Summary
Синтетическая среда мокроты при муковисцидозе (SCFM2) может быть использована в сочетании как с конфокальной лазерной сканирующей микроскопией, так и с флуоресцентно-активированной сортировкой клеток для наблюдения бактериальных агрегатов с высоким разрешением. В этой статье подробно описываются методы оценки совокупных популяций во время антимикробного лечения в качестве платформы для будущих исследований.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (Pa) является одним из наиболее распространенных условно-патогенных микроорганизмов, связанных с муковисцидозом (МВ). Как только колонизация Па установлена, большая часть инфекционных бактерий образует биопленки в мокроте дыхательных путей. Было показано, что биопленки Па, выделенные из мокроты муковисцидного средства, растут в небольших, плотных агрегатах ~ 10-1000 клеток, которые пространственно организованы и демонстрируют клинически значимые фенотипы, такие как устойчивость к противомикробным препаратам. Одной из самых больших проблем при изучении того, как агрегаты Pa реагируют на изменение среды мокроты, является отсутствие питательных и надежных систем, которые способствуют образованию агрегатов. Используя синтетическую среду мокроты CF (SCFM2), историю жизни агрегатов Pa можно наблюдать с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) и анализа изображений с разрешением одной клетки. Эта система in vitro позволяет наблюдать тысячи агрегатов различного размера в режиме реального времени, трех измерениях и в микроном масштабе. На индивидуальном и популяционном уровнях способность группировать агрегаты по фенотипу и положению облегчает наблюдение агрегированных агрегатов на разных стадиях развития и их реакцию на изменения в микросреде, такие как лечение антибиотиками, которые должны быть дифференцированы с точностью.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa (Pa) является оппортунистическим патогеном, который устанавливает хронические инфекции у людей с ослабленным иммунитетом. Для людей с генетическим заболеванием муковисцидоз (МВ) эти инфекции могут охватывать всю жизнь. Муковисцидоз вызывает накопление вязкой, богатой питательными веществами мокроты в дыхательных путях, которая со временем колонизируется различными микробными патогенами. Па является одним из наиболее распространенных патогенов муковисцидоза, колонизируя дыхательные пути в раннем детстве и устанавливая трудноизуемые инфекции1. Па остается значительной клинической проблемой и считается ведущей причиной смертности у лиц с муковисцидозом, несмотря на улучшение схем терапии в последниегоды2,3. Этот фенотип персистенции и повышение толерантности к антибиотикам принесли Па место в группе патогенов, идентифицированных как Центрами по контролю и профилактике заболеваний (CDC), так и Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в качестве исследовательских приоритетов для разработки новых терапевтических стратегий - патогенов ESKAPE4.
Как и другие патогены ESKAPE, приобретенная устойчивость к антибиотикам распространена в Pa,но есть также много внутренних свойств, которые способствуют антимикробной толерантности Pa. Среди них способность Па образовывать агрегаты — высокоплотные кластеры из ~10-1000 клеток, которые могут наблюдаться при множественных инфекциях, в том числе при МВ мокроте больного5,6. Подобно Pa, изученным в других системах биопленки, агрегаты Pa демонстрируют клинически значимые фенотипы, такие как повышенная устойчивость к антибиотикам и активация клеточно-клеточной коммуникации (кворум-зондирование (QS)). Например, было показано, что агрегаты Па используют QS-регулируемое поведение для борьбы с другими микробами, а также переносят антимикробные методы лечения, такие как производство пиоцианина7. Способность изучать такое поведение дает захватывающее представление о бактериальных экосистемах в среде, подобной той, в которой они существуют в организме человека.
Одной из самых больших проблем при изучении того, как агрегаты Pa реагируют на изменение среды мокроты, является отсутствие питательных и надежных систем, которые способствуют образованию агрегатов. Многое из того, что известно о Па, было обнаружено с использованием систем in vitro, в которых клетки растут планктонально или в характерной поверхностно-прикрепленной, «грибной» архитектуре, которая не наблюдалась in vivo8. В то время как классические модели роста биопленки, такие как прототочные клетки или твердый агар, дали обширные и ценные знания о поведении бактерий и механизмах толерантности к антибиотикам, эти результаты не всегда переводятся in vivo. Многие модели in vitro имеют ограниченную способность имитировать среду роста места инфекции человека, что требует дорогостоящих исследований in vivo. В свою очередь, многим моделям in vivo не хватает гибкости и разрешения, предоставляемых методами in vitro.
Синтетический муковисцидоз мокроты (SCFM2) предназначен для обеспечения среды для роста Па, аналогичной той, которая наблюдается во время хронической инфекции в легких муковисцидоза. SCFM2 включает источники питания, идентифицированные в отхаркиваемой смуте CF в дополнение к муцину, липидам и ДНК. Рост Pa в SCFM2 требует почти идентичного набора генов, необходимых для роста фактической мокроты, и поддерживает естественное образование агрегата Pa 9,10. После инокуляции планктонные клетки образуют агрегаты, которые увеличиваются в размерах за счет расширения. Отдельные клетки (называемые мигрантами) высвобождаются из агрегатов, мигрируют в неколонизированные районы и образуют новые агрегаты10. Эту историю жизни можно наблюдать с помощью CLSM и анализа изображений с разрешением одной клетки. Агрегаты Па, образующиеся в SCFM2, имеют размеры, аналогичные тем, которые наблюдаются в легкомCF 10. Эта модель позволяет наблюдать несколько агрегатов различного размера в режиме реального времени и в трех измерениях в микроновом масштабе. Покадровая микроскопия позволяет отслеживать тысячи (~50 000) агрегатов в одном эксперименте. Использование программного обеспечения для анализа изображений позволяет количественно оценить совокупные фенотипы по микроснимкам, включая совокупный объем, площадь поверхности и положение в трех измерениях до ближайших 0,1 мкм, как на индивидуальном агрегированном, так и на популяционном уровнях. Наличие способности группировать агрегаты по фенотипу и положению позволяет с точностью дифференцировать агрегаты на разных стадиях развития, а также их реакцию на изменениемикросреды 6,11.
Применение SCFM2 для изучения агрегатов Pa в анализах с низким объемом и высокой пропускной способностью делает его гибкой и экономически эффективной моделью. В качестве определенной среды SCFM2 обеспечивает однородность и воспроизводимость на нескольких платформах, обеспечивая питательную и физически релевантную методику изучения агрегатов Pa in vitro9. Приложения включают его использование в сочетании с CLSM для наблюдения пространственной организации и толерантности к антибиотикам при высоком разрешении (как описано в этой статье о методах). Возможность проводить эксперименты, которые предоставляют данные в микроновом масштабе в режиме реального времени, позволяет изучать внутривидовые и межвидовые взаимодействия, поскольку они могут происходить in vivo. Например, SCFM2 ранее использовался для изучения пространственной динамики клеточно-клеточной коммуникации в совокупных популяциях через сеть систем, используемых Pa для регулирования нескольких генов, которые способствуют вирулентности и патогенезу6.
Рисунок 1:Графическое изображение основных экспериментальных этапов. (A)SCFM2 инокулируют Па-клетками и позволяют формировать агрегаты в чашке со стеклянным дном. (B) Агрегаты переносятся в конфокальный микроскоп и добавляют антибиотик. Изображены три технические реплики (камеры 1-3) и контрольная скважина (4) инокулированного SCFM2 без лечения антибиотиками. Агрегаты визуализируются с использованием CLSM в течение 18 ч. (C) После первоначальной 18-ч визуализации агрегаты обрабатывают йодидом пропидия для визуализации мертвых клеток и визуализируют с помощью CLSM (D) Агрегаты с желаемым фенотипом отделяют от SCFM2 с помощью FACS. Сокращения: SCFM2 = синтетический муковисцидоз мокроты; Pa = Синегнойная палочка; CLSM = конфокальная лазерная сканирующая микроскопия; FACS = флуоресцентная сортировка клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Здесь демонстрируется полезность SCFM2 для изучения влияния лечения антибиотиками на агрегаты Pa в режиме реального времени, за которым следует использование клеточного подхода для выделения популяций агрегатов с различными фенотипами для последующего анализа(рисунок 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовьте синтетическую среду муковисцидоза (SCFM2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка SCFM2 состоит из трех основных этапов, описанных ниже(рисунок 2). Для получения полной информации и ссылок см.9,10,12.
Рисунок 2:Подготовка и инокуляция среды SCFM2. (А)Буферное основание получают с использованием солей и аминокислот, перечисленных в Таблице 1 и Таблице 2. Буферизованная основа может храниться при 4 °C до 30 дней, но должна быть защищена от воздействия света. (B)Муцин и ДНК добавляют к аликвоте буферного основания и растворяют в растворе на ночь при 4 °C.(C)Липиды и дополнительные запасы добавляют в ночной раствор и инкубируют при 37 °C с перемешиванием при 250 об/мин в течение 20 мин. Затем SFCM2 инокулируют промытыми, логарифматическими клетками при OD600 = 0,05. Сокращения: SCFM2 = синтетический муковисцидоз мокроты среды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Стерилизация муцина свиней
- Готовят стерильный муцин в конечной концентрации 5 мг/мл в SCFM2. Например, для объема SCFM2 объемом 5 мл взвесьте 25 мг муцина типа II в стерильной чашке Петри и поместите в ультрафиолетовый (УФ) стерилизатор на 4 ч, осторожно перемешивая каждый час.
- Через 4 ч переведите обработанный УФ-излучение муцин в аутоклавные пробирки по 1,7 мл в стерильных условиях и храните при -20 °C.
- Чтобы подтвердить полную стерилизацию, растворите образец муцина в стерильной жидкости, такой как вода или бульон Luria Bertani (LB), и наблюдайте под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизованный муцин можно хранить при -20 °C до 6 месяцев.
- Подготовка буферного основания
- Приготовьте растворы солей и аминокислот, добавив соответствующие количества по весу в деионизированную воду, как указано в таблице 1. Фильтруйте и стерилизуйте все стандартные растворы с помощью фильтра 0,22 мкм, заверните в фольгу для защиты от легкой деградации и храните при 4 °C до одного месяца.
- Готовят буферное основание путем объединения 190 мл деионизированной воды с растворами аминокислот и солей по объемам, перечисленным в таблице 1. Отрегулируйте раствор до рН 6,8 и увеличьте до конечного объема 250 мл. Фильтруют-стерилизуют с помощью фильтра 0,22 мкм и хранят при 4 °C до 30 дней.
- Вечером перед экспериментом аликвотируйте нужное количество буферного основания в стеклянную культурную колбу и добавляйте муцин (5 мг/мл, как описано на этапе 1.1.1) и очищенную ДНК сперматозоидов лосося (0,6 мг/мл). Осторожно перемешать, завернуть в фольгу и оставить при 4 °C на ночь, чтобы муцин и ДНК растворились в растворе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвоты ДНК сперматозоидов лосося следует размораживать на льду, вихрь и добавлять в буферное основание и муцин. Растворы триптофана, аспарагина и тирозина необходимо готовить в растворах NaOH (см. таблицу 1 для концентраций) вместо деионизированной воды. Храните буферизованный фундамент и все склады растворов, обернутые в фольгу для защиты от воздействия света. Большинство акций будут стабильными до месяца. Запасы, которые обесцвечиваются, не должны использоваться и должны быть заменены перед использованием.
- Добавление дополнительных запасов
- В день эксперимента добавьте запасы, перечисленные в таблице 2, к буферной основе, содержащей муцин и ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Готовят свежий раствор FeSO4 в день эксперимента, но все остальные запасы можно сделать заранее и хранить в течение 30 дней при 4 °C. 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC) содержит хлороформ. Относитесь с осторожностью и не используйте близкое открытое пламя. После добавления DOPC инкубируют SCFM2 при 37 °C с встряхиванием (250 об/мин) в течение не менее 20 мин (для культуры 5 мл). Этот инкубационный период позволяет хлороформу в DOPC испаряться. Колба не должна быть герметичной; вместо этого накройте отверстие колбы свободно фольгой.
- В день эксперимента добавьте запасы, перечисленные в таблице 2, к буферной основе, содержащей муцин и ДНК.
2. Оценка толерантности к противомикробным препаратам в бактериальных агрегатах в режиме реального времени
- Подготовка культур на ночь
- Вечером перед экспериментом привить 5 мл бульона LB несколькими колониями Pa PAO1-pMRP9-113 из пластины агара LB, содержащей антибиотик (карбенициллин 300 мкг/мл). Расти в течение ночи при 37 °C с перемешиванием при 250 об/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выращивать ночные культуры с добавлением антибиотиков, необходимых для отбора необходимых плазмид (здесь плазмида экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP), pMRP9-1). Обратите внимание, что Па-клетки должны быть промыты перед инокуляцией SCFM2. LB может быть заменен другими богатыми лабораторными средами для ночных культур. Все бактериальные изоляты должны обрабатываться с использованием соответствующих руководящих принципов BSL-2 на протяжении всего этого протокола.
- Вечером перед экспериментом привить 5 мл бульона LB несколькими колониями Pa PAO1-pMRP9-113 из пластины агара LB, содержащей антибиотик (карбенициллин 300 мкг/мл). Расти в течение ночи при 37 °C с перемешиванием при 250 об/мин.
- Инокулировать SCFM2
- В день эксперимента обратно разбавляют ночные культуры Па 1:10 (культура: жидкие среды) путем инокуляции 500 мкл в 5 мл свежего бульона LB. Выращивают клетки до логарифмической фазы (60-90 мин) при 37 °C с перемешиванием при 250 об/мин.
- Центрифуга log phase культуры при 10 000 × г в течение 5 мин. Промывайте клетки путем удаления супернатанта и повторного использования в 3 мл стерилизованного фильтром фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS, pH 7,0). Повторите дважды и повторно суспендируют гранулу в конечном объеме 1 мл PBS.
- Измерьте абсорбируемость промытых клеток с помощью спектрофотометра при 600 нм (OD600)и рассчитайте объем культуры, необходимый для начального OD600 0,05 в 5 мл SCFM2. Инокулируют Па в SCFM2 и осторожно вихрь распределяют клетки по всему. Пипетка 1 мл инокулированного SCFM2 в каждую камеру 4-х скважин, стеклянного дна, оптической чашки и инкубировать в течение 4 ч статически при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время удвоения па-культур зависит от штамма и доступности кислорода. В SCFM2, в условиях, описанных здесь, время удвоения Pa составляет ~1,4 ч10.
3. Визуализация агрегатов во время лечения антибиотиками с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM)
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается использование конфокального лазерного сканирующего микроскопа и программного обеспечения для захвата изображений для визуализации агрегатов Pa в SCFM2. Цель состоит в том, чтобы наблюдать и охарактеризовать оставшуюся (толерантную) бактериальную биомассу после лечения антибиотиками. Описанные шаги могут быть успешно выполнены на других конфокальных микроскопах, хотя руководство по эксплуатации прибора должно быть упомянуто для конкретного руководства.
- Изображение культур Pa с использованием либо нагретой камеры, либо нагретой микропластины, установленной на сцене микроскопа, для поддержания температуры окружающей среды 37 °C. Запустите инкубационный модуль по меньшей мере за 2 ч до начала эксперимента, чтобы позволить всему аппарату достичь желаемой температуры и уменьшить дальнейшее расширение и движение во время сбора данных.
- Через 4 ч перекладывать культуры SCFM2, содержащие Па-клетки, на стадию нагретого микроскопа. Назначьте 3 из 4 скважин в качестве технических реплик для лечения антибиотиками, а4-ю скважину рассмотрите как необочевой контроль, содержащую только Па-клетки в SCFM2, без антибиотика. Идентифицируйте агрегаты с помощью микроскопии яркого поля на вкладке «Местоположение» перед любым возбуждением флуоресцентных репортеров. Определите область для визуализации в пределах каждой скважины и сохраните ее положение (координаты x-y-z) с помощью модуля «Позиции» в программном обеспечении для визуализации.
- Используйте 63-кратный масляный объектив для визуализации культур Pa, содержащих плазмиду экспрессии GFP pMRP9-1 в SCFM2 с длиной волны возбуждения 488 нм и длиной волны излучения 509 нм. Снимайте снимки с помощью опции z-stack в модуле Acquisition с интервалом 1 мкм (всего 60 фрагментов). Используйте модуль линейного усреднения для уменьшения фоновой флуоресценции в канале GFP в пределах общего объема изображений z-стека 60 мкм (1 093,5 мм3). Получение контрольных изображений неинокулированного SCFM2 с использованием идентичных настроек для определения фоновой флуоресценции для анализа изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения получены путем создания 512 пикселей x 512 пикселей (0,26 мкм x 0,26 мкм пикселей) 8-битных изображений z-стека, которые находятся на 60 мкм от основания крышки. - Используйте опцию временных рядов в программном обеспечении для визуализации, чтобы захватить 60 срезов в каждом положении (скважине) с интервалом 15 минут в течение 18 часов. Используйте определенную стратегию фокусировки в программном обеспечении для хранения фокальной плоскости для каждой позиции, которая возвращается в каждую точку времени на протяжении всего эксперимента.
- После в общей сложности 4,5 ч инкубации визуйте каждую позицию, используя вышеуказанные настройки, чтобы определить совокупную биомассу в каждой из четырех скважин до добавления антибиотика.
- После 6 ч полной инкубации добавляют антибиотик в 2 раза ниже минимальной ингибирующей концентрации (МИК) к каждой реплике. Пипетка прямо и осторожно в середину колодца, чуть ниже воздушно-жидкой межфазы. Храните все культуры в отапливаемой конфокальной камере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовался колистина сульфат в концентрации 140 мкг/мл. - Начните визуализацию после лечения антибиотиками, нажав на опцию Начать эксперимент в программе визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая концентрация антибиотика зависит от антибиотика, изолята Па, и от того, хочет ли пользователь изучить убийственные или переносимые эффекты. В этом эксперименте используется одна доза. Дополнительные дозы могут быть добавлены без разрушения культур, если это необходимо.
4. Окрашивание йодида пропидия агрегатов Pa
ПРИМЕЧАНИЕ: Йодид пропидия (PI) обычно используется в качестве окрашивающего реагента для идентификации нежизнеспособных (мертвых) бактериальных клеток в культуре. Здесь он используется для выявления агрегатов, чувствительных к лечению антибиотиками, применяемым в разделе 3. На протяжении всего этого протокола экспрессия и обнаружение GFP в Па-клетках используется в качестве основного прокси для жизнеспособности клеток. Этот заключительный этап позволяет еще раз использовать конфокальную визуализацию для определения пространственного позиционирования живых/мертвых агрегатов по отношению друг к другу. Кроме того, агрегаты идентифицируются как живые/мертвые для дальнейшей последующей сортировки ячеек в разделе 5.
- Через 18 ч добавляют PI в каждую скважину четырехкамерной оптической донных тарелок, содержащей культуры SCFM2. Следуйте инструкциям производителя по объему ПИ и времени инкубации(например,~2 мкл на мл культуры, ~20-30 мин).
5. Изоляция живых клеток от агрегатов с использованием подхода FACS
ПРИМЕЧАНИЕ: FACS представляет собой мощную платформу для сортировки и изоляции групп клеток в соответствии с флуоресцентно помеченным фенотипом. Здесь FACS используется для выделения живых (устойчивых к антибиотикам) агрегатов из нежизностных агрегатов.
- После окрашивания йодидом пропидия удаляют культуры из инкубации и переносят на прибор FACS в изолированном контейнере для поддержания 37 °C.
- Запустите 1 мл аликвот SCFM2, содержащих агрегаты Pa, с наименьшим расходом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая аликвота будет содержать ~15 000 агрегатов. - Чтобы обнаружить GFP, осветите ячейки лазером 488 нм и запишите высоту флуоресцентного сигнала на уровне 530/30 нм. Визуализируйте окрашивание PI путем возбуждения с помощью лазера 561 нм и запишите высоту флуоресцентного сигнала на уровне 610/20 нм. Выполните сортировку с помощью 70-еу сопла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отсортированные агрегаты могут быть объединены в пул несколькими способами в зависимости от приложения пользователя. В этом случае FACS использовался для сортировки жизнеспособных агрегатов Pa для последующего секвенирования РНК. Альтернативные приложения обсуждаются ниже.
6. Анализ изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Покадровая микроскопия генерирует большие объемы данных. 18-часовой эксперимент по наблюдению агрегатов Па в SCFM2 выявил ~50 000 агрегатов с течением времени, которые могут быть охарактеризованы для объемного и пространственного позиционирования. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для количественной оценки совокупной динамики в SCFM2:
- Для агрегированных исследований в SCFM2 количественно оцените фоновую флуоресценцию GFP путем создания гистограммы количеств в канале GFP, которая производится для неинокуляционных SCFM2 и SCFM2, привитых штаммом Pa PAO1, несущим pMRP9-1. Чтобы убедиться, что обнаруженные вокселы GFP коррелируют с биомассой Pa, определите воксель GFP+ как ≥1,5x значения фонового количества GFP.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фоновая флуоресценция определяется как наибольшее значение вокселя из трех случайно выбранных позиций, усредненное. Количество фона, как стандартная мера, вычитается из всех пикселей экспериментальных изображений программным обеспечением для анализа изображений. - После вычитания фона в модуле Surpass создайте изоповерхности для всех оставшихся вокселей.
- Чтобы обнаружить отдельные агрегаты, включите параметр «Разделенные объекты» и определите агрегаты как объекты с объемами ≥5 мкм3. Используйте модуль Vantage в программном обеспечении для анализа изображений для расчета объема, x-y-z и суммы вокселей GFP для каждого отдельного объекта. Экспортируйте эти данные на внешнюю статистическую платформу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые программы для анализа изображений позволяют экспортировать несколько количественных фентоайпов одновременно, что позволяет рассчитывать корреляции. - Фильтруйте данные, экспортируемые из модуля Vantage, по размеру, чтобы гарантировать, что не останется объектов <0,5мкм3 (дисперсная биомасса). Для каждого отдельного объекта в пределах изображения рассчитайте расстояние от себя по отношению к другим объектам (агрегатам) с помощью модуля Vantage программного обеспечения для анализа изображений или вручную с помощью следующего уравнения.
d = sqrt((x2− x1)2 + (y2− y1)2 + (z2− z1)2) (1) - Используйте расчеты SUM и AVERAGE, чтобы найти общую биомассу и средний совокупный объем. В качестве альтернативы можно экспортировать данные в другие статистические платформы или сценарии, например,распределение агрегатов по биомассе, как обсуждается в репрезентативных результатах (сценарий не опубликован в сотрудничестве с лабораторией Уайтли, Технологический институт Джорджии).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этой работе подробно описываются методы наблюдения агрегатов Па в высоком разрешении и в среде, аналогичной хронической инфекциилегкого МВ 9,10,12. SCFM2 обеспечивает систему in vitro, которая способствует естественной агрегации Па-клеток в размерах, аналогичных тем, которые наблюдаются во время фактической инфекции10. Адаптивность SCFM2 в качестве определенной среды может быть использована для подхода ко многим направлениям исследований. Цель этой работы состоит в том, чтобы подчеркнуть рабочий процесс, который включает в себя сочетание микроскопии и FACS, с намерением поощрять его использование для будущих исследований, сотрудничества и приложений.
Использование CLSM позволяет проводить временную визуализацию с высоким разрешением, которая может быть использована для изучения динамики развития бактериальных популяций. Эта работа демонстрирует несколько потенциальных способов, с помощью которых агрегаты Па могут быть охарактеризованы после лечения антибиотиком. Рисунок 3А дает широкое представление о жизнеспособных агрегатах Па после лечения антибиотиками. Через четыре часа после применения антибиотика остаются множественные агрегаты; цветовые диапазоны могут быть применены для представления различных характеристик каждого отдельного агрегата. Примеры количественных характеристик включают объем, площадь, интенсивность вокселя (для использования флуоресцентных репортеров) и положение в любой из осей x-y-z.
Анализ изображений с использованием специального программного обеспечения позволяет полностью настраивать данные, идентифицируя каждую совокупность как отдельный объект, при этом количественные данные могут быть экспортированы для дальнейшего анализа. На рисунке 3B приведен пример использования экспортированных данных. Здесь общая биомасса совокупных популяций может быть рассчитана с течением времени. В этих репрезентативных данных лечение антибиотиком значительно снижает биомассу по сравнению с необработанными агрегатами. Дополнительное видео S1 является мощным представлением того, как микроскопия временных рядов может быть использована для физического наблюдения агрегатов в этих данных биомассы после лечения антибиотиками. Каждая совокупность была окрашена в цветовую кодировку для представления расчетного объема (мкм3),что позволяет визуально регистрировать совокупные популяции, которые также могут быть использованы для дальнейшего пространственного анализа с использованием приложений, как в программном обеспечении для анализа изображений, так и в других ресурсах (не обсуждается здесь10,15).
Эксперименты, разработанные для выявления механизмов толерантности к антибиотикам в агрегатах Па, дают большие объемы данных. Каждая реплика производит физические данные ~ 15 000 агрегатов (~ 60 000 агрегатов в общей сложности). Новый подход к обработке этих данных включал в себя производство агрегированных тепловых карт(рисунок 3C). Вычисляя, как агрегаты разных размеров вносят вклад в общую популяцию, можно определить закономерности того, как агрегаты реагируют на лечение антибиотиками по отношению к их размеру, форме и положению по отношению друг к другу.
Рисунок 3:Примеры анализа агрегированных данных. (A) Обзор оставшейся совокупной биомассы после лечения антибиотиками. Изоповерхности соответствующих вокселей GFP были отрисованы и окрашены в соответствии с объемом (мкм3). Шкала бара = 30 мкм. (B)Общая биомасса (мкм3)совокупных популяций Па с течением времени в SCFM2. Синяя линия представляет необработанные агрегаты, красная линия представляет агрегаты, обработанные антибиотиком, колистином (140 мкг/мл). Представленные данные включают 3 биологических репликата (± SEM). (C)Агрегированные объемные тепловые карты, представляющие вклад отдельных агрегатов по объему (мкм3, осьx) в общую биомассу (мкм3,вторая ось y) с течением времени (h, ось y). Репрезентативные данные включают агрегаты Pa в присутствии и отсутствии антибиотика (как на рисунке 3B),где 0 ч представляет время добавления антибиотика после 6 ч совокупного роста. Данные включают три биологические реплики (~ 50 000 общих агрегатов). Сокращения: GFP = зеленый флуоресцентный белок; SCFM2 = синтетическая среда мокроты муковисцидоза; SEM = стандартная погрешность среднего значения; Pa = Синегнойная палочка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Пространственный анализ на этом этапе предполагает использование экспрессии GFP Pa в качестве прокси жизнеспособности в присутствии антибиотика. Добавление ПИ после 18 ч позволяет определить положение нежизрелых агрегатов по отношению к жизнеспособным агрегатам(дополнительный рисунок S1). Главной целью этого метода является выявление пространственных закономерностей между чувствительными и толерантными агрегатами после лечения антибиотиками. Будущие исследования будут включать в себя несколько временных точек в дополнение к анализу конечной точки, описанному выше.
На заключительном этапе рабочего процесса используется основанный на СУИМ подход к сортировке агрегатов в SCFM2. Эта работа демонстрирует способность FACS отделять жизнеспособные клетки от оставшейся популяции агрегатов (включая нежизности). На рисунке 4 показано использование FACS для объединения жизнеспособных агрегатов для дальнейших экспериментов, таких как высокопроизводительное секвенирование, например,секвенирование РНК (RNA-seq). После лечения антибиотиками(Рисунок 4А представляет собой один момент времени (18 ч) аликвоты SCFM2, содержащие агрегаты Pa, могут быть успешно разделены в соответствии с их флуоресцентными характеристиками. Здесь GFP был идентифицирован для толерантных агрегатов. На рисунке 4B приведен пример одного из таких событий сортировки, когда GFP-экспрессирующие клетки отделяются от оставшейся культуры (агрегатов, обработанных PI). Кроме того, агрегаты могут быть четко идентифицированы по SCFM2, который производит свой собственный флуоресцентный профиль. Возможность сортировки ячеек таким способом имеет множество применений(рисунок 5).
Рисунок 4:СУИМ по агрегатам Па в SCFM2. (A)Диаграмма инструмента СУИМ, используемого для отделения жизнеспособных и неживостных агрегатов Па от СКФМ2. (B)Репрезентативный график агрегатов, разделенных в SCFM2, генерируемый программным обеспечением FACS. Три квадранта указывают на живые агрегаты (GFP), оставшуюся культуру, содержащую нежизнеспособные клетки (RFP используется в качестве альтернативы окрашиванию йодида пропидия, оба возбуждаемые лазером 488 нм), и контроль SCFM2. Данные представляют собой 1 из 3 биологических реплик, содержащих ~15 000 событий (агрегатов). Сокращения: FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток; SCFM2 = синтетическая среда мокроты муковисцидоза; Pa = Синегнойная палочка; GFP = зеленый флуоресцентный белок; RFP = красный флуоресцентный белок; PE-Texas Red-H = пиковая высота для фикоэритрин-техасских красных конъюгированных окрашенных клеток; FITC-H = пиковая высота для флуоресцеиновых изотиоцианат-окрашенных клеток.
Рисунок 5:Потенциальное экспериментальное применение с использованием SCFM2. (A)Воздействие агрегатов Pa повторных доз антибиотиков. (B) Кокультура агрегатов Па с другими видами бактерий. (C)Воздействие агрегатов Pa на иммунные клетки хозяина, например,PMN. A, Bи C могут быть объединены с методами визуализации CLSM и подходом FACS для последующего РНК-seq, протеомики или 3D-пространственного анализа. Сокращения: SCFM2 = синтетический муковисцидоз мокроты; Pa = Синегнойная палочка; ПМН = полиморфоядерные лейкоциты; CLSM = конфокальная лазерная сканирующая микроскопия; FACS = флуоресцентная активированная сортировка клеток; RNA-seq = секвенирование РНК; 3D = трехмерный; LC-MS/MS = жидкостная хроматография/тандемная масс-спектрометрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Химический | Концентрация запасов (м) | Конечная концентрация (мМ) | Примечания |
| НаН2PO4 | 0.2 | 1.3 | |
| Na2HPO4 | 0.2 | 1.25 | |
| КНО3 | 1 | 0.35 | |
| К2SO4 | 0.25 | 0.27 | |
| NH4Cl | 2.28 | Добавление твердого вещества непосредственно к буферизованной базе | |
| ККл | 14.94 | Добавление твердого вещества непосредственно к буферизованной базе | |
| НаКл | 51.85 | Добавление твердого вещества непосредственно к буферизованной базе | |
| ШВАБРЫ | 10 | Добавление твердого вещества непосредственно к буферизованной базе | |
| Сир | 0.1 | 1.45 | |
| Глу HCl | 0.1 | 1.55 | |
| Профессионал | 0.1 | 1.66 | |
| Гли | 0.1 | 1.2 | |
| Ала | 0.1 | 1.78 | |
| Валь | 0.1 | 1.12 | |
| Встреченный | 0.1 | 0.63 | |
| Иль | 0.1 | 1.12 | |
| Лей | 0.1 | 1.61 | |
| Орн HCl | 0.1 | 0.68 | |
| Lys HCl | 0.1 | 2.13 | |
| Arg HCl | 0.1 | 0.31 | |
| Трп | 0.1 | 0.01 | Подготовлено за 0,2 М NaOH |
| Гадюка | 0.1 | 0.83 | Подготовлено за 0,5 М NaOH |
| Тир | 0.1 | 0.8 | Подготовлено за 1,0 м NaOH |
| Thr | 0.1 | 1.07 | |
| Cys HCl | 0.1 | 0.16 | |
| Пхе | 0.1 | 0.53 | |
| Его HCl H2O | 0.1 | 0.52 | |
| ДНК сперматозоидов лосося | 0,6 мг/мл | ||
| Свиной муцин | 5 мг/нл |
Таблица 1: Получение солей, аминокислот, ДНК и муцинов, необходимых для буферного основания синтетической среды мокроты муковисцидоза, SCFM2.
| Химический | Концентрация запасов (М) | Конечная концентрация (мМ) | Примечания |
| Декстроза (D-глюкоза) | 1 | 3 | |
| L-молочная кислота | 1 | 9.3 | Настройка на pH 7.0 с naOH |
| CaCl2*2H2O | 1 | 1.75 | |
| MgCl2*6H2O | 1 | 0.61 | |
| FeSO4*7H2O | 1 мг/мл | 0.0036 | Делайте свежим ежедневно |
| N-ацетилглюкозамин | 0.25 | 0.3 | |
| 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоколин (DOPC) | 25 мг/мл | 100 мкг/мл | Инкубировать не менее 20 мин при 37 °C после добавления |
Таблица 2: Подготовка дополнительных запасов, необходимых для буферного основания синтетической среды мокроты при муковисцидозе, SCFM2.
Дополнительный рисунок S1: Агрегаты Pa в SCFM2. Визуализированная конфокальная микрофотография жизнеспособных (зеленый) и нежизносимых (красный) агрегатов Па, сформированных в SCFM2. Шкала бара = 5мкм. Сокращения: SCFM2 = синтетический муковисцидоз мокроты; Pa = Синегнойная палочка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительное видео S1: Агрегаты в SCFM2 после лечения антибиотиком. Pa агрегированные изображения, снятые каждые 30 минут в SCFM2 с помощью CLSM. Агрегаты маркируются индивидуально цветами, представляющими совокупный объем (мкм3,цветовая шкала не показана как репрезентативное изображение). Шкала бар = 5 мкм. Сокращения: SCFM2 = синтетический муковисцидоз мокроты; Pa = Синегнойная палочка; CLSM = конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта работа представила методологии, которые могут быть объединены для изучения бактериальных совокупных популяций при наличии и отсутствии лечения антибиотиками. CLSM с высоким разрешением позволяет визуализировать изменения в совокупной биомассе и структурной ориентации агрегатов в режиме реального времени при воздействии антибиотиков. Кроме того, физические и структурные особенности биомассы, которые остаются после лечения антибиотиками, могут быть количественно определены с целью корреляции этих наблюдений с будущими исследованиями экспрессии генов с использованием РНК-seq. Хотя использование GFP-экспрессивных клеток позволяет визуализировать коллективное и индивидуальное поведение устойчивых к антибиотикам клеток, оно обеспечивает лишь часть общей картины. Многое можно узнать из пространственного позиционирования клеток, которые не пережили лечение антибиотиками, как индивидуально, так и по отношению к выживающей и толерантной биомассе.
Покадровая микроскопия генерирует большие объемы данных. 18-часовой эксперимент по наблюдению агрегатов Па в SCFM2 выявил ~50 000 агрегатов с течением времени, которые могут быть охарактеризованы для объемного и пространственного позиционирования. CLSM, используемый здесь (см. Таблицу материалов),захватывает изображения с высоким разрешением разрабатываемых агрегатов для анализа. Пространственное позиционирование отдельного агрегата (относительно окружающих агрегатов) в трех измерениях (± 0,1 мкм) может быть использовано для точного измерения расстояния между агрегатами. Физические фенотипы бактериальных агрегатов могут быть определены с использованием комбинации подходов к анализу. Программное обеспечение для визуализации обеспечивает рендеринг поверхности и трехмерное (3D) позиционирование. Внутренние скрипты могут быть использованы для сортировки агрегатов по фенотипу(например,объему) и расчета распределения биомассы по размеру. Доступны дополнительные ресурсы для сегментирования отдельных ячеек в рамках агрегатов(например,для поддержки использования транскрипционных репортеров14). В совокупности эти инструменты анализа обеспечивают широкую оценку совокупных фенотипов с гибкостью для модификации анализа для новых интересов по мере генерации данных.
После первоначальной 18-ч визуализации агрегаты обрабатывали PI, методом, часто называемым живым / мертвым окрашиванием. PI входит в клетки с пористой (скомпрометированной) мембраной, что позволяет визуализировать мертвые или сильно напряженные клетки в отличие от живых клеток, экспрессирующих GFP. Пространственная организация бактериальных сообществ в легких муковисцидоза в виде агрегатов может предоставить информацию о поведении бактериального сообщества. Идентификация жизнеспособных и нежизненных клеток, которые изолированы внутри совокупности, облегчает идентификацию распределения клеток в сообществе, которые могут быть более чувствительными к лечению антибиотиками. Количественная оценка физических изменений, которые агрегаты претерпевают в ответ на антибиотики, а также выявление генотипических особенностей антибиотикоустойчивых агрегатов могут помочь в будущих методах лечения па.
Использование ПРЭ также имеет последующие применения в подходе FACS к рабочему процессу, хотя следует отметить, что это не всегда необходимо, поскольку жизнеспособные клетки в этом эксперименте могут быть дифференцированы экспрессией GFP. Тем не менее, окрашивание PI позволяет получать пространственную информацию из агрегатов в конце каждого анализа. Подчеркивая использование СУИМ для сортировки агрегатов, этот документ демонстрирует 1) что SCFM2 может использоваться в машине FACS, не вызывая повреждений или засоров, несмотря на его вязкость, 2) FACS может использоваться для отделения отдельных клеток от агрегата и группировки их в отдельные популяции (фенотипы), и 3) окрашивание PI имеет полезность для отделения мертвых клеток от популяции с FACS, особенно, если другие клетки, представляющие интерес, не экспрессируют флуоресцентный маркер. Использование методов окрашивания живых клеток подчеркивает применение этого протокола для использования клинических изолятов, в которых генетические манипуляции часто затруднены. Хотя оптимизация, вероятно, требуется от штамма к штамму, совокупные фенотипы могут быть идентифицированы с тем же разрешением с использованием многих коммерчески доступных флуорофоров.
Совместимость SCFM2 с FACS является огромным преимуществом и теперь позволяет исследователям изолировать конкретные одиночные клетки из совокупности в отдельные популяции. Это само по себе имеет много применений для будущих исследований, содержащих смешанные популяции клеток. Например, изучение агрегации с другими видами или гетерогенности в пределах одного вида объединяет6. Этот захватывающий процесс сортировки с высоким разрешением широко доступен во многих учреждениях и имеет множество последующих применений. Жизнеспособные клетки из агрегатов в этом исследовании были отсортированы для будущих экспериментов с РНК-seq. Другие области применения могут включать протеомику; ресамплинг агрегатов для эволюционных исследований, таких как оценка последствий повторного воздействия антибиотиков; совместное культивирование с другими видами; или совместное культивирование с иммунными клетками человека(рисунок 5). Объединение этих методов с экспериментами по визуализации CLSM позволяет соотнести наблюдаемые бактериальные признаки и поведение с количественными данными, с потенциалом для выявления механизмов бактериальных сообществ, внутривидовых отношений или устойчивости к противомикробным препаратам.
Наряду со многими преимуществами этих методологий существуют некоторые подводные камни, которые следует устранить. Это исследование использует PI в качестве маркера конечной точки жизнеспособности клеток; в идеале в будущем это будет заменено моделями клеточной активности для дифференцировки клеток в течение нескольких временных точек. Однако эти данные устанавливают использование SCFM2 для культивирования агрегатов, которые могут быть отсортированы несколькими способами, кроме живых/мертвых. Основным преимуществом является то, что агрегаты могут быть перенесены непосредственно в машину FACS без стирки, и потенциальное нарушение любой пространственной структуры, разработанной в ходе эксперимента. В целом, это захватывающая платформа, которая может быть использована многими лабораториями для содействия совместным проектам с теми, кто интересуется Па,муковисцидозом и микробным поведением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
S.E.D поддерживается стартовыми фондами, предоставляемыми Департаментом молекулярной медицины Университета Южной Флориды, а также исследовательским грантом CFF (DARCH19G0) N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, Chen)) и Институтом микробиомов USF. Мы благодарим лабораторию Уайтли за постоянное сотрудничество с наборами данных, связанных с этой рукописью. Мы благодарим д-ра Чарльза Секереса за содействие в сортировке FACS. Рисунки были созданы A.D.G и S.E.D с использованием Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino acids | |||
| Alanine | Acros Organics | 56-41-7 | |
| Arginine HCl | MP | 1119-34-2 | |
| Asparagine | Acros Organics | 56-84-8 | Prepared in 0.5 M NaOH |
| Cystine HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
| Glutamic acid HCl | Acros Organics | 138-15-8 | |
| Glycine | Acros Organics | 56-40-6 | |
| Histidine HCl H2O | Alfa Aesar | A17627 | |
| Isoleucine | Acros Organics | 73-32-5 | |
| Leucine | Alfa Aesar | A12311 | |
| Lysine HCl | Alfa Aesar | J62099 | |
| Methionine | Acros Organics | 63-68-3 | |
| Ornithine HCl | Alfa Aesar | A12111 | |
| Phenylalanine | Acros Organics | 63-91-2 | |
| Proline | Alfa Aesar | A10199 | |
| Serine | Alfa Aesar | A11179 | |
| Threonine | Acros Organics | 72-19-5 | |
| Tryptophan | Acros Organics | 73-22-3 | Prepared in 0.2 M NaOH |
| Tyrosine | Alfa Aesar | A11141 | Prepared in 1.0 M NaOH |
| Valine | Acros Organics | 72-18-4 | |
| Antibiotic | |||
| Carbenicillin | Alfa Aesar | J6194903 | |
| Day-of Stocks | |||
| CaCl2 * 2H2O | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Chemical | 50-99-7 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Fisher (Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform |
| FeSO4 * 7H2O | Acros Organics | 7782-63-0 | this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh |
| L-lactic acid | Alfa Aesar | L13242 | pH stock to 7 with NaOH |
| MgCl2 * 6H2O | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| N-acetylglucosamine | TCI | A0092 | |
| Prepared solids | |||
| Porcine mucin | Sigma | M1778-100G | UV-sterilize |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
| Stain | |||
| Propidium iodide | Alfa Aesar | J66764MC | |
| Salts | |||
| K2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
| KCl | Alfa Aesar | J64189 | add solid directly to buffered base |
| KNO3 | Acros Organics | 7757-79-1 | |
| MOPS | Alfa Aesar | A12914 | add solid directly to buffered base |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | add solid directly to buffered base |
| Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
| NH4Cl | Acros Organics | 12125-02-9 | add solid directly to buffered base |
| Consumables | |||
| Conical tubes (15 mL) | Olympus plastics | 28-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Olympus plastics | 28-106 | |
| Culture tubes w/air flow cap | Olympus plastics | 21-129 | |
| 35 mm four chamber glass-bottom dish | CellVis | NC0600518 | |
| Luria Bertani (LB) broth | Genessee Scientific | 11-118 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Bioreagents | BP2944100 | |
| Pipet tips (p200) | Olympus plastics | 23-150RL | |
| Pipet tips (p1000) | Olympus plastics | 23-165RL | |
| Serological pipets (5 mL) | Olympus plastics | 12-102 | |
| Serological pipets (25 mL) | Olympus plastics | 12-106 | |
| Serological pipets (50 mL) | Olympus plastics | 12-107 | |
| Ultrapure water (RNase/DNase free); nanopure water | Genessee Scientific | 18-194 | Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1 |
| Syringes (10 mL) | BD | 794412 | |
| Syringes (50 mL) | BD | 309653 | |
| 0.22 mm PES syringe filter | Olympus plastics | 25-244 | |
| PS cuvette semi-mico | Olympus plastics | 91-408 | |
| Software | |||
| Biorender | To prepare the figures | ||
| FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| Imaris | Bitplane | version 9.6 | |
| Zen Black | |||
| Equipment | |||
| FacsAriallu | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| LSM 880 confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
- Ramsay, K. A., et al. The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).
- Bessonova, L., et al. Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor. Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).
- Breuer, O., et al. Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).
- O'Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections. Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).
- Bjarnsholt, T., et al.
- Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).
- Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
- Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).
- Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. MBio. 8 (2), 00240 (2017).
- Jorth, P., et al. Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs. Cell Host & Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
- Hartmann, R., et al. Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ. Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).
- Stacy, A., et al. Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).
