantage i billedanalysesoftwaren til at beregne volumen, x-y-z og summen af GFP-voxels for hvert enkelt objekt. Eksporter disse data til en ekstern statistisk platform.
BEMÆRK: Nogle billedanalysesoftware gør det muligt at eksportere flere kvantitative phentoyper på én gang, hvilket gør det muligt at beregne korrelationer. - Filterdata, der eksporteres fra Vantage-modulet efter størrelse for at sikre, at der ikke er nogen objekter på <0,5 μm3 (spredt biomasse). For hvert enkelt objekt i billedet skal du beregne afstanden fra sig selv i forhold til andre objekter (aggregater) ved hjælp af Vantage-modulet i billedanalysesoftwaren eller manuelt med følgende ligning.
d = kvm(x2− x1)2 + (y2− y1)2 + (z2− z1)2) (1) - Brug SUM- og GENNEMSNITSberegninger til at finde den samlede biomasse og den gennemsnitlige samlede mængde. Alternativt kan du eksportere data til andre statistiske platforme eller scripts, f.eks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette arbejde beskriver metoder til at observere Pa aggregater i en høj opløsning og i et miljø svarende til kronisk infektion i CF lunge9,10,12. SCFM2 giver et in vitro-system, der fremmer naturlig sammenlægning af Pa-celler i størrelser svarende til dem, der observeres under den faktiske infektion10. SCFM2's tilpasningsevne som et defineret medium kan udnyttes til at nærme sig mange forskningsveje. Målet med dette arbejde er at fremhæve en arbejdsgang, der involverer en kombination af mikroskopi og FACS, med det formål at fremme dets anvendelse til fremtidig forskning, samarbejder og applikationer.
Brugen af CLSM tillader tidsmæssig billeddannelse med høj opløsning, der kan bruges til at studere dynamikken i at udvikle bakteriepopulationer. Dette arbejde viser flere potentielle måder, hvorpå Pa aggregater kan karakteriseres efter behandling med antibiotika. Figur 3A giver et bredt overblik over levedygtige Pa aggregater efter antibiotikabehandling. Fire timer efter påføring af antibiotika, flere aggregater tilbage; farveområder kan anvendes til at repræsentere forskellige karakteristika for hver enkelt aggregat. Eksempler på kvantificerbare egenskaber omfatter volumen, område, voxel intensitet (til brug for fluorescerende reportere) og position i en af x-y-z akserne.
Billedanalyse ved hjælp af dedikeret software giver mulighed for fuldt tilpasselig observation af data, identificere hver aggregat som et individuelt objekt, hvori kvantitative data kan eksporteres til yderligere analyse. Figur 3B er et eksempel på, hvordan eksporterede data kan bruges. Her kan den samlede biomasse af samlede populationer beregnes over tid. I disse repræsentative data reducerer behandling med antibiotika biomasse betydeligt i forhold til ubehandlede aggregater. Supplerende Video S1 er en stærk repræsentation af, hvordan tidsseriemikroskopi kan bruges til fysisk at observere aggregater inden for disse biomassedata efter antibiotikabehandling. Hvert aggregat er farvekodet til at repræsentere det beregnede volumen (μm3), hvilket giver mulighed for en visuel registrering af samlede populationer, som også kan bruges til yderligere rumlig analyse ved hjælp af applikationer, både inden for billedanalysesoftwaren og andre ressourcer (ikke diskuteret her10,15).
Forsøg udviklet til at identificere mekanismer for antibiotika tolerance i Pa aggregater producere store mængder af data. Hver replikation producerer fysiske data på ~15.000 aggregater (~60.000 aggregater i alt). En ny metode til håndtering af disse data har omfattet produktion af samlede varmekort (figur 3C). Ved at beregne, hvordan aggregater af forskellige størrelser bidrager til den samlede befolkning, kan mønstre for, hvordan aggregater reagerer på antibiotikabehandling i forhold til deres størrelse, form og position i forhold til hinanden, identificeres.
Figur 3: Eksempler på samlet dataanalyse. (A) Oversigt over resterende samlet biomasse efter antibiotikabehandling. Isokirurger af tilsvarende GFP voxels er blevet gengivet og farvekodet i henhold til volumen (μm3). Skalalinje = 30 μm. (B) Samlet biomasse (μm3) af pa aggregerede populationer over tid i SCFM2. Blå linje repræsenterer ubehandlede aggregater, rød linje repræsenterer aggregater behandlet med antibiotika, colistin (140 μg/mL). Præsenterede data omfatter 3 biologiske replikerer (± SEM). (C) Samlet volumenvarmekort, der repræsenterer de enkelte aggregater efter volumen (μm3, x-akse) til samlet biomasse (μm3, anden y-akse) over tid (h, y-akse). Repræsentative data omfatter Pa aggregater i nærvær og fravær af antibiotika (som i figur 3B), hvor 0 h repræsenterer tidspunktet for tilsætning af antibiotika efter 6 timers samlet vækst. Data omfatter tre biologiske replikeringer (~50.000 samlede aggregater). Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; SCFM2 = syntetisk cystisk fibrose spyt medium; SEM = standardfejl i middelværdien; Pa = Pseudomonas aeruginosa. Klik her for at se en større version af dette tal.
Rumlig analyse på dette stadium indebærer at bruge udtrykket af GFP af Pa som en proxy for levedygtighed i nærværelse af antibiotika. Tilføjelsen af PI efter 18 timer gør det muligt at identificere positionen af ikke-levedygtige aggregater i forhold til levedygtige aggregater (supplerende figur S1). Det overordnede mål med denne metode er at identificere rumlige mønstre mellem følsomme og tolerante aggregater efter behandling med antibiotika. Fremtidige undersøgelser vil omfatte flere tidspunkter ud over slutpunktet assay beskrevet ovenfor.
Den sidste fase af arbejdsprocessen bruger en FACS-baseret tilgang til sortering af aggregater i SCFM2. Dette arbejde viser FACS' evne til at adskille levedygtige celler fra den resterende population af aggregater (herunder ikke-levedygtige). Figur 4 viser, hvordan FACS anvendes til at samle levedygtige aggregater til yderligere eksperimenter såsom sekventering med høj kapacitet, f.eks. Efter behandling med antibiotika (Figur 4A repræsenterer et gangpunkt (18 timer), aliquots af SCFM2 indeholdende Pa aggregater kan med succes adskilles i henhold til deres fluorescerende funktioner. Her er GFP blevet identificeret for tolerante aggregater. Figur 4B er et eksempel på en sådan sorteringshændelse, hvor GFP-udtrykkende celler adskilles fra den resterende kultur (PI-behandlede aggregater). Derudover kan aggregater tydeligt identificeres fra SCFM2, som producerer sin egen fluorescerende profil. Evnen til at sortere celler på denne måde har mange applikationer (Figur 5).
Figur 4: FACS af pa aggregater i SCFM2. (A) Diagram over et FACS-instrument, der anvendes til at adskille levedygtige og ikke-levedygtige Pa aggregater fra SCFM2. (B) Repræsentativt plot af aggregater adskilt i SCFM2 genereret af FACS-software. Tre kvadranter angiver levende aggregater (GFP), resterende kultur, der indeholder ikke-levedygtige celler (RFP bruges som et alternativ til propidium jod farvning her, både ophidset af 488 nm laser), og SCFM2 kontrol. Data repræsenterer 1 af 3 biologiske replikater, der indeholder ~ 15.000 hændelser (aggregater). Forkortelser: FACS = fluorescensaktiveret cellesortering; SCFM2 = syntetisk cystisk fibrose spyt medium; Pa = Pseudomonas aeruginosa; GFP = grønt fluorescerende protein; RFP = rødt fluorescerende protein; PE-Texas Red-H = tophøjde for phycoerythrin-Texas Rød konjugat farvede celler; FITC-H = tophøjde for fluorescein isothiocyanate-farvede celler.
Figur 5: Potentielle eksperimentelle anvendelser ved hjælp afSCFM2. (A) Eksponering af pa aggregater til gentagne antibiotikadoser. (B) Co-kultur af Pa aggregater med andre bakteriearter. (C) Eksponering af pa aggregater til at være vært immunceller, f.eks. Forkortelser: SCFM2 = syntetisk cystisk fibrose spyt medium; Pa = Pseudomonas aeruginosa; PMNs = polymoronukleare leukocytter; CLSM = konfokal laserscanningsmikroskopi; FACS = fluorescensaktiveret cellesortering; RNA-seq = RNA sekventering; 3D = tredimensionel; LC-MS/MS = flydende kromatografi/tandem massespektrometri. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Kemisk | Lagerkoncentration (M) | Endelig koncentration (mM) | Noter |
| NaH2PO4 | 0.2 | 1.3 | |
| Na2HPO4 | 0.2 | 1.25 | |
| KNO3 | 1 | 0.35 | |
| K2SO4 | 0.25 | 0.27 | |
| NH4Cl | 2.28 | Føj solid direkte til bufferbunden | |
| KCl | 14.94 | Føj solid direkte til bufferbunden | |
| NaCl | 51.85 | Føj solid direkte til bufferbunden | |
| MOPPER | 10 | Føj solid direkte til bufferbunden | |
| Ser | 0.1 | 1.45 | |
| Glu HCl | 0.1 | 1.55 | |
| Pro | 0.1 | 1.66 | |
| Gly | 0.1 | 1.2 | |
| Ala | 0.1 | 1.78 | |
| Val | 0.1 | 1.12 | |
| Mødte | 0.1 | 0.63 | |
| Ile | 0.1 | 1.12 | |
| Leu | 0.1 | 1.61 | |
| Orn HCl | 0.1 | 0.68 | |
| Lys HCl | 0.1 | 2.13 | |
| Arg HCl | 0.1 | 0.31 | |
| Trp | 0.1 | 0.01 | Udarbejdet i 0,2 M NaOH |
| Asp | 0.1 | 0.83 | Udarbejdet i 0,5 M NaOH |
| Tyr | 0.1 | 0.8 | Udarbejdet i 1,0 M NaOH |
| Thr | 0.1 | 1.07 | |
| Cys HCl | 0.1 | 0.16 | |
| Phe | 0.1 | 0.53 | |
| Hans HCl H2O | 0.1 | 0.52 | |
| Laks Sperm DNA | 0,6 mg/mL | ||
| Porcine Mucin | 5 mg/nL |
Tabel 1: Fremstilling af salt, aminosyre, DNA, og mucin lagre kræves for buffered base af syntetisk cystisk fibrose spyt medium, SCFM2.
| Kemisk | Lagerkoncentration (M) | Endelig koncentration (mM) | Noter |
| Dextrose (D-glukose) | 1 | 3 | |
| Mælkesyre | 1 | 9.3 | Juster til pH 7.0 med NaOH |
| CaCl2*2H2O | 1 | 1.75 | |
| MgCl2*6H2O | 1 | 0.61 | |
| FeSO4*7H2O | 1 mg/mL | 0.0036 | Lav frisk dagligt |
| N-acetylglucosamin | 0.25 | 0.3 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocolin (DOPC) | 25 mg/mL | 100 μg/mL | Inkuberes i mindst 20 min ved 37 °C efter tilsætning |
Tabel 2: Udarbejdelse af yderligere lagre, der er nødvendige for bufferbunden af syntetisk cystisk fibrose spytmedium, SCFM2.
Supplerende figur S1: Pa aggregater i SCFM2. En gengivet konfokal mikrograf af levedygtige (grønne) og ikke-levedygtige (røde) Pa aggregater dannet i SCFM2. Skalalinje = 5 μm. Forkortelser: SCFM2 = syntetisk cystisk fibrose spyt medium; Pa = Pseudomonas aeruginosa. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Video S1: Aggregater i SCFM2 efter behandling med antibiotika. Pa samlede billeder taget hver 30 minutter i SCFM2 ved hjælp af CLSM. Aggregater mærkes individuelt efter farver, der repræsenterer den samlede volumen (μm3, farveskala, der ikke vises som repræsentativt billede). Skalalinje = 5 μm. Forkortelser: SCFM2 = syntetisk cystisk fibrose spyt medium; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = konfokal laserscanningsmikroskopi. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbejde har indført metoder, der kan kombineres for at studere bakterielle samlede populationer i nærvær og fravær af antibiotikabehandling. Høj opløsning CLSM tillader visualisering af ændringer i den samlede biomasse og den strukturelle orientering af aggregater over realtid, når de udsættes for antibiotika. Derudover kan fysiske og strukturelle træk ved den biomasse, der er tilbage efter behandling med antibiotika, kvantificeres med det formål at korrelere disse observationer med fremtidige genekspressionsundersøgelser ved hjælp af RNA-seq. Mens brugen af GFP-udtrykkende celler tillader visualisering af den kollektive og individuelle adfærd af antibiotikatolerante celler, giver det kun en del af det samlede billede. Meget kan læres af den rumlige positionering af celler, der ikke overlevede antibiotikabehandling, både individuelt og i forhold til den overlevende og tolerante biomasse.
Time-lapse mikroskopi genererer store mængder data. En 18-timers eksperiment til observation af Pa aggregater i SCFM2 identificerer ~ 50.000 aggregater over tid, som har potentiale til at blive karakteriseret for volumen og rumlig positionering. ClSM, der bruges her (se materialetabellen)indfanger billeder i høj opløsning af at udvikle aggregater til analyse. Rumlig positionering af et individuelt aggregat (i forhold til de omgivende aggregater) i tre dimensioner (± 0,1 μm) kan bruges til at muliggøre præcise målinger af afstanden mellem aggregater. Fysiske fænotyper af bakterielle aggregater kan bestemmes ved hjælp af en kombination af analyse tilgange. Billedbehandlingssoftware giver overfladegengivelse og tredimensionel (3D) positionering. In-house-genererede scripts kan bruges til at sortere aggregater efter fænotype(f.eks.., volumen) og beregne fordelingen af størrelsesp binned biomasse. Der er yderligere ressourcer til rådighed til at segmentere individuelle celler i aggregater (f.eks. Tilsammen giver disse analyseværktøjer en bred vurdering af de samlede fænotyper med fleksibilitet til at ændre analyser for nye interesser, efterhånden som der genereres data.
Efter den første 18-timers billeddannelse blev aggregater behandlet med PI, en teknik, der ofte omtales som levende / død farvning. PI kommer ind i celler med en porøs (kompromitteret) membran, der tillader visualisering af døde eller alvorligt stressede celler i modsætning til levende celler, der udtrykker GFP. Den rumlige organisering af bakterielle samfund i CF lunge som aggregater kan give oplysninger om bakterielle samfund adfærd. Identifikation af levedygtige og ikke-levedygtige celler, som er afsondret inden for et samlet, letter identifikationen af fordelingen af celler i samfundet, der kan være mere følsomme over for antibiotikabehandling. Kvantificering af de fysiske ændringer, som aggregater gennemgår som reaktion på antibiotika samt identificere genoskopiske træk ved antibiotikatolerante aggregater kunne informere fremtidige behandlinger mod Pa.
Brugen af PI har også downstream-applikationer i FACS-tilgangen til arbejdsgangen, selv om det skal bemærkes, at det ikke altid er nødvendigt, da levedygtige celler i dette eksperiment kan differentieres ved GFP-udtryk. Pi-farvning gør det dog muligt at få geografisk information fra aggregater i slutningen af hver analyse. Ved at fremhæve brugen af FACS til at sortere aggregater, denne metode papir viser 1), at SCFM2 kan bruges i en FACS maskine uden at forårsage skade eller træsko på trods af sin viskositet, 2) FACS kan bruges til at adskille enkelte celler fra et aggregat og gruppere dem i forskellige populationer (fænotyper), og 3) PI farvning har nytte til at adskille døde celler fra en befolkning med FACS, især hvis de andre interesseceller ikke udtrykker en fluorescerende markør. Brugen af levende celle farvning teknikker fremhæver anvendelsen af denne protokol til brug af kliniske isolater, hvori genetisk manipulation er ofte vanskeligt. Selvom optimering sandsynligvis er påkrævet stamme-for-stamme , samlede fænotyper kan identificeres ved samme opløsning ved hjælp af mange kommercielt tilgængelige fluorophores.
Kompatibilitet af SCFM2 med FACS er en enorm fordel og giver nu efterforskere mulighed for at isolere specifikke enkeltceller fra et samlet i forskellige populationer. Dette i sig selv har mange ansøgninger til fremtidige undersøgelser, der indeholder blandede populationer af celler. For eksempel studerer sammenlægning med andre arter eller heterogenitet inden for enkelte arter aggregeret6. Denne spændende sorteringsproces med høj opløsning er bredt tilgængelig i mange institutioner og har mange downstream-applikationer. Levedygtige celler fra aggregaterne i denne undersøgelse blev sorteret til fremtidige RNA-seq-eksperimenter. Andre anvendelser kan omfatte proteomics; resampling af granulater til evolutionære undersøgelser, såsom vurdering af virkningerne af gentagen antibiotikaeksponering samdyrkende med andre arter; eller samdyrkende med humane immunceller (Figur 5). Ved at kombinere disse metoder med CLSM billedeksperimenter tillader korrelation af observerede bakterieegenskaber og adfærd med kvantitative data med potentiale til at identificere mekanismer i bakterielle samfund, intra-art relationer eller resistens over for antimikrobielle stoffer.
Ved siden af de mange fordele ved disse metoder er der nogle faldgruber, der skal løses. Denne undersøgelse bruger PI som et slutpunktsmarkør for celle levedygtighed; ideelt set i fremtiden, ville dette blive erstattet med celle aktivitet modeller til at differentiere celler over flere tidspunkter. Disse data fastslår imidlertid brugen af SCFM2 til kulturaggregater, der kan sorteres på andre måder end levende / døde. Den primære fordel er, at aggregater kan overføres direkte til FACS-maskinen uden vask, og potentiel forstyrrelse af enhver rumlig struktur udviklet i løbet af et eksperiment. Samlet set er dette en spændende platform, der kunne bruges af mange laboratorier til at fremme samarbejdsprojekter med dem, der er interesseret i Pa,CF og mikrobiel adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
S.E.D er støttet af start-up midler fra Department of Molecular Medicine, The University of South Florida, samt en CFF forskningsbevilling (DARCH19G0) N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, Chen)) og USF Institute on Microbiomes. Vi takker Whiteley laboratoriet for løbende samarbejde med datasæt relateret til dette manuskript. Vi takker Dr. Charles Szekeres for at lette FACS sortering. Tallene blev skabt af A.D.G og S.E.D ved hjælp af Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino acids | |||
| Alanine | Acros Organics | 56-41-7 | |
| Arginine HCl | MP | 1119-34-2 | |
| Asparagine | Acros Organics | 56-84-8 | Prepared in 0.5 M NaOH |
| Cystine HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
| Glutamic acid HCl | Acros Organics | 138-15-8 | |
| Glycine | Acros Organics | 56-40-6 | |
| Histidine HCl H2O | Alfa Aesar | A17627 | |
| Isoleucine | Acros Organics | 73-32-5 | |
| Leucine | Alfa Aesar | A12311 | |
| Lysine HCl | Alfa Aesar | J62099 | |
| Methionine | Acros Organics | 63-68-3 | |
| Ornithine HCl | Alfa Aesar | A12111 | |
| Phenylalanine | Acros Organics | 63-91-2 | |
| Proline | Alfa Aesar | A10199 | |
| Serine | Alfa Aesar | A11179 | |
| Threonine | Acros Organics | 72-19-5 | |
| Tryptophan | Acros Organics | 73-22-3 | Prepared in 0.2 M NaOH |
| Tyrosine | Alfa Aesar | A11141 | Prepared in 1.0 M NaOH |
| Valine | Acros Organics | 72-18-4 | |
| Antibiotic | |||
| Carbenicillin | Alfa Aesar | J6194903 | |
| Day-of Stocks | |||
| CaCl2 * 2H2O | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Chemical | 50-99-7 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Fisher (Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform |
| FeSO4 * 7H2O | Acros Organics | 7782-63-0 | this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh |
| L-lactic acid | Alfa Aesar | L13242 | pH stock to 7 with NaOH |
| MgCl2 * 6H2O | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| N-acetylglucosamine | TCI | A0092 | |
| Prepared solids | |||
| Porcine mucin | Sigma | M1778-100G | UV-sterilize |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
| Stain | |||
| Propidium iodide | Alfa Aesar | J66764MC | |
| Salts | |||
| K2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
| KCl | Alfa Aesar | J64189 | add solid directly to buffered base |
| KNO3 | Acros Organics | 7757-79-1 | |
| MOPS | Alfa Aesar | A12914 | add solid directly to buffered base |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | add solid directly to buffered base |
| Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
| NH4Cl | Acros Organics | 12125-02-9 | add solid directly to buffered base |
| Consumables | |||
| Conical tubes (15 mL) | Olympus plastics | 28-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Olympus plastics | 28-106 | |
| Culture tubes w/air flow cap | Olympus plastics | 21-129 | |
| 35 mm four chamber glass-bottom dish | CellVis | NC0600518 | |
| Luria Bertani (LB) broth | Genessee Scientific | 11-118 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Bioreagents | BP2944100 | |
| Pipet tips (p200) | Olympus plastics | 23-150RL | |
| Pipet tips (p1000) | Olympus plastics | 23-165RL | |
| Serological pipets (5 mL) | Olympus plastics | 12-102 | |
| Serological pipets (25 mL) | Olympus plastics | 12-106 | |
| Serological pipets (50 mL) | Olympus plastics | 12-107 | |
| Ultrapure water (RNase/DNase free); nanopure water | Genessee Scientific | 18-194 | Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1 |
| Syringes (10 mL) | BD | 794412 | |
| Syringes (50 mL) | BD | 309653 | |
| 0.22 mm PES syringe filter | Olympus plastics | 25-244 | |
| PS cuvette semi-mico | Olympus plastics | 91-408 | |
| Software | |||
| Biorender | To prepare the figures | ||
| FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| Imaris | Bitplane | version 9.6 | |
| Zen Black | |||
| Equipment | |||
| FacsAriallu | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| LSM 880 confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
- Ramsay, K. A., et al. The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).
- Bessonova, L., et al. Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor. Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).
- Breuer, O., et al. Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).
- O'Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections. Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).
- Bjarnsholt, T., et al.
- Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).
- Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
- Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).
- Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. MBio. 8 (2), 00240 (2017).
- Jorth, P., et al. Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs. Cell Host & Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
- Hartmann, R., et al. Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ. Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).
- Stacy, A., et al. Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).
