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Immunology and Infection

एक स्यूडोमोनास एरुगिनोसा संक्रमण मॉडल के वास्तविक समय के आकलन के लिए उपकरण

Published: April 6, 2021 doi: 10.3791/62420
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Medicine, Morsani College of Medicine, University of South Florida

Summary

सिंथेटिक सिस्टिक फाइब्रोसिस थूक माध्यम (SCFM2) दोनों confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी और फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है उच्च संकल्प पर जीवाणु समुच्चय का निरीक्षण करने के लिए । यह कागज विवरण भविष्य के अध्ययन के लिए एक मंच के रूप में रोगाणुरोधी उपचार के दौरान कुल आबादी का आकलन करने के लिए तरीकों ।

Abstract

स्यूडोमोनास एयरोगिनोसा (पीए) सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) से जुड़े सबसे आम अवसरवादी रोगजनकों में से एक है। एक बार पा उपनिवेशीकरण की स्थापना हो जाने के बाद, संक्रमित बैक्टीरिया का एक बड़ा हिस्सा वायुमार्ग थूक के भीतर बायोफिल्म बनाता है। सीएफ थूक से अलग पीए बायोफिल्म्स को ~ 10-1000 कोशिकाओं के छोटे, घने समुच्चय में विकसित करने के लिए दिखाया गया है जो स्थानिक रूप से संगठित हैं और रोगाणुरोधी सहिष्णुता जैसे चिकित्सकीय प्रासंगिक फेनोटाइप प्रदर्शित करते हैं। अध्ययन करने के लिए सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक कैसे Pa समुच्चय बदलते थूक पर्यावरण का जवाब पोषण प्रासंगिक और मजबूत प्रणाली है कि समग्र गठन को बढ़ावा देने की कमी है । एक सिंथेटिक CF थूक माध्यम (SCFM2) का उपयोग करना, पीए समुच्चय के जीवन इतिहास को एक ही सेल के संकल्प पर कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएफएम) और छवि विश्लेषण का उपयोग करके देखा जा सकता है। यह इन विट्रो सिस्टम वास्तविक समय, तीन आयामों और माइक्रोन पैमाने पर अलग-अलग आकार के हजारों समुच्चय के अवलोकन की अनुमति देता है। व्यक्तिगत और जनसंख्या के स्तर पर, फेनोटाइप और स्थिति द्वारा समूह समुच्चय की क्षमता होने से विभिन्न विकासात्मक चरणों में समुच्चय के अवलोकन और एंटीबायोटिक उपचार जैसे माइक्रोएनवायरमेंट में परिवर्तन के लिए उनकी प्रतिक्रिया को परिशुद्धता के साथ विभेदित करने की सुविधा प्रदान करता है।

Introduction

स्यूडोमोनास एयरोग्नोसा (पीए) एक अवसरवादी रोगजनक है जो प्रतिरक्षा-समझौता व्यक्तियों में पुराने संक्रमण स्थापित करता है। आनुवंशिक रोग सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) वाले लोगों के लिए, ये संक्रमण जीवन भर के पाठ्यक्रम का विस्तार कर सकते हैं। सीएफ वायुमार्ग में एक चिपचिपा, पोषक तत्वों से भरपूर थूक के निर्माण का कारण बनता है, जो समय के साथ विभिन्न प्रकार के माइक्रोबियल रोगजनकों द्वारा उपनिवेश बन जाता है। पीए सबसे प्रचलित CF रोगजनकों में से एक है, बचपन में वायुमार्ग उपनिवेश और मुश्किल से इलाज संक्रमण1 कीस्थापना । पीए एक महत्वपूर्ण नैदानिक समस्या बनी हुई है और हाल के वर्षों में बेहतर चिकित्सा आहार के बावजूद सीएफ के साथ उन लोगों में मृत्यु का एक प्रमुख कारण माना जाता है2,3। इस हठ फेनोटाइप और बढ़ती एंटीबायोटिक सहिष्णुता ने पी को रोगजनकों के एक समूह में एक जगह अर्जित की है, जो रोग नियंत्रण के लिए केंद्र (सीडीसी) और विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) द्वारा नई चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए अनुसंधान प्राथमिकताओं के रूप में पहचाने गए रोगजनकों के एक समूह में है-ESKAPE रोगजनक4 ।

अन्य ESKAPE रोगजनकों की तरह, अधिग्रहीतएंटीबायोटिक प्रतिरोध पीए में आम है, लेकिन कई आंतरिक गुण भी हैं जो पा एंटीमाइक्रोबियल सहिष्णुता में योगदान देते हैं। इनमें से पीए की ~ 10-1000 कोशिकाओं के समुच्चय-अत्यधिक घने समूह बनाने की क्षमता है, जिसे सीएफ रोगी थूक5,6सहित कई संक्रमणों में देखा जा सकता है। अन्य बायोफिल्म प्रणालियों में अध्ययन किए गए पीए के समान, पीए एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिरोध में वृद्धि और सेल-सेल संचार (कोरम संवेदन (क्यूएस) के सक्रियण जैसे चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक फेनोटाइप प्रदर्शित करता है। उदाहरण के लिए, पीए के समुच्चय को अन्य रोगाणुओं का मुकाबला करने के लिए क्यूएस-विनियमित व्यवहारों का उपयोग करने के साथ-साथ पाइओसाइनिन7के उत्पादन जैसे रोगाणुरोधी उपचारों को सहन करने के लिए दिखाया गया है। इस तरह के व्यवहार का अध्ययन करने की क्षमता एक वातावरण में जीवाणु पारिस्थितिकी प्रणालियों में एक रोमांचक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जिसमें वे मानव शरीर में मौजूद हैं।

अध्ययन करने के लिए सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक कैसे Pa समुच्चय बदलते थूक पर्यावरण का जवाब पोषण प्रासंगिक और मजबूत प्रणाली है कि समग्र गठन को बढ़ावा देने की कमी है । पीए के बारे में जो कुछ जाना जाता है, उसमें विट्रो सिस्टम का उपयोग करके खोज की गई है जिसमें कोशिकाएं प्लैंकटॉनी या एक विशेषता सतह से जुड़ी होती हैं, "मशरूम" वास्तुकला जिसे वीवो8मेंनहीं देखा गया है। जबकि शास्त्रीय बायोफिल्म विकास मॉडल, जैसे प्रवाह कोशिकाओं या ठोस आगर, जीवाणु व्यवहार और एंटीबायोटिक सहिष्णुता के तंत्र के बारे में व्यापक और मूल्यवान ज्ञान मिले हैं, इन निष्कर्षों को हमेशा वीवो में अनुवाद नहीं करते हैं । कई इन विट्रो मॉडल में मानव संक्रमण स्थल के विकास के वातावरण की नकल करने की सीमित क्षमता होती है, जिससे वीवो अध्ययन में महंगा होना पड़ता है। बदले में, वीवो मॉडल में कई में इन विट्रो तकनीकों द्वारा प्रदान किए गए लचीलेपन और संकल्प की कमी है।

सिंथेटिक सिस्टिक फाइब्रोसिस थूक (SCFM2) सीएफ फेफड़ों में पुराने संक्रमण के दौरान अनुभवी के समान पीए विकास के लिए एक वातावरण प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। SCFM2 में म्यूसिन, लिपिड और डीएनए के अलावा उम्मीद सीएफ स्पुटा में पहचाने गए पोषण स्रोत शामिल हैं। SCFM2 में पीए वृद्धि के लिए वास्तविक थूक में वृद्धि के लिए आवश्यक एक समान जीन सेट की आवश्यकता होती है और यह प्राकृतिक पा कुलगठन 9,10का समर्थन करता है । टीका लगाने के बाद, प्लैंक्टोनिक कोशिकाएं समग्र रूप से बनती हैं जो विस्तार के माध्यम से आकार में वृद्धि करती हैं। व्यक्तिगत कोशिकाओं (प्रवासियों के रूप में संदर्भित) को एकत्रित से जारी किया जाता है, बिना कोलोनीकृत क्षेत्रों में स्थानांतरित किया जाता है, और नए समुच्चय10बनाते हैं। यह जीवन इतिहास एक एकल कोशिका के संकल्प पर सीएलएसएम और छवि विश्लेषण का उपयोग करके देखा जा सकता है। SCFM2 में गठित पीए के समुच्चय सीएफ फेफड़े10में देखे गए लोगों के समान आकार के होते हैं । यह मॉडल वास्तविक समय में और माइक्रोन पैमाने पर तीन आयामों में अलग-अलग आकार के कई समुच्चय के अवलोकन की अनुमति देता है। समय-चूक माइक्रोस्कोपी एक प्रयोग में हजारों (~ 50,000) समुच्चय की ट्रैकिंग की अनुमति देता है। छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग माइक्रोग्राफ से कुल फेनोटाइप के मात्राकरण की अनुमति देता है, जिसमें कुल मात्रा, सतह क्षेत्र, और तीन आयामों में स्थिति शामिल है, जो व्यक्तिगत कुल और जनसंख्या दोनों स्तरों पर निकटतम 0.1 माइक्रोन तक है। फेनोटाइप और स्थिति द्वारा समूह के लिए एकत्रित होने से विभिन्न विकासात्मक चरणों में सटीकता के साथ-साथ बदलते माइक्रोएनवायरमेंट6,11के प्रति उनकी प्रतिक्रिया के साथ-साथ एकत्रित होने की अनुमति देता है।

पीए का अध्ययन करने के लिए SCFM2 का आवेदन कम मात्रा में एकत्रित होता है और उच्च-थ्रूपुट परख इसे एक लचीला, लागत प्रभावी मॉडल बनाते हैं। एक परिभाषित माध्यम के रूप में, SCFM2 कई प्लेटफार्मों पर एकरूपता और प्रजनन क्षमता प्रदान करता है, जो विट्रो9में पीए समुच्चय का अध्ययन करने के लिए पोषण और शारीरिक रूप से प्रासंगिक विधि प्रदान करता है। अनुप्रयोगों में उच्च संकल्प पर स्थानिक संगठन और एंटीबायोटिक सहिष्णुता का निरीक्षण करने के लिए सीएलएम के साथ संयोजन में इसका उपयोग शामिल है (जैसा कि इस विधियों के कागज में वर्णित है)। वास्तविक समय, माइक्रोन-स्केल डेटा प्रदान करने वाले प्रयोगों को करने की क्षमता अंतर-प्रजातियों और अंतर-प्रजातियों की बातचीत के अध्ययन की अनुमति देती है क्योंकि वे वीवो मेंहो सकते हैं। उदाहरण के लिए, SCFM2 पहले पीए द्वारा उपयोग किए जाने वाले सिस्टम के नेटवर्क के माध्यम से कुल आबादी में सेल-सेल संचार की स्थानिक गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है ताकि कई जीनों को विनियमित किया जा सके जो उग्रता और रोगजनकता6में योगदान देते हैं।

Figure 1
चित्र 1:मुख्य प्रयोगात्मक चरणों का चित्रमय चित्रण। (ए)SCFM2 को पीए कोशिकाओं के साथ टीका लगाया जाता है और ग्लास-तली संस्कृति डिश में समुच्चय बनाने की अनुमति दी जाती है। (ख)एग्रीगेट्स को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में ट्रांसफर किया जाता है, और एंटीबायोटिक जोड़ा जाता है । चित्रित तीन तकनीकी प्रतिकृति (कक्षों 1-3) और एंटीबायोटिक उपचार के बिना टीका ति SCFM2 के एक नियंत्रण अच्छी तरह से (4) कर रहे हैं । 18 एच(सी)के दौरान सीएलएसएम का उपयोग करके समुच्चय को इमेज किया जाता है। 18-एच इमेजिंग के बाद, कुल 18 कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ इलाज किया जाता है और सीएलएसएम का उपयोग करके इमेज किया जाता है(डी)वांछित फेनोटाइप के साथ एकत्रित एससीएफएम 2 से वीएफएस का उपयोग करके अलग किया जाता है। संक्षिप्त: SCFM2 = सिंथेटिक सिस्टिक फाइब्रोसिस थूक माध्यम; Pa = स्यूडोमोनास एरुगिनोसा; CLSM = कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी; FACS = फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

यहां, वास्तविक समय में पीए समुच्चय पर एंटीबायोटिक उपचार के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए SCFM2 की उपयोगिता का प्रदर्शन किया जाता है, जिसके बाद डाउनस्ट्रीम विश्लेषण(चित्र 1)के लिए अलग-अलग फेनोटाइप के साथ समुच्चय की आबादी को अलग करने के लिए सेल-सॉर्टिंग दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है।

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Protocol

1. सिंथेटिक सिस्टिक फाइब्रोसिस माध्यम तैयार (SCFM2)

नोट: SCFM2 की तैयारी में नीचे उल्लिखित तीन मुख्य चरण शामिलहैं (चित्र 2)। पूर्ण विवरण और संदर्भ के लिए,9,10,12देखें।

Figure 2
चित्रा 2:SCFM2 माध्यम की तैयारी और टीका। }बफर्ड बेस को टेबल 1 और टेबल 2 में सूचीबद्ध साल्ट और अमीनो एसिड का इस्तेमाल करते हुए तैयार किया जाताहै । बफर आधार को 30 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन प्रकाश जोखिम से संरक्षित किया जाना चाहिए। (ख)म्यूसिन और डीएनए को बफर बेस के एक एलिकोट में जोड़ा जाता है और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान में भंग कर दिया जाता है ।(C)लिपिड और अतिरिक्त स्टॉक रात भर के समाधान में जोड़ा जाता है और 20 मिनट के लिए २५० आरपीएम पर आंदोलन के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड । SFCM2 तो धोया, एक OD६०० = ०.०५ पर चरण कोशिकाओं लॉग के साथ inoculated है । संक्षिप्त: SCFM2 = सिंथेटिक सिस्टिक फाइब्रोसिस थूक माध्यम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. पोर्सिन म्यूसिन की नसबंदी
    1. SCFM2 में 5 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता पर बाँझ म्यूसिन तैयार करें। उदाहरण के लिए, SCFM2 की 5 एमएल मात्रा के लिए, बाँझ पेट्री डिश में टाइप II म्यूसिन के 25 मिलीग्राम का वजन करें, और 4 घंटे के लिए एक पराबैंगनी (यूवी) स्टरलाइजर में रखें, हर घंटे धीरे से आंदोलन करें।
    2. 4 घंटे के बाद, यूवी-इलाज म्यूसिन को बाँझ परिस्थितियों में ऑटोक्लेवेड 1.7 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. पूर्ण नसबंदी की पुष्टि करने के लिए, एक बाँझ तरल में म्यूसिन का एक नमूना भंग करें, जैसे पानी या लुरिया बर्तानी (एलबी) शोरबा, और एक माइक्रोस्कोप के नीचे निरीक्षण करें।
      नोट: निष्फल म्यूसिन को 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. बफर बेस की तैयारी
    1. टेबल 1में सूचीबद्ध पानी को डिओनाइज्ड करने के लिए वजन से उचित मात्रा में जोड़कर नमक और अमीनो एसिड स्टॉक समाधान तैयार करें। फिल्टर-0.22 माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करके सभी स्टॉक समाधानों को स्टरलाइज करें, प्रकाश गिरावट से बचाने के लिए पन्नी में लपेटें, और एक महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. टेबल1 में सूचीबद्ध वॉल्यूम द्वारा अमीनो एसिड और नमक स्टॉक समाधानों के साथ 190 मिलीएल डिओनाइज्ड पानी के संयोजन से बफर बेस तैयार करें। पीएच 6.8 के समाधान को समायोजित करें, और 250 एमएल की अंतिम मात्रा में वृद्धि करें। 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर-स्टरलाइज करें, और 30 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. प्रयोग से पहले शाम को, एक ग्लास संस्कृति फ्लास्क में बफर आधार की वांछित मात्रा को अलीकोट करें, और म्यूसिन (5 मिलीग्राम/एमएल के रूप में चरण 1.1.1) और शुद्ध सामन शुक्राणु डीएनए (0.6 मिलीग्राम/एमएल) में वर्णित जोड़ें। धीरे-धीरे उत्तेजित करें, पन्नी में लपेटें, और मसिन और डीएनए को समाधान में भंग करने की अनुमति देने के लिए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
      नोट: सामन शुक्राणु डीएनए aliquots बर्फ पर गल जाना चाहिए, भंवर, और बफर आधार और म्यूसिन में जोड़ा । ट्रिप्टोफान, शतावरी, और टायरोसिन स्टॉक समाधान को नाओएच के समाधानों में तैयार किया जाना चाहिए (सांद्रता के लिए तालिका 1 देखें) बजाय डिओनाइज्ड पानी के। बफ़र्स आधार और प्रकाश जोखिम से बचाने के लिए पन्नी में लिपटे सभी स्टॉक समाधान रखें। ज्यादातर स्टॉक्स एक महीने तक स्थिर रहेंगे । स्टॉक्स जो फीका हो जाते हैं, उनका उपयोग नहीं किया जाना चाहिए और उपयोग से पहले प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए।
  3. पूरक शेयरों के अलावा
    1. प्रयोग के दिन, टेबल 2 में सूचीबद्ध स्टॉक को म्यूसिन और डीएनए युक्त बफर बेस में जोड़ें।
      नोट: प्रयोग के दिन एक ताजा FeSO4 समाधान तैयार करें, लेकिन अन्य सभी स्टॉक समय से पहले बनाए जा सकते हैं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 दिनों के लिए संग्रहीत किए जा सकते हैं 1,2-डायोलोइल-एसएन-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (DOPC) में क्लोरोफॉर्म होता है। सावधानी के साथ संभाल, और खुली लपटों के पास का उपयोग नहीं करते। DOPC के अलावा के बाद, कम से कम 20 मिनट (5 एमएल संस्कृति के लिए) के लिए मिलाते हुए (250 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर SCFM2 incubate। इस इनक्यूबेशन अवधि डीओपीसी में क्लोरोफॉर्म को वाष्पित होने की अनुमति देती है। फ्लास्क एयरटाइट नहीं होना चाहिए; इसके बजाय, पन्नी के साथ ढीला फ्लास्क खोलने को कवर करें।

2. बैक्टीरियल समुच्चय में एंटीमाइक्रोबियल सहिष्णुता का वास्तविक समय मूल्यांकन

  1. रातोंरात संस्कृतियों को तैयार करें
    1. प्रयोग से पहले शाम को, पा पाओ1-pMRP9-113 की कई कालोनियों के साथ पौंड शोरबा के 5 एमएल टीका एक पौंड आगर एंटीबायोटिक युक्त प्लेट से (carbenicillin ३०० μg/l) । 250 आरपीएम पर आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ें।
      नोट: आवश्यक प्लाज्मिड (यहां, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) अभिव्यक्ति प्लाज्मिड, पीएफआरपी9-1) के चयन के लिए आवश्यक एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा रातोंरात संस्कृतियों को बढ़ाएं। ध्यान दें कि SCFM2 टीका लगाने से पहले पीए कोशिकाओं को धोया जाना है। एलबी रातोंरात संस्कृतियों के लिए अन्य अमीर प्रयोगशाला मीडिया के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के दौरान उपयुक्त बीएसएल-2 दिशानिर्देशों का उपयोग करके सभी बैक्टीरियल आइसोले को संभाला जाना चाहिए।
  2. टीका SCFM2
    1. प्रयोग के दिन, ताजा पौंड शोरबा के 5 मिलील में 500 माइक्रोन को इनोक्यूल करके पीए 1:10 (संस्कृति: तरल मीडिया) की रातोंरात संस्कृतियों को वापस पतला करें। 250 आरपीएम पर आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर लॉग चरण (60-90 मिनट) तक कोशिकाओं को बढ़ाएं।
    2. 5 मिनट के लिए 10,000 × जी पर सेंट्रलाइज लॉग चरण संस्कृतियां। फिल्टर-स्टरलाइज्ड फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस, पीएच 7.0) के 3 एमएल में सुपरनैंट और रिसिपेंडिंग को हटाकर कोशिकाओं को धोएं। दो बार दोहराएं, और पीबीएस के 1 एमएल की अंतिम मात्रा में गोली को फिर से खर्च करें।
    3. 600 एनएम(ओडी600) पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके धोई गई कोशिकाओं के अवशोषण को मापें, और SCFM2 के 5 एमएल में0.05 के शुरुआती ओडी 600 के लिए आवश्यक संस्कृति की मात्रा की गणना करें। SCFM2 में पीए टीका, और भंवर धीरे भर में कोशिकाओं को वितरित करने के लिए । एक 4-अच्छी तरह से, ग्लास बॉटम, ऑप्टिकल डिश के प्रत्येक कक्ष में टीका लगाया SCFM2 के पिपेट 1 एमसीएल, और 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रूप से 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
      नोट: पीए संस्कृतियों का दोगुना समय तनाव और ऑक्सीजन की उपलब्धता पर निर्भर करता है । SCFM2 में, यहां वर्णित शर्तों के तहत, पीए का दोगुना समय ~ 1.4 एच10है।

3. कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) के साथ एंटीबायोटिक उपचार के दौरान समग्र कल्पना करना

नोट: यह अनुभाग SCFM2 में Pa समुच्चय की इमेजिंग के लिए कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप और इमेज कैप्चर सॉफ्टवेयर के उपयोग का वर्णन करता है। लक्ष्य एंटीबायोटिक दवाओं के साथ उपचार के बाद शेष (सहिष्णु) बैक्टीरियल बायोमास का निरीक्षण और विशेषता है। उल्लिखित कदम अन्य कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर सफलता के साथ किए जा सकते हैं, हालांकि उपकरण ऑपरेटिंग मैनुअल विशिष्ट मार्गदर्शन के लिए संदर्भित किया जाना चाहिए।

  1. छवि Pa संस्कृतियों या तो एक गर्म कक्ष या एक गर्म माइक्रोप्लेट माइक्रोस्कोप चरण पर लगे एक गर्म माइक्रोप्लेट का उपयोग करने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस के एक परिवेश तापमान बनाए रखने के लिए । सभी उपकरण को वांछित तापमान तक पहुंचने की अनुमति देने के लिए प्रयोग की शुरुआत से कम से कम 2 घंटे पहले इनक्यूबेशन मॉड्यूल शुरू करें, और डेटा संग्रह के दौरान आगे विस्तार और आंदोलन को कम करें।
  2. 4 घंटे के बाद, गर्म माइक्रोस्कोप चरण में पीए कोशिकाओं वाली SCFM2 संस्कृतियों को स्थानांतरित करें। एंटीबायोटिक उपचार के लिए तकनीकी प्रतिकृति के रूप में 4 कुओं में से 3 नामित, और 4अच्छी तरह से एक नहीं उपचार नियंत्रण के रूप में विचार करें, SCFM2 में केवल पीए कोशिकाओं युक्त, एंटीबायोटिक के बिना । फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के किसी भी उत्तेजन से पहले पता लगाने टैब के भीतर ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर समुच्चय की पहचान करें। प्रत्येक अच्छी तरह से भीतर इमेजिंग के लिए एक क्षेत्र को परिभाषित करें, और इमेजिंग सॉफ्टवेयर में पोजिशन मॉड्यूल का उपयोग करके अपनी स्थिति (एक्स-वाई-जेड निर्देशांक) स्टोर करें।
  3. 488 एनएम की उत्तेजन तरंगदैर्ध्य और 509 एनएम के उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ SCFM2 में जीएफपी अभिव्यक्ति प्लाज्मिड pMRP9-1 युक्त पीए संस्कृतियों की कल्पना करने के लिए 63x तेल-विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें। 1 माइक्रोन अंतराल (कुल 60 स्लाइस) पर अधिग्रहण मॉड्यूल के भीतर जेड-स्टैक विकल्प का उपयोग करके छवियां लें। 60 माइक्रोन जेड-स्टैक छवियों (1,093.5 मिमी3)की कुल मात्रा के भीतर जीएफपी चैनल में पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को कम करने के लिए लाइन-औसत मॉड्यूल का उपयोग करें। छवि विश्लेषण के लिए पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस निर्धारित करने के लिए समान सेटिंग्स का उपयोग करके uninoculated SCFM2 की नियंत्रण छवियों को लें।
    नोट: छवियां 512 पिक्सल x 512 पिक्सल (0.26 माइक्रोन x 0.26 माइक्रो मीटर पिक्सल) 8-बिट जेड-स्टैक छवियों का उत्पादन करके प्राप्त की जाती हैं जो कवर्लिपी के आधार से 60 माइक्रोन हैं।
  4. इमेजिंग सॉफ्टवेयर के भीतर समय श्रृंखला विकल्प का उपयोग करें प्रत्येक स्थिति पर ६० स्लाइस पर कब्जा करने के लिए (अच्छी तरह से) 18 घंटे की अवधि में 15 मिनट के अंतराल पर । प्रत्येक स्थिति के लिए एक फोकल प्लेन स्टोर करने के लिए सॉफ्टवेयर के भीतर निश्चित फोकस रणनीति का उपयोग करें, जो पूरे प्रयोग में प्रत्येक समय बिंदु पर वापस आ जाता है।
  5. इनक्यूबेशन के कुल 4.5 घंटे के बाद, एंटीबायोटिक के अलावा से पहले चार कुओं में से प्रत्येक के भीतर कुल बायोमास निर्धारित करने के लिए उपरोक्त सेटिंग्स का उपयोग करके प्रत्येक स्थिति की छवि।
  6. कुल इनक्यूबेशन के 6 घंटे के बाद, प्रत्येक को दोहराने के लिए 2x-नीचे न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (MIC) पर एंटीबायोटिक जोड़ें । पाइपेट सीधे और धीरे-धीरे कुएं के बीच में, हवा-तरल इंटरफेज के ठीक नीचे। गर्म कॉन्फोकल कक्ष में सभी संस्कृतियों को बनाए रखें।
    नोट: यहां, १४० μg/mL की एकाग्रता पर colistin सल्फेट का इस्तेमाल किया गया था ।
  7. इमेजिंग कार्यक्रम के भीतर स्टार्ट एक्सपेरिमेंट विकल्प पर क्लिक करके इमेजिंग पोस्ट-एंटीबायोटिक उपचार शुरू करें।
    नोट: एंटीबायोटिक एकाग्रता का इस्तेमाल एंटीबायोटिक पर निर्भर है, पीए अलग है, और क्या उपयोगकर्ता की हत्या या सहिष्णुता प्रभाव की जांच करना चाहते हैं । यह प्रयोग एक ही खुराक का उपयोग करता है। यदि आवश्यक हो तो संस्कृतियों को बाधित किए बिना अतिरिक्त खुराक जोड़ी जा सकती है।

4. पीए एग्रीगेट्स का प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला

नोट: प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) का उपयोग आमतौर पर संस्कृति में गैर-व्यवहार्य (मृत) जीवाणु कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक धुंधला अभिवाक के रूप में किया जाता है। यहां, इसका उपयोग धारा 3 में लागू एंटीबायोटिक उपचार के प्रति संवेदनशील समग्र की पहचान करने के लिए किया जाता है। इस प्रोटोकॉल के दौरान, पीए कोशिकाओं में जीएफपी की अभिव्यक्ति और पहचान कोशिका व्यवहार्यता के लिए मुख्य प्रॉक्सी के रूप में उपयोग की जाती है। यह अंतिम चरण एक दूसरे के संबंध में लाइव/डेड एग्रीगेट्स की स्थानिक स्थिति की पहचान करने के लिए एक बार और इस्तेमाल करने की अनुमति देता है । इसके अतिरिक्त, खंड 5 में आगे डाउनस्ट्रीम सेल छंटाई के लिए कुल को लाइव/डेड के रूप में पहचाना जाता है ।

  1. 18 घंटे के बाद, SCFM2 संस्कृतियों युक्त चार कक्ष ऑप्टिकल नीचे पकवान के प्रत्येक कुएं में पीआई जोड़ें । पीआई और इनक्यूबेशन समय की मात्रा के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें(उदाहरण के लिए,संस्कृति के प्रति एमएल ~ 2 माइक्रोन, ~ 20-30 मिनट)।

5. एक FACS दृष्टिकोण का उपयोग कर समुच्चय से लाइव कोशिकाओं को अलग

नोट: FACS एक फ्लोरोसेंटली टैग फेनोटाइप के अनुसार कोशिकाओं के समूहों को सॉर्ट और अलग करने के लिए एक शक्तिशाली मंच प्रस्तुत करता है। यहां, FACS का उपयोग गैर-व्यवहार्य समुच्चय से लाइव (एंटीबायोटिक सहिष्णु) को अलग करने के लिए किया जाता है।

  1. प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ धुंधला होने के बाद, संस्कृतियों को इनक्यूबेशन से हटा दें, और 37 डिग्री सेल्सियस बनाए रखने के लिए एक अछूता कंटेनर में एक FACS उपकरण में स्थानांतरित करें।
  2. सबसे कम प्रवाह दर पर पीए समुच्चय युक्त SCFM2 के 1 एमएल एलिकोट्स चलाएं।
    नोट: प्रत्येक एलिकोट में ~ 15,000 समुच्चय होंगे।
  3. जीएफपी का पता लगाने के लिए, कोशिकाओं को 488 एनएम लेजर के साथ रोशन करें, और फ्लोरोसेंट सिग्नल ऊंचाई को 530/30 एनएम पर रिकॉर्ड करें। 561 एनएम लेजर के साथ उत्तेजन द्वारा पीआई धुंधला कल्पना करें, और 610/20 एनएम पर फ्लोरोसेंट सिग्नल ऊंचाई रिकॉर्ड करें। 70-यू नोजल का उपयोग करके छंटाई करें।
    नोट: उपयोगकर्ता के आवेदन के आधार पर सॉर्ट किए गए समुच्चय को कई तरीकों से एकत्र किया जा सकता है। इस मामले में, FACS का उपयोग डाउनस्ट्रीम आरएनए अनुक्रमण के लिए व्यवहार्य पा समुच्चय को सॉर्ट करने के लिए किया गया था। वैकल्पिक आवेदनों पर नीचे चर्चा की जाती है।

6. छवि विश्लेषण

नोट: समय-चूक माइक्रोस्कोपी बड़ी मात्रा में डेटा उत्पन्न करती है। SCFM2 में पीए समुच्चय के अवलोकन के लिए एक 18-एच प्रयोग समय के साथ ~ 50,000 समुच्चय की पहचान करता है, जिसमें मात्रा और स्थानिक स्थिति के लिए विशेषता होने की क्षमता होती है। SCFM2 में कुल गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें:

  1. SCFM2 में कुल अध्ययन के लिए, GFP चैनल में गिनती का एक हिस्टोग्राम बनाकर पृष्ठभूमि जीएफपी फ्लोरोरेसेंस की मात्रा निर्धारित करें जो कि uninoculated SCFM2 और SCFM2 के लिए उत्पादित किया जाता है पीए तनाव PAO1 के साथ टीका लगाया pMRP9-1 ले जाने । यह सुनिश्चित करने के लिए कि पता लगाया गया जीएफपी वोक्सल पीए बायोमास से संबंधित है, जीएफपी + वोक्सल को ≥1.5x GFP पृष्ठभूमि गिनती मूल्य के रूप में परिभाषित करें।
    नोट: पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को तीन बेतरतीब ढंग से चुने गए पदों के उच्चतम स्वर मूल्य के रूप में परिभाषित किया गया है, औसत। पृष्ठभूमि की गिनती, एक मानक उपाय के रूप में, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा प्रयोगात्मक छवियों में सभी पिक्सेल से घटाया जाता है।
  2. पार मॉड्यूल में पृष्ठभूमि घटाव के बाद, सभी शेष स्वरों के लिए आइसोसुरफेस का उत्पादन करें।
  3. व्यक्तिगत समुच्चय का पता लगाने के लिए, स्प्लिट ऑब्जेक्ट्स विकल्प को सक्षम करें, और ≥5 माइक्रोन3की मात्रा वाली वस्तुओं के रूप में समुच्चय को परिभाषित करें। प्रत्येक व्यक्ति वस्तु के लिए वॉल्यूम, एक्स-वाई-जेड और जीएफपी वोक्सल के योग की गणना करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में सुविधाजनक मॉड्यूल का उपयोग करें। इस डेटा को बाहरी सांख्यिकीय मंच पर निर्यात करें।
    नोट: कुछ छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर एक बार में कई मात्रात्मक फेन्टोइप्स के निर्यात की अनुमति देते हैं, जिससे सहसंबंधों की गणना की जा सकती है।
  4. यह सुनिश्चित करने के लिए कि <0.5 माइक्रोन3 (तितर-बितर बायोमास) की कोई वस्तु नहीं रह गई है, आकार के अनुसार सुविधाजनक मॉड्यूल से निर्यात किए गए डेटा को फ़िल्टर करें। छवि के भीतर प्रत्येक व्यक्ति वस्तु के लिए, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के सुविधाजनक मॉड्यूल का उपयोग करके अन्य वस्तुओं (समुच्चय) के संबंध में या निम्नलिखित समीकरण के साथ मैन्युअल रूप से दूरी की गणना करें।
    घ= वर्ग (x2−x1)2 +(y 2−y 1)2 + (z2−z1)2)(1)
  5. कुल बायोमास और औसत कुल मात्रा खोजने के लिए योग और औसत गणना का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, अन्य सांख्यिकीय प्लेटफार्मों या लिपियों में निर्यात डेटा, उदाहरण के लिए,प्रतिनिधि परिणामों में चर्चा के अनुसार बायोमास में समुच्चय का वितरण (व्हाइटले प्रयोगशाला, जॉर्जिया इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी के सहयोग से अप्रकाशित स्क्रिप्ट)।

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Representative Results

यह काम के तरीकोंका विवरण एक उच्च संकल्प पर और सीएफ फेफड़ों के पुराने संक्रमण के समान वातावरण में एक उच्च संकल्प पर देखते हैं ,10,12। SCFM2 एक इन विट्रो सिस्टम प्रदान करता है जो वास्तविक संक्रमण10के दौरान देखे गए आकारों में पीए कोशिकाओं के प्राकृतिक एकत्रीकरण को बढ़ावा देता है। एक परिभाषित माध्यम के रूप में SCFM2 की अनुकूलनशीलता कई अनुसंधान रास्ते दृष्टिकोण करने के लिए लीवरेज किया जा सकता है । इस काम का लक्ष्य एक कार्यप्रवाह को उजागर करना है जिसमें भविष्य के अनुसंधान, सहयोग और अनुप्रयोगों के लिए इसके उपयोग को प्रोत्साहित करने के इरादे से माइक्रोस्कोपी और FACS का संयोजन शामिल है।

सीएलएसएम का उपयोग अस्थायी, उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की अनुमति देता है जिसका उपयोग बैक्टीरियल आबादी के विकास की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यह काम कई संभावित तरीकों को दर्शाता है जिसके द्वारा Pa समुच्चय को एंटीबायोटिक के साथ उपचार के बाद चिह्नित किया जा सकता है। चित्रा 3A एंटीबायोटिक उपचार के बाद व्यवहार्य पीए समुच्चय का एक व्यापक दृश्य प्रदान करता है। एंटीबायोटिक के आवेदन के चार घंटे बाद, कई समुच्चय रहते हैं; प्रत्येक व्यक्ति कुल की विभिन्न विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करने के लिए रंग पर्वतमाला लागू की जा सकती है। मात्रात्मक विशेषताओं के उदाहरणों में मात्रा, क्षेत्र, स्वर तीव्रता (फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के उपयोग के लिए), और एक्स-वाई-जेड अक्षों में से किसी में स्थिति शामिल है।

समर्पित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके छवि विश्लेषण डेटा के पूरी तरह से अनुकूलन अवलोकन के लिए अनुमति देता है, प्रत्येक कुल को एक व्यक्तिगत वस्तु के रूप में पहचानता है, जिसमें मात्रात्मक डेटा को आगे के विश्लेषण के लिए निर्यात किया जा सकता है। चित्रा 3B एक उदाहरण प्रदान करता है कि निर्यात किए गए डेटा का उपयोग कैसे किया जा सकता है। यहां, कुल आबादी के कुल बायोमास की गणना समय के साथ की जा सकती है। इन प्रतिनिधि डेटा में, एंटीबायोटिक के साथ उपचार अनुपचारित समुच्चय की तुलना में बायोमास को काफी कम कर देता है। पूरक वीडियो S1 कैसे समय श्रृंखला माइक्रोस्कोपी शारीरिक रूप से एंटीबायोटिक उपचार के बाद इन बायोमास डेटा के भीतर समुच्चय का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक शक्तिशाली प्रतिनिधित्व है । प्रत्येक कुल को गणना की गई मात्रा (माइक्रोन3)का प्रतिनिधित्व करने के लिए रंग-कोडित किया गया है, जिससे कुल आबादी का एक दृश्य रिकॉर्ड होता है, जिसका उपयोग छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर और अन्य संसाधनों दोनों के भीतर अनुप्रयोगों का उपयोग करके आगे स्थानिक विश्लेषण के लिए भी किया जा सकता है (यहां10,15पर चर्चा नहीं की गई)।

पीए में एंटीबायोटिक सहिष्णुता के तंत्र की पहचान करने के लिए विकसित प्रयोग बड़ी मात्रा में डेटा का उत्पादन करते हैं। प्रत्येक दोहराने ~ 15,000 समुच्चय (कुल में ~ 60,000 समुच्चय) के भौतिक डेटा का उत्पादन करता है। इस डेटा को संभालने के लिए एक नया दृष्टिकोण कुल गर्मी नक्शे(चित्रा 3C)के उत्पादन में शामिल है । गणना करके कि विभिन्न आकारों के समुच्चय समग्र आबादी में कैसे योगदान देते हैं, एक दूसरे के संबंध में उनके आकार, आकार और स्थिति के संबंध में एंटीबायोटिक उपचार का जवाब कैसे एकत्रित होता है, इसकी पहचान की जा सकती है।

Figure 3
चित्र 3:समग्र डेटा विश्लेषण के उदाहरण। (A)एंटीबायोटिक उपचार के बाद शेष समग्र बायोमास का अवलोकन। इसी जीएफपी वोक्सल्स के आइसोस्यूरफेस प्रदान किए गए हैं और वॉल्यूम (μm3)के अनुसार रंग-कोडित किए गए हैं। स्केल बार = 30 माइक्रोन। (ख)SCFM2 में समय के साथ पीए कुल आबादी के कुल बायोमास(μm 3)। ब्लू लाइन अनुपचारित समुच्चय का प्रतिनिधित्व करती है, लाल रेखा एंटीबायोटिक, कोलिस्टिन (140 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ इलाज किए गए समुच्चय का प्रतिनिधित्व करती है। प्रस्तुत किए गए आंकड़ों में 3 जैविक प्रतिकृति (± एसईएम) शामिल हैं। (ग)कुल मात्रा हीट मानचित्र जो समय के साथ कुल बायोमास (μm3,दूसरी वाई-एक्सिस) (एच, वाई-एक्सिस) के लिए मात्रा (μm3,x-अक्ष) द्वारा व्यक्तिगत समुच्चय के योगदान का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रतिनिधि डेटा में एंटीबायोटिक की उपस्थिति और अनुपस्थिति (जैसा कि चित्र 3बी)में पीए समुच्चय शामिल है, जहां 0 एच 6 एच समग्र विकास के बाद एंटीबायोटिक इसके अलावा के समय का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा में तीन जैविक प्रतिकृति (~ 50,000 कुल समुच्चय) शामिल हैं। संक्षिप्त रूप: जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; SCFM2 = सिंथेटिक सिस्टिक फाइब्रोसिस थूक माध्यम; SEM = मतलब के मानक त्रुटि; Pa= स्यूडोमोनास एरुगिनोसा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इस स्तर पर स्थानिक विश्लेषण एंटीबायोटिक की उपस्थिति में व्यवहार्यता के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में पीए द्वारा जीएफपी की अभिव्यक्ति का उपयोग शामिल है । 18 एच के बाद पीआई के अलावा व्यवहार्य समुच्चय(पूरक चित्रा S1)के संबंध में गैर-व्यवहार्य समुच्चय की स्थिति की पहचान की अनुमति देता है। इस विधि का व्यापक लक्ष्य एंटीबायोटिक दवाओं के साथ उपचार के बाद संवेदनशील और सहिष्णु समुच्चय के बीच स्थानिक पैटर्न की पहचान करना है। भविष्य के अध्ययनों में ऊपर वर्णित अंतिम बिंदु परख के अलावा कई समय अंक शामिल होंगे।

वर्कफ़्लो का अंतिम चरण SCFM2 में समुच्चय को सॉर्ट करने के लिए एफएसीएस-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करता है। यह काम सीएफएस की कुल की शेष आबादी (गैर-व्यवहार्य सहित) से व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता को दर्शाता है। चित्रा 4 उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण जैसे आगे के प्रयोगों के लिए व्यवहार्य समुच्चय पूल के लिए FACS के उपयोग को दर्शाता है, उदाहरण के लिए,आरएनए-अनुक्रमण (आरएनए-एसईक्यू)। एंटीबायोटिक दवाओं के साथ उपचार के बाद(चित्रा 4A एक समय बिंदु (18 एच) का प्रतिनिधित्व करता है, पीए समुच्चय युक्त SCFM2 के aliquots सफलतापूर्वक उनके फ्लोरोसेंट सुविधाओं के अनुसार अलग किया जा सकता है । यहां, सहिष्णु समुच्चय के लिए जीएफपी की पहचान की गई है । चित्रा 4B ऐसी ही एक छंटाई घटना का एक उदाहरण प्रदान करता है, जहां GFP-व्यक्त कोशिकाओं को शेष संस्कृति (पीआई-उपचारित समुच्चय) से अलग किया जाता है। इसके अलावा, समुच्चय को SCFM2 से स्पष्ट रूप से पहचाना जा सकता है, जो अपनी फ्लोरोसेंट प्रोफाइल पैदा करता है। इस तरह से कोशिकाओं को सॉर्ट करने की क्षमता में कई अनुप्रयोग(चित्रा 5) हैं।

Figure 4
चित्रा 4:SCFM2 में पीए के FACS समुच्चय। (A)एक FACS साधन का आरेख जो SCFM2 से व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य पा समुच्चय को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है । (ख)एफएसीएस सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न SCFM2 में अलग किए गए कुल के प्रतिनिधि भूखंड। तीन क्वाड्रंट्स लाइव एग्रीगेट्स (जीएफपी) से संकेत देते हैं, गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं वाली शेष संस्कृति (आरएफपी का उपयोग यहां प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला करने के विकल्प के रूप में किया जाता है, दोनों 488 एनएम लेजर द्वारा उत्तेजित होते हैं), और एससीएफ 2 नियंत्रण। डेटा ~ 15,000 घटनाओं (समुच्चय) वाले 3 जैविक प्रतिकृति का 1 प्रतिनिधित्व करता है। संक्षिप्त रूप: FACS = फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई; SCFM2 = सिंथेटिक सिस्टिक फाइब्रोसिस थूक माध्यम; Pa = स्यूडोमोनास एरुगिनोसा; जीएफपी = ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन; आरएफपी = लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन; पीई-टेक्सास रेड-एच = फाइकोरीथ्रिन-टेक्सास रेड कंजूगेट दाग कोशिकाओं के लिए पीक ऊंचाई; फिटीसी-एच = फ्लोरोसेइन आइसोथिओसायनेट-दाग कोशिकाओं के लिए पीक ऊंचाई।

Figure 5
चित्र 5:SCFM2 का उपयोग करने वाले संभावित प्रयोगात्मक अनुप्रयोग। (ए) पीए का एक्सपोजर बार-बार एंटीबायोटिक खुराक के लिए एकत्रित होता है। (ख) पा की सह-संस्कृति अन्य जीवाणु प्रजातियों के साथ एकत्रित होती है । (ग) पी के एक्सपोजर प्रतिरक्षा कोशिकाओं की मेजबानी के लिए समुच्चय, उदाहरण केलिए, PMNs. A, B,और सी CLSM इमेजिंग विधियों और नीचे आरएनए-seq, प्रोटेओमिक्स, या 3 डी स्थानिक विश्लेषण के लिए FACS दृष्टिकोण के साथ जोड़ा जा सकता है । संक्षिप्त: SCFM2 = सिंथेटिक सिस्टिक फाइब्रोसिस थूक माध्यम; Pa = स्यूडोमोनास एरुगिनोसा; पीएमएन = बहुरूप न्यूक्लियर ल्यूकोसाइट्स; CLSM = कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी; FACS = फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई; आरएनए-एसईक्यू = आरएनए अनुक्रमण; 3डी = त्रि-आयामी; एलसी-एमएस/एमएस = लिक्विड क्रोमेटोग्राफी/टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

रासायनिक स्टॉक एकाग्रता (एम) अंतिम एकाग्रता (एमएन) नोट्स
एनएएच2पीओ4 0.2 1.3
एनए 2एचपीओ4 0.2 1.25
KNO3 1 0.35
कश्मीर2एसओ4 0.25 0.27
एनएच4सीएल 2.28 बफर बेस पर सीधे ठोस जोड़ें
केसीएल 14.94 बफर बेस पर सीधे ठोस जोड़ें
नैक 51.85 बफर बेस पर सीधे ठोस जोड़ें
एमओपी 10 बफर बेस पर सीधे ठोस जोड़ें
सेर 0.1 1.45
ग्लू एचसीएल 0.1 1.55
प्रो 0.1 1.66
ग्ली 0.1 1.2
अला 0.1 1.78
वैल 0.1 1.12
मिले 0.1 0.63
इले 0.1 1.12
लियू 0.1 1.61
ओआरएन एचसीएल 0.1 0.68
Lys एचसीएल 0.1 2.13
एआरजी एचसीएल 0.1 0.31
टीआरपी 0.1 0.01 0.2 एम नाओएच में तैयार
एएसपी 0.1 0.83 0.5 एम नाओएच में तैयार
टायर 0.1 0.8 1.0 एम नाओएच में तैयार
टीएचआर 0.1 1.07
सीवाईएस एचसीएल 0.1 0.16
पीएचई 0.1 0.53
उनका एचसीएल एच2ओ 0.1 0.52
सामन शुक्राणु डीएनए 0.6 मिलीग्राम/एमएल
पोर्सिन म्यूसिन 5 मिलीग्राम/एनएल

तालिका 1: सिंथेटिक सिस्टिक फाइब्रोसिस थूक माध्यम, SCFM2 के बफर बेस के लिए आवश्यक नमक, अमीनो एसिड, डीएनए, और म्यूसिन स्टॉक की तैयारी।

रासायनिक स्टॉक एकाग्रता (एम) अंतिम एकाग्रता (एमएन) नोट्स
डेक्सट्रोस (डी-ग्लूकोज) 1 3
एल-लैक्टिक एसिड 1 9.3 NaOH के साथ पीएच 7.0 को समायोजित करें
सीएसीएल2*2H2O 1 1.75
एमजीसीएल2*6H2O 1 0.61
FeSO4 * 7H2O 1 मिलीग्राम/एमएल 0.0036 दैनिक ताजा करें
एन-एसिटिलग्लूकोसामाइन 0.25 0.3
1,2-डाइयोल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (DOPC) 25 मिलीग्राम/एमएल 100 माइक्रोग्राम/एमएल अतिरिक्त के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट

तालिका 2: सिंथेटिक सिस्टिक फाइब्रोसिस थूक माध्यम, SCFM2 के बफर बेस के लिए आवश्यक अतिरिक्त स्टॉक की तैयारी।

पूरक चित्रा S1: PA SCFM2 में समुच्चय। एससीएफएम 2 में गठित व्यवहार्य (हरे) और गैर-व्यवहार्य (लाल) पीए एग्रीगेट का एक प्रदान किया गया कॉन्फोकल माइक्रोग्राफ। स्केल बार = 5 माइक्रोन। संक्षिप्त: SCFM2 = सिंथेटिक सिस्टिक फाइब्रोसिस थूक माध्यम; Pa= स्यूडोमोनास एरुगिनोसा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक वीडियो S1: एंटीबायोटिक के साथ उपचार के बाद SCFM2 में समुच्चय। Pa कुल छवियों CLSM का उपयोग कर SCFM2 में हर 30 मिनट पर कब्जा कर लिया । कुल एकत्रित को कुल मात्रा (μm3,रंग पैमाने प्रतिनिधि छवि के रूप में नहीं दिखाया गया है) का प्रतिनिधित्व करने वाले रंगों द्वारा व्यक्तिगत रूप से लेबल किया जाता है। स्केल बार = 5 माइक्रोन। संक्षिप्त: SCFM2 = सिंथेटिक सिस्टिक फाइब्रोसिस थूक माध्यम; Pa = स्यूडोमोनास एरुगिनोसा; CLSM = कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस काम ने ऐसे तरीके पेश किए हैं जिन्हें एंटीबायोटिक उपचार की उपस्थिति और अनुपस्थिति में बैक्टीरियल कुल आबादी का अध्ययन करने के लिए जोड़ा जा सकता है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन सीएलएसएम कुल बायोमास में परिवर्तनों के दृश्य और एंटीबायोटिक दवाओं के संपर्क में आने पर वास्तविक समय में समग्र के संरचनात्मक अभिविन्यास की अनुमति देता है। इसके अलावा, एंटीबायोटिक दवाओं के साथ उपचार के बाद रहने वाले बायोमास की भौतिक और संरचनात्मक विशेषताओं को मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जिसमें आरएनए-एसईक्यू का उपयोग करते हुए भविष्य के जीन अभिव्यक्ति अध्ययनों के साथ इन टिप्पणियों को सहसंबंधित करने का लक्ष्य है। जबकि GFP-व्यक्त कोशिकाओं का उपयोग एंटीबायोटिक सहिष्णु कोशिकाओं के सामूहिक और व्यक्तिगत व्यवहार के दृश्य की अनुमति देता है, यह समग्र तस्वीर का ही हिस्सा प्रदान करता है । जीवित और सहिष्णु बायोमास दोनों व्यक्तिगत रूप से और संबंध में एंटीबायोटिक उपचार से जीवित नहीं रहने वाली कोशिकाओं की स्थानिक स्थिति से बहुत कुछ सीखा जा सकता है।

टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी बड़ी मात्रा में डेटा उत्पन्न करती है। SCFM2 में पीए समुच्चय के अवलोकन के लिए एक 18-एच प्रयोग समय के साथ ~ 50,000 समुच्चय की पहचान करता है, जिसमें मात्रा और स्थानिक स्थिति के लिए विशेषता होने की क्षमता होती है। सीएलएसएम यहां उपयोग किया जाता है (सामग्री की तालिकादेखें) विश्लेषण के लिए समुच्चय विकसित करने की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को कैप्चर करता है। एक व्यक्ति के कुल की स्थानिक स्थिति (आसपास के समुच्चय के सापेक्ष) तीन आयामों में (± ०.१ μm) के लिए समुच्चय के बीच की दूरी के सटीक माप के लिए अनुमति देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । बैक्टीरियल समुच्चय के भौतिक फेनोटाइप विश्लेषण दृष्टिकोणों के संयोजन का उपयोग करके निर्धारित किए जा सकते हैं। इमेजिंग सॉफ्टवेयर सतह प्रतिपादन और त्रि-आयामी (3 डी) स्थिति प्रदान करता है। इन-हाउस-जेनरेटेड लिपियों का उपयोग फेनोटाइप(जैसे,वॉल्यूम) द्वारा एकत्रित करने और आकार-बिन्ड बायोमास के वितरण की गणना करने के लिए किया जा सकता है। अतिरिक्त संसाधन एकत्रित करने वाले संवाददाताओं14के उपयोग का समर्थन करने के लिए समुचित(उदाहरण के लिए)के भीतर अलग-अलग कोशिकाओं को खंडित करने के लिए उपलब्ध हैं। संयुक्त रूप से, ये विश्लेषण उपकरण समग्र फेनोटाइप का व्यापक मूल्यांकन प्रदान करते हैं, जिसमें उभरते हितों के लिए विश्लेषण को संशोधित करने के लचीलेपन के साथ डेटा उत्पन्न होता है।

प्रारंभिक 18-एच इमेजिंग के बाद, समुच्चय को पीआई के साथ इलाज किया गया, एक तकनीक जिसे अक्सर लाइव/डेड स्टेनिंग के रूप में जाना जाता है । पीआई एक छिद्रपूर्ण (समझौता) झिल्ली के साथ कोशिकाओं में प्रवेश करती है, जिससे जीएफपी व्यक्त करने वाली जीवित कोशिकाओं के विपरीत मृत या गंभीर रूप से तनावग्रस्त कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति होती है। सीएफ फेफड़ों में बैक्टीरियल समुदायों के स्थानिक संगठन के रूप में समुच्चय बैक्टीरियल समुदाय व्यवहार के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं । व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं की पहचान करना, जो कुल मिलाकर तनहा होते हैं, समुदाय के भीतर कोशिकाओं के वितरण की पहचान की सुविधा प्रदान करते हैं जो एंटीबायोटिक उपचार के प्रति अधिक संवेदनशील हो सकते हैं। एंटीबायोटिक दवाओं के जवाब में जो भौतिक परिवर्तन हैं, उनकी मात्रा के साथ-साथ एंटीबायोटिक-सहिष्णु समुच्चय की जीनोटिपिक विशेषताओं की पहचान करने से पीए के खिलाफ भविष्य के उपचारों को सूचित किया जासकता है ।

पीआई के उपयोग में वर्कफ्लो के एफएएफएस दृष्टिकोण में डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन भी हैं, हालांकि यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह हमेशा आवश्यक नहीं है, क्योंकि इस प्रयोग में व्यवहार्य कोशिकाओं को जीएफपी अभिव्यक्ति द्वारा अलग किया जा सकता है। हालांकि, पीआई धुंधला प्रत्येक परख के अंत में एकत्रित से स्थानिक जानकारी प्राप्त करने की अनुमति देता है। कुल मिलाकर FACS के उपयोग को उजागर करके, यह तरीका कागज 1 को दर्शाता है) कि SCFM2 अपनी चिपचिपाहट के बावजूद नुकसान या मोज़री पैदा किए बिना एक FACS मशीन में इस्तेमाल किया जा सकता है, 2) FACS एक कुल से एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और उन्हें अलग आबादी (फेनोटाइप) में समूह, और 3) PI धुंधला FACS के साथ एक आबादी से मृत कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयोगिता है विशेष रूप से यदि ब्याज की अन्य कोशिकाएं फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त नहीं कर रही हैं। लाइव-सेल धुंधला तकनीकों का उपयोग नैदानिक आइसोलेशन के उपयोग के लिए इस प्रोटोकॉल के आवेदन पर प्रकाश डालता है जिसमें आनुवंशिक हेरफेर अक्सर मुश्किल होता है। यद्यपि अनुकूलन की संभावना तनाव-बाय-तनाव की आवश्यकता होती है, लेकिन कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोफोरस का उपयोग करके एक ही संकल्प पर समग्र फेनोटाइप की पहचान की जा सकती है।

FACS के साथ SCFM2 की अनुकूलता एक बड़ा लाभ है और अब जांचकर्ताओं को विशिष्ट एकल कोशिकाओं को एक कुल से अलग आबादी में अलग करने की अनुमति देता है । यह अपने आप में कोशिकाओं की मिश्रित आबादी युक्त भविष्य के अध्ययनों के लिए कई अनुप्रयोग हैं। उदाहरण के लिए, एकल प्रजातियों के भीतर अन्य प्रजातियों या विषमता के साथ एकत्रीकरण का अध्ययनकरना 6होता है । यह रोमांचक, उच्च संकल्प छंटाई प्रक्रिया कई संस्थानों में व्यापक रूप से उपलब्ध है और कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग हैं। इस अध्ययन में समुच्चय से व्यवहार्य कोशिकाओं को भविष्य के आरएनए-एसईक्यू प्रयोगों के लिए हल किया गया था। अन्य अनुप्रयोगों में प्रोटेओमिक्स शामिल हो सकते हैं; विकासवादी अध्ययनों के लिए समुच्चय का पुनर्स्पंरना, जैसे कि दोहराया एंटीबायोटिक एक्सपोजर के प्रभावों का आकलन; अन्य प्रजातियों के साथ सह-संस्कृति; या मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं(चित्रा 5)के साथ सह-संस्कृति । CLSM इमेजिंग प्रयोगों के साथ इन तरीकों का संयोजन मात्रात्मक डेटा के साथ मनाया बैक्टीरियल लक्षण और व्यवहार के संबंध की अनुमति देता है, बैक्टीरियल समुदायों के तंत्र की पहचान करने की क्षमता के साथ, अंतर प्रजातियों के संबंधों, या रोगाणुरोधी के लिए प्रतिरोध ।

इन तरीकों के कई फायदों के साथ-साथ कुछ नुकसान भी हैं, जिन्हें दूर किया जाना चाहिए । यह अध्ययन सेल व्यवहार्यता के अंतिम बिंदु मार्कर के रूप में पीआई का उपयोग करता है; आदर्श रूप से भविष्य में, इसे कई समय बिंदुओं पर कोशिकाओं में अंतर करने के लिए सेल गतिविधि मॉडल के साथ प्रतिस्थापित किया जाएगा। हालांकि, ये डेटा संस्कृति समुच्चय के लिए SCFM2 के उपयोग को स्थापित करते हैं जिसे लाइव/डेड के अलावा कई तरीकों से हल किया जा सकता है । प्राथमिक लाभ यह है कि समुच्चय को बिना धोने के सीधे एफएएफएस मशीन में स्थानांतरित किया जा सकता है, और प्रयोग के दौरान विकसित किसी भी स्थानिक संरचना का संभावित व्यवधान। कुल मिलाकर, यह एक रोमांचक मंच है जिसका उपयोग कई प्रयोगशालाओं द्वारा पीए,सीएफ और माइक्रोबियल व्यवहार में रुचि रखने वालों के साथ सहयोगी परियोजनाओं को बढ़ावा देने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

एसईई डी को आणविक चिकित्सा विभाग, दक्षिण फ्लोरिडा विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किए गए स्टार्ट-अप फंडों के साथ-साथ एक सीएफएफ रिसर्च ग्रांट (DARCH19G0) एनआईएच (5R21AI147654 - 02 (पीआई, चेन)) और माइक्रोबायोम पर यूएसएफ संस्थान द्वारा समर्थित किया जाता है। हम इस पांडुलिपि से संबंधित डेटा सेट से जुड़े चल रहे सहयोग के लिए Whiteley प्रयोगशाला का शुक्रिया अदा करते हैं । हम FACS छंटाई की सुविधा के लिए डॉ चार्ल्स Szekeres शुक्रिया अदा करते हैं । आंकड़े Biorender.com का उपयोग कर A.D.G.G और एसईई द्वारा बनाए गए थे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amino acids
Alanine Acros Organics 56-41-7
Arginine HCl MP 1119-34-2
Asparagine Acros Organics 56-84-8 Prepared in 0.5 M NaOH
Cystine HCl Alfa Aesar L06328
Glutamic acid HCl Acros Organics 138-15-8
Glycine Acros Organics 56-40-6
Histidine HCl H2O Alfa Aesar A17627
Isoleucine Acros Organics 73-32-5
Leucine Alfa Aesar A12311
Lysine HCl Alfa Aesar J62099
Methionine Acros Organics 63-68-3
Ornithine HCl Alfa Aesar A12111
Phenylalanine Acros Organics 63-91-2
Proline Alfa Aesar A10199
Serine Alfa Aesar A11179
Threonine Acros Organics 72-19-5
Tryptophan Acros Organics 73-22-3 Prepared in 0.2 M NaOH
Tyrosine Alfa Aesar A11141 Prepared in 1.0 M NaOH
Valine Acros Organics 72-18-4
Antibiotic
Carbenicillin Alfa Aesar J6194903
Day-of Stocks
CaCl2 * 2H2O Fisher Chemical C79-500
Dextrose (D-glucose) Fisher Chemical 50-99-7
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Fisher (Avanti Polar Lipids) 4235-95-4 shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform
FeSO4 * 7H2O Acros Organics 7782-63-0 this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh
L-lactic acid Alfa Aesar L13242 pH stock to 7 with NaOH
MgCl2 * 6H2O Acros Organics 7791-18-6
N-acetylglucosamine  TCI A0092
Prepared solids
Porcine mucin Sigma M1778-100G UV-sterilize
Salmon sperm DNA Invitrogen 15632-011
Stain
Propidium iodide Alfa Aesar J66764MC
Salts
K2SO4 Alfa Aesar A13975
KCl Alfa Aesar J64189 add solid directly to buffered base
KNO3 Acros Organics 7757-79-1
MOPS Alfa Aesar A12914 add solid directly to buffered base
NaCl Fisher Chemical S271-500 add solid directly to buffered base
Na2HPO4 RPI S23100-500.0
NaH2PO4 RPI S23120-500.0
NH4Cl Acros Organics 12125-02-9 add solid directly to buffered base
Consumables
Conical tubes (15 mL) Olympus plastics 28-101
Conical tubes (50 mL) Olympus plastics 28-106
Culture tubes w/air flow cap Olympus plastics 21-129
35 mm four chamber glass-bottom dish CellVis NC0600518
Luria Bertani (LB) broth Genessee Scientific 11-118
Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Bioreagents BP2944100
Pipet tips (p200) Olympus plastics 23-150RL
Pipet tips (p1000) Olympus plastics 23-165RL
Serological pipets (5 mL) Olympus plastics 12-102
Serological pipets (25 mL) Olympus plastics 12-106
Serological pipets (50 mL) Olympus plastics 12-107
Ultrapure water (RNase/DNase free); nanopure water Genessee Scientific 18-194 Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1
Syringes (10  mL) BD 794412
Syringes (50 mL) BD 309653
0.22 mm PES syringe filter Olympus plastics 25-244
PS cuvette semi-mico Olympus plastics 91-408
Software
Biorender To prepare the figures
FacsDiva6.1.3 Becton Dickinson, San Jose, CA
Imaris Bitplane version 9.6
Zen Black
Equipment
FacsAriallu Becton Dickinson, San Jose, CA
LSM 880 confocal laser scanning microscope Zeiss

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 170 बायोफिल्म कुल स्यूडोमोनास एरुगिनोसा,एंटीबायोटिक सहिष्णुता सिस्टिक फाइब्रोसिस माइक्रोबियल इंटरैक्शन
एक <em>स्यूडोमोनास एरुगिनोसा</em> संक्रमण मॉडल के वास्तविक समय के आकलन के लिए उपकरण
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Gannon, A. D., Darch, S. E. Tools… More

Gannon, A. D., Darch, S. E. Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model. J. Vis. Exp. (170), e62420, doi:10.3791/62420 (2021).

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