Summary
合成嚢胞性線維化痰培地(SCFM2)は、共焦点レーザー走査顕微鏡と蛍光活性化細胞選別の両方と組み合わせて利用して、細菌凝集体を高分解能で観察することができる。本論文では、将来の研究のためのプラットフォームとして抗菌治療中の集団を評価する方法を詳述する。
Abstract
緑膿菌(Pa)は 嚢胞性線維症(CF)に関連する最も一般的な日和見病原体の1つである。 Pa のコロニー形成が確立されると、感染菌の大部分が気道痰内にバイオフィルムを形成する。CF痰から分離された Pa バイオフィルムは、空間的に組織化され、抗菌耐性などの臨床的に関連する表現型を示す〜10〜1,000個の細胞の小さく密な凝集体で増殖することが示されている。変化する痰環境に Pa 凝集体がどのように反応するかを研究する上で最大の課題の1つは、凝集形成を促進する栄養的に関連性の高い堅牢なシステムの欠如です。合成CF痰培地(SCFM2)を用いて 、Pa 凝集体の寿命を観察するには、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)と単一細胞の分解能での画像解析を用いる。この インビトロ システムは、リアルタイム、3次元、およびミクロンスケールでの様々なサイズの数千の集合体の観察を可能にする。個体レベルおよび集団レベルでは、表現型および位置によって集合体をグループ化する能力を有することは、異なる発達段階での凝集体の観察を容易にし、抗生物質治療などの微小環境の変化に対する応答を精密に区別することを促進する。
Introduction
緑膿菌(Pa)は、免疫障害を持つ個人に慢性感染を確立する日和見病原体です。遺伝性疾患嚢胞性線維症(CF)を有する人にとって、これらの感染症は一生に一度の経過に及ぶ可能性がある。CFは、気道に粘性のある栄養豊富な痰の蓄積を引き起こし、時間の経過とともに様々な微生物病原体によって植民地化される。Paは最も普及しているCF病原体の1つで、幼児期に気道を植民地化し、治療が困難な感染症1を確立する。Paは依然として重大な臨床的問題であり、近年2,3で改善された治療レジメンにもかかわらず、CFを有する人々における死亡率の主要な原因と考えられている。この持続性表現型および抗生物質耐性の増加は、新しい治療戦略の開発のための研究の優先事項として、疾病管理センター(CDC)と世界保健機関(WHO)の両方によって同定された病原体群のPaに位置を獲得している- ESKAPE病原体4。
他のESKAPE病原体と同様に、獲得した抗生物質耐性はPaでは一般的であるが、Pa抗菌耐性に寄与する多くの固有の特性もある。これらの中には、−10〜1,000細胞の凝集高密度クラスターを形成するPaの能力があり、これはCF患者痰5、6を含む複数の感染症で観察することができる。他のバイオフィルムシステムで研究されたPaと同様に、Pa凝集体は、抗生物質に対する耐性の増加や細胞間コミュニケーションの活性化(クォーラムセンシング(QS))などの臨床的に関連する表現型を表示する。例えば、Paの集合体は、他の微生物と戦うとともに、ピオシャニン7の産生などの抗菌治療を容認するためにQS規制行動を使用することが示されている。このような行動を研究する能力は、人体に存在する環境と同様の環境で細菌生態系に関するエキサイティングな洞察を提供します。
変化する痰環境にPa凝集体がどのように反応するかを研究する上で最大の課題の1つは、凝集形成を促進する栄養的に関連性の高い堅牢なシステムの欠如です。Paについて知られていることの多くは、細胞がプランクトニックに成長するインビトロシステムを使用して発見された、または生体内8で観察されていない特徴的な表面に付着した「キノコ」アーキテクチャで発見されている。フローセルや固体寒天などの古典的なバイオフィルム成長モデルは、細菌の挙動と抗生物質耐性のメカニズムに関する広範かつ貴重な知識を生み出していますが、これらの知見は必ずしもin vivoで翻訳されるとは限りません。多くのin vitroモデルは、ヒト感染部位の成長環境を模倣する能力が限られており、生体内研究では高価なコストが必要である。さらに、多くのin vivoモデルは、インビトロ技術によって得られる柔軟性と解像度を欠いている。
合成嚢胞性線維症痰(SCFM2)は、CF肺の慢性感染時に経験したようなPa成長の環境を提供するように設計されている。SCFM2は、ムチン、脂質、およびDNAに加えて、期待CF痰で同定された栄養源を含む。SCFM2のPa成長は、実際の痰の成長に必要なほぼ同一の遺伝子を必要とし、自然なPa凝集形成9、10をサポートする。接種後、プランクトニック細胞は膨張によって大きさが大きくなる凝集体を形成する。個々のセル (移民と呼ばれます) は、集合から解放され、非植民地化された領域に移行され、新しい集合体10を形成します。この生命史は、単一の細胞の解像度でCLSMおよび画像解析を使用して観察することができる。SCFM2で形成されたPaの集合体は、CF肺10で観察されるものと同様のサイズである。このモデルは、リアルタイムで、ミクロンスケールで3次元で様々なサイズの複数の集合体を観察することができます。タイムラプス顕微鏡は、1回の実験で数千個(約50,000)の集合体を追跡することを可能にします。画像解析ソフトウェアを使用することで、個々の集合体レベルと母集団レベルの両方で、3次元の集合体積、表面積、位置を含むマイクログラフの集合式の定量を可能にします。表現型と位置によって集合体をグループ化する能力を有することで、異なる発達段階での凝集体の分化と、変化する微小環境6,11への応答が可能となる。
SCFM2を使用してPa集合体を低容量および高スループットアッセイで研究すると、柔軟で費用対効果の高いモデルになります。定義された媒体として、SCFM2は複数のプラットフォームにわたって均一性および再現性を提供し、vitro9でPa集合体を研究するための栄養的および物理的に関連する方法を提供する。アプリケーションには、CLSMと組み合わせて空間組織と抗生物質耐性を高解像度で観察するアプリケーションが含まれます(この方法の論文で説明したように)。リアルタイムのミクロンスケールのデータを提供する実験を行う能力は、それらが生体内で起こり得る種間および種間相互作用の研究を可能にする。例えば、SCFM2は以前、P.が毒性および病原性に寄与する複数の遺伝子を調節するために利用するシステムのネットワークを介して、集合集団における細胞間コミュニケーションの空間的ダイナミクスを研究するために使用されてきた。
図1: 主な実験工程のグラフィカル描写( A)SCFM2はPa細胞を接種し、ガラス底培養皿に凝集体を形成させる。(B)凝集体を共焦点顕微鏡に移し、抗生物質を加える。描かれているのは、抗生物質治療を伴わない3つの技術的複製(チャンバー1-3)と、接種されたSCFM2のコントロールウェル(4)である。凝集体は、18時間にわたってCLSMを用いて画像化され、(C)初期18時間イメージング後、死細胞を視覚化するためにヨウ化プロピジウムで骨材を処理し、所望の表現型を有する凝集体をFACSを用いてSCFM2から分離する。略語: SCFM2 = 合成嚢胞性線維症痰培地;Pa =緑膿菌CLSM = 共焦点レーザー走査顕微鏡;FACS = 蛍光活性化細胞分類。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ここで、リアルタイムでPa集合体に対する抗生物質治療の影響を研究するSCFM2の有用性が示され、続いて下流分析のための明確な型素型を有する集合体の集団を分離する細胞選別アプローチの使用が示される(図1)。
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Protocol
1. 合成嚢胞性線維症培地(SCFM2)を調製する
注: SCFM2 の準備は、以下に概説する 3 つの主要な段階から構成されます (図 2)。詳細と参照については、9、 10、12を参照してください。
図2: SCFM2培地の調製と接種(A)緩衝塩基は、表1および表2に記載されている塩およびアミノ酸を用いて調製される。緩衝ベースは、最大30日間4°Cで保存できますが、光の露出から保護する必要があります。(B)ムチンとDNAを緩衝塩基のアリコートに添加し、4°C(C)で一晩溶液に溶解し、脂質および追加のストックを一晩溶液に添加し、250rpmで250rpmで37°Cで20分間インキュベーションしてインキュベートし、SFCM2は洗浄された、ログ相細胞をOD600= 0.05で接種する。略語: SCFM2 = 合成嚢胞性線維症痰培地.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- ブタムチンの殺菌
- SCFM2で5mg/mLの最終濃度で滅菌ムチンを調製します。例えば、SCFM2の5mL体積の場合、滅菌ペトリ皿中の25mgのタイプのムチンを秤量し、紫外線(UV)滅菌器に4時間、穏やかに1時間攪拌する。
- 4時間後、UV処理されたムチンを無菌状態でオートクレーブ1.7mLチューブに移し、-20°Cで保存します。
- 完全な滅菌を確認するには、水やルリアベルタニ(LB)ブロスなどの滅菌液にムチンのサンプルを溶解し、顕微鏡で観察します。
注:滅菌されたモチンは、6ヶ月まで-20°Cで保存することができます。
- 緩衝された基盤の準備
- 塩およびアミノ酸ストック液を、 表1に記載されているように脱イオン水に適量を加えて調製する。0.22 μmフィルターを使用してすべてのストックソリューションをフィルター滅菌し、ホイルで包んで光の劣化から保護し、4°Cで最大1ヶ月間保存します。
- 190 mLの脱イオン水とアミノ酸および塩ストック溶液を組み合わせて、 表1に記載された体積で緩衝塩基を調製する。pH 6.8に溶液を調整し、250 mLの最終容積に増加させます。0.22 μmフィルターを使用してフィルター滅菌し、4°Cで最大30日間保存します。
- 実験前の夕方、ガラス培養フラスコに緩衝塩基の所望の量をアリコートし、ムチン(ステップ1.1.1で説明した5mg/mL)および精製されたサケ精子DNA(0.6mg/mL)を加えた。軽く撹拌し、ホイルで包み、4°Cで一晩放置し、ムチンとDNAを溶液に溶解させます。
注:サケ精子DNAアリコートは、氷の上で解凍し、渦を起こさせ、緩衝塩基およびムチンに添加するべきである。トリプトファン、アスパラギン、およびチロシンストック溶液は、脱イオン水の代わりにNaOH(濃度については 表1 を参照)の溶液で調製されなければならない。光の露出から保護するために、バッファ付きベースとすべてのストックソリューションをホイルで包み込んでおきます。ほとんどの株は最大1ヶ月間安定しています。変色した銘柄は使用しないでくださいし、使用前に交換する必要があります。
- 補足株式の追加
- 実験当日に、 表2 に記載されているストックを、ムチンとDNAを含む緩衝ベースに追加します。
注:実験の日に新鮮なFeSO4 溶液を準備しますが、他のすべての在庫は、事前に作ることができ、4 °Cで30日間保存することができます、2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)はクロロホルムが含まれています。注意して取り扱い、炎の近くで使用しないでください。DOPCを添加した後、SCFM2を37°Cで、少なくとも20分間(5mL培養)の揺れ(250rpm)でインキュベートする。このインキュベーション期間は、DOPCのクロロホルムが蒸発することを可能にする。フラスコは気密であってはならない。代わりに、フラスコの開口部をホイルでゆるく覆います。
- 実験当日に、 表2 に記載されているストックを、ムチンとDNAを含む緩衝ベースに追加します。
細菌凝集体における抗菌耐性のリアルタイム評価
- 一晩の文化を準備する
- 実験前の夕方に、抗生物質(カルベニシリン300 μg/mL)を含むLB寒天プレートからPaPAO1-pMRP9-113のコロニーを含むLBスープの5 mLを接種する。250 rpmで撹拌して37°Cで一晩成長させます。
注:必要なプラスミドの選択に必要な抗生物質を添加して一晩培養を成長させます(ここでは、緑色蛍光タンパク質(GFP)発現プラスミド、pMRP9-1)。なお 、Pa 細胞はSCFM2が接種される前に洗浄される。LBは、一晩培養のために他のリッチラボメディアに置き換えることができます。すべての細菌分離株は、このプロトコル全体で適切なBSL-2ガイドラインを使用して処理する必要があります。
- 実験前の夕方に、抗生物質(カルベニシリン300 μg/mL)を含むLB寒天プレートからPaPAO1-pMRP9-113のコロニーを含むLBスープの5 mLを接種する。250 rpmで撹拌して37°Cで一晩成長させます。
- イノキュレート SCFM2
- 実験の日に 、Pa 1:10(培養:液体培地)の一晩培養物を5mLに5mLの新鮮なLBスープに接種して、一晩培養した後ろに希釈します。250 rpmで撹拌して37°Cで丸ごと(60〜90分)まで細胞を成長させます。
- 遠心分離機は、5分間10,000×gでの相培養をログします。上清を除去し、フィルター滅菌したリン酸緩衝食塩(PBS、pH 7.0)の3mLで再懸濁して細胞を洗浄します。2回繰り返し、PBSの最終体積1mLでペレットを再懸濁する。
- 600 nm(OD600)の分光光度計を用いて洗浄細胞の吸光度を測定し、SCFM2の5mLで0.05の開始OD600 に必要な培養量を算出する。 Pa をSCFM2に接種し、渦を穏やかにして細胞全体に分配します。4ウェル、ガラス底、光学皿の各チャンバーに接種したSCFM2のピペット1mLを、37°Cで4h静的にインキュベートする。
注:Pa培養の倍加時間は、歪みと酸素の利用可能性に依存します。SCFM2では、ここで説明する条件の下で、Paの倍加時間は〜1.4時間10.
3. 共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)による抗生物質治療中の凝集体の可視化
注: このセクションでは、SCFM2での Pa 集合体のイメージング用の共焦点レーザー走査顕微鏡と画像キャプチャソフトウェアの使用について説明します。目的は、抗生物質による治療後に残っている(耐性の)細菌バイオマスを観察し、特徴付ける。説明した手順は、他の共焦点顕微鏡で成功して実行できますが、器械操作マニュアルは特定の指導のために参照されるべきである。
- 画像 Pa 培養は、37°Cの周囲温度を維持するために、顕微鏡ステージに取り付けられた加熱室または加熱マイクロプレートのいずれかを使用した。 実験開始の少なくとも2時間前に インキュベーション モジュールを起動して、全ての装置が所望の温度に達するようにし、データ収集中にさらなる膨張と移動を低減します。
- 4時間後 、Pa 細胞を含むSCFM2培養物を加熱顕微鏡ステージに移す。4つの井戸のうち3つの井戸を抗生物質治療のための技術的複製として指定し、4番目 の治療コントロールと、抗生物質なしでSCFM2の Pa 細胞のみを含むノー治療コントロールと考えてください。蛍光レポーターの励起の前に 、位置指定 タブ内の明視野顕微鏡を使用して凝集体を識別します。各ウェル内でイメージング用の領域を定義し、イメージ作成ソフトウェアの 位置 モジュールを使用して位置(x-y-z座標)を保存します。
- 63x油浸性目標を使用して、488 nmの励起波長と509nmの発光波長を有するSCFM2のGFP発現プラスミドpMRP9-1を含む Pa 培養物を視覚化します。1 μm間隔(合計60スライス)で 、取得 モジュール内のZスタックオプションを使用して画像を撮影します。 ライン平均 化モジュールを使用して、60 μm z スタックイメージの総容量内での GFP チャネルのバックグラウンド蛍光を低減します (1,093.5 mm3)。同一の設定を使用して、画像分析のための背景蛍光を決定することにより、単線SCFM2の制御画像を取ります。
注:画像は、カバースリップの底部から60 μmの8ビットzスタック画像を512ピクセルx 512ピクセル(0.26 μm x 0.26 μmピクセル)生成することによって取得されます。 - イメージングソフトウェア内の時系列オプションを使用して、18時間の15分間隔で各位置(ウェル)で60枚のスライスをキャプチャします。ソフトウェア内の明確な焦点戦略を使用して、各位置の焦点面を保存し、実験全体を通して各時点で戻されます。
- 合計4.5時間のインキュベーションの後、上記の設定を使用して各位置を画像化し、抗生物質を添加する前に4つのウェルのそれぞれ内の総バイオマスを決定します。
- 6時間の全インキュベーションの後、各複製に2x以下の最小阻害濃度(MIC)で抗生物質を添加する。ピペットは、空気液体間相のすぐ下の井戸の真ん中に直接、穏やかに入ります。加熱された共焦点室ですべての培養物を維持する。
注:ここでは、140μg/mLの濃度でコリスチン硫酸を使用しました。 - イメージングプログラム内の実験 開始オプションを クリックして、抗生物質後の治療のイメージングを開始します。
注:使用される抗生物質濃度は、抗生物質 、Pa 分離物、およびユーザーが殺す効果または耐性効果を調べたいかどうかに依存します。この実験は、単一の用量を使用します。追加の用量は、必要に応じて培養を中断することなく追加することができます。.
4. パ凝集体のヨウ化プロピジウム染色
注:ヨウ化プロピジウム(PI)は、培養中の生存不可能な(死んだ)細菌細胞を同定するための染色試薬として一般的に利用されています。ここでは、セクション3で適用される抗生物質治療に敏感な凝集体を同定するために用いられる。このプロトコルを通して 、Pa 細胞におけるGFPの発現および検出は細胞生存能の主要な代理として使用される。この最終ステップでは、共焦点イメージングをもう一度使用して、互いに関連して生きている/死んだ集合体の空間的位置を特定することができます。さらに、セクション 5 でのさらに下流セルの並べ替えのために、集約はライブ/デッドとして識別されます。
- 18時間後、SCFM2培養物を含む4チャンバ式光学底皿の各ウェルにPIを加える。PIの容積とインキュベーション時間(例えば、培養液のmLあたり〜2μL、〜20〜30分)のメーカーの指示に従ってください。
5. FACS アプローチを使用して、集合体から生細胞を分離する
注: FACS は、蛍光タグ付き表現型に従って細胞のグループを選別し、分離する強力なプラットフォームを提供します。ここで、FACSは、生存(抗生物質耐性)凝集を生存不能な集合体から分離するために使用される。
- ヨウ化プロピジウムで染色した後、培養から培養液を除去し、37°Cを維持するために絶縁容器内のFACS器具に移す。
- 最も低い流量でPa集合体を含むSCFM2の1 mLアリコートを実行する。
注:各アリコートには約15,000個の集計が含まれます。 - GFPを検出するには、488 nmレーザーで細胞を照らし、530/30 nmの蛍光信号高さを記録します。561 nmレーザーで励起してPI染色を可視化し、610/20nmで蛍光信号の高さを記録します。70-u ノズルを使用してソートを実行します。
注: 並べ替えられた集計は、ユーザーのアプリケーションに応じて複数の方法でプールできます。この場合、FACSは、下流RNAシーケンシングのために実行可能な Pa 凝集体をソートするために使用されました。代替アプリケーションについては、以下で説明します。
6. 画像解析
注意: タイムラプス顕微鏡は大量のデータを生成します。SCFM2で Pa 集合体を観測する18時間の実験では、時間の経過とともに約50,000個の集合体を特定し、体積および空間位置決めに特徴付けられる可能性を有する。画像解析ソフトウェアを使用して、SCFM2 の集約ダイナミクスを定量化します。
- SCFM2の集合研究では、pMRP9-1を運ぶ Pa 株PAO1を接種した単線SCFM2およびSCFM2のために産生されるGFPチャンネルでカウントのヒストグラムを作成することによって、GFP蛍光の背景を定量化する。検出された GFP ボクセルが Pa バイオマスと相関していることを確認するには、GFP+ ボクセルを gFP バックグラウンドカウント値 ≥1.5x として定義します。
注: バックグラウンド蛍光は、3つのランダムに選択された位置の最高ボクセル値として定義され、平均されます。背景数は、標準的な尺度として、画像解析ソフトウェアによって実験画像内のすべてのピクセルから差し引かれます。 - 「昇天」モジュールで背景を減算した後、残りのすべてのボクセルに対して等値面を生成します。
- 個々の集計を検出するには、[ オブジェクトの分割 ]オプションを有効にし、ボリュームが≥5 μm3のオブジェクトとして集約を定義します。イメージ解析ソフトウェアの Vantage モジュールを使用して、個々のオブジェクトの GFP ボクセルのボリューム、x-y-z、合計を計算します。このデータを外部の統計プラットフォームにエクスポートします。
注: 一部の画像解析ソフトウェアでは、複数の定量フェントイを一度にエクスポートできるため、相関を計算できます。 - Vantageモジュールからサイズでエクスポートされたフィルターデータは、<0.5 μm3(分散バイオマス)の物体が残らないようにします。画像内の個々のオブジェクトごとに、画像解析ソフトウェアのVantageモジュールを使用するか、次の式を使用して手動で他のオブジェクト(集計)に対してそれ自体からの距離を計算します。
d = sqrt(((x2- x1)2 + (y2- y1)2 + (z2- z1)(1) - 合計と平均の計算を使用して、総バイオマスと平均総計量を見つけます。あるいは、データを他の統計プラットフォームまたはスクリプト( 例えば、代表的な結果で説明されているようにバイオマス全体の集合体の分布)にエクスポートする(ジョージア工科大学ホワイトリー研究所と共同で未発表のスクリプト)。
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Representative Results
この研究は、CF肺9、10、12の慢性感染と同様の環境において、高分解能でPa凝集体を観察する方法を詳述する。SCFM2は、実際の感染時に観察されたものと同様のサイズでPa細胞の自然な凝集を促進するインビトロシステムを提供する10。定義された媒体としてのSCFM2の適応性は、多くの研究手段にアプローチするために活用することができる。この研究の目的は、将来の研究、コラボレーション、およびアプリケーションへの使用を奨励することを目的として、顕微鏡と FACS の組み合わせを含むワークフローを強調することです。
CLSMを使用することで、細菌集団の発達のダイナミクスを研究するために使用できる一時的で高解像度のイメージングが可能です。この研究は 、Pa 凝集体が抗生物質による治療後に特徴付けることができるいくつかの潜在的な方法を示している。 図3A は、抗生物質治療後の実行可能 なPa 凝集体の広い視野を提供する。抗生物質の適用から4時間後、複数の凝集体が残る。色範囲を適用して、個々の集計の異なる特性を表すことができます。定量可能な特性の例としては、体積、面積、ボクセル強度(蛍光レポーターの使用用)、x-y-z軸のいずれかにおける位置が挙げられます。
専用ソフトウェアを使用した画像解析により、データを完全にカスタマイズ可能なデータの観察が可能になり、各集合体を個別のオブジェクトとして識別し、定量的データをエクスポートしてさらなる分析を行うことができます。図 3Bは、エクスポートされたデータの使用方法の例を示しています。ここでは、総集団の総バイオマスを時間の経過とともに計算することができる。これらの代表的なデータでは、抗生物質による治療は、未処理の凝集体と比較してバイオマスを有意に減少させる。補足ビデオS1は、抗生物質治療後にこれらのバイオマスデータ内の凝集体を物理的に観察するために時系列顕微鏡を使用する方法の強力な表現です。各集合体は、計算された容積(μm3)を表す色分けされており、画像解析ソフトウェアおよびその他のリソース内で、アプリケーションを使用したさらなる空間解析にも使用できる集合体の視覚的記録を可能にしている(ここでは10,15を論じていない)。
Pa集合体における抗生物質耐性のメカニズムを同定するために開発された実験は、大量のデータを生成する。各レプリケートは、約 15,000 個の集計 (合計で 60,000 件の集計) の物理データを生成します。このデータを処理する新しいアプローチには、集約ヒートマップの生成が含まれています (図 3C)。異なるサイズの集合体が全人口にどのように寄与するかを計算することで、互いに関連する大きさ、形状、位置に関連して、骨材が抗生物質治療にどのように反応するかのパターンを特定することができます。
図3: 集合データ分析の例( A)抗生物質処理後の残存総バイオマスの概要対応するGFPボクセルの等面は、ボリューム(μm3)に従ってレンダリングされ、色分けされています。スケールバー= 30 μm(B) SCFM2 におけるPa集合体の総バイオマス(μm3)の時間経過に関する。青い線は未処理の凝集体を表し、赤線は抗生物質、コリスチン(140μg/mL)で処理された凝集体を表す。提示されたデータは、3つの生物学的複製(±SEM)を含む。(C) 体積(μm3,x軸)による個々の集合体の寄与を時系列(h,y軸)の総バイオマス(μm3,第2Y軸)に表す集合容積ヒートマップ。代表的なデータは、抗生物質の存在下および不存在下におけるPa集合体(図3B)を含む、0hは6時間の総成長後の抗生物質添加時を表す。データは、3つの生物学的複製(約50,000の総計)を含む。略語: GFP = 緑色蛍光タンパク質;SCFM2 = 合成嚢胞性線維症痰培地;SEM = 平均の標準誤差。Pa =緑膿菌.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
この段階での空間解析は、抗生物質の存在下で生存率を求めるプロキシとして Pa によるGFPの発現を用いる。18時間後にPIを追加することで、生存可能な集合体に関連して生存不可能な集合体の位置を同定することができる(補足図S1)。この方法の包括的な目標は、抗生物質による治療後の感受性と寛容な集合体の間の空間パターンを同定することです。今後の研究には、上記の終点アッセイに加えて、複数の時点が含まれる。
ワークフローの最終段階では、FACS ベースのアプローチを使用して、SCFM2 の集計を並べ替えます。この研究は、FACSが生存細胞を残りの集団(生存不可能を含む)から分離する能力を示している。図 4は、FACS を使用して、高スループットシーケンシングなどのさらなる実験のために生存可能な集合体をプールする方法を示しています。抗生物質による治療後(図4Aは1つの時点(18時間)を表し、Pa凝集体を含むSCFM2のアリコートは、それらの蛍光特徴に応じて正常に分離することができる。ここで、GFP は、寛容な集合体について同定されています。図4Bは、GFP発現細胞が残りの培養物(PI処理された凝集体)から分離されるような並べ替えイベントの一例を示す。さらに、独自の蛍光プロファイルを生成するSCFM2から凝集体を明確に識別することができます。このようにセルを並べ替える機能には、多くのアプリケーションがあります (図 5)。
図4:SCFM2における Pa 集合体のFACS (A) 実行可能な Pa と非実行可能な Pa 集合を SCFM2 から分離するために使用される FACS 装置の図。(B) FACS ソフトウェアによって生成された SCFM2 で分離された集合体の代表的なプロット。3つの象限は、生きた凝集体(GFP)、非生存細胞を含む残りの培養物(RFPは、ここでヨウ化プロピジウム染色の代替として使用され、いずれも488nmレーザーによる励起可能)、およびSCFM2対照を示す。データは、約15,000個の事象(集合体)を含む3つの生物学的複製のうちの1つである。略語: FACS = 蛍光活性化細胞分類;SCFM2 = 合成嚢胞性線維症痰培地; Pa = 緑膿菌GFP = 緑色蛍光タンパク質;RFP = 赤色蛍光タンパク質;PE-テキサスレッドH = フィコエリスリンテキサスレッドコンジュゲート染色細胞のピーク高さ;FITC-H = フルオレセインイソチオシアネート染色細胞のピーク高さ
図5:SCFM2を利用した潜在的な実験的応用( A) 繰り返し抗生物質用量へのPa集合体の曝露(B) Paの共培養は、他の細菌種と凝集する。(C) Pa凝集体の宿主免疫細胞への曝露は、例えば、A、B、C、CLSMイメージング法およびFACSアプローチと組み合わせて、下流RNA-seq、プロテオミクス、または3D空間解析を行う。 略語: SCFM2 = 合成嚢胞性線維症痰培地;Pa =緑膿菌PMN = 多形核白血球;CLSM = 共焦点レーザー走査顕微鏡;FACS = 蛍光活性化細胞分類;RNA-シーク = RNA シーケンシング;3D = 3 次元;LC-MS/MS = 液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ケミカル | ストック濃度 (M) | 最終濃度 (mM) | 筆記 |
| NaH2PO4 | 0.2 | 1.3 | |
| ナ2HPO4 | 0.2 | 1.25 | |
| KNO3 | 1 | 0.35 | |
| K2SO4 | 0.25 | 0.27 | |
| NH4Cl | 2.28 | バッファーベースに直接ソリッドを追加 | |
| KCl | 14.94 | バッファーベースに直接ソリッドを追加 | |
| ナクル | 51.85 | バッファーベースに直接ソリッドを追加 | |
| モップ | 10 | バッファーベースに直接ソリッドを追加 | |
| サー | 0.1 | 1.45 | |
| グル HCl | 0.1 | 1.55 | |
| プロ | 0.1 | 1.66 | |
| グリ | 0.1 | 1.2 | |
| 翼 | 0.1 | 1.78 | |
| ヴァル | 0.1 | 1.12 | |
| 会った | 0.1 | 0.63 | |
| イル | 0.1 | 1.12 | |
| ルー | 0.1 | 1.61 | |
| オーン HCl | 0.1 | 0.68 | |
| クリス・HCl | 0.1 | 2.13 | |
| アルグ HCl | 0.1 | 0.31 | |
| Trp | 0.1 | 0.01 | 0.2 M NaOHで準備 |
| アスプス | 0.1 | 0.83 | 0.5 M NaOHで準備 |
| ティル | 0.1 | 0.8 | 1.0 M NaOHで準備 |
| シニア | 0.1 | 1.07 | |
| サイス HCl | 0.1 | 0.16 | |
| フェ | 0.1 | 0.53 | |
| 彼の HCl H2O | 0.1 | 0.52 | |
| サケ精子DNA | 0.6 mg/mL | ||
| 豚ムチン | 5 mg/nL |
表1:合成嚢胞性線維症痰培地SCFM2の緩衝塩基に必要な塩分、アミノ酸、DNA、およびムチンストックの調製。
| ケミカル | 在庫集中(M) | 最終濃度 (mM) | 筆記 |
| デキストロース(D-グルコース) | 1 | 3 | |
| L-乳酸 | 1 | 9.3 | NaOH で pH 7.0 に調整 |
| CaCl2*2H2O | 1 | 1.75 | |
| MgCl2*6H2O | 1 | 0.61 | |
| フェソ4*7H2O | 1 mg/mL | 0.0036 | 毎日新鮮な作る |
| N-アセチルグルコサミン | 0.25 | 0.3 | |
| 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC) | 25 mg/mL | 100 μg/mL | 添加後37°Cで20分以上インキュベート |
表2: 合成嚢胞性線維症痰培地SCFM2の緩衝塩基に必要な追加のストックの調製。
補足図 S1: Pa は SCFM2 で集計します。SCFM2で形成された実行可能(緑色)および非実行可能(赤)Pa凝集体のレンダリングされた共焦点顕微鏡写真。スケールバー = 5μm略語: SCFM2 = 合成嚢胞性線維症痰培地;Pa =緑膿菌.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオS1:抗生物質による治療後のSCFM2の凝集体。CLSM を使用してSCFM2で30分ごとにキャプチャされたPa集合画像。集計は、集計ボリュームを表す色で個別にラベル付けされます(μm3、カラースケールは代表的な画像として表示されません)。スケールバー= 5 μm略語: SCFM2 = 合成嚢胞性線維症痰培地; Pa = 緑膿菌CLSM = 共焦点レーザー走査顕微鏡こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
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Discussion
この研究は、抗生物質治療の有無において細菌集合体集団を研究するために組み合わせることができる方法論を導入した。高解像度CLSMは、抗生物質にさらされると、凝集バイオマスの変化と、リアルタイムでの凝集物の構造的指向の可視化を可能にします。また、抗生物質による処理後に残るバイオマスの物理的・構造的特徴を定量化し、RNA-seqを用いた将来の遺伝子発現研究とこれらの観察を関連付けることを目標としています。GFP発現細胞の使用は、抗生物質耐性細胞の集団および個々の行動の視覚化を可能にするが、それは全体像の一部のみを提供する。抗生物質治療を生き延びなかった細胞の空間的位置から、個々に、そして生き残った寛容なバイオマスとの関係から多くを学ぶことができます。
タイムラプス顕微鏡は大量のデータを生成します。SCFM2で Pa 集合体を観測する18時間の実験では、時間の経過とともに約50,000個の集合体を特定し、体積および空間位置決めに特徴付けられる可能性を有する。ここで使用されている CLSM ( 材料表を参照) は、分析用の集約を開発する高解像度の画像をキャプチャします。3次元(±0.1 μm)での個々の集合体の空間位置決め(0.1 μm)を使用して、集合間の距離を正確に測定できます。細菌凝集体の物理フェノタイプは、分析アプローチの組み合わせを用いて決定することができる。イメージング ソフトウェアは、サーフェス レンダリングと 3 次元(3D)ポジショニングを提供します。社内で生成されたスクリプトを使用して、表現型(.,体積など)で集計をソートし、サイズビン化されたバイオマスの分布を計算することができます。追加のリソースは、集合体内の個々のセルをセグメント化するために利用可能です (例えば、転写レポーター14の使用をサポートします)。これらの分析ツールを組み合わせることで、集約表現型の幅広い評価が可能で、データ生成時に新たな関心の分析を柔軟に変更できます。
最初の18時間イメージングの後、凝集体をPIで処理し、しばしば生きた/死染色と呼ばれる技術である。PIは多孔質(損なわれた)膜を有する細胞に入り、GFPを発現する生細胞とは対照的に死んだ細胞または重度にストレスを受けた細胞の可視化を可能にする。凝集体としてのCF肺の細菌群集の空間的組織は、細菌群集行動に関する情報を提供することができる。骨組内で隔離された生存可能および生存不可能な細胞を同定することは、抗生物質治療に対してより敏感である可能性のあるコミュニティ内の細胞の分布の同定を容易にする。抗生物質に反応して骨材が受ける物理的な変化を定量化し、抗生物質耐性骨材の遺伝子質特徴を同定することは 、Paに対する将来の治療法を知らせる可能性がある。
PIの使用は、ワークフローのFACSアプローチにおける下流のアプリケーションも有するが、必ずしも必要ではないが、この実験で生存可能な細胞はGFP発現によって分化することができるので留意すべきである。しかし、PI染色により、各アッセイの最後に凝集体から空間情報を得ることができます。FACSによる集計のソートの使用を強調することで、この方法論文は、SCFM2が粘度にもかかわらず損傷や詰まりを引き起こすことなくFACSマシンで使用できることを示し、2)FACSを使用して単一細胞を集合体から分離し、それらを異なる集団(異種)にグループ化し、3)PI染色はFACSを持つ集団から死細胞を分離する有用性を有する 特に、目的の他の細胞が蛍光マーカーを発現していない場合。生細胞染色技術の使用は、遺伝子操作がしばしば困難である臨床分離株の使用に対するこのプロトコルの適用を強調する。最適化はひずみによって必要とされる可能性が高いが、集合的な型は、市販の蛍光体を多く用いることで同じ解像度で同定することができる。
SCFM2とFACSとの互換性は大きな利点であり、研究者は集合体から異なる集団に特定の単一細胞を分離することを可能にする。これ自体は、細胞の混合集団を含む将来の研究のための多くのアプリケーションを持っています。例えば、単一種内の他の種または異種との集合体を研究する6.このエキサイティングな高解像度の選別プロセスは、多くの機関で広く利用可能であり、多くの下流のアプリケーションがあります。本研究の凝集体から生存可能な細胞を、将来のRNA-seq実験のために選別した。他のアプリケーションには、プロテオミクスが含まれる可能性があります。抗生物質曝露の繰り返しの効果を評価するなど、進化研究のための凝集体のリサンプリング;他の種との共培養;またはヒト免疫細胞との共培養(図5)。これらの方法をCLSMイメージング実験と組み合わせることで、観察された細菌の形質と行動を定量データと相関させ、細菌群集のメカニズム、種内関係、または抗菌薬に対する耐性を同定する可能性を有する。
これらの方法論の多くの利点と並んで、対処すべきいくつかの落とし穴があります。この研究では、細胞生存率の終点マーカーとして PI を使用します。将来的には、これはセル活動モデルに置き換えられ、複数の時間ポイントにわたって細胞を区別することが理想的です。ただし、これらのデータは、ライブ/デッド以外の複数の方法でソートできるカルチャ集計に対する SCFM2 の使用を確立します。主な利点は、凝集体を洗浄せずにFACSマシンに直接転送できることと、実験の過程で開発された空間構造の潜在的な破壊です。全体として、これは パ、CF、および微生物行動に興味のある人々との共同プロジェクトを促進するために多くの研究室で使用することができるエキサイティングなプラットフォームです。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
S.E.Dは、南フロリダ大学分子医学部のスタートアップ資金と、CFF研究助成金(DARCH19G0)N.I.H(5R21AI147654 - 02(PI、陳))およびUSF微生物叢研究所によって支援されています。ホワイトリー・ラボは、この原稿に関連するデータセットを含む継続的なコラボレーションに感謝します。FACSの選別を促進してくれたチャールズ・シェカーズ博士に感謝します。数字は、Biorender.com を使用してA.D.GとS.E.Dによって作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino acids | |||
| Alanine | Acros Organics | 56-41-7 | |
| Arginine HCl | MP | 1119-34-2 | |
| Asparagine | Acros Organics | 56-84-8 | Prepared in 0.5 M NaOH |
| Cystine HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
| Glutamic acid HCl | Acros Organics | 138-15-8 | |
| Glycine | Acros Organics | 56-40-6 | |
| Histidine HCl H2O | Alfa Aesar | A17627 | |
| Isoleucine | Acros Organics | 73-32-5 | |
| Leucine | Alfa Aesar | A12311 | |
| Lysine HCl | Alfa Aesar | J62099 | |
| Methionine | Acros Organics | 63-68-3 | |
| Ornithine HCl | Alfa Aesar | A12111 | |
| Phenylalanine | Acros Organics | 63-91-2 | |
| Proline | Alfa Aesar | A10199 | |
| Serine | Alfa Aesar | A11179 | |
| Threonine | Acros Organics | 72-19-5 | |
| Tryptophan | Acros Organics | 73-22-3 | Prepared in 0.2 M NaOH |
| Tyrosine | Alfa Aesar | A11141 | Prepared in 1.0 M NaOH |
| Valine | Acros Organics | 72-18-4 | |
| Antibiotic | |||
| Carbenicillin | Alfa Aesar | J6194903 | |
| Day-of Stocks | |||
| CaCl2 * 2H2O | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Chemical | 50-99-7 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Fisher (Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform |
| FeSO4 * 7H2O | Acros Organics | 7782-63-0 | this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh |
| L-lactic acid | Alfa Aesar | L13242 | pH stock to 7 with NaOH |
| MgCl2 * 6H2O | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| N-acetylglucosamine | TCI | A0092 | |
| Prepared solids | |||
| Porcine mucin | Sigma | M1778-100G | UV-sterilize |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
| Stain | |||
| Propidium iodide | Alfa Aesar | J66764MC | |
| Salts | |||
| K2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
| KCl | Alfa Aesar | J64189 | add solid directly to buffered base |
| KNO3 | Acros Organics | 7757-79-1 | |
| MOPS | Alfa Aesar | A12914 | add solid directly to buffered base |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | add solid directly to buffered base |
| Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
| NH4Cl | Acros Organics | 12125-02-9 | add solid directly to buffered base |
| Consumables | |||
| Conical tubes (15 mL) | Olympus plastics | 28-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Olympus plastics | 28-106 | |
| Culture tubes w/air flow cap | Olympus plastics | 21-129 | |
| 35 mm four chamber glass-bottom dish | CellVis | NC0600518 | |
| Luria Bertani (LB) broth | Genessee Scientific | 11-118 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Bioreagents | BP2944100 | |
| Pipet tips (p200) | Olympus plastics | 23-150RL | |
| Pipet tips (p1000) | Olympus plastics | 23-165RL | |
| Serological pipets (5 mL) | Olympus plastics | 12-102 | |
| Serological pipets (25 mL) | Olympus plastics | 12-106 | |
| Serological pipets (50 mL) | Olympus plastics | 12-107 | |
| Ultrapure water (RNase/DNase free); nanopure water | Genessee Scientific | 18-194 | Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1 |
| Syringes (10 mL) | BD | 794412 | |
| Syringes (50 mL) | BD | 309653 | |
| 0.22 mm PES syringe filter | Olympus plastics | 25-244 | |
| PS cuvette semi-mico | Olympus plastics | 91-408 | |
| Software | |||
| Biorender | To prepare the figures | ||
| FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| Imaris | Bitplane | version 9.6 | |
| Zen Black | |||
| Equipment | |||
| FacsAriallu | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| LSM 880 confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
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