Summary
Syntetisk cystisk fibrose sputum medium (SCFM2) kan brukes i kombinasjon med både konfokal laser skanning mikroskopi og fluorescens-aktivert celle sortering for å observere bakterielle aggregater ved høy oppløsning. Denne artikkelen beskriver metoder for å vurdere aggregerte populasjoner under antimikrobiell behandling som en plattform for fremtidige studier.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (Pa) er et av de vanligste opportunistiske patogenene forbundet med cystisk fibrose (CF). Når Pa-koloniseringen er etablert, danner en stor del av de smittende bakteriene biofilmer i luftveissputum. Pa biofilmer isolert fra CF sputum har vist seg å vokse i små, tette aggregater på ~ 10-1000 celler som er romlig organisert og viser klinisk relevante fenotyper som antimikrobiell toleranse. En av de største utfordringene med å studere hvordan Pa aggregater reagerer på det skiftende sputummiljøet, er mangelen på ernæringsmessig relevante og robuste systemer som fremmer aggregert dannelse. Ved hjelp av et syntetisk CF-sputummedium (SCFM2) kan livshistorien til Pa-aggregater observeres ved hjelp av konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) og bildeanalyse ved oppløsningen til en enkelt celle. Dette in vitro-systemet tillater observasjon av tusenvis av aggregater av varierende størrelse i sanntid, tre dimensjoner og i mikronskalaen. På individ- og befolkningsnivå legger det å ha evnen til å gruppere aggregater etter fenotype og posisjon observasjon av aggregater på ulike utviklingsstadier og deres respons på endringer i mikromiljøet, som antibiotikabehandling, å bli differensiert med presisjon.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa (Pa) er et opportunistisk patogen som etablerer kroniske infeksjoner hos immun-kompromitterte individer. For de med den genetiske sykdommen cystisk fibrose (CF), kan disse infeksjonene strekke seg over livets løpet. CF forårsaker oppbygging av et viskøs, næringsrikt sputum i luftveiene, som blir kolonisert av en rekke mikrobielle patogener over tid. Pa er en av de mest utbredte CF patogener, koloniserer luftveiene i tidlig barndom og etablerer vanskelige å behandle infeksjoner1. Pa er fortsatt et betydelig klinisk problem og regnes som en ledende årsak til dødelighet hos de med CF, til tross for forbedrede terapiregimer de siste årene2,3. Denne utholdenhet fenotypen og økende antibiotikatoleranse har gitt Pa en plass i en gruppe patogener identifisert av både Centers for Disease Control (CDC) og Verdens helseorganisasjon (WHO) som forskningsprioriteringer for utvikling av nye terapeutiske strategier - ESKAPE patogener4.
Som andre ESKAPE-patogener er er ervervet antibiotikaresistens vanlig hos Pa, men det er også mange iboende egenskaper som bidrar til Pa antimikrobiell toleranse. Blant disse er Pas evne til å danne aggregater-svært tette klynger på ~ 10-1000 celler, som kan observeres ved flere infeksjoner, inkludert CF pasient sputum5,6. I likhet med Pa studert i andre biofilmsystemer, viser Pa aggregater klinisk relevante fenotyper som økt resistens mot antibiotika og aktivering av cellecellekommunikasjon (quorumssensor (QS)). For eksempel har aggregater av Pa vist seg å bruke QS-regulert oppførsel for å bekjempe andre mikrober, samt tolerere antimikrobielle behandlinger som produksjon av pyocyanin7. Evnen til å studere slik atferd gir et spennende innblikk i bakterielle økosystemer i et miljø som ligner det de eksisterer i menneskekroppen.
En av de største utfordringene med å studere hvordan Pa aggregater reagerer på det skiftende sputummiljøet, er mangelen på ernæringsmessig relevante og robuste systemer som fremmer aggregert dannelse. Mye av det som er kjent om Pa har blitt oppdaget ved hjelp av in vitro-systemer der celler vokser planktonisk eller i en karakteristisk overflatemontert, "sopp" arkitektur som ikke har blitt observert in vivo8. Mens klassiske biofilmvekstmodeller, som strømningsceller eller fast agar, har gitt omfattende og verdifull kunnskap om bakteriell atferd og mekanismer for antibiotikatoleranse, oversetter disse funnene ikke alltid in vivo. Mange in vitro-modeller har en begrenset evne til å etterligne vekstmiljøet på det menneskelige infeksjonsstedet, noe som krever kostbare in vivo-studier. I sin tur mangler mange in vivo-modeller fleksibiliteten og oppløsningen som gis av in vitro-teknikker.
Syntetisk cystisk fibrose sputum (SCFM2) er designet for å gi et miljø for Pa vekst som ligner det som oppleves under kronisk infeksjon i CF-lungen. SCFM2 inkluderer ernæringskilder identifisert i ekspektorert CF-sputa i tillegg til mucin, lipider og DNA. Pa vekst i SCFM2 krever et nesten identisk gen satt til det som kreves for vekst i faktisk sputum og støtter naturlig Pa aggregertformasjon 9,10. Etter inokulering danner planktoniske celler aggregater som øker i størrelse gjennom ekspansjon. Enkeltceller (referert til som migranter) frigjøres fra aggregater, migrerer til ukoloniserte områder og danner nye aggregater10. Denne livshistorikken kan observeres ved hjelp av CLSM og bildeanalyse ved oppløsningen til en enkelt celle. Aggregater av Pa dannet i SCFM2 er av lignende størrelser som de som er observert i CF lunge10. Denne modellen tillater observasjon av flere aggregater av varierende størrelse i sanntid og i tre dimensjoner på mikronskalaen. Intervallmikroskopi gjør det mulig å spore tusenvis (~50 000) aggregater i ett eksperiment. Bruken av bildeanalyseprogramvare tillater kvantifisering av aggregerte fenotyper fra mikrografer, inkludert aggregert volum, overflateareal og posisjon i tre dimensjoner til nærmeste 0,1 μm, både på individnivå og befolkningsnivå. Å ha evnen til å gruppere aggregater etter fenotype og posisjon tillater differensiering av aggregater på forskjellige utviklingsstadier med presisjon, samt deres respons på et skiftende mikromiljø6,11.
Anvendelsen av SCFM2 for å studere Pa-aggregater i lavvolum- og høygjennomstrømningsanalyser gjør den til en fleksibel, kostnadseffektiv modell. Som et definert medium tilbyr SCFM2 ensartethet og reproduserbarhet på tvers av flere plattformer, og gir en ernæringsmessig og fysisk relevant metode for å studere Pa aggregater in vitro9. Anvendelser inkluderer bruk i kombinasjon med CLSM for å observere romlig organisering og antibiotikatoleranse ved høy oppløsning (som beskrevet i dette metodepapiret). Evnen til å utføre eksperimenter som gir sanntidsdata i mikronskala, gjør det mulig å studere intraarter og inter-arts interaksjoner som de kan forekomme in vivo. For eksempel har SCFM2 tidligere blitt brukt til å studere den romlige dynamikken i cellecellekommunikasjon i samlede populasjoner via et nettverk av systemer som brukes av Pa for å regulere flere gener som bidrar til virulens og patogenese6.
Figur 1: Grafisk fremstilling av de viktigste eksperimentelle trinnene. (A) SCFM2 er inokulert med Pa-celler og har lov til å danne aggregater i en glassbunnet kulturrett. (B) Aggregater overføres til det konfiske mikroskopet, og antibiotika tilsettes. Avbildet er tre tekniske replikeringer (kamre 1-3) og en kontrollbrønn (4) inokulert SCFM2 uten antibiotikabehandling. Aggregater er avbildet ved hjelp av CLSM i løpet av 18 h. (C) Etter den første 18-timers avbildningen behandles aggregater med propidiumjodid for å visualisere døde celler og avbildet ved hjelp av CLSM (D) Aggregater med ønsket fenotype er skilt fra SCFM2 ved hjelp av FACS. Forkortelser: SCFM2 = syntetisk cystisk fibrose sputum medium; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = konfekt laser skanning mikroskopi; FACS = fluorescensaktivert cellesortering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Her demonstreres nytten av SCFM2 for å studere effekten av antibiotikabehandling på Pa-aggregater i sanntid, etterfulgt av bruk av en cellesorteringstilnærming for å isolere populasjoner av aggregater med distinkte fenotyper for nedstrømsanalyse (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered syntetisk cystisk fibrose medium (SCFM2)
MERK: Klargjøring av SCFM2 består av tre hovedtrinn som er beskrevet nedenfor (Figur 2). Hvis du vil ha fullstendig informasjon og referanser, kan du se9,10,12.
Figur 2: Tilberedning og inokulering av SCFM2 medium. (A) Bufret base fremstilles ved hjelp av salter og aminosyrer som er oppført i tabell 1 og tabell 2. Bufret base kan oppbevares ved 4 °C i opptil 30 dager, men må beskyttes mot lyseksponering. (B) Mucin og DNA tilsettes en aliquot av bufret base og oppløses i oppløsning over natten ved 4 °C. (C) Lipid og flere lagre tilsettes til over natten-løsningen og inkuberes ved 37 °C med agitasjon ved 250 o/min i 20 min. SFCM2 inokuleres deretter med vasket, loggfaseceller ved en OD600 = 0,05. Forkortelser: SCFM2 = syntetisk cystisk fibrose sputum medium. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Sterilisering av svinemucin
- Forbered steril mucin ved en endelig konsentrasjon på 5 mg/ml i SCFM2. For eksempel, for et 5 ml volum SCFM2, vei 25 mg type II mucin i en steril Petri-tallerken, og legg den i en ultrafiolett (UV) sterilisator i 4 timer, forsiktig agitating hver time.
- Etter 4 timer, overfør den UV-behandlede mucinen til autoklavede 1,7 ml rør under sterile forhold, og oppbevar ved -20 °C.
- For å bekrefte fullstendig sterilisering, oppløs en prøve av mucin i en steril væske, for eksempel vann eller Luria Bertani (LB) buljong, og observere under et mikroskop.
MERK: Sterilisert mucin kan oppbevares ved -20 °C i opptil 6 måneder.
- Utarbeidelse av bufret base
- Forbered salt- og aminosyrelagrløsninger ved å tilsette passende mengder etter vekt til deionisert vann som oppført i tabell 1. Filtrer-steriliser alle lagerløsninger ved hjelp av et 0,22 μm filter, pakk inn folie for å beskytte mot lysforringelse, og oppbevar ved 4 °C i opptil en måned.
- Forbered bufret base ved å kombinere 190 ml deionisert vann med aminosyre og saltlagreløsninger etter volumer som er oppført i tabell 1. Juster løsningen til pH 6,8, og øk til et endelig volum på 250 ml. Filtrer steriliser med et filter på 0,22 μm, og oppbevar det ved 4 °C i opptil 30 dager.
- Kvelden før eksperimentet, aliquot ønsket mengde bufret base inn i en glasskultur kolbe, og tilsett mucin (5 mg / ml som beskrevet i trinn 1.1.1) og renset laks sperm DNA (0,6 mg / ml). Rør forsiktig, pakk inn folie, og la det stå ved 4 °C over natten for å la mucin og DNA oppløses i oppløsning.
MERK: Laksesperm-DNA-aliquots skal tines på is, virveliseres og tilsettes til bufret base og mucin. Tryptofan-, asparagin- og tyrosinbestandsløsninger må fremstilles i løsninger av NaOH (se tabell 1 for konsentrasjoner) i stedet for deionisert vann. Hold bufret base og alle lagerløsninger pakket inn i folie for å beskytte mot lyseksponering. De fleste aksjer vil være stabile i opptil en måned. Aksjer som blir misfarget bør ikke brukes og bør byttes ut før bruk.
- Tillegg av supplerende aksjer
- På eksperimentets dag legger du til bestandene som er oppført i tabell 2, i den bufrede basen som inneholder mucin og DNA.
MERK: Forbered en frisk FeSO4-løsning på eksperimentets dag, men alle andre lagre kan gjøres på forhånd og lagres i 30 dager ved 4 °C. 1,2-Dioleoyl-sn-glysero-3-fosfokolin (DOPC) inneholder kloroform. Håndter forsiktig, og ikke bruk i nærheten av åpne flammer. Etter tilsetning av DOPC, inkuber SCFM2 ved 37 °C med risting (250 o/min) i minst 20 minutter (for 5 ml kultur). Denne inkubasjonsperioden gjør at kloroformen i DOPC kan fordampe. Kolben skal ikke være lufttett; Dekk i stedet kolbeåpningen løst med folie.
- På eksperimentets dag legger du til bestandene som er oppført i tabell 2, i den bufrede basen som inneholder mucin og DNA.
2. Sanntidsvurdering av antimikrobiell toleranse i bakterielle aggregater
- Forbered kulturer over natten
- Kvelden før eksperimentet inokulerer du 5 ml LB-buljong med flere kolonier av Pa PAO1-pMRP9-113 fra en LB agarplate som inneholder antibiotika (carbenicillin 300 μg/ml). Vokse over natten ved 37 °C med agitasjon ved 250 o/min.
MERK: Vokse nattkulturer med tilsetning av antibiotika som kreves for valg av nødvendige plasmider (her, det grønne fluorescerende proteinuttrykket (GFP) plasmid, pMRP9-1). Vær oppmerksom på at Pa-celler skal vaskes før SCFM2 inokuleres. LB kan erstattes med andre rike laboratoriemedier for nattkulturer. Alle bakterieisolasjoner bør håndteres ved hjelp av passende BSL-2-retningslinjer gjennom hele denne protokollen.
- Kvelden før eksperimentet inokulerer du 5 ml LB-buljong med flere kolonier av Pa PAO1-pMRP9-113 fra en LB agarplate som inneholder antibiotika (carbenicillin 300 μg/ml). Vokse over natten ved 37 °C med agitasjon ved 250 o/min.
- Inokuler SCFM2
- På eksperimentets dag fortynner back-dilute nattkulturer av Pa 1:10 (kultur: flytende medier) ved å inokulere 500 μL i 5 ml fersk LB-buljong. Vokse celler til loggfasen (60-90 min) ved 37 °C med agitasjon ved 250 o/min.
- Sentrifuge loggfasekulturer på 10.000 × g i 5 min. Vask cellene ved å fjerne supernatanten og resuspending i 3 ml filtersterilisert fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7.0). Gjenta to ganger, og resuspend pellet i et siste volum på 1 ml PBS.
- Mål absorbansen til de vaskede cellene ved hjelp av et spektrofotometer ved 600 nm (OD600), og beregn kulturvolumet som kreves for en start-OD600 av 0,05 i 5 ml SCFM2. Inokuler Pa inn i SCFM2, og virvel forsiktig for å distribuere celler gjennom hele. Pipette 1 ml av den inokulerte SCFM2 i hvert kammer med en 4-brønns glassbunn, optisk tallerken og inkubering i 4 timer statisk ved 37 °C.
MERK: Doblingstiden til Pa-kulturer er avhengig av belastningen og tilgjengeligheten av oksygen. I SCFM2, under forholdene beskrevet her, er doblingstiden til Pa ~ 1,4 h10.
3. Visualisere aggregater under antibiotikabehandling med konfekt laserskanning mikroskopi (CLSM)
MERK: Denne delen beskriver bruken av konfekt laserskanning mikroskop og bildeopptak programvare for avbildning av Pa aggregater i SCFM2. Målet er å observere og karakterisere den gjenværende (tolerante) bakterielle biomassen etter behandling med antibiotika. Trinnene som er skissert kan utføres med suksess på andre konfikale mikroskoper, selv om instrumentets bruksanvisning bør refereres til for spesifikk veiledning.
- Image Pa kulturer ved hjelp av enten et oppvarmet kammer eller en oppvarmet mikroplate montert på mikroskop scenen for å opprettholde en omgivelsestemperatur på 37 °C. Start inkubasjonsmodulen minst 2 timer før begynnelsen av eksperimentet for å la alle apparater nå ønsket temperatur, og reduser ytterligere utvidelse og bevegelse under datainnsamling.
- Etter 4 timer, overfør SCFM2-kulturer som inneholder Pa-celler til det oppvarmede mikroskopstadiet. Angi 3 av 4 brønner som tekniske repliker for antibiotikabehandling, og vurder denfjerde samt en ikke-behandlingskontroll, som bare inneholder Pa-celler i SCFM2, uten antibiotika. Identifiser aggregater ved hjelp av brightfield-mikroskopi i Finn-fanen før eksitasjon av fluorescerende reportere. Definer et område for avbildning i hver brønn, og lagre plasseringen (x-y-z-koordinater) ved hjelp av Posisjoner-modulen i bildebehandlingsprogramvaren.
- Bruk et 63x olje-nedsenkingsmål for å visualisere Pa-kulturer som inneholder GFP-uttrykket plasmid pMRP9-1 i SCFM2 med en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm og utslippsbølgelengde på 509 nm. Ta bilder ved hjelp av z-stack-alternativet i anskaffelsesmodulen med 1 μm intervaller (totalt 60 stykker). Bruk line-averaging-modulen til å redusere fluorescens i bakgrunnen i GFP-kanalen innenfor det totale volumet av 60 μm z-stack-bilder (1 093,5 mm3). Ta kontrollbilder av ukinokulert SCFM2 ved å bruke identiske innstillinger for å bestemme bakgrunnsfluorescensen for bildeanalyse.
MERK: Bilder hentes ved å produsere 512 piksler x 512 piksler (0,26 μm x 0,26 μm piksler) 8-biters z-stack-bilder som er 60 μm fra bunnen av dekslet. - Bruk alternativet for tidsserier i bildeprogramvaren til å ta opp 60 stykker i hver posisjon (brønn) med intervaller på 15 minutter over en periode på 18 timer. Bruk den bestemte fokusstrategien i programvaren til å lagre et fokusplan for hver posisjon, som returneres til hvert tidspunkt gjennom hele eksperimentet.
- Etter totalt 4,5 timers inkubasjon, bilde hver posisjon ved hjelp av de ovennevnte innstillingene for å bestemme den samlede biomassen i hver av de fire brønnene før tilsetning av antibiotika.
- Etter 6 timer total inkubasjon, tilsett antibiotika ved 2x-under minimum hemmende konsentrasjon (MIC) til hver replikering. Pipette direkte og forsiktig inn i midten av brønnen, like under luftvæsken interfase. Oppretthold alle kulturer i det oppvarmede konfektkammeret.
MERK: Her ble colistinsulfat i en konsentrasjon på 140 μg/ml brukt. - Begynn å avbilde post-antibiotikabehandling ved å klikke på Start eksperiment-alternativet i bildebehandlingsprogrammet.
MERK: Antibiotikakonsentrasjonen som brukes er avhengig av antibiotika, Pa isolerer, og om brukeren ønsker å undersøke draps- eller toleranseeffekter. Dette eksperimentet bruker en enkelt dose. Ytterligere doser kan tilsettes uten å forstyrre kulturer om nødvendig.
4. Propidiumjod farging av Pa aggregater
MERK: Propidiumjodid (PI) brukes vanligvis som et fargereagens for å identifisere ikke-levedyktige (døde) bakterieceller i kulturen. Her brukes den til å identifisere aggregater som er følsomme for antibiotikabehandling som brukes i avsnitt 3. Gjennom hele denne protokollen brukes uttrykket og deteksjonen av GFP i Pa-celler som hovedproxy for celle levedyktighet. Dette siste trinnet gjør det mulig å bruke konfektavbildning igjen for å identifisere romlig posisjonering av levende / døde aggregater i forhold til hverandre. I tillegg identifiseres aggregater som levende/døde for ytterligere nedstrøms cellesortering i avsnitt 5.
- Etter 18 timer, tilsett PI i hver brønn av den firekammerte optiske bunnfatet som inneholder SCFM2-kulturer. Følg produsentens instruksjoner for volumet av PI og inkubasjonstid(f.eks.~ 2 μL per ml kultur, ~ 20-30 min).
5. Isolere levende celler fra aggregater ved hjelp av en FACS-tilnærming
MERK: FACS presenterer en kraftig plattform for å sortere og isolere grupper av celler i henhold til en fluorescerende merket fenotype. Her brukes FACS til å isolere levende (antibiotikatolerant) aggregater fra ikke-levedyktige aggregater.
- Etter farging med propidiumjodid, fjern kulturene fra inkubasjon, og overfør til et FACS-instrument i en isolert beholder for å opprettholde 37 °C.
- Kjør 1 ml aliquots av SCFM2 som inneholder Pa aggregater med lavest strømningshastighet.
MERK: Hver aliquot vil inneholde ~15,000 aggregater. - For å oppdage GFP, belys cellene med en 488 nm laser, og registrer fluorescerende signalhøyde ved 530/30 nm. Visualiser PI-fargingen ved eksitasjon med en 561 nm laser, og registrer fluorescerende signalhøyde ved 610/20 nm. Utfør sortering ved hjelp av en 70-u dyse.
MERK: Sorterte aggregater kan samles på flere måter, avhengig av brukerens applikasjon. I dette tilfellet ble FACS brukt til å sortere levedyktige Pa-aggregater for nedstrøms RNA-sekvensering. Alternative søknader diskuteres nedenfor.
6. Bildeanalyse
MERK: Intervallmikroskopi genererer store mengder data. Et 18-timers eksperiment for observasjon av Pa-aggregater i SCFM2 identifiserer ~50 000 aggregater over tid, som har potensial til å bli karakterisert for volum- og romlig posisjonering. Bruk en programvare for bildeanalyse til å kvantifisere aggregert dynamikk i SCFM2:
- For aggregerte studier i SCFM2 kvantifiserer du bakgrunnen GFP fluorescens ved å skape et histogram av tellinger i GFP-kanalen som er produsert for uinokulert SCFM2 og SCFM2 inokulert med Pa-stamme PAO1 som bærer pMRP9-1. For å sikre at oppdagede GFP-voxels korrelerer med Pa biomasse, definerer du en GFP+ voxel som ≥1,5 ganger GFP-bakgrunnsantallverdien.
MERK: Bakgrunnsfluorescensen er definert som den høyeste voxelverdien av tre tilfeldig valgte posisjoner, i gjennomsnitt. Bakgrunnsantall trekkes som standard fra alle piksler i eksperimentelle bilder av bildeanalyseprogramvaren. - Etter bakgrunnsdelsnitt i Overgår-modulen produserer du isosurfaces for alle gjenværende voxels.
- Hvis du vil oppdage individuelle aggregater, aktiverer du alternativet Del objekter og definerer mengde som objekter med volumer på ≥5 μm3. Bruk Vantage-modulen i bildeanalyseprogramvaren til å beregne volumet, x-y-z og summen av GFP-voxels for hvert enkelt objekt. Eksporter disse dataene til en ekstern statistisk plattform.
MERK: Noen bildeanalyseprogrammer tillater eksport av flere kvantitative phentoypes samtidig, slik at korrelasjoner kan beregnes. - Filtrer data eksportert fra Vantage-modulen etter størrelse for å sikre at ingen objekter på <0,5 μm3 (dispergert biomasse) forblir. For hvert enkelt objekt i bildet beregner du avstanden fra seg selv i forhold til andre objekter (aggregater) ved hjelp av Vantage-modulen til bildeanalyseprogramvaren eller manuelt med følgende formel.
d = sqrt((x2− x1)2 + (å2− y1)2 + (z2− z1)2) (1) - Bruk SUMMER- og GJENNOMSNITT-beregninger for å finne den totale biomassen og gjennomsnittlig aggregert volum. Alternativt kan du eksportere data til andre statistiske plattformer eller skript, for eksempeldistribusjon av aggregater på tvers av biomasse som omtalt i de representative resultatene (skript upublisert i samarbeid med Whiteley Laboratory, Georgia Institute of Technology).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette arbeidet beskriver metoder for å observere Pa aggregater med høy oppløsning og i et miljø som ligner på kronisk infeksjon i CF lunge9,10,12. SCFM2 gir et in vitro-system som fremmer naturlig aggregering av Pa-celler i størrelser som ligner de som observeres under faktisk infeksjon10. Tilpasningsevnen til SCFM2 som et definert medium kan utnyttes til å nærme seg mange forskningsveier. Målet med dette arbeidet er å fremheve en arbeidsflyt som involverer en kombinasjon av mikroskopi og FACS, med den hensikt å oppmuntre til bruk for fremtidig forskning, samarbeid og applikasjoner.
Bruken av CLSM tillater tidsmessig, høyoppløselig avbildning som kan brukes til å studere dynamikken i å utvikle bakteriepopulasjoner. Dette arbeidet viser flere potensielle måter pa aggregater kan karakteriseres etter behandling med antibiotika. Figur 3A gir et bredt syn på levedyktige Pa-aggregater etter antibiotikabehandling. Fire timer etter påføring av antibiotika forblir flere aggregater; fargeområder kan brukes til å representere forskjellige egenskaper for hvert enkelt aggregat. Eksempler på kvantifiserbare egenskaper inkluderer volum, areal, voxelintensitet (for bruk av fluorescerende reportere), og posisjon i en av x-y-z-aksene.
Bildeanalyse ved hjelp av dedikert programvare gjør det mulig å tilpasse data fullt ut, identifisere hvert aggregat som et individuelt objekt, hvor kvantitative data kan eksporteres for videre analyse. Figur 3B gir et eksempel på hvordan eksporterte data kan brukes. Her kan den totale biomassen av aggregerte populasjoner beregnes over tid. I disse representative dataene reduserer behandling med antibiotika biomasse betydelig sammenlignet med ubehandlede aggregater. Supplemental Video S1 er en kraftig representasjon av hvordan tidsseriemikroskopi kan brukes til å fysisk observere aggregater i disse biomassedataene etter antibiotikabehandling. Hver mengde er fargekodet for å representere det beregnede volumet (μm3), noe som gir en visuell oversikt over aggregerte populasjoner, som også kan brukes til ytterligere romlig analyse ved hjelp av programmer, både i bildeanalyseprogramvaren og andre ressurser (ikke diskutert her10,15).
Eksperimenter utviklet for å identifisere mekanismer for antibiotikatoleranse i Pa aggregater produserer store mengder data. Hver replikering produserer fysiske data med ~15 000 aggregater (~60 000 aggregater totalt). En ny tilnærming til håndtering av disse dataene har involvert produksjon av aggregerte varmekart (Figur 3C). Ved å beregne hvordan aggregater av forskjellige størrelser bidrar til den totale befolkningen, kan mønstre for hvordan aggregater reagerer på antibiotikabehandling i forhold til størrelse, form og posisjon i forhold til hverandre identifiseres.
Figur 3: Eksempler på aggregert dataanalyse. (A) Oversikt over gjenværende aggregert biomasse etter antibiotikabehandling. Isosurfaces av tilsvarende GFP-voxels har blitt gjengitt og fargekodet i henhold til volum (μm3). Skalastang = 30 μm. (B) Total biomasse (μm3) av Pa aggregerte populasjoner over tid i SCFM2. Blå linje representerer ubehandlede aggregater, rød linje representerer aggregater behandlet med antibiotika, colistin (140 μg / ml). Presenterte data inkluderer 3 biologiske replikeringer (± SEM). (C) Aggreger volumvarmekart som representerer bidraget fra individuelle aggregater etter volum (μm3, x-akse) til total biomasse (μm3, andre y-akse) over tid (h, y-akse). Representative data inkluderer Pa aggregater i nærvær og fravær av antibiotika (som i figur 3B), hvor 0 h representerer tid for antibiotika tillegg etter 6 h samlet vekst. Data inkluderer tre biologiske replikeringer (~ 50 000 totale aggregater). Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; SCFM2 = syntetisk cystisk fibrose sputum medium; SEM = standardfeil av gjennomsnittet; Pa = Pseudomonas aeruginosa. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Romlig analyse på dette stadiet innebærer å bruke uttrykket av GFP av Pa som proxy for levedyktighet i nærvær av antibiotika. Tillegg av PI etter 18 h tillater identifisering av posisjonen til ikke-levedyktige aggregater i forhold til levedyktige aggregater (Supplerende figur S1). Det overordnede målet med denne metoden er å identifisere romlige mønstre mellom følsomme og tolerante aggregater etter behandling med antibiotika. Fremtidige studier vil inkludere flere tidspoeng i tillegg til sluttpunktanalysen beskrevet ovenfor.
Den siste fasen av arbeidsflyten bruker en FACS-basert tilnærming til å sortere aggregater i SCFM2. Dette arbeidet viser FACS' evne til å skille levedyktige celler fra den gjenværende populasjonen av aggregater (inkludert ikke-levedyktig). Figur 4 viser bruken av konsepter for å samle levedyktige aggregater for videre eksperimenter som sekvensering med høy gjennomstrømning, for eksempelRNA-sekvensering (RNA-seq). Etter behandling med antibiotika (Figur 4A representerer ett tidspunkt (18 t), aliquots av SCFM2 som inneholder Pa aggregater kan vellykket separeres i henhold til deres fluorescerende egenskaper. Her er GFP identifisert for tolerante aggregater. Figur 4B gir et eksempel på en slik sorteringshendelse, der GFP-uttrykkende celler skilles fra den gjenværende kulturen (PI-behandlede aggregater). I tillegg kan aggregater tydelig identifiseres fra SCFM2, som produserer sin egen fluorescerende profil. Muligheten til å sortere celler på denne måten har mange programmer (Figur 5).
Figur 4: FACS of Pa aggregater i SCFM2. (A) Diagram over et FACS-instrument som brukes til å skille levedyktige og ikke-levedyktige Pa-aggregater fra SCFM2. (B) Representativ plott av aggregater atskilt i SCFM2 generert av FACS programvare. Tre kvadranter indikerer levende aggregater (GFP), gjenværende kultur som inneholder ikke-levedyktige celler (RFP brukes som et alternativ til propidiumjodidfarging her, begge spennende med 488 nm laser) og SCFM2-kontroll. Data representerer 1 av 3 biologiske repliker som inneholder ~15 000 hendelser (aggregater). Forkortelser: FACS = fluorescensaktivert cellesortering; SCFM2 = syntetisk cystisk fibrose sputum medium; Pa = Pseudomonas aeruginosa; GFP = grønt fluorescerende protein; RFP = rødt fluorescerende protein; PE-Texas Red-H = topphøyde for fycoerythrin-Texas Red konjugerte fargede celler; FITC-H = topphøyde for fluoresceinisiocyanate-fargede celler.
Figur 5: Potensielle eksperimentelle anvendelser ved bruk av SCFM2. (A) Eksponering av Pa aggregater til gjentatte antibiotikadoser. (B) Co-kultur av Pa aggregater med andre bakterielle arter. (C) Eksponering av Pa-aggregater som er vert for immunceller, for eksempelPMNer A, Bog C, kan kombineres med CLSM-avbildningsmetoder og FACS-tilnærming for nedstrøms RNA-seq, proteomikk eller 3D-romlig analyse. Forkortelser: SCFM2 = syntetisk cystisk fibrose sputum medium; Pa = Pseudomonas aeruginosa; PMNer = polymorforukære leukocytter; CLSM = konfekt laser skanning mikroskopi; FACS = fluorescensaktivert cellesortering; RNA-seq = RNA-sekvensering; 3D = tredimensjonal; LC-MS/MS = flytende kromatografi/tandemmassespektrometri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Kjemisk | Lagerkonsentrasjon (M) | Endelig konsentrasjon (mM) | Notater |
| NaH2PO4 | 0.2 | 1.3 | |
| Na2HPO4 | 0.2 | 1.25 | |
| KNO3 | 1 | 0.35 | |
| K2SO4 | 0.25 | 0.27 | |
| NH4Cl | 2.28 | Legg til heldekkende direkte i bufret basis | |
| KCl | 14.94 | Legg til heldekkende direkte i bufret basis | |
| NaCl | 51.85 | Legg til heldekkende direkte i bufret basis | |
| MOPPER | 10 | Legg til heldekkende direkte i bufret basis | |
| Ser | 0.1 | 1.45 | |
| Lim HCl | 0.1 | 1.55 | |
| Proff | 0.1 | 1.66 | |
| Gly | 0.1 | 1.2 | |
| Ala | 0.1 | 1.78 | |
| Val | 0.1 | 1.12 | |
| Møtte | 0.1 | 0.63 | |
| Ile | 0.1 | 1.12 | |
| Leu | 0.1 | 1.61 | |
| Orn HCl | 0.1 | 0.68 | |
| Lys HCl | 0.1 | 2.13 | |
| Arg HCl | 0.1 | 0.31 | |
| Trp | 0.1 | 0.01 | Tilberedt i 0,2 M NaOH |
| Asp | 0.1 | 0.83 | Tilberedt i 0,5 M NaOH |
| Tyr | 0.1 | 0.8 | Tilberedt i 1,0 M NaOH |
| Thr | 0.1 | 1.07 | |
| Cys HCl | 0.1 | 0.16 | |
| Phe | 0.1 | 0.53 | |
| Hans HCl H2O | 0.1 | 0.52 | |
| Laks Sperm DNA | 0,6 mg/ml | ||
| Porcine Mucin | 5 mg/nL |
Tabell 1: Tilberedning av salt-, aminosyre-, DNA- og mucinlagre som kreves for bufret base av syntetisk cystisk fibrose sputummedium, SCFM2.
| Kjemisk | Lagerkonsentrasjon (M) | Endelig konsentrasjon (mM) | Notater |
| Dekstrose (D-glukose) | 1 | 3 | |
| L-melkesyre | 1 | 9.3 | Juster til pH 7.0 med NaOH |
| CaCl2* 2H2O | 1 | 1.75 | |
| MgCl2*6H2O | 1 | 0.61 | |
| FeSO4*7H2O | 1 mg/ml | 0.0036 | Gjør fersk daglig |
| N-acetylglukosamin | 0.25 | 0.3 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-fosfokolin (DOPC) | 25 mg/ml | 100 μg/ml | Inkuber i minst 20 min ved 37 °C etter tilsetning |
Tabell 2: Fremstilling av ekstra bestander som kreves for bufret base av syntetisk cystisk fibrose sputum medium, SCFM2.
Supplerende figur S1: Pa aggregater i SCFM2. En gjengitt konfokal mikrograf av levedyktige (grønne) og ikke-levedyktige (røde) Pa-aggregater dannet i SCFM2. Skalastang = 5 μm. Forkortelser: SCFM2 = syntetisk cystisk fibrose sputum medium; Pa = Pseudomonas aeruginosa. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende video S1: Aggregater i SCFM2 etter behandling med antibiotika. Pa aggregerte bilder tatt hvert 30. Aggregater merkes individuelt av farger som representerer aggregert volum (μm3, fargeskala ikke vist som representativt bilde). Skalastang = 5 μm. Forkortelser: SCFM2 = syntetisk cystisk fibrose sputum medium; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = konfekt laserskanning mikroskopi. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbeidet har innført metoder som kan kombineres for å studere bakterielle aggregerte populasjoner i nærvær og fravær av antibiotikabehandling. Høyoppløselig CLSM tillater visualisering av endringer i aggregert biomasse og strukturell orientering av aggregater over sanntid når de utsettes for antibiotika. I tillegg kan fysiske og strukturelle egenskaper ved biomassen som forblir etter behandling med antibiotika kvantifiseres, med sikte på å korrelere disse observasjonene med fremtidige genuttrykksstudier ved hjelp av RNA-seq. Mens bruken av GFP-uttrykkende celler tillater visualisering av den kollektive og individuelle oppførselen til antibiotikatolerante celler, gir det bare en del av det overordnede bildet. Mye kan læres av romlig posisjonering av celler som ikke overlevde antibiotikabehandling, både individuelt og i forhold til den overlevende og tolerante biomassen.
Intervallmikroskopi genererer store mengder data. Et 18-timers eksperiment for observasjon av Pa-aggregater i SCFM2 identifiserer ~50 000 aggregater over tid, som har potensial til å bli karakterisert for volum- og romlig posisjonering. CLSM som brukes her (se materialtabellen) fanger opp høyoppløselige bilder av å utvikle aggregater for analyse. Romlig posisjonering av et individuelt aggregat (i forhold til omkringliggende aggregater) i tre dimensjoner (± 0,1 μm) kan brukes til å muliggjøre nøyaktige målinger av avstanden mellom aggregater. Fysiske fenotyper av bakterielle aggregater kan bestemmes ved hjelp av en kombinasjon av analysetilnærminger. Bildebehandlingsprogramvare gir overflategjengivelse og tredimensjonal (3D) posisjonering. Interne skript kan brukes til å sortere aggregater etter fenotype(f.eks.volum) og beregne fordeling av størrelsesbinned biomasse. Ytterligere ressurser er tilgjengelige for segmentering av enkeltceller i aggregater (f.eks.for å støtte bruken av transkripsjonelle reportere14). Samlet gir disse analyseverktøyene en bred vurdering av aggregerte fenotyper, med fleksibilitet til å endre analyser for nye interesser etter hvert som data genereres.
Etter den første 18-timers avbildningen ble aggregater behandlet med PI, en teknikk som ofte kalles levende/død farging. PI går inn i celler med en porøs (kompromittert) membran, slik at visualiseringen av døde eller sterkt stressede celler i motsetning til levende celler som uttrykker GFP. Den romlige organiseringen av bakterielle samfunn i CF-lungen som aggregater kan gi informasjon om bakteriell samfunnsatferd. Identifisering av levedyktige og ikke-levedyktige celler, som er beslaglagt i et aggregat, letter identifiseringen av fordelingen av celler i samfunnet som kan være mer følsom for antibiotikabehandling. Kvantifisering av de fysiske endringene som aggregater gjennomgår som respons på antibiotika, samt identifisere genotypiske egenskaper ved antibiotikatolerante aggregater, kan informere fremtidige terapier mot Pa.
Bruken av PI har også nedstrømsapplikasjoner i arbeidsflytens FACS-tilnærming, selv om det bør bemerkes at det ikke alltid er nødvendig, da levedyktige celler i dette eksperimentet kan differensieres av GFP-uttrykk. PI-farging gjør det imidlertid mulig å få romlig informasjon fra aggregater på slutten av hver analyse. Ved å fremheve bruken av FACS for å sortere aggregater, demonstrerer dette metodepapiret 1) at SCFM2 kan brukes i en FACS-maskin uten å forårsake skade eller tresko til tross for viskositeten, 2) FACS kan brukes til å skille enkeltceller fra et aggregat og gruppere dem i forskjellige populasjoner (fenotyper), og 3) PI-farging har verktøy for å skille døde celler fra en populasjon med FACS, spesielt hvis de andre cellene av interesse ikke uttrykker en fluorescerende markør. Bruken av levende cellefargingsteknikker fremhever anvendelsen av denne protokollen for bruk av kliniske isolasjoner der genetisk manipulasjon ofte er vanskelig. Selv om optimalisering sannsynligvis kreves stamme-for-stamme , kan aggregerte fenotyper identifiseres med samme oppløsning ved å bruke mange kommersielt tilgjengelige fluoroforer.
Kompatibilitet med SCFM2 med FACS er en stor fordel og lar nå etterforskere isolere spesifikke enkeltceller fra et aggregat til forskjellige populasjoner. Dette har i seg selv mange applikasjoner for fremtidige studier som inneholder blandede populasjoner av celler. For eksempel studere aggregering med andre arter eller heterogenitet innenfor enkeltarter aggregerer6. Denne spennende sorteringsprosessen med høy oppløsning er allment tilgjengelig i mange institusjoner og har mange nedstrømsapplikasjoner. Levedyktige celler fra aggregatene i denne studien ble sortert for fremtidige RNA-seq-eksperimenter. Andre programmer kan omfatte proteomikk; resampling av aggregater for evolusjonære studier, for eksempel å vurdere effekten av gjentatt antibiotikaeksponering; co-culturing med andre arter; eller kokulturering med humane immunceller (figur 5). Ved å kombinere disse metodene med CLSM-avbildningseksperimenter kan man korrelasjonen mellom observerte bakterielle egenskaper og atferd med kvantitative data, med potensial til å identifisere mekanismer for bakterielle samfunn, intraartrelasjoner eller resistens mot antimikrobielle midler.
Ved siden av de mange fordelene med disse metodene, er det noen fallgruver som bør løses. Denne studien bruker PI som en sluttpunktmarkør for celle levedyktighet; Ideelt sett i fremtiden vil dette bli erstattet med celleaktivitetsmodeller for å skille celler over flere tidspunkter. Disse dataene etablerer imidlertid bruken av SCFM2 til kulturmengder som kan sorteres på flere andre måter enn levende/døde. Den viktigste fordelen er at aggregater kan overføres direkte til FACS-maskinen uten vask, og potensiell forstyrrelse av enhver romlig struktur utviklet i løpet av et eksperiment. Totalt sett er dette en spennende plattform som kan brukes av mange laboratorier for å fremme samarbeidsprosjekter med de som er interessert i Pa, CF og mikrobiell oppførsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
S.E.D støttes av oppstartsmidler levert av Department of Molecular Medicine, University of South Florida, samt et CFF-forskningsstipend (DARCH19G0) N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, Chen)) og USF Institute on Microbiomes. Vi takker Whiteley-laboratoriet for løpende samarbeid med datasett relatert til dette manuskriptet. Vi takker Dr. Charles Szekeres for å legge til rette for FACS-sortering. Tall ble opprettet av A.D.G og S.E.D ved hjelp av Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino acids | |||
| Alanine | Acros Organics | 56-41-7 | |
| Arginine HCl | MP | 1119-34-2 | |
| Asparagine | Acros Organics | 56-84-8 | Prepared in 0.5 M NaOH |
| Cystine HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
| Glutamic acid HCl | Acros Organics | 138-15-8 | |
| Glycine | Acros Organics | 56-40-6 | |
| Histidine HCl H2O | Alfa Aesar | A17627 | |
| Isoleucine | Acros Organics | 73-32-5 | |
| Leucine | Alfa Aesar | A12311 | |
| Lysine HCl | Alfa Aesar | J62099 | |
| Methionine | Acros Organics | 63-68-3 | |
| Ornithine HCl | Alfa Aesar | A12111 | |
| Phenylalanine | Acros Organics | 63-91-2 | |
| Proline | Alfa Aesar | A10199 | |
| Serine | Alfa Aesar | A11179 | |
| Threonine | Acros Organics | 72-19-5 | |
| Tryptophan | Acros Organics | 73-22-3 | Prepared in 0.2 M NaOH |
| Tyrosine | Alfa Aesar | A11141 | Prepared in 1.0 M NaOH |
| Valine | Acros Organics | 72-18-4 | |
| Antibiotic | |||
| Carbenicillin | Alfa Aesar | J6194903 | |
| Day-of Stocks | |||
| CaCl2 * 2H2O | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Chemical | 50-99-7 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Fisher (Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform |
| FeSO4 * 7H2O | Acros Organics | 7782-63-0 | this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh |
| L-lactic acid | Alfa Aesar | L13242 | pH stock to 7 with NaOH |
| MgCl2 * 6H2O | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| N-acetylglucosamine | TCI | A0092 | |
| Prepared solids | |||
| Porcine mucin | Sigma | M1778-100G | UV-sterilize |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
| Stain | |||
| Propidium iodide | Alfa Aesar | J66764MC | |
| Salts | |||
| K2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
| KCl | Alfa Aesar | J64189 | add solid directly to buffered base |
| KNO3 | Acros Organics | 7757-79-1 | |
| MOPS | Alfa Aesar | A12914 | add solid directly to buffered base |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | add solid directly to buffered base |
| Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
| NH4Cl | Acros Organics | 12125-02-9 | add solid directly to buffered base |
| Consumables | |||
| Conical tubes (15 mL) | Olympus plastics | 28-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Olympus plastics | 28-106 | |
| Culture tubes w/air flow cap | Olympus plastics | 21-129 | |
| 35 mm four chamber glass-bottom dish | CellVis | NC0600518 | |
| Luria Bertani (LB) broth | Genessee Scientific | 11-118 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Bioreagents | BP2944100 | |
| Pipet tips (p200) | Olympus plastics | 23-150RL | |
| Pipet tips (p1000) | Olympus plastics | 23-165RL | |
| Serological pipets (5 mL) | Olympus plastics | 12-102 | |
| Serological pipets (25 mL) | Olympus plastics | 12-106 | |
| Serological pipets (50 mL) | Olympus plastics | 12-107 | |
| Ultrapure water (RNase/DNase free); nanopure water | Genessee Scientific | 18-194 | Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1 |
| Syringes (10 mL) | BD | 794412 | |
| Syringes (50 mL) | BD | 309653 | |
| 0.22 mm PES syringe filter | Olympus plastics | 25-244 | |
| PS cuvette semi-mico | Olympus plastics | 91-408 | |
| Software | |||
| Biorender | To prepare the figures | ||
| FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| Imaris | Bitplane | version 9.6 | |
| Zen Black | |||
| Equipment | |||
| FacsAriallu | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| LSM 880 confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
- Ramsay, K. A., et al. The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).
- Bessonova, L., et al. Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor. Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).
- Breuer, O., et al. Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).
- O'Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections. Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).
- Bjarnsholt, T., et al.
- Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).
- Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
- Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).
- Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. MBio. 8 (2), 00240 (2017).
- Jorth, P., et al. Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs. Cell Host & Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
- Hartmann, R., et al. Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ. Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).
- Stacy, A., et al. Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).
