Summary
ניתן להשתמש במדיום כיח סיסטיק פיברוזיס סינתטי (SCFM2) בשילוב עם מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות כדי לצפות באגרגטים חיידקיים ברזולוציה גבוהה. מאמר זה מפרט שיטות להערכת אוכלוסיות מצטברות במהלך טיפול מיקרוביאלי כפלטפורמה למחקרים עתידיים.
Abstract
פסאודומונס ארוגינוזה (Pa) הוא אחד הפתוגנים האופורטוניסטיים הנפוצים ביותר הקשורים סיסטיק פיברוזיס (CF). ברגע שהקולוניזציה של הרשות הפלסטינית נקבעת, חלק גדול מהחיידקים הנגועים יוצרים ביופילמים בתוך כיח דרכי הנשימה. Pa biofilms מבודד כיח CF הוכח לגדול אגרגטים קטנים, צפופים של ~ 10-1,000 תאים כי הם מאורגנים מרחבית ולהציג פנוטיפים רלוונטיים קלינית כגון סובלנות מיקרוביאלית. אחד האתגרים הגדולים ביותר בחקר האופן שבו אגרגטים של הרשות הפלסטינית מגיבים לסביבת הכיח המשתנה הוא היעדר מערכות רלוונטיות וחזקות מבחינה תזונתית המקדמות היווצרות מצטברת. באמצעות מדיום כיח CF סינתטי (SCFM2), ניתן לראות את היסטוריית החיים של אגרגטים Pa באמצעות מיקרוסקופיה סריקת לייזר confocal (CLSM) וניתוח תמונה ברזולוציה של תא אחד. מערכת במבחנה זו מאפשרת התבוננות באלפי אגרגטים בגדלים משתנים בזמן אמת, בשלושה ממדים ובקנה מידה מיקרון. ברמות הפרט והאוכלוסייה, היכולת לקבץ אגרגטים לפי פנוטיפ ומיקום מאפשרת תצפית של אגרגטים בשלבים התפתחותיים שונים ותגובתם לשינויים במיקרו-סביבה, כגון טיפול אנטיביוטי, יובדלו בדיוק.
Introduction
פסאודומונס ארוגינוזה (Pa) הוא פתוגן אופורטוניסטי המבסס זיהומים כרוניים אצל אנשים שנפגעו ממערכת החיסון. עבור אלה עם המחלה הגנטית סיסטיק פיברוזיס (CF), זיהומים אלה יכולים להתפרש במהלך החיים. CF גורם להצטברות של כיח צמיג, עשיר בחומרים מזינים בדרכי הנשימה, אשר הופך קולוניאלי על ידי מגוון רחב של פתוגנים מיקרוביאליים לאורך זמן. Pa הוא אחד הפתוגנים הנפוצים ביותר CF, ליישב את דרכי הנשימה בגיל הרך ולהקים זיהומים קשים לטיפול1. הרשות הפלסטינית נותרהבעיהקלינית משמעותית ונחשבת לסיבה מובילה לתמותה אצל בעלי CF, למרות משטרי טיפול משופרים בשנים האחרונות 2,3. פנוטיפ התמדה זה וסובלנות אנטיביוטית גוברת זיכו את אבא במקום בקבוצת פתוגנים שזוהו הן על ידי המרכז לבקרת מחלות (CDC) והן על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO) כסדרי עדיפויות מחקריים לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות - פתוגנים ESKAPE4.
כמו פתוגנים אחרים ESKAPE, עמידות לאנטיביוטיקה נרכשת נפוצה ברשות הפלסטינית, אבל יש גם תכונות מהותיות רבות התורמות Pa סובלנות מיקרוביאלית. בין אלה היא היכולת של הרשות הפלסטינית ליצור אשכולות צפופים מאוד של ~ 10-1,000 תאים, אשר ניתן לראות בזיהומים מרובים, כולל כיח חולה CF5,6. בדומה ל-Pa שנחקרה במערכות ביופילם אחרות, אגרגטים של הרשות מציגים פנוטיפים רלוונטיים קלינית כגון עמידות מוגברת לאנטיביוטיקה והפעלה של תקשורת תאית (חישת מניין (QS)). לדוגמה, אגרגטים של Pa הוכחו להשתמש בהתנהגויות מוסדר QS כדי להילחם חיידקים אחרים, כמו גם לסבול טיפולים מיקרוביאלית כגון הייצור של פיוצינין7. היכולת לחקור התנהגויות כאלה מציעה תובנה מרגשת על מערכות אקולוגיות חיידקיות בסביבה דומה לזו שבה הן קיימות בגוף האדם.
אחד האתגרים הגדולים ביותר בחקר האופן שבו אגרגטים של הרשות הפלסטינית מגיבים לסביבת הכיח המשתנה הוא היעדר מערכות רלוונטיות וחזקות מבחינה תזונתית המקדמות היווצרות מצטברת. הרבה ממה שידוע על אבא התגלה באמצעות מערכות במבחנה שבהן תאים גדלים פלנקטונית או בארכיטקטורה אופיינית המחוברת לפני השטח, "פטריות" שלא נצפתה ב- vivo8. בעוד שמודלים קלאסיים לצמיחה של ביופילם, כגון תאי זרימה או אגר מוצק, הניבו ידע נרחב ויקר ערך על התנהגויות חיידקים ומנגנונים של סובלנות אנטיביוטית, ממצאים אלה לא תמיד מתורגמים ב- vivo. מודלים במבחנה רבים יש יכולת מוגבלת לחקות את סביבת הצמיחה של אתר הזיהום האנושי, המחייב יקר במחקרים vivo. בתורו, דגמים רבים ב- vivo חסרים את הגמישות והרזולוציה המוענקות על ידי טכניקות במבחנה.
כיח סיסטיק פיברוזיס סינתטי (SCFM2) נועד לספק סביבה לצמיחת Pa דומה לזו שחוו במהלך זיהום כרוני בריאת CF. SCFM2 כולל מקורות תזונתיים שזוהו CF סייחה צפויה בנוסף mucin, שומנים, ו- DNA. צמיחת הרשות הפלסטינית ב- SCFM2 דורשת גן כמעט זהה לזה הנדרש לצמיחה בליחה בפועל ותומכת במבנה טבעי של הרשות הפלסטינית 9,10. לאחר החיסון, תאים פלנקטוניים יוצרים אגרגטים הגדלים בגודלם באמצעות התרחבות. תאים בודדים (המכונים מהגרים) משתחררים מצבירה, נודדים לאזורים לא נוסעים ויוצרים אגרגטים חדשים10. ניתן לצפות בהיסטוריית חיים זו באמצעות CLSM וניתוח תמונה ברזולוציה של תא בודד. אגרגטים של Pa שנוצר ב- SCFM2 הם בגדלים דומים לאלה שנצפו בריאת CF10. מודל זה מאפשר תצפית של אגרגטים מרובים בגודל משתנה בזמן אמת ובשלושה ממדים בקנה המידה המיקרוני. מיקרוסקופיה של זמן-לשגות מאפשרת מעקב אחר אלפי אגרגטים (כ-50,000) בניסוי אחד. השימוש בתוכנת ניתוח תמונה מאפשר כימות של פנוטיפים מצטברים ממיקרוגרפים, כולל נפח מצטבר, שטח פנים ומיקום בשלושה ממדים ל- 0.1 מיקרומטר הקרוב ביותר, הן במצטבר האישי והן ברמת האוכלוסייה. לאחר היכולת לקבץ אגרגטים לפי פנוטיפ ומיקום מאפשרת הבחנה של אגרגטים בשלבים התפתחותיים שונים עם דיוק, כמו גם את תגובתם microenvironment משתנה6,11.
היישום של SCFM2 ללמוד אגרגטים Pa בנפח נמוך ובוחות תפוקה גבוהה להפוך אותו מודל גמיש, חסכוני. כמדיום מוגדר, SCFM2 מציע אחידות ושחזור על פני פלטפורמות מרובות, מתן שיטה רלוונטית מבחינה תזונתית ופיזית ללמוד אגרגטים Pa במבחנה9. היישומים כוללים את השימוש בו בשילוב עם CLSM כדי לבחון ארגון מרחבי וסובלנות אנטיביוטית ברזולוציה גבוהה (כמתואר בנייר שיטות זה). היכולת לבצע ניסויים המספקים נתונים בקנה מידה מיקרוני בזמן אמת מאפשרת לחקור אינטראקציות בין מינים ובין מינים כפי שהם עשויים להתרחש ב vivo. לדוגמה, SCFM2 שימש בעבר כדי ללמוד את הדינמיקה המרחבית של תקשורת תא-תאים באוכלוסיות צבירה באמצעות רשת של מערכות המשמשות את הרשות הפלסטינית כדי לווסת גנים מרובים התורמים virulence ופתוגנזה6.
איור 1: תיאור גרפי של השלבים הניסיוניים העיקריים. (A)SCFM2 מחוסן בתאי Pa ומותר ליצור אגרגטים בצלחת תרבות עם תחתית זכוכית. (B)אגרגטים מועברים למיקרוסקופ הקונפוקלי, ומתווסף אנטיביוטיקה. מתוארים שלושה העתקים טכניים (תאים 1-3) ובאר שליטה (4) של SCFM2 מחוסן ללא טיפול אנטיביוטי. אגרגטים מצולם באמצעות CLSM במהלך 18 שעות. (C) לאחר ההדמיה הראשונית של 18 שעות, אגרגטים מטופלים עם פרופיל יודיד כדי לדמיין תאים מתים ותמונה באמצעות CLSM (D)אגרגטים עם פנוטיפ הרצוי מופרדים SCFM2 באמצעות FACS. קיצורים: SCFM2 = סיסטיק פיברוזיס סינתטי כיח בינוני; Pa = פסאודומונס ארוגינוזה; CLSM = מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית; FACS = מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
כאן, השירות של SCFM2 כדי לחקור את ההשפעה של טיפול אנטיביוטי על אגרגטים Pa בזמן אמת מוכח, ואחריו שימוש בגישה של מיון תאים כדי לבודד אוכלוסיות של אגרגטים עם פנוטיפים ברורים לניתוח במורד הזרם (איור 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכן סיסטיק פיברוזיס סינטטי בינוני (SCFM2)
הערה: הכנת SCFM2 כוללת שלושה שלבים עיקריים המפורטים להלן (איור 2). לפרטים מלאים והאזכורים, ראה9,10,12.
איור 2: הכנה וחיסון של SCFM2 בינוני. (A)בסיס חוצץ מוכן באמצעות מלחים וחומצות אמינו המפורטים בטבלה 1 ושולחן 2. בסיס חוצץ יכול להיות מאוחסן ב 4 °C (5 °F) עד 30 ימים, אבל חייב להיות מוגן מפני חשיפה לאור. (B)Mucin ו- DNA מתווספים ל- aliquot של בסיס חוצץ ומומסים לפתרון בן לילה ב 4 °C. (C)שומנים ומלאי נוסף מתווספים לפתרון הלילה ודגרו ב 37 °C עם תסיסה ב 250 סל"ד במשך 20 דקות. SFCM2 מחוסן לאחר מכן עם תאים שטופים, שלב יומן ב OD600 = 0.05. קיצורים: SCFM2 = סיסטיק פיברוזיס סיחום בינוני סינתטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- עיקור של מוצין חזירי
- הכן מוצין סטרילי בריכוז סופי של 5 מ"ג /מ"ל ב- SCFM2. לדוגמה, עבור נפח 5 מ"ל של SCFM2, לשקול 25 מ"ג של mucin סוג II בצלחת פטרי סטרילית, ולהניח לתוך עיקור אולטרה סגול (UV) במשך 4 שעות, בעדינות נסער כל שעה.
- לאחר 4 שעות, להעביר את mucin שטופלו UV לתוך autoclaved 1.7 mL צינורות בתנאים סטריליים, ולאחסן ב -20 °C (50 °F).
- כדי לאשר עיקור מלא, להמיס מדגם של mucin בנוזל סטרילי, כגון מים או לוריא ברטאני (LB) מרק, ולהתבונן תחת מיקרוסקופ.
הערה: mucin מעוקר ניתן לאחסן ב -20 °C (70 °F) עד 6 חודשים.
- הכנת בסיס במאגר
- הכן מלח וחומצות אמינו פתרונות מלאי על ידי הוספת הכמויות המתאימות לפי משקל למים deionized כמפורט בטבלה 1. מסנן לעקר את כל פתרונות המלאי באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר, לעטוף בנייר כסף כדי להגן מפני השפלת אור, ולאחסן ב 4 °C (70 °F) עד חודש אחד.
- הכן בסיס חוצץ על ידי שילוב של 190 מ"ל של מים דהיוניים עם חומצות אמינו ופתרונות מלאי מלח לפי נפחים המפורטים בטבלה 1. התאם את הפתרון ל- pH 6.8 והגדל לנפח סופי של 250 מ"ל. מסנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר, ולאחסן ב 4 °C (50 °F) עד 30 ימים.
- בערב שלפני הניסוי, aliquot את הכמות הרצויה של בסיס חוצץ לתוך בקבוקון תרבות זכוכית, ולהוסיף mucin (5 מ"ג / מ"ל כמתואר בשלב 1.1.1) ו DNA זרע סלמון מטוהר (0.6 מ"ג / מ"ל). להתסיס בעדינות, לעטוף בנייר כסף, ולהשאיר ב 4 °C (4 °F) לילה כדי לאפשר mucin ו- DNA להתמוסס לתוך פתרון.
הערה: עליקוטים DNA זרע סלמון צריך להיות מופשר על קרח, מערבולת, והוסיף לבסיס חוצץ mucin. פתרונות מלאי טריפטופן, אספרגין וטיורוסין חייבים להיות מוכנים בפתרונות של NaOH (ראה טבלה 1 לריכוזים) במקום מים דה-יוניים. שמור על בסיס חוצץ ואת כל פתרונות המלאי עטופים בנייר כסף כדי להגן מפני חשיפה לאור. רוב המניות יהיו יציבות עד חודש. אין להשתמש במניות שהופכות דהויות ויש להחליףן לפני השימוש.
- תוספת מניות משלימות
- ביום הניסוי, הוסף את המניות הרשומות בטבלה 2 לבסיס המאגר המכיל מוצין ודנ"א.
הערה: הכן פתרון FeSO4 טרי ביום הניסוי, אך כל שאר המניות יכולות להתבצע מראש ומאוחסנות למשך 30 יום ב-4 °C .1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) מכיל כלורופורם. יש לטפל בזהירות, ואין להשתמש ליד להבות פתוחות. לאחר התוספת של DOPC, דגירה SCFM2 ב 37 °C (37 °F) עם רועד (250 סל"ד) לפחות 20 דקות (עבור תרבות 5 מ"ל). תקופת דגירה זו מאפשרת לכלורופורם ב- DOPC להתאדות. הבקבוקון לא צריך להיות אטום; במקום זאת, לכסות את הבקבוק נפתח באופן רופף עם נייר כסף.
- ביום הניסוי, הוסף את המניות הרשומות בטבלה 2 לבסיס המאגר המכיל מוצין ודנ"א.
2. הערכה בזמן אמת של סובלנות מיקרוביאלית במצרפים חיידקיים
- הכנת תרבויות לילה
- בערב שלפני הניסוי, לחסן 5 מ"ל של מרק LB עם כמה מושבות של Pa PAO1-pMRP9-113 מצלחת אגר LB המכילה אנטיביוטיקה (קרבניצילין 300 מיקרוגרם / מ"ל). לגדול לילה ב 37 °C (55 °F) עם עצבנות ב 250 סל"ד.
הערה: לגדול תרביות לילה עם תוספת של אנטיביוטיקה הנדרשת לבחירת plasmids הנדרש (כאן, חלבון פלורסנט ירוק (GFP) ביטוי plasmid, pMRP9-1). שים לב שיש לשטוף תאי Pa לפני פיקוח SCFM2. LB עשוי להיות מוחלף מדיה מעבדה עשירה אחרת עבור תרבויות לילה. כל בידוד חיידקים צריך להיות מטופל באמצעות הנחיות BSL-2 מתאימות לאורך פרוטוקול זה.
- בערב שלפני הניסוי, לחסן 5 מ"ל של מרק LB עם כמה מושבות של Pa PAO1-pMRP9-113 מצלחת אגר LB המכילה אנטיביוטיקה (קרבניצילין 300 מיקרוגרם / מ"ל). לגדול לילה ב 37 °C (55 °F) עם עצבנות ב 250 סל"ד.
- SCFM2 לחסן
- ביום הניסוי, לדלל בחזרה תרבויות לילה של Pa 1:10 (תרבות: מדיה נוזלית) על ידי חנק 500 μL לתוך 5 מ"ל של מרק LB טרי. לגדל תאים עד שלב יומן (60-90 דקות) ב 37 °C עם תסיסה ב 250 סל"ד.
- תרבויות שלב יומן צנטריפוגות ב 10,000 × גרם במשך 5 דקות. לשטוף את התאים על ידי הסרת supernatant ו resuspending ב 3 מ"ל של תמיסת מלח פוספט מעוקרת מסנן (PBS, pH 7.0). חזור פעמיים, ו resuspend הכדור בנפח הסופי של 1 מ"ל של PBS.
- למדוד את הספיגה של התאים שטף באמצעות ספקטרופוטומטר ב 600 ננומטר (OD600), ולחשב את נפח התרבות הנדרש עבור OD600 מתחיל של 0.05 ב 5 מ"ל של SCFM2. לחסן את Pa לתוך SCFM2, ומערבולת בעדינות כדי להפיץ תאים ברחבי. Pipette 1 מ"ל של SCFM2 מחוסן לתוך כל תא של 4-טוב, תחתית זכוכית, צלחת אופטית, ודגרה עבור 4 שעות סטטי ב 37 °C (50 °F).
הערה: זמן ההכפלה של תרביות הרשות הפלסטינית תלוי במתח ובזמינות החמצן. ב- SCFM2, בתנאים המתוארים כאן, זמן ההכפלה של הרשות הפלסטינית הוא ~ 1.4 שעות10.
3. הדמיית אגרגטים במהלך טיפול אנטיביוטי עם מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית (CLSM)
הערה: סעיף זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלית ותוכנת לכידת תמונה להדמיה של אגרגטים Pa ב- SCFM2. המטרה היא להתבונן ולאפיין את הביומסה החיידקית הנותרת (סובלנית) לאחר הטיפול באנטיביוטיקה. השלבים המתוארים יכולים להתבצע בהצלחה במיקרוסקופים קונפוקליים אחרים, אם כי יש להפנות את מדריך ההפעלה של המכשיר לקבלת הדרכה ספציפית.
- תמונה Pa תרביות באמצעות תא מחומם או מיקרו-לוח מחומם מצויד על בימת המיקרוסקופ כדי לשמור על טמפרטורת הסביבה של 37 °C (50 °F). התחל את מודול הדגירה לפחות 2 שעות לפני תחילת הניסוי כדי לאפשר לכל המנגנונים להגיע לטמפרטורה הרצויה, ולהפחית התרחבות ותנועה נוספות במהלך איסוף הנתונים.
- לאחר 4 שעות, העבר תרביות SCFM2 המכילות תאי Pa לשלב המיקרוסקופ המחומם. ייעדו 3 מתוך 4 בארות כשכפולים טכניים לטיפול אנטיביוטי, וחשבו את ה-4 גם כבקרה ללא טיפול, המכילה רק תאי Pa ב-SCFM2, ללא אנטיביוטיקה. זהה אגרגטים באמצעות מיקרוסקופיה של Brightfield בתוך הכרטיסיה איתור לפני כל עירור של כתבים פלואורסצנטיים. הגדר אזור להדמיה בתוך כל באר, ואחסן את מיקומו (קואורדינטות x-y-z) באמצעות מודול מיקומים בתוכנת ההדמיה.
- השתמש במטרה טבילת שמן 63x לדמיין תרבויות Pa המכילות את ביטוי GFP pMRP9-1 ב- SCFM2 עם אורך גל עירור של 488 ננומטר ואורך גל פליטה של 509 ננומטר. צצו תמונות באמצעות האפשרות z-stack בתוך מודול הרכישה במרווחי זמן של 1 מיקרומטר (סה"כ 60 פרוסות). השתמש במודול ממוצע קו כדי להפחית פלואורסצנטיות ברקע בערוץ GFP בתוך הנפח הכולל של תמונות 60 מיקרומטר z-stack (1,093.5 מ"מ3). קח תמונות שליטה של SCFM2 לא מנוקול באמצעות הגדרות זהות כדי לקבוע את פלואורסצנטיות הרקע לניתוח תמונה.
הערה: תמונות נרכשות על-ידי הפקת 512 פיקסלים x 512 פיקסלים (0.26 מיקרומטר x 0.26 מיקרומטר פיקסלים) תמונות z-stack של 8 סיביות שנמצאות במרחק של 60 מיקרומטר מבסיס כיסוי הכיסוי. - השתמש באפשרות סידרת זמן בתוכנת ההדמיה כדי ללכוד 60 פרוסות בכל מיקום (טוב) במרווחי זמן של 15 דקות על פני תקופה של 18 שעות. השתמש באסטרטגיית המיקוד המובהק בתוך התוכנה כדי לאחסן מישור מוקד לכל עמדה, שאליה מוחזר בכל נקודת זמן לאורך הניסוי.
- לאחר סך של 4.5 שעות של דגירה, תמונה כל מיקום באמצעות ההגדרות לעיל כדי לקבוע את הביומסה המצרפית בתוך כל אחת מארבע הבארות לפני תוספת של אנטיביוטיקה.
- לאחר 6 שעות של דגירה כוללת, להוסיף אנטיביוטיקה ב 2x מתחת לריכוז מעכבי מינימלי (MIC) לכל לשכפל. פיפטה ישירות ובעדינות לאמצע הבאר, ממש מתחת לאינטרפאזה נוזלית האוויר. שמרו על כל התרבויות בחדר הקונפוקלי המחומם.
הערה: כאן, קוליסטין גופרתי בריכוז של 140 מיקרוגרם / מ"ל שימש. - התחל הדמיה טיפול לאחר אנטיביוטיקה על ידי לחיצה על האפשרות התחל ניסוי בתוך תוכנית ההדמיה.
הערה: ריכוז אנטיביוטיקה בשימוש תלוי באנטיביוטיקה, הרשות הפלסטינית לבודד, והאם המשתמש רוצה לבחון הרג או סובלנות אפקטים. ניסוי זה משתמש במנה אחת. ניתן להוסיף מינונים נוספים מבלי לשבש תרבויות במידת הצורך.
4. הכתמת יודיד פרופידיום של אגרגטים של הרשות הפלסטינית
הערה: פרופיליום יודיד (PI) משמש בדרך כלל כמו ריאגנט מכתים לזהות תאים חיידקיים שאינם קיימא (מת) בתרבית. כאן, הוא משמש לזיהוי אגרגטים רגישים לטיפול אנטיביוטי החל בסעיף 3. לאורך פרוטוקול זה, הביטוי והזיהוי של GFP בתאי Pa משמש כ- Proxy העיקרי עבור הכדאיות של התא. שלב סופי זה מאפשר שימוש נוסף בהדמיה קונפוקלית כדי לזהות את המיקום המרחבי של אגרגטים חיים/מתים ביחס זה לזה. בנוסף, אגרגטים מזוהים כחי/מתים למיון תאים במורד הזרם בסעיף 5.
- לאחר 18 שעות, הוסף PI לכל באר של צלחת תחתונה אופטית ארבעה תאים המכיל תרביות SCFM2. בצע את הוראות היצרן עבור נפח PI וזמן הדגירה (למשל., ~ 2 μL לכל mL של תרבות, ~ 20-30 דקות).
5. בידוד תאים חיים מצברים באמצעות גישת FACS
הערה: FACS מציג פלטפורמה רבת עוצמה כדי למיין ולבודד קבוצות של תאים על פי פנוטיפ מתויג פלואורסצנטית. כאן, FACS משמש כדי לבודד אגרגטים חיים (עמידים לאנטיביוטיקה) מן אגרגטים שאינם קיימא.
- לאחר הכתמה עם יוד propidium, להסיר את התרבויות מדגירה, ולהעביר למכשיר FACS במיכל מבודד כדי לשמור על 37 °C (50 °F).
- הפעל 1 mL aliquots של SCFM2 המכיל אגרגטים Pa בקצב הזרימה הנמוך ביותר.
הערה: כל aliquot יכיל ~ 15,000 אגרגטים. - כדי לזהות GFP, להאיר את התאים עם לייזר 488 ננומטר, ולתעד את גובה האות פלואורסצנטי ב 530/30 ננומטר. דמיינו את הכתמת PI על ידי עירור בלייזר 561 ננומטר, ותעדו את גובה האות הפלואורסצנטי ב- 610/20 ננומטר. בצע מיון באמצעות זרבובית 70 u.
הערה: ניתן לאגד אגרגטים ממוינים במספר דרכים בהתאם ליישום המשתמש. במקרה זה, FACS שימש למיון אגרגטים של Pa בר קיימא עבור ריצוף RNA במורד הזרם. יישומים חלופיים נדונים להלן.
6. ניתוח תמונה
הערה: מיקרוסקופיה של זמן-לשגות יוצרת כמויות גדולות של נתונים. ניסוי של 18 שעות לתצפית על אגרגטים של Pa ב- SCFM2 מזהה כ - 50,000 אגרגטים לאורך זמן, אשר יש להם פוטנציאל להיות מאופיין עבור נפח ומיצוב מרחבי. השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי לכמת דינמיקה מצטברת ב- SCFM2:
- עבור מחקרים מצטברים ב- SCFM2, לכמת את הפלואורסצנטיות של GFP ברקע על ידי יצירת היסטוגרמה של ספירות בערוץ GFP המיוצר עבור SCFM2 ו- SCFM2 לא מחוסנים עם זן Pa PAO1 הנושא pMRP9-1. כדי להבטיח ש-voxels GFP שזוהו מתואמים לביומסה של Pa, הגדר ווקסל GFP+ כערך ספירת רקע של GFP ≥1.5x.
הערה: פלואורסצנטיות הרקע מוגדרת כערך הווקסל הגבוה ביותר של שלוש עמדות שנבחרו באקראי, בממוצע. ספירת הרקעים, כמדד סטנדרטי, מופחתת מכל הפיקסלים בתמונות ניסיוניות על ידי תוכנת ניתוח התמונות. - לאחר חיסור רקע במודול ה-Surpass, יש לייצר isosurfaces עבור כל ה-voxels הנותרים.
- כדי לזהות צבירים בודדים, הפוך את האפשרות Split Objects לזמינה והגדר צבירה כאובייקטים עם אמצעי אחסון של ≥5 מיקרומטר3. השתמש במודול Vantage בתוכנת ניתוח התמונה כדי לחשב את אמצעי האחסון, x-y-z והסכום של voxels GFP עבור כל אובייקט בודד. יצא נתונים אלה לפלטפורמה סטטיסטית חיצונית.
הערה: כמה תוכנה לניתוח תמונה לאפשר ייצוא של phentoypes כמותי מרובים בבת אחת, המאפשר מתאם להיות מחושב. - מסנן נתונים שיוצאו ממודול Vantage לפי גודל כדי להבטיח שלא יישארו אובייקטים של <0.5 מיקרומטר3 (ביומסה מפוזרת). עבור כל אובייקט בודד בתוך התמונה, חשב את המרחק מעצמו ביחס לאובייקטים אחרים (אגרגטים) באמצעות מודול Vantage של תוכנת ניתוח התמונה או באופן ידני עם המשוואה הבאה.
d = sqrt((x2− x1)2 + (y2− y1)2 + (z2− z1)2) (1) - השתמש בחישובי SUM ו- AVERAGE כדי למצוא את הביומסה הכוללת ואת נפח הצבירה הממוצע. לחלופין, לייצא נתונים לפלטפורמות סטטיסטיות אחרות או סקריפטים אחרים, למשל. . התפלגות של אגרגטים על פני ביומסה כפי שנדון בתוצאות הייצוגיות (סקריפט שלא פורסם בשיתוף עם המעבדה Whiteley, המכון הטכנולוגי של ג'ורג'יה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עבודה זו מפרטת שיטות להתבונן אגרגטים Pa ברזולוציה גבוהה ובסביבה דומה לזו של זיהום כרוני של CFריאה 9,10,12. SCFM2 מספק מערכת במבחנה המקדמת צבירה טבעית של תאי Pa בגדלים דומים לאלה שנצפו במהלך זיהום בפועל10. ניתן למנף את יכולת ההסתגלות של SCFM2 כאמצעי מוגדר כדי להתקרב לאפיקי מחקר רבים. מטרת עבודה זו היא להדגיש זרימת עבודה הכוללת שילוב של מיקרוסקופיה ו- FACS, מתוך כוונה לעודד את השימוש בה למחקר, שיתופי פעולה ויישומים עתידיים.
השימוש ב- CLSM מאפשר הדמיה זמנית ברזולוציה גבוהה שניתן להשתמש בה כדי לחקור את הדינמיקה של פיתוח אוכלוסיות חיידקים. עבודה זו מדגימה מספר דרכים פוטנציאליות שבאמצעותן ניתן לאפיין את אגרגטים של הרשות הפלסטינית לאחר טיפול באנטיביוטיקה. איור 3A מספק מבט רחב על אגרגטים בר קיימא של הרשות הפלסטינית לאחר טיפול אנטיביוטי. ארבע שעות לאחר יישום של אנטיביוטיקה, אגרגטים מרובים נשארים; ניתן להחיל טווחי צבעים כדי לייצג מאפיינים שונים של כל צבירה בודדת. דוגמאות למאפיינים הניתנים לכימות כוללות נפח, שטח, עוצמת ווקסל (לשימוש בכתבים פלואורסצנטיים), ומיקום באחד מצירי x-y-z.
ניתוח תמונה באמצעות תוכנה ייעודית מאפשר תצפית הניתנת להתאמה אישית מלאה של נתונים, זיהוי כל צבירה כאובייקט בודד, שבו ניתן לייצא נתונים כמותיים לניתוח נוסף. איור 3B מספק דוגמה לאופן השימוש בנתונים מיוצאים. כאן, ניתן לחשב את הביומסה הכוללת של אוכלוסיות צבירה לאורך זמן. בנתונים מייצגים אלה, טיפול באנטיביוטיקה מפחית באופן משמעותי ביומסה בהשוואה אגרגטים מטופלים. וידאו S1 משלים הוא ייצוג רב עוצמה של האופן שבו מיקרוסקופיה מסדרת זמן יכולה לשמש כדי לבחון פיזית אגרגטים בתוך נתונים ביומסה אלה לאחר טיפול אנטיביוטי. כל צבירה מקודדת בצבע כדי לייצג את אמצעי האחסון המחושב (μm3), המאפשר תיעוד חזותי של אוכלוסיות צבירה, אשר יכול לשמש גם לניתוח מרחבי נוסף באמצעות יישומים, הן בתוך תוכנת ניתוח התמונה והן משאבים אחרים (לא נדון כאן10,15).
ניסויים שפותחו לזיהוי מנגנונים של עמידות לאנטיביוטיקה במצטבר הרשות הפלסטינית מייצרים כמויות גדולות של נתונים. כל שכפול מייצר נתונים פיזיים של כ-15,000 אגרגטים (כ-60,000 אגרגטים בסך הכל). גישה חדשה לטיפול בנתונים אלה כללה ייצור של מפות חום מצטברות(איור 3C). על ידי חישוב האופן שבו אגרגטים בגדלים שונים תורמים לאוכלוסייה הכללית, ניתן לזהות דפוסים של האופן שבו אגרגטים מגיבים לטיפול אנטיביוטי ביחס לגודלם, צורתם ומיקומה ביחס זה לזה.
איור 3: דוגמאות לניתוח נתונים מצטבר ( A) סקירה כללית של ביומסה מצטברת שנותרה לאחר טיפול אנטיביוטי. Isosurfaces של voxels GFP המתאים כבר מעובדים וקודד צבע על פי נפח (μm3). סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר. (B)ביומסה כוללת (μm3) של אוכלוסיות צבירה Pa לאורך זמן ב- SCFM2. הקו הכחול מייצג אגרגטים לא מטופלים, הקו האדום מייצג אגרגטים שטופלו באנטיביוטיקה, קוליסטין (140 מיקרוגרם/מ"ל). הנתונים המוצגים כוללים 3 שכפולים ביולוגיים (± SEM). (C)מפות חום נפח מצטברות המייצגות את התרומה של אגרגטים בודדים לפי נפח (מיקרומטר3, ציר x) לביומסה הכוללת (μm3, ציר y השני) לאורך זמן (h, ציר y). הנתונים הייצוגיים כוללים אגרגטים של Pa בנוכחות ובהיעדר אנטיביוטיקה (כמו באיור 3B),כאשר 0 h מייצג את הזמן של תוספת אנטיביוטית לאחר צמיחה מצטברת של 6 שעות. הנתונים כוללים שלושה שכפולים ביולוגיים (כ-50,000 אגרגטים בסך הכל). קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; SCFM2 = סיסטיק פיברוזיס סיקטני בינוני; SEM = שגיאה סטנדרטית של הממוצע; Pa = פסאודומונס ארוגינוזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
ניתוח מרחבי בשלב זה כרוך בשימוש בביטוי של GFP על ידי הרשות הפלסטינית כבא כוח קיימא בנוכחות אנטיביוטיקה. התוספת של PI לאחר 18 שעות מאפשרת זיהוי של המיקום של אגרגטים שאינם ברי קיימא ביחס אגרגטים קיימא (איור S1 משלים). מטרת העל של שיטה זו היא לזהות דפוסים מרחביים בין אגרגטים רגישים וסבלניים לאחר הטיפול באנטיביוטיקה. מחקרים עתידיים יכללו נקודות זמן מרובות בנוסף לאי-נקודה הסופית שתוארה לעיל.
השלב הסופי של זרימת העבודה משתמש בגישה מבוססת FACS כדי למיין אגרגטים ב- SCFM2. עבודה זו מדגימה את יכולתו של FACS להפריד תאים ברי קיימא מאוכלוסיית האגרגטים הנותרת (כולל לא-בת קיימא). איור 4 מדגים את השימוש ב-FACS כדי לאגד אגרגטים מעשיים לניסויים נוספים כגון רצף בעל תפוקה גבוהה, למשל., ריצוף RNA (RNA-seq). לאחר טיפול באנטיביוטיקה (איור 4A מייצג נקודת זמן אחת (18 שעות), ניתן להפריד בהצלחה עליקוטים של SCFM2 המכילים אגרגטים של Pa על פי תכונות הפלואורסצנטיות שלהם. כאן, GFP זוהה עבור אגרגטים סובלניים. איור 4B מספק דוגמה לאירוע מיון אחד כזה, שבו תאים המביעים GFP מופרדים מהתרבות הנותרת (אגרגטים שטופלו ב-PI). בנוסף, אגרגטים ניתן לזהות בבירור מ SCFM2, אשר מייצר פרופיל פלואורסצנטי משלו. ליכולת למיין תאים בדרך זו יש יישומים רבים(איור 5).
איור 4: FACS של אגרגטים של הרשות הפלסטינית ב- SCFM2. (A)דיאגרמה של מכשיר FACS המשמש להפרדת אגרגטים של Pa בת קיימא ולא בת קיימא לבין SCFM2. (B)חלקה מייצגת של אגרגטים המופרדים ב- SCFM2 שנוצרה על-ידי תוכנת FACS. שלושה רבעים מצביעים על אגרגטים חיים (GFP), תרבות נותרת המכילה תאים שאינם בני קיימא (RFP משמש כחלופה להכתמת יודיד פרופידיום כאן, שניהם נרגשים על ידי לייזר 488 ננומטר) ובקרת SCFM2. הנתונים מייצגים 1 מתוך 3 שכפולים ביולוגיים המכילים ~ 15,000 אירועים (אגרגטים). קיצורים: FACS = מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות; SCFM2 = סיסטיק פיברוזיס סיקטני בינוני; Pa = פסאודומונס ארוגינוזה; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; RFP = חלבון פלואורסצנטי אדום; PE-טקסס אדום-H = גובה שיא עבור תאים מוכתמים מצומדים אדום phycoerythrin-טקסס; FITC-H = גובה שיא עבור תאים מוכתמים בו בואורסין איזוטיוציאאט.
איור 5: יישומים ניסיוניים פוטנציאליים המשתמשים ב- SCFM2. (A)חשיפה של אגרגטים של הרשות הפלסטינית למינונים אנטיביוטיים חוזרים ונשנים. (B)תרבית משותפת של Pa אגרגטים עם מינים חיידקיים אחרים. (C)ניתן לשלב חשיפה של אגרגטים של Pa לתאי מערכת החיסון המארחים, למשל., PMNs. A, Bו- C עם שיטות הדמיה CLSM וגישת FACS עבור RNA-seq במורד הזרם, פרוטאומיקה או ניתוח מרחבי תלת-ממדי. קיצורים: SCFM2 = סיסטיק פיברוזיס סינתטי כיח בינוני; Pa = פסאודומונס ארוגינוזה; PMNs = לויקוציטים פולימורפונוקלאריים; CLSM = מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית; FACS = מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות; RNA-seq = רצף RNA; תלת-ממד = תלת מימדי; LC-MS/MS = כרומטוגרפיה נוזלית/ספקטרומטריית מסה דו-מושבית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| כימי | ריכוז מלאי (ז) | ריכוז סופי (mM) | הערות |
| נה2PO4 | 0.2 | 1.3 | |
| Na2HPO4 | 0.2 | 1.25 | |
| KNO3 | 1 | 0.35 | |
| K2SO4 | 0.25 | 0.27 | |
| NH4Cl | 2.28 | הוסף מלא ישירות לבסיס עם אגירה | |
| KCl | 14.94 | הוסף מלא ישירות לבסיס עם אגירה | |
| NaCl | 51.85 | הוסף מלא ישירות לבסיס עם אגירה | |
| סתתים | 10 | הוסף מלא ישירות לבסיס עם אגירה | |
| סר | 0.1 | 1.45 | |
| גלו HCl | 0.1 | 1.55 | |
| מקצוען | 0.1 | 1.66 | |
| גלי | 0.1 | 1.2 | |
| עלא | 0.1 | 1.78 | |
| ואל | 0.1 | 1.12 | |
| פגשתי | 0.1 | 0.63 | |
| איל | 0.1 | 1.12 | |
| לאו | 0.1 | 1.61 | |
| אורן HCl | 0.1 | 0.68 | |
| ליס HCl | 0.1 | 2.13 | |
| ארג HCl | 0.1 | 0.31 | |
| Trp | 0.1 | 0.01 | הוכן ב 0.2 M NaOH |
| Asp | 0.1 | 0.83 | מוכן ב 0.5 M NaOH |
| טיר | 0.1 | 0.8 | הוכן ב 1.0 M NaOH |
| ת'אר | 0.1 | 1.07 | |
| סייס HCl | 0.1 | 0.16 | |
| פה | 0.1 | 0.53 | |
| HClH2O שלו | 0.1 | 0.52 | |
| DNA זרע סלמון | 0.6 מ"ג/מ"ל | ||
| חזירי מוצ'ין | 5 מ"ג/nL |
טבלה 1: הכנת מלח, חומצת אמינו, DNA, ומניות mucin נדרש לבסיס חוצץ של מדיום כיח סיסטיק פיברוזיס סינתטי, SCFM2.
| כימי | ריכוז מלאי (ז) | ריכוז סופי (mM) | הערות |
| דקסטרוז (D-גלוקוז) | 1 | 3 | |
| חומצה L-לקטית | 1 | 9.3 | הסתגל ל- pH 7.0 עם NaOH |
| CaCl2*2H2O | 1 | 1.75 | |
| MgCl2*6H2O | 1 | 0.61 | |
| FeSO4*7H2O | 1 מ"ג/מ"ל | 0.0036 | הפוך טרי מדי יום |
| N-אצטילגלוקוסאמין | 0.25 | 0.3 | |
| 1,2-דיאולאויל-סן-גליצריו-3-פוספוקולין (DOPC) | 25 מ"ג/מ"ל | 100 מיקרוגרם/מ"ל | דגירה של לפחות 20 דקות ב 37 °C (50 °F) לאחר תוספת |
טבלה 2: הכנת מלאי נוסף הנדרש לבסיס אגירה של מדיום כיח סיסטיק פיברוזיס סינתטי, SCFM2.
איור משלים S1: אגרגטים של הרשות הפלסטינית ב-SCFM2. מיקרוגרף קונפוקלרי מעובד של אגרגטים של Pa בר קיימא (ירוק) ולא בר קיימא (אדום) שנוצר ב- SCFM2. סרגל קנה מידה = 5מיקרומטר. קיצורים: SCFM2 = סיסטיק פיברוזיס סינתטי כיח בינוני; Pa = פסאודומונס ארוגינוזה. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
וידאו משלים S1: אגרגטים ב- SCFM2 לאחר טיפול באנטיביוטיקה. תמונות צבירה של Pa נלכדו כל 30 דקות ב- SCFM2 באמצעות CLSM. צבירה מסומנת בנפרד על-ידי צבעים המייצגים אמצעי אחסון מצטבר (μm3, סרגל צבעים שאינו מוצג כתמונה מייצגת). סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. קיצורים: SCFM2 = סיסטיק פיברוזיס סינתטי כיח בינוני; Pa = פסאודומונס ארוגינוזה; CLSM = מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבודה זו הציגה מתודולוגיות שניתן לשלב כדי לחקור אוכלוסיות צבירה חיידקיות בנוכחות ובהיעדר טיפול אנטיביוטי. CLSM ברזולוציה גבוהה מאפשר הדמיה של שינויים ביומסה מצטברת ואת הכיוון המבני של אגרגטים על פני זמן אמת כאשר נחשף לאנטיביוטיקה. בנוסף, ניתן לכמת תכונות פיזיות ומבניות של הביומסה שנותרו לאחר הטיפול באנטיביוטיקה, במטרה לתאם תצפיות אלה עם מחקרי ביטוי גנים עתידיים המשתמשים ב- RNA-seq. בעוד שהשימוש בתאים המביעים GFP מאפשר הדמיה של ההתנהגות הקולקטיבית והאינדיבידואלית של תאים עמידים לאנטיביוטיקה, הוא מספק רק חלק מהתמונה הכוללת. ניתן ללמוד רבות מהמיצוב המרחבי של תאים שלא שרדו טיפול אנטיביוטי, הן בנפרד והן ביחס לביומסה ששרדה וסבלנית.
מיקרוסקופיה של זמן-לשגות יוצרת כמויות גדולות של נתונים. ניסוי של 18 שעות לתצפית על אגרגטים של Pa ב- SCFM2 מזהה כ - 50,000 אגרגטים לאורך זמן, אשר יש להם פוטנציאל להיות מאופיין עבור נפח ומיצוב מרחבי. CLSM המשמש כאן (ראה טבלת החומרים) לוכד תמונות ברזולוציה גבוהה של אגרגטים מתפתחים לניתוח. מיקום מרחבי של צבירה בודדת (ביחס לצבירה שמסביב) בשלושה ממדים (± 0.1 מיקרומטר) יכול לשמש כדי לאפשר מדידות מדויקות של המרחק בין אגרגטים. פנוטיפים פיזיים של אגרגטים חיידקיים ניתן לקבוע באמצעות שילוב של גישות ניתוח. תוכנת ההדמיה מספקת עיבוד פני שטח ומיצוב תלת מימדי (תלת-ממדי). סקריפטים שנוצרו בתוך הבית יכולים לשמש כדי למיין אגרגטים לפי פנוטיפ (למשל., נפח) ולחשב התפלגות של ביומסה binned גודל. משאבים נוספים זמינים לפלח תאים בודדים בתוך אגרגטים (למשל. . , כדי לתמוך בשימוש בכתבי תמלול14). בשילוב, כלי ניתוח אלה מספקים הערכה רחבה של פנוטיפים מצטברים, עם הגמישות לשנות ניתוחים עבור תחומי עניין מתעוררים עם יצירת נתונים.
לאחר ההדמיה הראשונית של 18 שעות, אגרגטים טופלו עם PI, טכניקה המכונה לעתים קרובות כתמים חיים / מתים. PI נכנס לתאים עם קרום נקבובי (נפרץ), ומאפשר הדמיה של תאים מתים או לחוצים קשות בניגוד לתאים חיים המבטאים GFP. הארגון המרחבי של קהילות חיידקים בריאת CF כמו אגרגטים יכול לספק מידע על התנהגויות קהילתיות חיידקים. זיהוי תאים בני קיימא ולא בני קיימא, המבודדים בתוך צבירה, מאפשר זיהוי של התפלגות התאים בתוך הקהילה שעשויים להיות רגישים יותר לטיפול אנטיביוטי. כימות השינויים הפיזיים שעוברים אגרגטים בתגובה לאנטיביוטיקה, כמו גם זיהוי תכונות גנוטיפיות של אגרגטים עמידים לאנטיביוטיקה יכולים ליידע טיפולים עתידיים נגד הרשות הפלסטינית.
השימוש ב- PI כולל גם יישומים במורד הזרם בגישת FACS של זרימת העבודה, אם כי יש לציין כי זה לא תמיד הכרחי, כמו תאים קיימא בניסוי זה ניתן להבדיל על ידי ביטוי GFP. עם זאת, כתמי PI מאפשרים לקבל מידע מרחבי ממצרפים בסוף כל מטען. על ידי הדגשת השימוש ב- FACS למיון אגרגטים, נייר שיטות זה מדגים 1) כי SCFM2 יכול לשמש במכונת FACS מבלי לגרום נזק או קבקבים למרות צמיגותו, 2) ניתן להשתמש ב- FACS כדי להפריד תאים בודדים ממצטבר ולקבץ אותם לאוכלוסיות נפרדות (פנוטיפים), ו -3) כתמי PI יש תועלת להפרדת תאים מתים מאוכלוסייה עם FACS, במיוחד אם התאים האחרים של עניין אינם מבטאים סמן פלואורסצנטי. השימוש בטכניקות הכתמת תאים חיים מדגיש את היישום של פרוטוקול זה לשימוש בבודדים קליניים שבהם מניפולציה גנטית היא לעתים קרובות קשה. למרות אופטימיזציה נדרש ככל הנראה מתח אחר זן , פנוטיפים צבירה ניתן לזהות באותה רזולוציה באמצעות פלואורופורים זמינים מסחרית רבים.
תאימות של SCFM2 עם FACS היא יתרון עצום וכעת מאפשרת לחוקרים לבודד תאים בודדים ספציפיים ממצטבר לאוכלוסיות נפרדות. זה עצמו יש יישומים רבים למחקרים עתידיים המכילים אוכלוסיות מעורבות של תאים. לדוגמה, חקר צבירה עם מינים אחרים או הטרוגניות בתוך מינים בודדים מצטבר6. תהליך מיון מרגש ברזולוציה גבוהה זה זמין באופן נרחב במוסדות רבים ויש לו יישומים רבים במורד הזרם. תאים בני קיימא מהצברים במחקר זה מוינו לניסויי RNA-seq עתידיים. יישומים אחרים יכולים לכלול פרוטאומיה; דגימה מחדש של אגרגטים למחקרים אבולוציוניים, כגון הערכת ההשפעות של חשיפה אנטיביוטית חוזרת; שיתוף פולחן עם מינים אחרים; או שיתוף פעולה עם תאי מערכת החיסון האנושיים(איור 5). שילוב שיטות אלה עם ניסויי הדמיה CLSM מאפשר מתאם של תכונות חיידקיות שנצפו והתנהגויות עם נתונים כמותיים, עם פוטנציאל לזהות מנגנונים של קהילות חיידקים, יחסים בין מינים, או עמידות נגד מיקרוביאלים.
לצד היתרונות הרבים של מתודולוגיות אלה, יש כמה מלכודות שיש לטפל בהן. מחקר זה משתמש PI כסמן נקודת קצה של הכדאיות התא; באופן אידיאלי בעתיד, זה יוחלף במודלים של פעילות תאים כדי להבדיל תאים על פני נקודות זמן מרובות. עם זאת, נתונים אלה קובעים את השימוש ב- SCFM2 לצבירה של תרבות שניתן למיין בדרכים מרובות מלבד חיים/מתים. היתרון העיקרי הוא שניתן להעביר אגרגטים ישירות למכונת ה-FACS ללא כביסה, ושיבוש פוטנציאלי של כל מבנה מרחבי שפותח במהלך ניסוי. בסך הכל, זוהי פלטפורמה מרגשת שיכולה לשמש מעבדות רבות כדי לטפח פרויקטים שיתופיים עם המעוניינים Pa, CF, והתנהגויות מיקרוביאליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
S.E.D נתמך על ידי קרנות סטארט-אפ המסופקות על ידי המחלקה לרפואה מולקולרית, אוניברסיטת דרום פלורידה, כמו גם מענק מחקר CFF (DARCH19G0) N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, חן)) ומכון USF על מיקרוביום. אנו מודים למעבדת ויטלי על שיתוף הפעולה המתמשך הכולל ערכות נתונים הקשורות לכתב יד זה. אנו מודים לד"ר צ'ארלס סקרס על שטיפל במיון של FACS. דמויות נוצרו על ידי A.D.G וS.E.D. באמצעות Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino acids | |||
| Alanine | Acros Organics | 56-41-7 | |
| Arginine HCl | MP | 1119-34-2 | |
| Asparagine | Acros Organics | 56-84-8 | Prepared in 0.5 M NaOH |
| Cystine HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
| Glutamic acid HCl | Acros Organics | 138-15-8 | |
| Glycine | Acros Organics | 56-40-6 | |
| Histidine HCl H2O | Alfa Aesar | A17627 | |
| Isoleucine | Acros Organics | 73-32-5 | |
| Leucine | Alfa Aesar | A12311 | |
| Lysine HCl | Alfa Aesar | J62099 | |
| Methionine | Acros Organics | 63-68-3 | |
| Ornithine HCl | Alfa Aesar | A12111 | |
| Phenylalanine | Acros Organics | 63-91-2 | |
| Proline | Alfa Aesar | A10199 | |
| Serine | Alfa Aesar | A11179 | |
| Threonine | Acros Organics | 72-19-5 | |
| Tryptophan | Acros Organics | 73-22-3 | Prepared in 0.2 M NaOH |
| Tyrosine | Alfa Aesar | A11141 | Prepared in 1.0 M NaOH |
| Valine | Acros Organics | 72-18-4 | |
| Antibiotic | |||
| Carbenicillin | Alfa Aesar | J6194903 | |
| Day-of Stocks | |||
| CaCl2 * 2H2O | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Chemical | 50-99-7 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Fisher (Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform |
| FeSO4 * 7H2O | Acros Organics | 7782-63-0 | this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh |
| L-lactic acid | Alfa Aesar | L13242 | pH stock to 7 with NaOH |
| MgCl2 * 6H2O | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| N-acetylglucosamine | TCI | A0092 | |
| Prepared solids | |||
| Porcine mucin | Sigma | M1778-100G | UV-sterilize |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
| Stain | |||
| Propidium iodide | Alfa Aesar | J66764MC | |
| Salts | |||
| K2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
| KCl | Alfa Aesar | J64189 | add solid directly to buffered base |
| KNO3 | Acros Organics | 7757-79-1 | |
| MOPS | Alfa Aesar | A12914 | add solid directly to buffered base |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | add solid directly to buffered base |
| Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
| NH4Cl | Acros Organics | 12125-02-9 | add solid directly to buffered base |
| Consumables | |||
| Conical tubes (15 mL) | Olympus plastics | 28-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Olympus plastics | 28-106 | |
| Culture tubes w/air flow cap | Olympus plastics | 21-129 | |
| 35 mm four chamber glass-bottom dish | CellVis | NC0600518 | |
| Luria Bertani (LB) broth | Genessee Scientific | 11-118 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Bioreagents | BP2944100 | |
| Pipet tips (p200) | Olympus plastics | 23-150RL | |
| Pipet tips (p1000) | Olympus plastics | 23-165RL | |
| Serological pipets (5 mL) | Olympus plastics | 12-102 | |
| Serological pipets (25 mL) | Olympus plastics | 12-106 | |
| Serological pipets (50 mL) | Olympus plastics | 12-107 | |
| Ultrapure water (RNase/DNase free); nanopure water | Genessee Scientific | 18-194 | Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1 |
| Syringes (10 mL) | BD | 794412 | |
| Syringes (50 mL) | BD | 309653 | |
| 0.22 mm PES syringe filter | Olympus plastics | 25-244 | |
| PS cuvette semi-mico | Olympus plastics | 91-408 | |
| Software | |||
| Biorender | To prepare the figures | ||
| FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| Imaris | Bitplane | version 9.6 | |
| Zen Black | |||
| Equipment | |||
| FacsAriallu | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| LSM 880 confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
- Ramsay, K. A., et al. The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).
- Bessonova, L., et al. Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor. Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).
- Breuer, O., et al. Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).
- O'Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections. Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).
- Bjarnsholt, T., et al.
- Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).
- Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
- Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).
- Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. MBio. 8 (2), 00240 (2017).
- Jorth, P., et al. Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs. Cell Host & Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
- Hartmann, R., et al. Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ. Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).
- Stacy, A., et al. Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).
