Synthetisch cystic fibrosis sputum medium (SCFM2) kan worden gebruikt in combinatie met zowel confocale laserscanmicroscopie als fluorescentie-geactiveerde celsortering om bacteriële aggregaten met hoge resolutie te observeren. Dit artikel beschrijft methoden om geaggregeerde populaties te beoordelen tijdens antimicrobiële behandeling als een platform voor toekomstige studies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Tools voor de real-time beoordeling van een Pseudomonas aeruginosa-infectiemodel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Pseudomonas aeruginosa (Pa) is een van de meest voorkomende opportunistische pathogenen geassocieerd met cystische fibrose (CF). Zodra Pa-kolonisatie is vastgesteld, vormt een groot deel van de infecterende bacteriën biofilms in het sputum van de luchtwegen. Van pa-biofilms geïsoleerd uit CF-sputum is aangetoond dat ze groeien in kleine, dichte aggregaten van ~ 10-1.000 cellen die ruimtelijk georganiseerd zijn en klinisch relevante fenotypen vertonen, zoals antimicrobiële tolerantie. Een van de grootste uitdagingen bij het bestuderen van hoe Pa-aggregaten reageren op de veranderende sputumomgeving is het gebrek aan nutritioneel relevante en robuuste systemen die de vorming van aggregaten bevorderen. Met behulp van een synthetisch CF-sputummedium (SCFM2) kan de levensgeschiedenis van Pa-aggregaten worden waargenomen met behulp van confocale laserscanmicroscopie (CLSM) en beeldanalyse met de resolutie van een enkele cel. Dit in vitro systeem maakt de observatie van duizenden aggregaten van verschillende grootte in real time, drie dimensies en op micronschaal mogelijk. Op individueel en populatieniveau vergemakkelijkt het vermogen om aggregaten te groeperen op fenotype en positie de observatie van aggregaten in verschillende ontwikkelingsstadia en hun reactie op veranderingen in de micro-omgeving, zoals antibioticabehandeling, die met precisie moeten worden gedifferentieerd.
Inleiding
Pseudomonas aeruginosa (Pa) is een opportunistische ziekteverwekker die chronische infecties vaststelt bij immuungecompromitteerde personen. Voor mensen met de genetische ziekte cystic fibrosis (CF), kunnen deze infecties de loop van een leven duren. CF veroorzaakt de opbouw van een stroperig, voedingsrijk sputum in de luchtwegen, dat in de loop van de tijd wordt gekoloniseerd door een verscheidenheid aan microbiële pathogenen. Pa is een van de meest voorkomende CF-pathogenen, koloniseert de luchtwegen in de vroege kinderjaren en stelt moeilijk te behandelen infecties vast1. Pa blijft een belangrijk klinisch probleem ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereid synthetisch cystisch fibrosemedium (SCFM2)
OPMERKING: De bereiding van SCFM2 bestaat uit drie hoofdfasen die hieronder worden beschreven(figuur 2). Voor volledige details en referenties, zie9,10,12.
Figuur 2: Bereiding en inenting van SCFM2-medium. (A) Gebufferde base w....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit werk beschrijft methoden om Pa-aggregaten te observeren met een hoge resolutie en in een omgeving die vergelijkbaar is met die van chronische infectie van de CF-long9,10,12. SCFM2 biedt een in vitro systeem dat de natuurlijke aggregatie van Pa-cellen bevordert in groottes die vergelijkbaar zijn met die waargenomen tijdens de werkelijke infectie10. Het aanpassingsvermogen va.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit werk heeft methodologieën geïntroduceerd die kunnen worden gecombineerd om bacteriële geaggregeerde populaties te bestuderen in de aan- en afwezigheid van antibioticabehandeling. Clsm met hoge resolutie maakt de visualisatie mogelijk van veranderingen in geaggregeerde biomassa en de structurele oriëntatie van aggregaten in realtime bij blootstelling aan antibiotica. Bovendien kunnen fysieke en structurele kenmerken van de biomassa die overblijven na behandeling met antibiotica worden gekwantificeerd, met als doel dez.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
S.E.D wordt ondersteund door start-upfondsen van de afdeling Moleculaire Geneeskunde, de Universiteit van Zuid-Florida, evenals een CFF-onderzoeksbeurs (DARCH19G0), de N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, Chen)) en het USF Institute on Microbiomes. We bedanken het Whiteley-lab voor de voortdurende samenwerking met betrekking tot datasets met betrekking tot dit manuscript. Wij danken Dr. Charles Szekeres voor het faciliteren van FACS sortering. Figuren werden gemaakt door A.D.G en S.E.D met behulp van Biorender.com.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Aminozuren | |||
| Alanine | Acros Organics | 56-41-7 | |
| Arginine HCl | MP | 1119-34-2 | |
| Asparagine | Acros Organics | 56-84-8 | Bereid in 0,5 M NaOH |
| Cystine HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
| Glutamic acid HCl | Acros Organics | 138-15-8 | |
| Glycine | Acros Organics | 56-40-6 | |
| Histidine HCl H2O | Alfa Aesar | A17627 | |
| Isoleucine | Acros Organics | 73-32-5 | |
| Leucine | Alfa Aesar | A12311 | |
| Lysine HCl | Alfa Aesar | J62099 | |
| Methionine | Acros Organics | 63-68-3 | |
| Ornithine HCl | Alfa Aesar | A12111 | |
| Phenylalanine | Acros Organics | 63-91-2 | |
| Proline | Alfa Aesar | A10199 | |
| Serine | Alfa Aesar | A11179 | |
| Threonine | Acros Organics | 72-19-5 | |
| Tryptophan | Acros Organics | 73-22-3 | Bereid in 0,2 M NaOH |
| Tyrosine | Alfa Aesar | A11141 | Bereid in 1,0 M NaOH |
| Valine | Acros Organics | 72-18-4 | |
| Antibioticum | |||
| Carbenicillin | Alfa Aesar | J6194903 | |
| Dag-voorraden | |||
| CaCl2 * 2H2O | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Chemical | 50-99-7 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) | Fisher (Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | Schud 15-20 min bij 37 °C om chloroform te verdampen |
| FeSO4 * 7H2O | Acros Organics | 7782-63-0 | Deze voorraad is gelijk aan 1 mg/mL, MOET vers worden gemaakt |
| L-melkzuur | Alfa Aesar | L13242 | pH voorraad tot 7 met NaOH |
| MgCl2 * 6H2O | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| N-acetylglucosamine | TCI | A0092 | |
| Bereid vaste stoffen | |||
| Porcine mucine | Sigma | M1778-100G | UV-steriliseren |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
| Kleurstof | |||
| Propidiumjodide | Alfa Aesar | J66764MC | |
| Zouten | |||
| K2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
| KCl | Alfa Aesar | J64189 | Voeg het vaste materiaal direct toe aan de gebufferde basis |
| KNO3 | Acros Organics | 7757-79-1 | |
| MOPS | Alfa Aesar | A12914 | Voeg het vaste materiaal direct toe aan de gebufferde basis |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | Voeg het vaste materiaal direct toe aan de gebufferde basis |
| Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
| NH4Cl | Acros Organics | 12125-02-9 | Voeg het vaste materiaal direct toe aan de gebufferde basis |
| Consumables | |||
| Conische buisjes (15 mL) | Olympus plastics | 28-101 | |
| Conische buisjes (50 mL) | Olympus plastics | 28-106 | |
| Kweekbuisjes met luchtstromingsdop | Olympus plastics | 21-129 | |
| 35 mm vierkamer glasbodemschaal | CellVis | NC0600518 | |
| Luria Bertani (LB) bouillon | Genessee Scientific | 11-118 | |
| Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) | Fisher Bioreagents | BP2944100 | |
| Pipettips (p200) | Olympus plastics | 23-150RL | |
| Pipettips (p1000) | Olympus plastics | 23-165RL | |
| Serologische pipetten (5 mL) | Olympus plastics | 12-102 | |
| Serologische pipetten (25 mL) | Olympus plastics | 12-106 | |
| Serologische pipetten (50 mL) | Olympus plastics | 12-107 | |
| Ultrapuur water (RNase/DNase vrij); nanopuur water | Genessee Scientific | 18-194 | Nanopuur water gebruikt voor de bereiding van oplossingen in Tabel 1 |
| Spuiten (10 mL) | BD | 794412 | |
| Spuiten (50 mL) | BD | 309653 | |
| 0,22 mm PES-spuitenfilter | Olympus plastics | 25-244 | |
| PS cuvet semi-mico | Olympus plastics | 91-408 | |
| Software | |||
| Biorender | Om de figuren voor te bereiden | ||
| FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| Imaris | Bitplane | versie 9.6 | |
| Zen Black | |||
| Apparatuur | |||
| FacsAriallu | Becton Dickinson, San Jose |
Referenties
- Ramsay, K. A., et al. The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).
- Bessonova, L., et al. Data....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
