Summary
Il mezzo espettorato della fibrosi cistica sintetica (SCFM2) può essere utilizzato in combinazione sia con la microscopia a scansione laser confocale che con lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza per osservare aggregati batterici ad alta risoluzione. Questo documento descrive in dettaglio i metodi per valutare le popolazioni aggregate durante il trattamento antimicrobico come piattaforma per studi futuri.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (Pa) è uno dei più comuni patogeni opportunistici associati alla fibrosi cistica (FC). Una volta stabilita la colonizzazione della Pa, gran parte dei batteri infettivi forma biofilm all'interno dell'espettorato delle vie aeree. I biofilm di Pa isolati dall'espettorato CF hanno dimostrato di crescere in piccoli aggregati densi di ~ 10-1.000 cellule che sono organizzate spazialmente e mostrano fenotipi clinicamente rilevanti come la tolleranza antimicrobica. Una delle maggiori sfide per studiare come gli aggregati di Pa rispondono al mutevole ambiente dell'espettorato è la mancanza di sistemi nutrizionalmente rilevanti e robusti che promuovano la formazione di aggregati. Utilizzando un mezzo sintetico per l'espettorato CF (SCFM2), la storia di vita degli aggregati di Pa può essere osservata utilizzando la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) e l'analisi delle immagini alla risoluzione di una singola cellula. Questo sistema in vitro permette l'osservazione di migliaia di aggregati di varie dimensioni in tempo reale, tridimensionali, e su scala micron. A livello individuale e di popolazione, avere la capacità di raggruppare gli aggregati per fenotipo e posizione facilita l'osservazione degli aggregati in diversi stadi di sviluppo e la loro risposta ai cambiamenti nel microambiente, come il trattamento antibiotico, da differenziare con precisione.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa (Pa) è un patogeno opportunistico che stabilisce infezioni croniche in individui immuno-compromessi. Per quelli con la malattia genetica fibrosi cistica (FC), queste infezioni possono durare nel corso della vita. La FC provoca l'accumulo di un espettorato viscoso e ricco di sostanze nutritive nelle vie aeree, che viene colonizzato da una varietà di agenti patogeni microbici nel tempo. Pa è uno dei patogeni CF più diffusi, colonizzando le vie aeree nella prima infanzia e stabilendo infezioni difficili da trattare1. La Pa rimane un problema clinico significativo ed è considerata una delle principali cause di mortalità in quelli con FC, nonostante i regimi terapeutici migliorati negli ultimi anni2,3. Questo fenotipo di persistenza e la crescente tolleranza agli antibiotici hanno fatto guadagnare a Pa un posto in un gruppo di patogeni identificati sia dai Centers for Disease Control (CDC) che dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) come priorità di ricerca per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche: i patogeni ESKAPE4.
Come altri patogeni ESKAPE, la resistenza agli antibiotici acquisita è comune in Pa, ma ci sono anche molte proprietà intrinseche che contribuiscono alla tolleranza antimicrobica Pa. Tra questi c'è la capacità di Pa di formare aggregati-cluster altamente densi di ~ 10-1.000 cellule, che possono essere osservati in infezioni multiple, tra cui l'espettorato del paziente CF5,6. Simile alla Pa studiata in altri sistemi di biofilm, gli aggregati di Pa mostrano fenotipi clinicamente rilevanti come l'aumento della resistenza agli antibiotici e l'attivazione della comunicazione cellula-cellula (quorum sensing (QS)). Ad esempio, gli aggregati di Pa hanno dimostrato di utilizzare comportamenti regolati da QS per combattere altri microbi e tollerare trattamenti antimicrobici come la produzione di piocianina7. La capacità di studiare tali comportamenti offre una visione emozionante degli ecosistemi batterici in un ambiente simile a quello in cui esistono nel corpo umano.
Una delle maggiori sfide per studiare come gli aggregati di Pa rispondono al mutevole ambiente dell'espettorato è la mancanza di sistemi nutrizionalmente rilevanti e robusti che promuovano la formazione di aggregati. Gran parte di ciò che si sa sulla Pa è stato scoperto utilizzando sistemi in vitro in cui le cellule crescono planctonicamente o in una caratteristica architettura "a fungo" attaccata alla superficie che non è stata osservata in vivo8. Mentre i modelli classici di crescita del biofilm, come le cellule di flusso o l'agar solido, hanno prodotto una conoscenza ampia e preziosa sui comportamenti batterici e sui meccanismi di tolleranza agli antibiotici, questi risultati non sempre si traducono in vivo. Molti modelli in vitro hanno una capacità limitata di imitare l'ambiente di crescita del sito di infezione umana, rendendo necessari costosi studi in vivo. A loro volta, molti modelli in vivo mancano della flessibilità e della risoluzione offerte dalle tecniche in vitro.
L'espettorato sintetico della fibrosi cistica (SCFM2) è progettato per fornire un ambiente per la crescita di Pa simile a quello sperimentato durante l'infezione cronica nel polmone CF. SCFM2 include fonti nutrizionali identificate nella CF sputa espettorata oltre a mucina, lipidi e DNA. La crescita di Pa in SCFM2 richiede un set genetico quasi identico a quello richiesto per la crescita nell'espettorato reale e supporta la formazione naturale di aggregati di Pa 9,10. Dopo l'inoculazione, le cellule planctoniche formano aggregati che aumentano di dimensioni attraverso l'espansione. Le singole cellule (denominate migranti) vengono rilasciate dagli aggregati, migrano verso aree non colonizzate e formano nuovi aggregati10. Questa storia di vita può essere osservata utilizzando CLSM e l'analisi delle immagini alla risoluzione di una singola cellula. Gli aggregati di Pa formati in SCFM2 sono di dimensioni simili a quelli osservati nel polmone CF10. Questo modello consente l'osservazione di aggregati multipli di varie dimensioni in tempo reale e in tre dimensioni su scala micron. La microscopia time-lapse consente il tracciamento di migliaia (~ 50.000) di aggregati in un unico esperimento. L'uso di software di analisi delle immagini consente la quantificazione di fenotipi aggregati da micrografie, tra cui volume aggregato, superficie e posizione in tre dimensioni fino all'aeroporto di 0,1 μm, sia a livello di aggregato individuale che di popolazione. Avere la capacità di raggruppare gli aggregati per fenotipo e posizione consente la differenziazione degli aggregati in diversi stadi di sviluppo con precisione, nonché la loro risposta a un microambiente mutevole6,11.
L'applicazione di SCFM2 per studiare aggregati di Pa in saggi a basso volume e ad alto rendimento lo rendono un modello flessibile ed economico. Come mezzo definito, SCFM2 offre uniformità e riproducibilità su più piattaforme, fornendo un metodo nutrizionalmente e fisicamente rilevante per studiare gli aggregati di Pa in vitro9. Le applicazioni includono il suo uso in combinazione con CLSM per osservare l'organizzazione spaziale e la tolleranza agli antibiotici ad alta risoluzione (come descritto in questo documento sui metodi). La capacità di eseguire esperimenti che forniscono dati in tempo reale su scala micron consente lo studio delle interazioni intra-specie e inter-specie come possono verificarsi in vivo. Ad esempio, SCFM2 è stato precedentemente utilizzato per studiare le dinamiche spaziali della comunicazione cellula-cellula in popolazioni aggregate attraverso una rete di sistemi utilizzati da Pa per regolare più geni che contribuiscono alla virulenza e alla patogenesi6.
Figura 1: Rappresentazione grafica delle principali fasi sperimentali. (A) SCFM2 viene inoculato con cellule Pa e lasciato formare aggregati in un piatto di coltura con fondo di vetro. (B) Gli aggregati vengono trasferiti al microscopio confocale e viene aggiunto l'antibiotico. Sono raffigurate tre repliche tecniche (camere 1-3) e un pozzo di controllo (4) di SCFM2 inoculato senza trattamento antibiotico. Gli aggregati vengono ripresi utilizzando CLSM nel corso di 18 ore. (C) Dopo l'imaging iniziale di 18 ore, gli aggregati vengono trattati con ioduro di propidio per visualizzare le cellule morte e ripresi utilizzando CLSM (D) Gli aggregati con fenotipo desiderato vengono separati da SCFM2 utilizzando FACS. Abbreviazioni: SCFM2 = mezzo espettorato sintetico della fibrosi cistica; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = microscopia a scansione laser confocale; FACS = selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Qui, viene dimostrata l'utilità di SCFM2 per studiare l'impatto del trattamento antibiotico sugli aggregati di Pa in tempo reale, seguita dall'uso di un approccio di ordinamento cellulare per isolare popolazioni di aggregati con fenotipi distinti per l'analisi a valle (Figura 1).
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Protocol
1. Preparare il mezzo sintetico per la fibrosi cistica (SCFM2)
NOTA: La preparazione di SCFM2 comprende tre fasi principali descritte di seguito (Figura 2). Per i dettagli completi e i riferimenti, vedere9,10,12.
Figura 2: Preparazione e inoculazione del mezzo SCFM2. (A) La base tamponata è preparata utilizzando sali e amminoacidi elencati nelle tabelle 1 e 2. La base tamponata può essere conservata a 4 °C per un massimo di 30 giorni, ma deve essere protetta dall'esposizione alla luce. (B) La mucina e il DNA vengono aggiunti ad un'aliquota di base tamponata e disciolti in soluzione durante la notte a 4 °C. (C) I lipidi e le scorte aggiuntive vengono aggiunti alla soluzione durante la notte e incubati a 37 °C con agitazione a 250 giri/min per 20 minuti. SFCM2 viene quindi inoculato con celle lavate in fase logaritrica a un OD600 = 0,05. Abbreviazioni: SCFM2 = mezzo espettorato della fibrosi cistica sintetica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Sterilizzazione della mucina suina
- Preparare la mucina sterile ad una concentrazione finale di 5 mg/mL in SCFM2. Ad esempio, per un volume di 5 ml di SCFM2, pesare 25 mg di mucina di tipo II in una capsula di Petri sterile e metterlo in uno sterilizzatore ultravioletto (UV) per 4 ore, agitando delicatamente ogni ora.
- Dopo 4 ore, trasferire la mucina trattata con UV in tubi autoclavati da 1,7 ml in condizioni sterili e conservare a -20 °C.
- Per confermare la completa sterilizzazione, sciogliere un campione di mucina in un liquido sterile, come acqua o brodo Luria Bertani (LB), e osservare al microscopio.
NOTA: La mucina sterilizzata può essere conservata a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
- Preparazione della base tamponata
- Preparare soluzioni stock di sale e amminoacidi aggiungendo le quantità appropriate in peso all'acqua deionizzata come elencato nella Tabella 1. Filtrare tutte le soluzioni di riserva utilizzando un filtro da 0,22 μm, avvolgere in un foglio per proteggere dalla degradazione della luce e conservare a 4 °C per un massimo di un mese.
- Preparare la base tamponata combinando 190 ml di acqua deionizzata con aminoacidi e soluzioni saline per volumi elencati nella Tabella 1. Regolare la soluzione a pH 6,8 e aumentare fino a un volume finale di 250 ml. Filtrare con un filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C per un massimo di 30 giorni.
- La sera prima dell'esperimento, aliquotare la quantità desiderata di base tamponata in un pallone di coltura di vetro e aggiungere mucina (5 mg/mL come descritto al punto 1.1.1) e DNA di spermatozoi di salmone purificato (0,6 mg/mL). Agitare delicatamente, avvolgere in un foglio e lasciare a 4 °C durante la notte per consentire alla mucina e al DNA di dissolversi in soluzione.
NOTA: le aliquote del DNA dello sperma di salmone devono essere scongelate sul ghiaccio, vorticose e aggiunte alla base tamponata e alla mucina. Le soluzioni stock di triptofano, asparagina e tirosina devono essere preparate in soluzioni di NaOH (vedere Tabella 1 per le concentrazioni) anziché in acqua deionizzata. Mantenere la base tamponata e tutte le soluzioni stock avvolte in un foglio per proteggere dall'esposizione alla luce. La maggior parte delle azioni sarà stabile per un massimo di un mese. Le scorte che diventano scolorite non devono essere utilizzate e devono essere sostituite prima dell'uso.
- Aggiunta di scorte supplementari
- Il giorno dell'esperimento, aggiungere le scorte elencate nella tabella 2 alla base tamponata contenente mucina e DNA.
NOTA: Preparare unasoluzione fresca di FeSO 4 il giorno dell'esperimento, ma tutte le altre scorte possono essere prodotte in anticipo e conservate per 30 giorni a 4 °C. 1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) contiene cloroformio. Maneggiare con cautela e non utilizzare vicino a fiamme libere. Dopo l'aggiunta di DOPC, incubare SCFM2 a 37 °C con agitazione (250 rpm) per almeno 20 min (per 5 mL di coltura). Questo periodo di incubazione consente al cloroformio nel DOPC di evaporare. Il pallone non deve essere ermetico; coprire invece l'apertura del pallone liberamente con un foglio.
- Il giorno dell'esperimento, aggiungere le scorte elencate nella tabella 2 alla base tamponata contenente mucina e DNA.
2. Valutazione in tempo reale della tolleranza antimicrobica negli aggregati batterici
- Preparare colture notturne
- La sera prima dell'esperimento, inoculare 5 mL di brodo LB con diverse colonie di Pa PAO1-pMRP9-113 da una piastra di agar LB contenente antibiotico (carbenicillina 300 μg / mL). Crescere durante la notte a 37 °C con agitazione a 250 giri/min.
NOTA: Coltivare colture notturne con l'aggiunta di antibiotici necessari per la selezione dei plasmidi richiesti (qui, il plasmide di espressione della proteina fluorescente verde (GFP), pMRP9-1). Si noti che le cellule Pa devono essere lavate prima che SCFM2 venga inoculato. LB può essere sostituito da altri ricchi mezzi di laboratorio per colture notturne. Tutti gli isolati batterici devono essere maneggiati utilizzando le linee guida BSL-2 appropriate in tutto questo protocollo.
- La sera prima dell'esperimento, inoculare 5 mL di brodo LB con diverse colonie di Pa PAO1-pMRP9-113 da una piastra di agar LB contenente antibiotico (carbenicillina 300 μg / mL). Crescere durante la notte a 37 °C con agitazione a 250 giri/min.
- Inoculare SCFM2
- Il giorno dell'esperimento, diluire nuovamente le colture notturne di Pa 1:10 (coltura: mezzi liquidi) inoculando 500 μL in 5 ml di brodo LB fresco. Far crescere le cellule fino alla fase logarittiva (60-90 min) a 37 °C con agitazione a 250 rpm.
- Centrifughe log phase cultures a 10.000 × g per 5 min. Lavare le cellule rimuovendo il surnatante e riconsospendo in 3 ml di soluzione salina tamponata con fosfato sterilizzato con filtro (PBS, pH 7,0). Ripetere due volte e risusciere il pellet in un volume finale di 1 mL di PBS.
- Misurare l'assorbanza delle cellule lavate utilizzando uno spettrofotometro a 600 nm (OD600)e calcolare il volume di coltura richiesto per un OD600 iniziale di 0,05 in 5 mL di SCFM2. Inoculare Pa nell'SCFM2 e vortice delicatamente per distribuire le cellule in tutto. Pipettare 1 mL dell'SCFM2 inoculato in ogni camera di un fondo di vetro a 4 pozzetto, piatto ottico e incubare per 4 ore staticamente a 37 °C.
NOTA: Il tempo di raddoppio delle colture di Pa dipende dal ceppo e dalla disponibilità di ossigeno. In SCFM2, nelle condizioni qui descritte, il tempo di raddoppio di Pa è ~ 1.4 h10.
3. Visualizzazione di aggregati durante il trattamento antibiotico con microscopia a scansione laser confocale (CLSM)
NOTA: Questa sezione descrive l'uso del microscopio a scansione laser confocale e del software di acquisizione delle immagini per l'imaging di aggregati di Pa in SCFM2. L'obiettivo è osservare e caratterizzare la biomassa batterica residua (tollerante) dopo il trattamento con antibiotici. I passaggi delineati possono essere eseguiti con successo su altri microscopi confocali, anche se il manuale operativo dello strumento dovrebbe essere referenziato per una guida specifica.
- Image Pa si icoltura utilizzando una camera riscaldata o una micropiastra riscaldata montata sullo stadio del microscopio per mantenere una temperatura ambiente di 37 °C. Avviare il modulo di incubazione almeno 2 ore prima dell'inizio dell'esperimento per consentire a tutti gli apparecchi di raggiungere la temperatura desiderata e ridurre ulteriormente l'espansione e il movimento durante la raccolta dei dati.
- Dopo 4 ore, trasferire le colture SCFM2 contenenti cellule Pa allo stadio di microscopio riscaldato. Designare 3 pozzi su 4 come repliche tecniche per il trattamentoantibiotico e considerare il 4 ° pozzo come un controllo senza trattamento, contenente solo cellule Pa in SCFM2, senza antibiotico. Identificare gli aggregati utilizzando la microscopia a campo luminoso all'interno della scheda Individua prima di qualsiasi eccitazione dei reporter fluorescenti. Definire un'area per l'imaging all'interno di ciascun pozzo e memorizzarne la posizione (coordinate x-y-z) utilizzando il modulo Posizioni nel software di imaging.
- Utilizzare un obiettivo di immersione in olio 63x per visualizzare colture di Pa contenenti il plasmide di espressione GFP pMRP9-1 in SCFM2 con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 509 nm. Scatta immagini utilizzando l'opzione z-stack all'interno del modulo di acquisizione a intervalli di 1 μm (totale di 60 fette). Utilizzare il modulo Line-mediaaging per ridurre la fluorescenza di fondo nel canale GFP all'interno del volume totale delle immagini z-stack da 60 μm (1.093,5 mm3). Prendi le immagini di controllo di SCFM2 non inoculato utilizzando impostazioni identiche per determinare la fluorescenza di sfondo per l'analisi delle immagini.
NOTA: le immagini vengono acquisite producendo immagini z-stack a 8 bit a 8 bit da 512 pixel x 0,26 pixel a 8 μm (0,26 μm pixel) che si trovano a 60 μm dalla base del coverslip. - Utilizzare l'opzione serie temporali all'interno del software di imaging per acquisire 60 fette in ogni posizione (pozzo) a intervalli di 15 minuti per un periodo di 18 ore. Utilizzare la strategia di messa a fuoco definita all'interno del software per memorizzare un piano focale per ogni posizione, che viene restituito in ogni punto temporale durante l'esperimento.
- Dopo un totale di 4,5 ore di incubazione, immagina ogni posizione utilizzando le impostazioni di cui sopra per determinare la biomassa aggregata all'interno di ciascuno dei quattro pozzedi prima dell'aggiunta di antibiotico.
- Dopo 6 ore di incubazione totale, aggiungere antibiotico a 2 volte al di sotto della concentrazione minima inibitoria (MIC) a ciascuna replicazione. Pipettare direttamente e delicatamente nel mezzo del pozzo, appena sotto l'interfase aria-liquido. Mantenere tutte le colture nella camera confocale riscaldata.
NOTA: Qui è stato utilizzato colistina solfato ad una concentrazione di 140 μg/mL. - Inizia il trattamento post-antibiotico di imaging facendo clic sull'opzione Avvia esperimento all'interno del programma di imaging.
NOTA: La concentrazione di antibiotici utilizzati dipende dall'antibiotico, dall'isolato di Pa e dal fatto che l'utente desideri esaminare gli effetti di uccisione o tolleranza. Questo esperimento utilizza una singola dose. Ulteriori dosi possono essere aggiunte senza interrompere le colture, se necessario.
4. Colorazione dello ioduro di propidio degli aggregati di Pa
NOTA: Lo ioduro di propidio (PI) è comunemente utilizzato come reagente colorante per identificare cellule batteriche non vitali (morte) in coltura. Qui, viene utilizzato per identificare gli aggregati sensibili al trattamento antibiotico applicato nella sezione 3. In tutto questo protocollo, l'espressione e il rilevamento di GFP nelle cellule Pa viene utilizzato come proxy principale per la vitalità cellulare. Questa fase finale consente di utilizzare ancora una volta l'imaging confocale per identificare il posizionamento spaziale di aggregati vivi / morti in relazione tra loro. Inoltre, gli aggregati sono identificati come vivi/morti per un ulteriore smistamento cellulare a valle nella sezione 5.
- Dopo 18 ore, aggiungere PI a ciascun pozzo della parabola ottica a quattro camere contenente colture SCFM2. Seguire le istruzioni del produttore per il volume di PI e il tempo di incubazione(ad esempio,~ 2 μL per mL di coltura, ~ 20-30 min).
5. Isolare le cellule vive dagli aggregati utilizzando un approccio FACS
NOTA: FACS presenta una potente piattaforma per ordinare e isolare gruppi di cellule in base a un fenotipo con tag fluorescenti. Qui, FACS viene utilizzato per isolare aggregati vivi (tolleranti agli antibiotici) da aggregati non vitali.
- Dopo la colorazione con ioduro di propidio, rimuovere le colture dall'incubazione e trasferirle su uno strumento FACS in un contenitore isolato per mantenere 37 °C.
- Eseguire aliquote da 1 mL di SCFM2 contenenti aggregati di Pa alla portata più bassa.
NOTA: ogni aliquota conterrà ~15.000 aggregati. - Per rilevare la GFP, illuminare le celle con un laser a 488 nm e registrare l'altezza del segnale fluorescente a 530/30 nm. Visualizza la colorazione PI per eccitazione con un laser a 561 nm e registra l'altezza del segnale fluorescente a 610/20 nm. Eseguire l'ordinamento utilizzando un ugello da 70 u.
NOTA: le aggregazioni ordinate possono essere raggruppate in più modi a seconda dell'applicazione dell'utente. In questo caso, FACS è stato utilizzato per ordinare aggregati di Pa vitali per il sequenziamento dell'RNA a valle. Le applicazioni alternative sono discusse di seguito.
6. Analisi delle immagini
NOTA: la microscopia time-lapse genera grandi quantità di dati. Un esperimento di 18 ore per l'osservazione di aggregati di Pa in SCFM2 identifica circa 50.000 aggregati nel tempo, che hanno il potenziale per essere caratterizzati per il volume e il posizionamento spaziale. Utilizzare un software di analisi delle immagini per quantificare le dinamiche di aggregazione in SCFM2:
- Per gli studi aggregati in SCFM2, quantificare la fluorescenza GFP di fondo creando un istogramma di conteggi nel canale GFP che viene prodotto per SCFM2 e SCFM2 non inoculati inoculati con ceppo Pa PAO1 che trasporta pMRP9-1. Per garantire che i voxel GFP rilevati siano correlati alla biomassa Pa, definire un voxel GFP+ come ≥ 1,5 volte il valore di conteggio dello sfondo GFP.
NOTA: La fluorescenza di fondo è definita come il più alto valore voxel di tre posizioni scelte casualmente, mediate. I conteggi degli sfondi sono, come misura standard, sottratti da tutti i pixel nelle immagini sperimentali dal software di analisi delle immagini. - Dopo la sottrazione di sfondo nel modulo Surpass, produrre isosuperfici per tutti i voxel rimanenti.
- Per rilevare singole aggregazioni, attivare l'opzione Dividi oggetti e definire le aggregazioni come oggetti con volumi di ≥5 μm3. Utilizzare il modulo Vantage nel software di analisi delle immagini per calcolare il volume, x-y-z e la somma dei voxel GFP per ogni singolo oggetto. Esporta questi dati su una piattaforma statistica esterna.
NOTA: alcuni software di analisi delle immagini consentono l'esportazione di più fentoipi quantitativi contemporaneamente, consentendo di calcolare le correlazioni. - Filtrare i dati esportati dal modulo Vantage in base alle dimensioni per garantire che non rimangano oggetti di <0,5μm 3 (biomassa dispersa). Per ogni singolo oggetto all'interno dell'immagine, calcolare la distanza da se stessa in relazione ad altri oggetti (aggregati) utilizzando il modulo Vantage del software di analisi delle immagini o manualmente con la seguente equazione.
d = sqrt((x2− x1)2 + (y2− y1)2 + (z2− z1)2) (1) - Utilizzare i calcoli SUM e AVERAGE per trovare la biomassa totale e il volume aggregato medio. In alternativa, esportare i dati in altre piattaforme statistiche o script, ad esempiola distribuzione di aggregati attraverso la biomassa come discusso nei risultati rappresentativi (script non pubblicato in collaborazione con il laboratorio Whiteley, Georgia Institute of Technology).
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Representative Results
Questo lavoro descrive i metodi per osservare gli aggregati di Pa ad alta risoluzione e in un ambiente simile a quello dell'infezione cronica del polmone CF9,10,12. SCFM2 fornisce un sistema in vitro che promuove l'aggregazione naturale delle cellule Pa in dimensioni simili a quelle osservate durante l'infezione effettiva10. L'adattabilità di SCFM2 come mezzo definito può essere sfruttata per affrontare molte strade di ricerca. L'obiettivo di questo lavoro è quello di evidenziare un flusso di lavoro che coinvolge una combinazione di microscopia e FACS, con l'intenzione di incoraggiarne l'uso per future ricerche, collaborazioni e applicazioni.
L'uso di CLSM consente l'imaging temporale ad alta risoluzione che può essere utilizzato per studiare le dinamiche delle popolazioni batteriche in via di sviluppo. Questo lavoro dimostra diversi modi potenziali con cui gli aggregati di Pa possono essere caratterizzati dopo il trattamento con antibiotico. La Figura 3A fornisce un'ampia visione degli aggregati di Pa vitali dopo il trattamento antibiotico. Quattro ore dopo l'applicazione dell'antibiotico, rimangono più aggregati; gli intervalli di colori possono essere applicati per rappresentare caratteristiche diverse di ogni singolo aggregato. Esempi di caratteristiche quantificabili includono volume, area, intensità voxel (per l'uso di reporter fluorescenti) e posizione in uno degli assi x-y-z.
L'analisi delle immagini tramite software dedicato consente l'osservazione completamente personalizzabile dei dati, identificando ogni aggregato come un singolo oggetto, in cui i dati quantitativi possono essere esportati per ulteriori analisi. La Figura 3B fornisce un esempio di come possono essere utilizzati i dati esportati. Qui, la biomassa totale delle popolazioni aggregate può essere calcolata nel tempo. In questi dati rappresentativi, il trattamento con antibiotico riduce significativamente la biomassa rispetto agli aggregati non trattati. Supplemental Video S1 è una potente rappresentazione di come la microscopia delle serie temporali può essere utilizzata per osservare fisicamente gli aggregati all'interno di questi dati sulla biomassa dopo il trattamento antibiotico. Ogni aggregato è stato codificato a colori per rappresentare il volume calcolato (μm3),consentendo una registrazione visiva delle popolazioni aggregate, che può essere utilizzata anche per ulteriori analisi spaziali utilizzando applicazioni, sia all'interno del software di analisi delle immagini che di altre risorse (non discusse qui10,15).
Gli esperimenti sviluppati per identificare i meccanismi di tolleranza agli antibiotici negli aggregati di Pa producono grandi quantità di dati. Ogni replica produce dati fisici di ~ 15.000 aggregati (~ 60.000 aggregati in totale). Un nuovo approccio alla gestione di questi dati ha comportato la produzione di mappe di calore aggregate (Figura 3C). Calcolando come gli aggregati di diverse dimensioni contribuiscono alla popolazione complessiva, è possibile identificare i modelli di come gli aggregati rispondono al trattamento antibiotico in relazione alle loro dimensioni, forma e posizione l'uno rispetto all'altro.
Figura 3: Esempi di analisi dei dati aggregati. (A) Panoramica della biomassa aggregata residua dopo il trattamento antibiotico. Le isosuperfici dei corrispondenti voxel GFP sono state renderizzate e codificate a colori in base al volume (μm3). Barra della scala = 30 μm. (B) Biomassa totale (μm3) delle popolazioni aggregate di Pa nel tempo in SCFM2. La linea blu rappresenta gli aggregati non trattati, la linea rossa rappresenta gli aggregati trattati con l'antibiotico, la colistina (140 μg/ml). I dati presentati includono 3 repliche biologiche (± SEM). (C) Mappe termiche del volume aggregato che rappresentano il contributo dei singoli aggregati in volume(μm 3, asse x) alla biomassa totale(μm 3, secondo asse y) nel tempo (asse h, y). I dati rappresentativi includono aggregati di Pa in presenza e assenza di antibiotici (come nella Figura 3B), dove 0 h rappresenta il tempo di aggiunta di antibiotici dopo 6 ore di crescita aggregata. I dati includono tre repliche biologiche (~ 50.000 aggregati totali). Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; SCFM2 = mezzo espettorato sintetico della fibrosi cistica; SEM = errore standard della media; Pa = Pseudomonas aeruginosa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'analisi spaziale in questa fase comporta l'utilizzo dell'espressione di GFP da parte di Pa come proxy per la vitalità in presenza di antibiotici. L'aggiunta di PI dopo 18 h permette l'identificazione della posizione degli aggregati non vitali in relazione agli aggregati vitali (Figura supplementare S1). L'obiettivo generale di questo metodo è identificare modelli spaziali tra aggregati sensibili e tolleranti dopo il trattamento con antibiotici. Gli studi futuri includeranno più punti temporali oltre al test del punto finale sopra descritto.
La fase finale del flusso di lavoro utilizza un approccio basato su FACS per ordinare gli aggregati in SCFM2. Questo lavoro dimostra la capacità del FACS di separare le cellule vitali dalla restante popolazione di aggregati (compresi quelli non vitali). La Figura 4 mostra l'uso di FACS per mettere in comune aggregati vitali per ulteriori esperimenti come il sequenziamento ad alto rendimento, ad esempioil sequenziamento dell'RNA (RNA-seq). Dopo il trattamento con antibiotici (la Figura 4A rappresenta un punto temporale (18 h), le aliquote di SCFM2 contenenti aggregati di Pa possono essere separate con successo in base alle loro caratteristiche fluorescenti. Qui, GFP è stato identificato per aggregati tolleranti. La Figura 4B fornisce un esempio di uno di questi eventi di ordinamento, in cui le cellule che esprimono GFP sono separate dalla coltura rimanente (aggregati trattati con PI). Inoltre, gli aggregati possono essere chiaramente identificati da SCFM2, che produce il proprio profilo fluorescente. La possibilità di ordinare le celle in questo modo ha molte applicazioni (Figura 5).
Figura 4: FACS degli aggregati di Pa in SCFM2. (A) Diagramma di uno strumento FACS utilizzato per separare aggregati di Pa vitali e non vitali da SCFM2. (B) Grafico rappresentativo di aggregati separati in SCFM2 generati dal software FACS. Tre quadranti indicano aggregati vivi (GFP), coltura rimanente contenente cellule non vitali (RFP è usato come alternativa alla colorazione dello ioduro di propidio qui, entrambi eccitabili dal laser a 488 nm) e controllo SCFM2. I dati rappresentano 1 delle 3 repliche biologiche contenenti ~ 15.000 eventi (aggregati). Abbreviazioni: FACS = selezione cellulare attivata dalla fluorescenza; SCFM2 = mezzo espettorato sintetico della fibrosi cistica; Pa = Pseudomonas aeruginosa; GFP = proteina fluorescente verde; RFP = proteina fluorescente rossa; PE-Texas Red-H = altezza di picco per le cellule colorate coniugate di ficoeritrina-Texas Red; FITC-H = altezza di picco per le cellule colorate con isotiocianato di fluoresceina.
Figura 5: Potenziali applicazioni sperimentali che utilizzano SCFM2. (A) Esposizione di aggregati di Pa a dosi ripetute di antibiotici. (B) Co-coltura di aggregati di Pa con altre specie batteriche. (C)L'esposizione di aggregati di Pa alle cellule immunitarie ospiti, ad esempioPMN. A, Be C può essere combinata con metodi di imaging CLSM e approccio FACS per l'analisi spaziale a valle di RNA-seq, proteomica o 3D. Abbreviazioni: SCFM2 = mezzo espettorato sintetico della fibrosi cistica; Pa = Pseudomonas aeruginosa; PMN = leucociti polimorfonucleati; CLSM = microscopia a scansione laser confocale; FACS = selezione cellulare attivata dalla fluorescenza; RNA-seq = sequenziamento dell'RNA; 3D = tridimensionale; LC-MS/MS = cromatografia liquida/spettrometria di massa tandem. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Chimico | Concentrazione di stock (M) | Concentrazione finale (mM) | Note |
| NaH2PO4 | 0.2 | 1.3 | |
| Na2HPO4 | 0.2 | 1.25 | |
| KNO3 · | 1 | 0.35 | |
| K2SO4 | 0.25 | 0.27 | |
| NH4Cl | 2.28 | Aggiungi solido direttamente alla base buffered | |
| Kcl | 14.94 | Aggiungi solido direttamente alla base buffered | |
| NaCl | 51.85 | Aggiungi solido direttamente alla base buffered | |
| MOPS | 10 | Aggiungi solido direttamente alla base buffered | |
| Ser | 0.1 | 1.45 | |
| Colla HCl | 0.1 | 1.55 | |
| Pro | 0.1 | 1.66 | |
| Gly | 0.1 | 1.2 | |
| Ala · | 0.1 | 1.78 | |
| Val | 0.1 | 1.12 | |
| Incontrato | 0.1 | 0.63 | |
| Ile | 0.1 | 1.12 | |
| Leu | 0.1 | 1.61 | |
| Orn HCl | 0.1 | 0.68 | |
| Lys HCl | 0.1 | 2.13 | |
| Arg HCl | 0.1 | 0.31 | |
| Trp | 0.1 | 0.01 | Preparato in 0,2 M NaOH |
| Aspide | 0.1 | 0.83 | Preparato in 0,5 M NaOH |
| Tyr | 0.1 | 0.8 | Preparato in 1,0 M NaOH |
| Thr | 0.1 | 1.07 | |
| Cys HCl | 0.1 | 0.16 | |
| Phe | 0.1 | 0.53 | |
| Il suo HCl H2O | 0.1 | 0.52 | |
| DNA dello sperma di salmone | 0,6 mg/ml | ||
| Mucina suina | 5 mg/nL |
Tabella 1: Preparazione di sale, amminoacidi, DNA e mucina necessari per la base tamponata del mezzo espettorato della fibrosi cistica sintetica, SCFM2.
| Chimico | Concentrazione di stock (M) | Concentrazione finale (mM) | Note |
| Destrosio (D-glucosio) | 1 | 3 | |
| Acido L-lattico | 1 | 9.3 | Regolare a pH 7.0 con NaOH |
| CaCl2* 2H2O | 1 | 1.75 | |
| MgCl2*6H2O | 1 | 0.61 | |
| FeSO4*7H2O | 1 mg/ml | 0.0036 | Fai fresco ogni giorno |
| N-acetilglucosamina | 0.25 | 0.3 | |
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) | 25 mg/mL | 100 μg/ml | Incubare per almeno 20 minuti a 37 °C dopo l'aggiunta |
Tabella 2: Preparazione delle scorte supplementari necessarie per la base tamponata del mezzo espettorato sintetico della fibrosi cistica, SCFM2.
Figura supplementare S1: Aggregati di Pa in SCFM2. Una micrografia confocale renderizzata di aggregati di Pa vitali (verdi) e non vitali (rossi) formati in SCFM2. Barra della scala = 5 μm. Abbreviazioni: SCFM2 = mezzo espettorato sintetico della fibrosi cistica; Pa = Pseudomonas aeruginosa. Fare clic qui per scaricare questo file.
Video supplementare S1: Aggregati in SCFM2 dopo trattamento con antibiotico. Pa aggrega le immagini acquisite ogni 30 minuti in SCFM2 utilizzando CLSM. Gli aggregati sono etichettati singolarmente da colori che rappresentano il volume aggregato (μm3, scala di colori non mostrata come immagine rappresentativa). Barra di scala = 5 μm. Abbreviazioni: SCFM2 = mezzo espettorato sintetico della fibrosi cistica; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = microscopia a scansione laser confocale. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Questo lavoro ha introdotto metodologie che possono essere combinate per studiare le popolazioni di aggregati batterici in presenza e assenza di trattamento antibiotico. ClSM ad alta risoluzione consente la visualizzazione dei cambiamenti nella biomassa aggregata e l'orientamento strutturale degli aggregati in tempo reale quando esposti agli antibiotici. Inoltre, le caratteristiche fisiche e strutturali della biomassa che rimangono dopo il trattamento con antibiotici possono essere quantificate, con l'obiettivo di correlare queste osservazioni con futuri studi di espressione genica che utilizzano RNA-seq. Mentre l'uso di cellule che esprimono GFP consente la visualizzazione del comportamento collettivo e individuale delle cellule tolleranti agli antibiotici, fornisce solo una parte del quadro generale. Molto si può imparare dal posizionamento spaziale di cellule che non sono sopravvissute al trattamento antibiotico, sia individualmente che in relazione alla biomassa sopravvissuta e tollerante.
La microscopia time-lapse genera grandi quantità di dati. Un esperimento di 18 ore per l'osservazione di aggregati di Pa in SCFM2 identifica circa 50.000 aggregati nel tempo, che hanno il potenziale per essere caratterizzati per il volume e il posizionamento spaziale. Il CLSM utilizzato qui (vedi la Tabella dei materiali)cattura immagini ad alta risoluzione di aggregati in via di sviluppo per l'analisi. Il posizionamento spaziale di un singolo aggregato (rispetto agli aggregati circostanti) in tre dimensioni (± 0,1 μm) può essere utilizzato per consentire misurazioni precise della distanza tra gli aggregati. I fenotipi fisici degli aggregati batterici possono essere determinati utilizzando una combinazione di approcci di analisi. Il software di imaging fornisce il rendering delle superfici e il posizionamento tridimensionale (3D). Gli script generati internamente possono essere utilizzati per ordinare gli aggregati per fenotipo(ad esempio,volume) e calcolare la distribuzione della biomassa rileccata in dimensioni. Sono disponibili risorse aggiuntive per segmentare le singole celle all'interno di aggregati(ad esempio,per supportare l'uso di reporter trascrizionali14). Combinati, questi strumenti di analisi forniscono un'ampia valutazione dei fenotipi aggregati, con la flessibilità di modificare le analisi per gli interessi emergenti man mano che i dati vengono generati.
Dopo l'imaging iniziale di 18 ore, gli aggregati sono stati trattati con PI, una tecnica spesso indicata come colorazione viva / morta. PI entra nelle cellule con una membrana porosa (compromessa), consentendo la visualizzazione di cellule morte o gravemente stressate in contrasto con le cellule vive che esprimono GFP. L'organizzazione spaziale delle comunità batteriche nel polmone CF come aggregati può fornire informazioni sui comportamenti della comunità batterica. L'identificazione di cellule vitali e non vitali, che vengono sequestrate all'interno di un aggregato, facilita l'identificazione della distribuzione delle cellule all'interno della comunità che possono essere più sensibili al trattamento antibiotico. Quantificare i cambiamenti fisici che gli aggregati subiscono in risposta agli antibiotici e identificare le caratteristiche genotipiche degli aggregati tolleranti agli antibiotici potrebbe informare le future terapie contro la Pa.
L'uso di PI ha anche applicazioni a valle nell'approccio FACS del flusso di lavoro, anche se va notato che non è sempre necessario, poiché le cellule vitali in questo esperimento possono essere differenziate dall'espressione GFP. Tuttavia, la colorazione PI consente di ottenere informazioni spaziali dagli aggregati alla fine di ciascun test. Evidenziando l'uso di FACS per ordinare gli aggregati, questo documento sui metodi dimostra 1) che SCFM2 può essere utilizzato in una macchina FACS senza causare danni o zoccoli nonostante la sua viscosità, 2) FACS può essere utilizzato per separare singole cellule da un aggregato e raggrupparle in popolazioni distinte (fenotipi) e 3) la colorazione PI ha utilità per separare le cellule morte da una popolazione con FACS, in particolare se le altre cellule di interesse non esprimono un marcatore fluorescente. L'uso di tecniche di colorazione delle cellule vive evidenzia l'applicazione di questo protocollo per l'uso di isolati clinici in cui la manipolazione genetica è spesso difficile. Sebbene l'ottimizzazione sia probabilmente necessaria ceppo per ceppo, i fenotipi aggregati possono essere identificati alla stessa risoluzione utilizzando molti fluorofori disponibili in commercio.
La compatibilità di SCFM2 con FACS è un enorme vantaggio e ora consente ai ricercatori di isolare singole cellule specifiche da un aggregato in popolazioni distinte. Questo stesso ha molte applicazioni per studi futuri contenenti popolazioni miste di cellule. Ad esempio, lo studio dell'aggregazione con altre specie o dell'eterogeneità all'interno di singole specie aggrega6. Questo entusiasmante processo di smistamento ad alta risoluzione è ampiamente disponibile in molte istituzioni e ha molte applicazioni a valle. Le cellule vitali degli aggregati in questo studio sono state ordinate per futuri esperimenti RNA-seq. Altre applicazioni potrebbero includere la proteomica; ricampionamento di aggregati per studi evolutivi, come la valutazione degli effetti dell'esposizione ripetuta agli antibiotici; co-coltura con altre specie; o co-coltura con cellule immunitarie umane (Figura 5). La combinazione di questi metodi con esperimenti di imaging CLSM consente la correlazione dei tratti e dei comportamenti batterici osservati con dati quantitativi, con il potenziale per identificare meccanismi di comunità batteriche, relazioni intra-specie o resistenza agli antimicrobici.
Accanto ai numerosi vantaggi di queste metodologie, ci sono alcune insidie che dovrebbero essere affrontate. Questo studio utilizza PI come marcatore end-point della vitalità cellulare; idealmente in futuro, questo sarebbe sostituito con modelli di attività cellulare per differenziare le cellule su più punti temporali. Tuttavia, questi dati stabiliscono l'uso di SCFM2 per gli aggregati di cultura che possono essere ordinati in più modi diversi da vivi / morti. Il vantaggio principale è che gli aggregati possono essere trasferiti direttamente alla macchina FACS senza lavaggio e potenziale interruzione di qualsiasi struttura spaziale sviluppata nel corso di un esperimento. Nel complesso, questa è una piattaforma entusiasmante che potrebbe essere utilizzata da molti laboratori per promuovere progetti collaborativi con coloro che sono interessati a Pa,CF e comportamenti microbici.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
S.E.D è supportato da fondi di start-up forniti dal Dipartimento di Medicina Molecolare, The University of South Florida, nonché da una borsa di ricerca CFF (DARCH19G0), dal N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, Chen)) e dall'USF Institute on Microbiomes. Ringraziamo il laboratorio whiteley per la collaborazione in corso che coinvolge set di dati relativi a questo manoscritto. Ringraziamo il Dr. Charles Szekeres per aver facilitato lo smistamento FACS. Le figure sono state create da A.D.G e S.E.D utilizzando Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino acids | |||
| Alanine | Acros Organics | 56-41-7 | |
| Arginine HCl | MP | 1119-34-2 | |
| Asparagine | Acros Organics | 56-84-8 | Prepared in 0.5 M NaOH |
| Cystine HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
| Glutamic acid HCl | Acros Organics | 138-15-8 | |
| Glycine | Acros Organics | 56-40-6 | |
| Histidine HCl H2O | Alfa Aesar | A17627 | |
| Isoleucine | Acros Organics | 73-32-5 | |
| Leucine | Alfa Aesar | A12311 | |
| Lysine HCl | Alfa Aesar | J62099 | |
| Methionine | Acros Organics | 63-68-3 | |
| Ornithine HCl | Alfa Aesar | A12111 | |
| Phenylalanine | Acros Organics | 63-91-2 | |
| Proline | Alfa Aesar | A10199 | |
| Serine | Alfa Aesar | A11179 | |
| Threonine | Acros Organics | 72-19-5 | |
| Tryptophan | Acros Organics | 73-22-3 | Prepared in 0.2 M NaOH |
| Tyrosine | Alfa Aesar | A11141 | Prepared in 1.0 M NaOH |
| Valine | Acros Organics | 72-18-4 | |
| Antibiotic | |||
| Carbenicillin | Alfa Aesar | J6194903 | |
| Day-of Stocks | |||
| CaCl2 * 2H2O | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Chemical | 50-99-7 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Fisher (Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform |
| FeSO4 * 7H2O | Acros Organics | 7782-63-0 | this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh |
| L-lactic acid | Alfa Aesar | L13242 | pH stock to 7 with NaOH |
| MgCl2 * 6H2O | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| N-acetylglucosamine | TCI | A0092 | |
| Prepared solids | |||
| Porcine mucin | Sigma | M1778-100G | UV-sterilize |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
| Stain | |||
| Propidium iodide | Alfa Aesar | J66764MC | |
| Salts | |||
| K2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
| KCl | Alfa Aesar | J64189 | add solid directly to buffered base |
| KNO3 | Acros Organics | 7757-79-1 | |
| MOPS | Alfa Aesar | A12914 | add solid directly to buffered base |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | add solid directly to buffered base |
| Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
| NH4Cl | Acros Organics | 12125-02-9 | add solid directly to buffered base |
| Consumables | |||
| Conical tubes (15 mL) | Olympus plastics | 28-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Olympus plastics | 28-106 | |
| Culture tubes w/air flow cap | Olympus plastics | 21-129 | |
| 35 mm four chamber glass-bottom dish | CellVis | NC0600518 | |
| Luria Bertani (LB) broth | Genessee Scientific | 11-118 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Bioreagents | BP2944100 | |
| Pipet tips (p200) | Olympus plastics | 23-150RL | |
| Pipet tips (p1000) | Olympus plastics | 23-165RL | |
| Serological pipets (5 mL) | Olympus plastics | 12-102 | |
| Serological pipets (25 mL) | Olympus plastics | 12-106 | |
| Serological pipets (50 mL) | Olympus plastics | 12-107 | |
| Ultrapure water (RNase/DNase free); nanopure water | Genessee Scientific | 18-194 | Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1 |
| Syringes (10 mL) | BD | 794412 | |
| Syringes (50 mL) | BD | 309653 | |
| 0.22 mm PES syringe filter | Olympus plastics | 25-244 | |
| PS cuvette semi-mico | Olympus plastics | 91-408 | |
| Software | |||
| Biorender | To prepare the figures | ||
| FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| Imaris | Bitplane | version 9.6 | |
| Zen Black | |||
| Equipment | |||
| FacsAriallu | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| LSM 880 confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
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