Summary
El medio de esputo sintético para fibrosis quística (SCFM2) se puede utilizar en combinación con microscopía de barrido láser confocal y clasificación celular activada por fluorescencia para observar agregados bacterianos a alta resolución. Este documento detalla los métodos para evaluar las poblaciones agregadas durante el tratamiento antimicrobiano como plataforma para futuros estudios.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (Pa) es uno de los patógenos oportunistas más comunes asociados con la fibrosis quística (FQ). Una vez que se establece la colonización por Pa, una gran proporción de las bacterias infectantes forman biopelículas dentro del esputo de las vías respiratorias. Se ha demostrado que las biopelículas de Pa aisladas del esputo de FQ crecen en agregados pequeños y densos de ~ 10-1,000 células que están organizadas espacialmente y exhiben fenotipos clínicamente relevantes, como la tolerancia a los antimicrobianos. Uno de los mayores desafíos para estudiar cómo los agregados de Pa responden al entorno cambiante del esputo es la falta de sistemas nutricionalmente relevantes y robustos que promuevan la formación de agregados. Utilizando un medio sintético de esputo CF (SCFM2), se puede observar la historia de vida de los agregados de Pa utilizando microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) y análisis de imágenes a la resolución de una sola célula. Este sistema in vitro permite la observación de miles de agregados de tamaño variable en tiempo real, tres dimensiones y a escala de micras. A nivel individual y poblacional, tener la capacidad de agrupar agregados por fenotipo y posición facilita la observación de agregados en diferentes etapas de desarrollo y su respuesta a cambios en el microambiente, como el tratamiento antibiótico, para diferenciarlos con precisión.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa (Pa) es un patógeno oportunista que establece infecciones crónicas en individuos inmunocomprometidos. Para aquellos con la enfermedad genética fibrosis quística (FQ), estas infecciones pueden abarcar el curso de toda la vida. La FQ causa la acumulación de un esputo viscoso y rico en nutrientes en las vías respiratorias, que se coloniza por una variedad de patógenos microbianos con el tiempo. Pa es uno de los patógenos de la FQ más prevalentes, colonizando las vías respiratorias en la primera infancia y estableciendo infecciones difíciles de tratar1. La PA sigue siendo un problema clínico significativo y se considera una de las principales causas de mortalidad en las personas con FQ, a pesar de la mejora de los regímenes terapéuticos en los últimos años2,3. Este fenotipo de persistencia y el aumento de la tolerancia a los antibióticos le han valido a Pa un lugar en un grupo de patógenos identificados tanto por los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) como por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como prioridades de investigación para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas: los patógenos ESKAPE4.
Al igual que otros patógenos ESKAPE, la resistencia a los antibióticos adquirida es común en Pa,pero también hay muchas propiedades intrínsecas que contribuyen a la tolerancia antimicrobiana de Pa. Entre estos se encuentra la capacidad de Pa para formar agregados, grupos altamente densos de ~ 10-1,000 células, que se pueden observar en múltiples infecciones, incluido el esputo del paciente con FQ5,6. Al igual que el Pa estudiado en otros sistemas de biopelículas, los agregados de Pa muestran fenotipos clínicamente relevantes, como el aumento de la resistencia a los antibióticos y la activación de la comunicación célula-célula (detección de quórum (QS)). Por ejemplo, se ha demostrado que los agregados de Pa utilizan comportamientos regulados por QS para combatir otros microbios, así como tolerar tratamientos antimicrobianos como la producción de piocianina7. La capacidad de estudiar tales comportamientos ofrece una visión emocionante de los ecosistemas bacterianos en un entorno similar a aquel en el que existen en el cuerpo humano.
Uno de los mayores desafíos para estudiar cómo los agregados de Pa responden al entorno cambiante del esputo es la falta de sistemas nutricionalmente relevantes y robustos que promuevan la formación de agregados. Gran parte de lo que se sabe sobre Pa se ha descubierto utilizando sistemas in vitro en los que las células crecen planctonicamente o en una arquitectura característica de "hongo" unida a la superficie que no se ha observado in vivo8. Si bien los modelos clásicos de crecimiento de biopelículas, como las células de flujo o el agar sólido, han producido un conocimiento extenso y valioso sobre los comportamientos bacterianos y los mecanismos de tolerancia a los antibióticos, estos hallazgos no siempre se traducen in vivo. Muchos modelos in vitro tienen una capacidad limitada para imitar el entorno de crecimiento del sitio de infección humana, lo que requiere costosos estudios in vivo. A su vez, muchos modelos in vivo carecen de la flexibilidad y resolución que ofrecen las técnicas in vitro.
El esputo sintético de fibrosis quística (SCFM2) está diseñado para proporcionar un entorno para el crecimiento de Pa similar al experimentado durante la infección crónica en el pulmón de la FQ. SCFM2 incluye fuentes nutricionales identificadas en la sputa de FQ expectorada, además de mucina, lípidos y ADN. El crecimiento de Pa en SCFM2 requiere un conjunto de genes casi idéntico al requerido para el crecimiento en esputo real y apoya la formación natural de agregados de Pa 9,10. Después de la inoculación, las células planctónicas forman agregados que aumentan de tamaño a través de la expansión. Las células individuales (denominadas migrantes) se liberan de los agregados, migran a áreas no coloreadas y forman nuevos agregados10. Esta historia de vida se puede observar utilizando CLSM y análisis de imágenes a la resolución de una sola célula. Los agregados de Pa formados en SCFM2 son de tamaños similares a los observados en la FQ pulmonar10. Este modelo permite la observación de múltiples agregados de tamaño variable en tiempo real y en tres dimensiones a escala de micras. La microscopía de lapso de tiempo permite el seguimiento de miles (~ 50,000) de agregados en un experimento. El uso de software de análisis de imágenes permite la cuantificación de fenotipos agregados a partir de micrografías, incluido el volumen agregado, el área de superficie y la posición en tres dimensiones hasta los 0,1 μm más cercanos, tanto a nivel de agregado individual como de población. Tener la capacidad de agrupar agregados por fenotipo y posición permite la diferenciación de agregados en diferentes etapas de desarrollo con precisión, así como su respuesta a un microambiente cambiante6,11.
La aplicación de SCFM2 para estudiar agregados de Pa en ensayos de bajo volumen y alto rendimiento lo convierten en un modelo flexible y rentable. Como medio definido, SCFM2 ofrece uniformidad y reproducibilidad a través de múltiples plataformas, proporcionando un método nutricional y físicamente relevante para estudiar agregados de Pa in vitro9. Las aplicaciones incluyen su uso en combinación con CLSM para observar la organización espacial y la tolerancia a los antibióticos a alta resolución (como se describe en este documento de métodos). La capacidad de realizar experimentos que proporcionan datos en tiempo real a escala de micras permite el estudio de las interacciones intra-especie e inter-especie a medida que pueden ocurrir in vivo. Por ejemplo, SCFM2 se ha utilizado previamente para estudiar la dinámica espacial de la comunicación célula-célula en poblaciones agregadas a través de una red de sistemas utilizados por Pa para regular múltiples genes que contribuyen a la virulencia y patogénesis6.
Figura 1: Representación gráfica de los principales pasos experimentales. (A) SCFM2 se inocula con células Pa y se le permite formar agregados en un plato de cultivo con fondo de vidrio. (B) Los agregados se transfieren al microscopio confocal y se agrega antibiótico. Se representan tres réplicas técnicas (cámaras 1-3) y un pozo de control (4) de SCFM2 inoculado sin tratamiento antibiótico. Los agregados se visualizan utilizando CLSM en el transcurso de 18 h. (C) Después de la imagen inicial de 18 h, los agregados se tratan con yoduro de propidio para visualizar las células muertas y se visualizan utilizando CLSM (D) Los agregados con el fenotipo deseado se separan de SCFM2 utilizando FACS. Abreviaturas: SCFM2 = medio de esputo sintético de fibrosis quística; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = microscopía de barrido láser confocal; FACS = clasificación celular activada por fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Aquí, se demuestra la utilidad de SCFM2 para estudiar el impacto del tratamiento antibiótico en los agregados de Pa en tiempo real, seguido por el uso de un enfoque de clasificación celular para aislar poblaciones de agregados con fenotipos distintos para el análisis posterior(Figura 1).
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Protocol
1. Preparar un medio sintético de fibrosis quística (SCFM2)
NOTA: La preparación de SCFM2 comprende tres etapas principales que se describen a continuación(Figura 2). Para más detalles y referencias, véase9,10,12.
Figura 2: Preparación e inoculación del medio SCFM2. (A) La base tamponada se prepara utilizando sales y aminoácidos enumerados en los cuadros 1 y 2. La base tamponada se puede almacenar a 4 °C durante un tiempo de hasta 30 días, pero debe protegerse de la exposición a la luz. (B) La mucina y el ADN se añaden a una alícuota de base tamponada y se disuelven en solución durante la noche a 4 °C. (C) Los lípidos y las existencias adicionales se agregan a la solución durante la noche y se incuban a 37 °C con agitación a 250 rpm durante 20 min. SFCM2 se inocula con células lavadas en fase logarítuga a un OD600 = 0,05. Abreviaturas: SCFM2 = medio sintético de esputo de fibrosis quística. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Esterilización de mucina porcina
- Preparar mucina estéril a una concentración final de 5 mg/ml en SCFM2. Por ejemplo, para un volumen de 5 ml de SCFM2, pese 25 mg de mucina tipo II en una placa de Petri estéril y colóquela en un esterilizador ultravioleta (UV) durante 4 h, agitando suavemente cada hora.
- Después de 4 h, transfiera la mucina tratada con UV a tubos de 1,7 ml en autoclave en condiciones estériles y guárdelo a -20 °C.
- Para confirmar la esterilización completa, disuelva una muestra de mucina en un líquido estéril, como agua o caldo Luria Bertani (LB), y observe bajo un microscopio.
NOTA: La mucina esterilizada se puede almacenar a -20 °C durante un plazo de hasta 6 meses.
- Preparación de la base tamponada
- Preparar soluciones de caldo de sal y aminoácidos añadiendo las cantidades apropiadas en peso al agua desionizada como se indica en la Tabla 1. Esterilizar con filtro todas las soluciones de stock con un filtro de 0,22 μm, envolver en papel de aluminio para proteger de la degradación de la luz y almacenar a 4 °C durante un mes.
- Preparar la base tamponada combinando 190 ml de agua desionizada con soluciones de almacenamiento de aminoácidos y sal por volúmenes enumerados en la Tabla 1. Ajuste la solución a pH 6.8 y aumente a un volumen final de 250 ml. Esterilizar con filtro con un filtro de 0,22 μm y conservar a 4 °C durante un plazo de hasta 30 días.
- En la noche anterior al experimento, alícute la cantidad deseada de base tamponada en un matraz de cultivo de vidrio y agregue mucina (5 mg / ml como se describe en el paso 1.1.1) y ADN purificado de esperma de salmón (0.6 mg / ml). Agitar suavemente, envolver en papel de aluminio y dejar a 4 °C durante la noche para permitir que la mucina y el ADN se disuelvan en solución.
NOTA: Las alícuotas de ADN de los espermatozoides de salmón deben descongelarse en hielo, vórtice y agregarse a la base tamponada y la mucina. Las soluciones de stock de triptófano, asparagina y tirosina deben prepararse en soluciones de NaOH (ver Tabla 1 para concentraciones) en lugar de agua desionizada. Mantenga la base amortiguada y todas las soluciones de stock envueltas en papel de aluminio para proteger de la exposición a la luz. La mayoría de las acciones serán estables hasta por un mes. Las existencias que se decoloran no deben usarse y deben reemplazarse antes de su uso.
- Adición de existencias suplementarias
- El día del experimento, agregue las acciones enumeradas en la Tabla 2 a la base amortiguada que contiene mucina y ADN.
NOTA: Prepare una solución fresca de FeSO4 el día del experimento, pero todas las demás existencias se pueden hacer con anticipación y almacenarse durante 30 días a 4 ° C. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) contiene cloroformo. Manipule con precaución y no lo use cerca de llamas abiertas. Después de la adición de DOPC, incubar SCFM2 a 37 °C con agitación (250 rpm) durante al menos 20 min (para cultivo de 5 ml). Este período de incubación permite que el cloroformo en el DOPC se evapore. El matraz no debe ser hermético; en su lugar, cubra la abertura del matraz libremente con papel de aluminio.
- El día del experimento, agregue las acciones enumeradas en la Tabla 2 a la base amortiguada que contiene mucina y ADN.
2. Evaluación en tiempo real de la tolerancia a los antimicrobianos en agregados bacterianos
- Preparar cultivos nocturnos
- La noche anterior al experimento, inocular 5 ml de caldo LB con varias colonias de Pa PAO1-pMRP9-113 de una placa de agar LB que contiene antibiótico (carbenicilina 300 μg/mL). Cultivar durante la noche a 37 °C con agitación a 250 rpm.
NOTA: Cultive cultivos durante la noche con la adición de antibióticos necesarios para la selección de plásmidos requeridos (aquí, el plásmido de expresión de proteína fluorescente verde (GFP), pMRP9-1). Tenga en cuenta que las células Pa deben lavarse antes de que se inocule SCFM2. LB puede ser sustituido por otros medios de laboratorio ricos para cultivos nocturnos. Todos los aislamientos bacterianos deben manipularse utilizando las pautas apropiadas de BSL-2 a lo largo de este protocolo.
- La noche anterior al experimento, inocular 5 ml de caldo LB con varias colonias de Pa PAO1-pMRP9-113 de una placa de agar LB que contiene antibiótico (carbenicilina 300 μg/mL). Cultivar durante la noche a 37 °C con agitación a 250 rpm.
- Inocular SCFM2
- El día del experimento, vuelva a diluir los cultivos nocturnos de Pa 1:10 (cultivo: medios líquidos) inoculando 500 μL en 5 ml de caldo LB fresco. Cultivar células hasta la fase logaríts (60-90 min) a 37 °C con agitación a 250 rpm.
- Cultivos en fase logarítuga centrífuga a 10.000 × g durante 5 min. Lave las células retirando el sobrenadante y resuspiéndolo en 3 ml de solución salina tamponada con fosfato esterilizada por filtro (PBS, pH 7.0). Repita dos veces y vuelva a gastar el pellet en un volumen final de 1 ml de PBS.
- Mida la absorbancia de las células lavadas utilizando un espectrofotómetro a 600 nm (OD600), y calcule el volumen de cultivo requerido para un OD600 inicial de 0.05 en 5 mL de SCFM2. Inocular Pa en el SCFM2, y vórtice suavemente para distribuir las células por todas partes. Pipetee 1 ml del SCFM2 inoculado en cada cámara de un plato óptico de 4 pozos, fondo de vidrio, e incube durante 4 h estáticamente a 37 °C.
NOTA: El tiempo de duplicación de los cultivos de Pa depende de la tensión y la disponibilidad de oxígeno. En SCFM2, en las condiciones descritas aquí, el tiempo de duplicación de Pa es de ~1.4 h10.
3. Visualización de agregados durante el tratamiento antibiótico con microscopía de barrido láser confocal (CLSM)
NOTA: Esta sección describe el uso del microscopio de barrido láser confocal y el software de captura de imágenes para la obtención de imágenes de agregados pa en SCFM2. El objetivo es observar y caracterizar la biomasa bacteriana restante (tolerante) después del tratamiento con antibióticos. Los pasos descritos se pueden realizar con éxito en otros microscopios confocales, aunque se debe hacer referencia al manual de operación del instrumento para obtener una orientación específica.
- Cultivos de Pa de imagen utilizando una cámara calentada o una microplaca calentada instalada en el escenario del microscopio para mantener una temperatura ambiente de 37 °C. Inicie el módulo de incubación al menos 2 h antes del comienzo del experimento para permitir que todos los aparatos alcancen la temperatura deseada y reduzcan la expansión y el movimiento adicionales durante la recopilación de datos.
- Después de 4 h, transfiera los cultivos SCFM2 que contienen células Pa a la etapa de microscopio calentado. Designar 3 de cada 4 pozos como réplicas técnicas para el tratamiento con antibióticos, y considerar el4º pozo como un control sin tratamiento, que contiene solo células Pa en SCFM2, sin antibiótico. Identifique los agregados mediante microscopía de campo brillante dentro de la pestaña Localizar antes de cualquier excitación de los reporteros fluorescentes. Defina un área para obtener imágenes dentro de cada pozo y almacene su posición (coordenadas x-y-z) utilizando el módulo Posiciones en el software de imágenes.
- Utilice un objetivo de inmersión en aceite 63x para visualizar cultivos pa que contienen el plásmido de expresión GFP pMRP9-1 en SCFM2 con una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 509 nm. Tome imágenes utilizando la opción z-stack dentro del módulo Adquisición a intervalos de 1 μm (total de 60 cortes). Utilice el módulo de promediado de línea para reducir la fluorescencia de fondo en el canal GFP dentro del volumen total de las imágenes z-stack de 60 μm (1.093,5 mm3). Tome imágenes de control de SCFM2 no ininoculado utilizando configuraciones idénticas para determinar la fluorescencia de fondo para el análisis de imágenes.
NOTA: Las imágenes se adquieren produciendo imágenes de pila z de 8 bits de 512 píxeles x 512 píxeles (0,26 μm x 0,26 píxeles de μm) que están a 60 μm de la base de la cubierta. - Utilice la opción de series temporales dentro del software de imágenes para capturar 60 cortes en cada posición (pozo) a intervalos de 15 minutos durante un período de 18 h. Utilice la estrategia de enfoque definido dentro del software para almacenar un plano focal para cada posición, que se devuelve en cada punto de tiempo a lo largo del experimento.
- Después de un total de 4,5 h de incubación, imagine cada posición utilizando los ajustes anteriores para determinar la biomasa agregada dentro de cada uno de los cuatro pozos antes de la adición de antibiótico.
- Después de 6 h de incubación total, agregue antibiótico a una concentración inhibitoria (CMI) 2 veces inferior a la mínima a cada réplica. Pipete directa y suavemente en el centro del pozo, justo debajo de la interfase aire-líquido. Mantenga todos los cultivos en la cámara confocal calentada.
NOTA: Aquí, se utilizó sulfato de colistina a una concentración de 140 μg/ml. - Comience el tratamiento con imágenes después de los antibióticos haciendo clic en la opción Iniciar experimento dentro del programa de imágenes.
NOTA: La concentración de antibióticos utilizada depende del antibiótico, el aislado de Pa y si el usuario desea examinar los efectos de matanza o tolerancia. Este experimento utiliza una sola dosis. Se pueden agregar dosis adicionales sin interrumpir los cultivos si es necesario.
4. Tinción de yoduro de propidio de agregados de Pa
NOTA: El yoduro de propidio (PI) se utiliza comúnmente como reactivo de tinción para identificar células bacterianas no viables (muertas) en cultivo. Aquí, se utiliza para identificar agregados sensibles al tratamiento antibiótico aplicado en la sección 3. A lo largo de este protocolo, la expresión y detección de GFP en células Pa se utiliza como el principal proxy para la viabilidad celular. Este paso final permite que las imágenes confocales se utilicen una vez más para identificar el posicionamiento espacial de los agregados vivos / muertos en relación entre sí. Además, los agregados se identifican como vivos/muertos para una mayor clasificación de células aguas abajo en la sección 5.
- Después de 18 h, agregue PI a cada pozo del plato inferior óptico de cuatro cámaras que contiene cultivos SCFM2. Siga las instrucciones del fabricante para el volumen de PI y el tiempo de incubación(por ejemplo,~ 2 μL por ml de cultivo, ~ 20-30 min).
5. Aislar células vivas de agregados utilizando un enfoque FACS
NOTA: FACS presenta una poderosa plataforma para clasificar y aislar grupos de células de acuerdo con un fenotipo marcado fluorescentemente. Aquí, FACS se utiliza para aislar agregados vivos (tolerantes a antibióticos) de agregados no viables.
- Después de la tinción con yoduro de propidio, retire los cultivos de la incubación y transfiéralos a un instrumento FACS en un recipiente aislado para mantener 37 ° C.
- Ejecute alícuotas de 1 ml de SCFM2 que contenga agregados de Pa al caudal más bajo.
NOTA: Cada alícuota contendrá ~15,000 agregados. - Para detectar GFP, ilumine las células con un láser de 488 nm y registre la altura de la señal fluorescente a 530/30 nm. Visualice la tinción PI por excitación con un láser de 561 nm y registre la altura de la señal fluorescente a 610/20 nm. Realice la clasificación utilizando una boquilla de 70 u.
NOTA: Los agregados ordenados se pueden agrupar de varias maneras dependiendo de la aplicación del usuario. En este caso, se utilizó FACS para clasificar agregados de Pa viables para la secuenciación de ARN aguas abajo. Las aplicaciones alternativas se discuten a continuación.
6. Análisis de imágenes
NOTA: La microscopía de lapso de tiempo genera grandes cantidades de datos. Un experimento de 18 horas para la observación de agregados de Pa en SCFM2 identifica ~ 50,000 agregados a lo largo del tiempo, que tienen el potencial de caracterizarse para el volumen y el posicionamiento espacial. Utilice un software de análisis de imágenes para cuantificar la dinámica agregada en SCFM2:
- Para estudios agregados en SCFM2, cuantificar la fluorescencia GFP de fondo mediante la creación de un histograma de recuentos en el canal GFP que se produce para SCFM2 no inoculados y SCFM2 inoculados con la cepa PaO1 portadora de pMRP9-1. Para garantizar que los vóxeles GFP detectados se correlacionen con la biomasa de Pa, defina un vóxel GFP+ como ≥1,5 veces el valor del recuento de fondo de GFP.
NOTA: La fluorescencia de fondo se define como el valor de vóxel más alto de tres posiciones elegidas al azar, promediadas. Los recuentos de fondo son, como medida estándar, restados de todos los píxeles en imágenes experimentales por el software de análisis de imágenes. - Después de la resta de fondo en el módulo Surpass, produzca isosuperficies para todos los vóxeles restantes.
- Para detectar agregados individuales, habilite la opción Dividir objetos y defina los agregados como objetos con volúmenes de ≥5 μm3. Utilice el módulo Vantage en el software de análisis de imágenes para calcular el volumen, x-y-z y la suma de vóxeles GFP para cada objeto individual. Exporte estos datos a una plataforma estadística externa.
NOTA: Algunos software de análisis de imágenes permiten la exportación de múltiples phentoypes cuantitativos a la vez, lo que permite calcular las correlaciones. - Filtre los datos exportados desde el módulo Vantage por tamaño para garantizar que no queden objetos de <0,5μm 3 (biomasa dispersa). Para cada objeto individual dentro de la imagen, calcule la distancia desde sí mismo en relación con otros objetos (agregados) utilizando el módulo Vantage del software de análisis de imágenes o manualmente con la siguiente ecuación.
d = sqrt((x2− x1)2 + (y2− y1)2 + (z2− z1)2) (1) - Utilice los cálculos SUM y AVERAGE para encontrar la biomasa total y el volumen agregado promedio. Alternativamente, exporte datos a otras plataformas estadísticas o scripts, por ejemplo,la distribución de agregados a través de la biomasa como se discute en los resultados representativos (script no publicado en colaboración con el laboratorio Whiteley, Instituto de Tecnología de Georgia).
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Representative Results
Este trabajo detalla métodos para observar agregados de Pa a alta resolución y en un ambiente similar al de la infección crónica de la FQ pulmonar9,10,12. SCFM2 proporciona un sistema in vitro que promueve la agregación natural de células Pa en tamaños similares a los observados durante la infección real10. La adaptabilidad de SCFM2 como medio definido se puede aprovechar para abordar muchas vías de investigación. El objetivo de este trabajo es destacar un flujo de trabajo que implica una combinación de microscopía y FACS, con la intención de fomentar su uso para futuras investigaciones, colaboraciones y aplicaciones.
El uso de CLSM permite imágenes temporales de alta resolución que se pueden utilizar para estudiar la dinámica de las poblaciones bacterianas en desarrollo. Este trabajo demuestra varias formas potenciales por las cuales los agregados de Pa se pueden caracterizar después del tratamiento con antibióticos. La Figura 3A proporciona una visión amplia de los agregados viables de Pa después del tratamiento con antibióticos. Cuatro horas después de la aplicación del antibiótico, quedan múltiples agregados; se pueden aplicar rangos de color para representar diferentes características de cada agregado individual. Ejemplos de características cuantificables incluyen volumen, área, intensidad del vóxel (para el uso de reporteros fluorescentes) y posición en cualquiera de los ejes x-y-z.
El análisis de imágenes utilizando un software dedicado permite la observación totalmente personalizable de los datos, identificando cada agregado como un objeto individual, en el que los datos cuantitativos se pueden exportar para su posterior análisis. La figura 3B proporciona un ejemplo de cómo se pueden utilizar los datos exportados. Aquí, la biomasa total de las poblaciones agregadas se puede calcular a lo largo del tiempo. En estos datos representativos, el tratamiento con antibiótico reduce significativamente la biomasa en comparación con los agregados no tratados. El video suplementario S1 es una poderosa representación de cómo se puede usar la microscopía de series temporales para observar físicamente los agregados dentro de estos datos de biomasa después del tratamiento con antibióticos. Cada agregado ha sido codificado por colores para representar el volumen calculado (μm3),lo que permite un registro visual de las poblaciones agregadas, que también se puede utilizar para un análisis espacial posterior utilizando aplicaciones, tanto dentro del software de análisis de imágenes como de otros recursos (no discutido aquí10,15).
Los experimentos desarrollados para identificar mecanismos de tolerancia a los antibióticos en agregados de Pa producen grandes cantidades de datos. Cada réplica produce datos físicos de ~15,000 agregados (~60,000 agregados en total). Un nuevo enfoque para el manejo de estos datos ha implicado la producción de mapas de calor agregados(Figura 3C). Al calcular cómo los agregados de diferentes tamaños contribuyen a la población general, se pueden identificar patrones de cómo los agregados responden al tratamiento con antibióticos en relación con su tamaño, forma y posición entre sí.
Figura 3: Ejemplos de análisis de datos agregados. (A) Visión general de la biomasa agregada restante después del tratamiento con antibióticos. Las isosuperficies de los vóxeles GFP correspondientes se han renderizado y codificado por colores de acuerdo con el volumen (μm3). Barra de escala = 30 μm. (B) Biomasa total (μm3) de poblaciones agregadas de Pa a lo largo del tiempo en SCFM2. La línea azul representa los agregados no tratados, la línea roja representa los agregados tratados con el antibiótico, colistina (140 μg/mL). Los datos presentados incluyen 3 réplicas biológicas (± SEM). (C) Mapas de calor de volumen agregado que representan la contribución de agregados individuales por volumen (μm3, eje x) a la biomasa total (μm3, segundo eje y) a lo largo del tiempo (eje h, y). Los datos representativos incluyen agregados de Pa en presencia y ausencia de antibiótico (como en la Figura 3B),donde 0 h representa el tiempo de adición de antibióticos después de 6 h de crecimiento agregado. Los datos incluyen tres réplicas biológicas (~ 50,000 agregados totales). Abreviaturas: GFP = proteína verde fluorescente; SCFM2 = medio de esputo sintético de fibrosis quística; SEM = error estándar de la media; Pa = Pseudomonas aeruginosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El análisis espacial en esta etapa implica el uso de la expresión de GFP por Pa como un indicador de viabilidad en presencia de antibiótico. La adición de PI después de 18 h permite la identificación de la posición de agregados no viables en relación con agregados viables (Figura suplementaria S1). El objetivo general de este método es identificar patrones espaciales entre agregados sensibles y tolerantes después del tratamiento con antibióticos. Los estudios futuros incluirán múltiples puntos de tiempo además del ensayo de punto final descrito anteriormente.
La etapa final del flujo de trabajo utiliza un enfoque basado en FACS para ordenar los agregados en SCFM2. Este trabajo demuestra la capacidad de FACS para separar las células viables de la población restante de agregados (incluidos los no viables). La Figura 4 demuestra el uso de FACS para agrupar agregados viables para experimentos adicionales, como la secuenciación de alto rendimiento, por ejemplo,la secuenciación de ARN (RNA-seq). Después del tratamiento con antibióticos(la Figura 4A representa un punto de tiempo (18 h), las alícuotas de SCFM2 que contienen agregados de Pa se pueden separar con éxito de acuerdo con sus características fluorescentes. Aquí, GFP se ha identificado para agregados tolerantes. La Figura 4B proporciona un ejemplo de uno de estos eventos de clasificación, donde las células que expresan GFP se separan del cultivo restante (agregados tratados con PI). Además, los agregados se pueden identificar claramente a partir de SCFM2, que produce su propio perfil fluorescente. La capacidad de ordenar las células de esta manera tiene muchas aplicaciones (Figura 5).
Figura 4:FACS de agregados de Pa en SCFM2. (A) Diagrama de un instrumento FACS utilizado para separar agregados de Pa viables y no viables de SCFM2. (B) Gráfico representativo de agregados separados en SCFM2 generados por el software FACS. Tres cuadrantes indican agregados vivos (GFP), cultivo restante que contiene células no viables (RFP se utiliza como alternativa a la tinción de yoduro de propidio aquí, ambos excitables por el láser de 488 nm) y control SCFM2. Los datos representan 1 de 3 réplicas biológicas que contienen ~ 15,000 eventos (agregados). Abreviaturas: FACS = clasificación celular activada por fluorescencia; SCFM2 = medio de esputo sintético de fibrosis quística; Pa = Pseudomonas aeruginosa; GFP = proteína fluorescente verde; RFP = proteína fluorescente roja; PE-Texas Red-H = altura máxima para las células teñidas conjugadas de ficoerertina-Texas Red; FITC-H = altura máxima para células teñidas con isotiocianato de fluoresceína.
Figura 5: Aplicaciones experimentales potenciales utilizando SCFM2. (A) Exposición de agregados de Pa a dosis repetidas de antibióticos. (B) Coculto de Agregados de Pa con otras especies bacterianas. (C)La exposición de agregados de Pa a las células inmunes del huésped, por ejemplo,PMN. A, By C se puede combinar con métodos de imágenes CLSM y el enfoque FACS para RNA-seq aguas abajo, proteómica o análisis espacial 3D. Abreviaturas: SCFM2 = medio de esputo sintético de fibrosis quística; Pa = Pseudomonas aeruginosa; PMN = leucocitos polimorfonucleares; CLSM = microscopía de barrido láser confocal; FACS = clasificación celular activada por fluorescencia; ARN-seq = secuenciación de ARN; 3D = tridimensional; LC-MS/MS = cromatografía líquida/espectrometría de masas en tándem. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Químico | Concentración de existencias (M) | Concentración final (mM) | Notas |
| NaH2PO4 | 0.2 | 1.3 | |
| Na2HPO4 | 0.2 | 1.25 | |
| KNO3 | 1 | 0.35 | |
| K2SO4 | 0.25 | 0.27 | |
| NH4Cl | 2.28 | Agregar sólido directamente a la base almacenada en búfer | |
| Kcl | 14.94 | Agregar sólido directamente a la base almacenada en búfer | |
| NaCl | 51.85 | Agregar sólido directamente a la base almacenada en búfer | |
| MOPS | 10 | Agregar sólido directamente a la base almacenada en búfer | |
| Ser | 0.1 | 1.45 | |
| Glu HCl | 0.1 | 1.55 | |
| Pro | 0.1 | 1.66 | |
| Gly | 0.1 | 1.2 | |
| Ala | 0.1 | 1.78 | |
| Val | 0.1 | 1.12 | |
| Conocido | 0.1 | 0.63 | |
| Ile | 0.1 | 1.12 | |
| Leu | 0.1 | 1.61 | |
| Orn HCl | 0.1 | 0.68 | |
| Lys HCl | 0.1 | 2.13 | |
| Arg HCl | 0.1 | 0.31 | |
| Trp | 0.1 | 0.01 | Preparado en 0,2 M NaOH |
| Áspid | 0.1 | 0.83 | Preparado en 0,5 M NaOH |
| Tyr | 0.1 | 0.8 | Preparado en 1.0 M NaOH |
| Thr | 0.1 | 1.07 | |
| Cys HCl | 0.1 | 0.16 | |
| Phe | 0.1 | 0.53 | |
| Su HCl H2O | 0.1 | 0.52 | |
| ADN de esperma de salmón | 0,6 mg/ml | ||
| Mucina porcina | 5 mg/nL |
Tabla 1: Preparación de las existencias de sal, aminoácidos, ADN y mucina necesarias para la base tamponada del medio de esputo sintético para fibrosis quística, SCFM2.
| Químico | Concentración de existencias (M) | Concentración final (mM) | Notas |
| Dextrosa (D-glucosa) | 1 | 3 | |
| Ácido L-láctico | 1 | 9.3 | Ajustar al pH 7.0 con NaOH |
| CaCl2*2H2O | 1 | 1.75 | |
| MgCl2*6H2O | 1 | 0.61 | |
| FeSO4*7H2O | 1 mg/ml | 0.0036 | Hacer fresco diariamente |
| N-acetilglucosamina | 0.25 | 0.3 | |
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) | 25 mg/ml | 100 μg/ml | Incubar durante al menos 20 min a 37 °C después de la adición |
Tabla 2: Preparación de las existencias adicionales necesarias para la base tamponada del medio de esputo sintético para fibrosis quística, SCFM2.
Figura suplementaria S1: Agregados de Pa en SCFM2. Micrografía confocal renderizada de agregados de Pa viables (verdes) y no viables (rojos) formados en SCFM2. Barra de escala = 5 μm. Abreviaturas: SCFM2 = medio de esputo sintético de fibrosis quística; Pa = Pseudomonas aeruginosa. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Video Suplementario S1: Agregados en SCFM2 después del tratamiento con antibiótico. Pa imágenes agregadas capturadas cada 30 min en SCFM2 usando CLSM. Los agregados se etiquetan individualmente por colores que representan el volumen agregado (μm3,escala de color no se muestra como imagen representativa). Barra de escala = 5 μm. Abreviaturas: SCFM2 = medio de esputo sintético de fibrosis quística; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = microscopía de barrido láser confocal. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Este trabajo ha introducido metodologías que se pueden combinar para estudiar poblaciones agregadas bacterianas en presencia y ausencia de tratamiento antibiótico. El CLSM de alta resolución permite la visualización de los cambios en la biomasa agregada y la orientación estructural de los agregados en tiempo real cuando se exponen a antibióticos. Además, se pueden cuantificar las características físicas y estructurales de la biomasa que quedan después del tratamiento con antibióticos, con el objetivo de correlacionar estas observaciones con futuros estudios de expresión génica utilizando ARN-seq. Si bien el uso de células que expresan GFP permite la visualización del comportamiento colectivo e individual de las células tolerantes a los antibióticos, proporciona solo una parte de la imagen general. Se puede aprender mucho del posicionamiento espacial de las células que no sobrevivieron al tratamiento con antibióticos, tanto individualmente como en relación con la biomasa sobreviviente y tolerante.
La microscopía time-lapse genera grandes cantidades de datos. Un experimento de 18 horas para la observación de agregados de Pa en SCFM2 identifica ~ 50,000 agregados a lo largo del tiempo, que tienen el potencial de caracterizarse para el volumen y el posicionamiento espacial. El CLSM utilizado aquí (ver la Tabla de Materiales)captura imágenes de alta resolución de agregados en desarrollo para su análisis. El posicionamiento espacial de un agregado individual (en relación con los agregados circundantes) en tres dimensiones (± 0,1 μm) se puede utilizar para permitir mediciones precisas de la distancia entre agregados. Los fenotipos físicos de los agregados bacterianos se pueden determinar utilizando una combinación de enfoques de análisis. El software de imágenes proporciona renderizado de superficies y posicionamiento tridimensional (3D). Los scripts generados internamente se pueden usar para ordenar los agregados por fenotipo(por ejemplo,volumen) y calcular la distribución de la biomasa encuadernada en tamaño. Se dispone de recursos adicionales para segmentar células individuales dentro de agregados(por ejemplo,para apoyar el uso de reporteros transcripcionales14). Combinadas, estas herramientas de análisis proporcionan una evaluación amplia de los fenotipos agregados, con la flexibilidad de modificar los análisis para los intereses emergentes a medida que se generan datos.
Después de la imagen inicial de 18 horas, los agregados se trataron con PI, una técnica a menudo denominada tinción viva / muerta. PI ingresa a las células con una membrana porosa (comprometida), lo que permite la visualización de células muertas o severamente estresadas en contraste con las células vivas que expresan GFP. La organización espacial de las comunidades bacterianas en el pulmón de la FQ como agregados puede proporcionar información sobre los comportamientos de la comunidad bacteriana. La identificación de células viables y no viables, que están secuestradas dentro de un agregado, facilita la identificación de la distribución de células dentro de la comunidad que pueden ser más sensibles al tratamiento con antibióticos. Cuantificar los cambios físicos que experimentan los agregados en respuesta a los antibióticos, así como identificar las características genotípicas de los agregados tolerantes a los antibióticos, podría informar futuras terapias contra la PA.
El uso de PI también tiene aplicaciones posteriores en el enfoque FACS del flujo de trabajo, aunque debe tenerse en cuenta que no siempre es necesario, ya que las células viables en este experimento se pueden diferenciar por la expresión de GFP. Sin embargo, la tinción de PI permite obtener información espacial de los agregados al final de cada ensayo. Al destacar el uso de FACS para clasificar agregados, este documento de métodos demuestra 1) que SCFM2 se puede usar en una máquina FACS sin causar daños u obstrucciones a pesar de su viscosidad, 2) FACS se puede usar para separar células individuales de un agregado y agruparlas en poblaciones distintas (fenotipos), y 3) la tinción de PI tiene utilidad para separar células muertas de una población con FACS, particularmente si las otras células de interés no expresan un marcador fluorescente. El uso de técnicas de tinción de células vivas destaca la aplicación de este protocolo para el uso de aislados clínicos en los que la manipulación genética es a menudo difícil. Aunque es probable que se requiera optimización de cepa por cepa, los fenotipos agregados se pueden identificar a la misma resolución mediante el uso de muchos fluoróforos disponibles comercialmente.
La compatibilidad de SCFM2 con FACS es una gran ventaja y ahora permite a los investigadores aislar células individuales específicas de un agregado en poblaciones distintas. Esto en sí mismo tiene muchas aplicaciones para futuros estudios que contengan poblaciones mixtas de células. Por ejemplo, estudiar la agregación con otras especies o la heterogeneidad dentro de agregados de una sola especie6. Este emocionante proceso de clasificación de alta resolución está ampliamente disponible en muchas instituciones y tiene muchas aplicaciones posteriores. Las células viables de los agregados en este estudio se clasificaron para futuros experimentos de ARN-seq. Otras aplicaciones podrían incluir la proteómica; remuestreo de agregados para estudios evolutivos, como la evaluación de los efectos de la exposición repetida a antibióticos; co-cultivo con otras especies; o co-cultivo con células inmunes humanas (Figura 5). La combinación de estos métodos con experimentos de imágenes CLSM permite la correlación de rasgos y comportamientos bacterianos observados con datos cuantitativos, con el potencial de identificar mecanismos de comunidades bacterianas, relaciones intraespecie o resistencia a los antimicrobianos.
Junto con las muchas ventajas de estas metodologías, hay algunos escollos que deben abordarse. Este estudio utiliza pi como un marcador de punto final de la viabilidad celular; idealmente en el futuro, esto sería reemplazado por modelos de actividad celular para diferenciar las células en múltiples puntos de tiempo. Sin embargo, estos datos establecen el uso de SCFM2 para cultivar agregados que se pueden ordenar de múltiples maneras que no sean vivos/muertos. La principal ventaja es que los agregados se pueden transferir directamente a la máquina FACS sin lavado, y la posible interrupción de cualquier estructura espacial desarrollada en el transcurso de un experimento. En general, esta es una plataforma emocionante que podría ser utilizada por muchos laboratorios para fomentar proyectos de colaboración con aquellos interesados en Pa,CF y comportamientos microbianos.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
S.E.D cuenta con el apoyo de fondos iniciales proporcionados por el Departamento de Medicina Molecular de la Universidad del Sur de Florida, así como una subvención de investigación CFF (DARCH19G0), el N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, Chen)) y el Instituto de Microbiomas de la USF. Agradecemos al laboratorio de Whiteley por la colaboración continua que involucra conjuntos de datos relacionados con este manuscrito. Agradecemos al Dr. Charles Szekeres por facilitar la clasificación de FACS. Las figuras fueron creadas por A.D.G y S.E.D utilizando Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino acids | |||
| Alanine | Acros Organics | 56-41-7 | |
| Arginine HCl | MP | 1119-34-2 | |
| Asparagine | Acros Organics | 56-84-8 | Prepared in 0.5 M NaOH |
| Cystine HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
| Glutamic acid HCl | Acros Organics | 138-15-8 | |
| Glycine | Acros Organics | 56-40-6 | |
| Histidine HCl H2O | Alfa Aesar | A17627 | |
| Isoleucine | Acros Organics | 73-32-5 | |
| Leucine | Alfa Aesar | A12311 | |
| Lysine HCl | Alfa Aesar | J62099 | |
| Methionine | Acros Organics | 63-68-3 | |
| Ornithine HCl | Alfa Aesar | A12111 | |
| Phenylalanine | Acros Organics | 63-91-2 | |
| Proline | Alfa Aesar | A10199 | |
| Serine | Alfa Aesar | A11179 | |
| Threonine | Acros Organics | 72-19-5 | |
| Tryptophan | Acros Organics | 73-22-3 | Prepared in 0.2 M NaOH |
| Tyrosine | Alfa Aesar | A11141 | Prepared in 1.0 M NaOH |
| Valine | Acros Organics | 72-18-4 | |
| Antibiotic | |||
| Carbenicillin | Alfa Aesar | J6194903 | |
| Day-of Stocks | |||
| CaCl2 * 2H2O | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Chemical | 50-99-7 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Fisher (Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform |
| FeSO4 * 7H2O | Acros Organics | 7782-63-0 | this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh |
| L-lactic acid | Alfa Aesar | L13242 | pH stock to 7 with NaOH |
| MgCl2 * 6H2O | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| N-acetylglucosamine | TCI | A0092 | |
| Prepared solids | |||
| Porcine mucin | Sigma | M1778-100G | UV-sterilize |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
| Stain | |||
| Propidium iodide | Alfa Aesar | J66764MC | |
| Salts | |||
| K2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
| KCl | Alfa Aesar | J64189 | add solid directly to buffered base |
| KNO3 | Acros Organics | 7757-79-1 | |
| MOPS | Alfa Aesar | A12914 | add solid directly to buffered base |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | add solid directly to buffered base |
| Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
| NH4Cl | Acros Organics | 12125-02-9 | add solid directly to buffered base |
| Consumables | |||
| Conical tubes (15 mL) | Olympus plastics | 28-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Olympus plastics | 28-106 | |
| Culture tubes w/air flow cap | Olympus plastics | 21-129 | |
| 35 mm four chamber glass-bottom dish | CellVis | NC0600518 | |
| Luria Bertani (LB) broth | Genessee Scientific | 11-118 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Bioreagents | BP2944100 | |
| Pipet tips (p200) | Olympus plastics | 23-150RL | |
| Pipet tips (p1000) | Olympus plastics | 23-165RL | |
| Serological pipets (5 mL) | Olympus plastics | 12-102 | |
| Serological pipets (25 mL) | Olympus plastics | 12-106 | |
| Serological pipets (50 mL) | Olympus plastics | 12-107 | |
| Ultrapure water (RNase/DNase free); nanopure water | Genessee Scientific | 18-194 | Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1 |
| Syringes (10 mL) | BD | 794412 | |
| Syringes (50 mL) | BD | 309653 | |
| 0.22 mm PES syringe filter | Olympus plastics | 25-244 | |
| PS cuvette semi-mico | Olympus plastics | 91-408 | |
| Software | |||
| Biorender | To prepare the figures | ||
| FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| Imaris | Bitplane | version 9.6 | |
| Zen Black | |||
| Equipment | |||
| FacsAriallu | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| LSM 880 confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
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