ניתן להשתמש במדיום כיח סיסטיק פיברוזיס סינתטי (SCFM2) בשילוב עם מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות כדי לצפות באגרגטים חיידקיים ברזולוציה גבוהה. מאמר זה מפרט שיטות להערכת אוכלוסיות מצטברות במהלך טיפול מיקרוביאלי כפלטפורמה למחקרים עתידיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כלים להערכה בזמן אמת של מודל זיהום פסאודומונס ארוגינוזה
במאמר זה
סיכום
תקציר
פסאודומונס ארוגינוזה (Pa) הוא אחד הפתוגנים האופורטוניסטיים הנפוצים ביותר הקשורים סיסטיק פיברוזיס (CF). ברגע שהקולוניזציה של הרשות הפלסטינית נקבעת, חלק גדול מהחיידקים הנגועים יוצרים ביופילמים בתוך כיח דרכי הנשימה. Pa biofilms מבודד כיח CF הוכח לגדול אגרגטים קטנים, צפופים של ~ 10-1,000 תאים כי הם מאורגנים מרחבית ולהציג פנוטיפים רלוונטיים קלינית כגון סובלנות מיקרוביאלית. אחד האתגרים הגדולים ביותר בחקר האופן שבו אגרגטים של הרשות הפלסטינית מגיבים לסביבת הכיח המשתנה הוא היעדר מערכות רלוונטיות וחזקות מבחינה תזונתית המקדמות היווצרות מצטברת. באמצעות מדיום כיח CF סינתטי (SCFM2), ניתן לראות את היסטוריית החיים של אגרגטים Pa באמצעות מיקרוסקופיה סריקת לייזר confocal (CLSM) וניתוח תמונה ברזולוציה של תא אחד. מערכת במבחנה זו מאפשרת התבוננות באלפי אגרגטים בגדלים משתנים בזמן אמת, בשלושה ממדים ובקנה מידה מיקרון. ברמות הפרט והאוכלוסייה, היכולת לקבץ אגרגטים לפי פנוטיפ ומיקום מאפשרת תצפית של אגרגטים בשלבים התפתחותיים שונים ותגובתם לשינויים במיקרו-סביבה, כגון טיפול אנטיביוטי, יובדלו בדיוק.
מבוא
פסאודומונס ארוגינוזה (Pa) הוא פתוגן אופורטוניסטי המבסס זיהומים כרוניים אצל אנשים שנפגעו ממערכת החיסון. עבור אלה עם המחלה הגנטית סיסטיק פיברוזיס (CF), זיהומים אלה יכולים להתפרש במהלך החיים. CF גורם להצטברות של כיח צמיג, עשיר בחומרים מזינים בדרכי הנשימה, אשר הופך קולוניאלי על ידי מגוון רחב של פתוגנים מיקרוביאליים לאורך זמן. Pa הוא אחד הפתוגנים הנפוצים ביותר CF, ליישב את דרכי הנשימה בגיל הרך ולהקים זיהומים קשים לטיפול1. הרשות הפלסטינית נותרהבעיהקלינית משמעותית ונחשבת לסיבה מובילה לתמותה אצל בעלי CF, למרות משטרי טיפול משופרים בשנים האחרונות 2,3. פנוטיפ התמדה זה וס....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכן סיסטיק פיברוזיס סינטטי בינוני (SCFM2)
הערה: הכנת SCFM2 כוללת שלושה שלבים עיקריים המפורטים להלן (איור 2). לפרטים מלאים והאזכורים, ראה9,10,12.
איור 2: הכנה וחיסון של SCFM2 בינוני. (A)בסיס חוצץ מוכן באמצעות מלחים וחומצות אמינו המפורטים בטבלה 1 ושולחן ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עבודה זו מפרטת שיטות להתבונן אגרגטים Pa ברזולוציה גבוהה ובסביבה דומה לזו של זיהום כרוני של CFריאה 9,10,12. SCFM2 מספק מערכת במבחנה המקדמת צבירה טבעית של תאי Pa בגדלים דומים לאלה שנצפו במהלך זיהום בפועל10. ניתן למנף את יכולת ההסתגלות של SCFM2 כאמצעי מוגדר כדי להתקרב לאפיקי מחקר רבים. מטרת עבודה זו היא להדגיש זרימת עבודה הכוללת שילוב של מיקרוסקופיה ו- FACS, מתוך כוונה לעודד את השי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
עבודה זו הציגה מתודולוגיות שניתן לשלב כדי לחקור אוכלוסיות צבירה חיידקיות בנוכחות ובהיעדר טיפול אנטיביוטי. CLSM ברזולוציה גבוהה מאפשר הדמיה של שינויים ביומסה מצטברת ואת הכיוון המבני של אגרגטים על פני זמן אמת כאשר נחשף לאנטיביוטיקה. בנוסף, ניתן לכמת תכונות פיזיות ומבניות של הביומסה שנותרו לאחר הטיפול באנטיביוטיקה, במטרה לתאם תצפיות אלה עם מחקרי ביטוי גנים עתידיים המשתמשים ב- RNA-seq. בעוד שהשימוש בתאים המביעים GFP מאפשר הדמיה של ההתנהגות הקולקטיבית והאינדיבידואלית של תאים עמידים לאנטיביוטיקה, הוא מספק רק חלק מהתמונה הכוללת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים.
תודות
S.E.D נתמך על ידי קרנות סטארט-אפ המסופקות על ידי המחלקה לרפואה מולקולרית, אוניברסיטת דרום פלורידה, כמו גם מענק מחקר CFF (DARCH19G0) N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, חן)) ומכון USF על מיקרוביום. אנו מודים למעבדת ויטלי על שיתוף הפעולה המתמשך הכולל ערכות נתונים הקשורות לכתב יד זה. אנו מודים לד"ר צ'ארלס סקרס על שטיפל במיון של FACS. דמויות נוצרו על ידי A.D.G וS.E.D. באמצעות Biorender.com.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חומצות | |||
| Alanine | Acros Organics | 56-41-7 | |
| Arginine HCl | MP | 1119-34-2 | |
| Asparagine | Acros Organics | 56-84-8 | מוכן ב-0.5 M NaOH |
| Cystine HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
| חומצה גלוטמית HCl | Acros Organics | 138-15-8 | |
| Glycine | Acros Organics | 56-40-6 | |
| Histidine HCl H2O | Alfa | Aesar A17627 | |
| Isoleucine | Acros Organics | 73-32-5 | |
| Leucine | Alfa Aesar | A12311 | |
| Lysine HCl | Alfa Aesar | J62099 | |
| Methionine | Acros Organics | 63-68-3 | |
| אורניתין הידרוכלוריד | אלפא Aesar | A12111 | |
| פנילאלנין | אקרוס אורגניקס | 63-91-2 | |
| פרולין | אלפא Aesar | A10199 | |
| סרין | אלפא Aesar | A11179 | |
| תראונין | אקרוס אורגניקס | 72-19-5 | |
| טריפטופן | אקרוס אורגניקס | 73-22-3 | מוכן ב 0.2 מ ' NaOH |
| טירוזין | אלפא | Aesar A11141 | מוכן ב-1.0 מ' NaOH |
| Valine Acros Organics | 72-18-4 | ||
| אנטיביוטיקה | |||
| קרבניצילין | אלפא Aesar | J6194903 | |
| יום המלאי | |||
| CaCl2 * 2H2 | O Fisher Chemical | C79-500 | |
| דקסטרוז (D-גלוקוז) | פישר כימיקל | 50-99-7 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | פישר (אוונטי ליפידים קוטביים) | 4235-95-4 | שייק 15-20 דקות ב-37 מעלות; C לאידוי כלורופורם |
| FeSO4 * 7H2 | O Acros Organics | 7782-63-0 | מלאי זה שווה ל-1 מ"ג/מ"ל, חייב להכין |
| חומצה L-לקטית | Alfa Aesar | L13242 | מלאי pH ל-7 עם NaOH |
| MgCl2 * 6H2O | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| N-acetylglucosamine | TCI | A0092 | |
| מוצקים | |||
| מוצין חזיר | Sigma | M1778-100G | עיקור UV |
| זרע סלמון DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
| כתם | |||
| פרופידיום יודיד | אלפא Aesar | J66764MC | |
| מלחים | |||
| K2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
| KCl | Alfa Aesar | J64189 | הוסף מוצק ישירות לבסיס חוצץ |
| KNO3 | Acros Organics | 7757-79-1 | |
| MOPS | Alfa Aesar | A12914 | הוסף מוצק ישירות לבסיס חוצץ |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | הוסף מוצק ישירות לבסיס חוצץ |
| Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
| NH4Cl | Acros Organics | 12125-02-9 | מוסיפים מוצק ישירות לחומרים |
| מתכלים בסיסיים מאוחסניםצינורות חרוטיים (15 מ"ל) | פלסטיק אולימפוס | 28-101 | |
| צינורות חרוטיים (50 מ"ל) | פלסטיק אולימפוס | 28-106 | |
| צינורות תרבית עם מכסה זרימת אוויר | פלסטיק אולימפוס | 21-129 | |
| 35 מ"מ צלחת תחתית זכוכית עם ארבעה תאים | CellVis | NC0600518 | |
| Luria Bertani (LB) מרק | Genessee Scientific | 11-118 | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) | פישר ביוריאגנטים | BP2944100 | |
| קצות פיפט (p200) | פלסטיק אולימפוס | 23-150RL | |
| קצות פיפט (p1000) | פלסטיק אולימפוס | 23-165RL | |
| צנרת סרולוגית (5 מ"ל) | פלסטיק אולימפוס | 12-102 | |
| פיפט סרולוגי (25 מ"ל) | פלסטיק אולימפוס | 12-106 | |
| צינורות סרולוגיים (50 מ"ל) | פלסטיק אולימפוס | 12-107 | |
| מים טהורים במיוחד (ללא RNase/DNase); מים ננו-טהורים | Genessee Scientific | 18-194 | מים ננו-טהורים המשמשים להכנת תמיסות בטבלה 1 |
| מזרקים (10 מ"ל) | מזרקי BD | 794412 | |
| (50 מ"ל) | BD | 309653 | |
| 0.22 מ"מ מסנן מזרק PES | אולימפוס | 25-244 | |
| PS cuvette semi-mico | Olympus plastics | 91-408 | |
| Software | |||
| Biorender | להכנת הדמויות | ||
| FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| Imaris | Bitplane | גרסה 9.6 | |
| Zen Black | |||
| ציוד | |||
| FacsAriallu | Becton Dickinson, סן חוזה, קליפורניה | ||
| LSM 880 מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי | Zeiss |
מקורות
- Ramsay, K. A., et al. The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).
- Bessonova, L., et al. Data....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
