Verktyg för realtidsbedömning av en Pseudomonas aeruginosa-infektionsmodell

Summary

Syntetisk cystisk fibros sputum medium (SCFM2) kan användas i kombination med både confocal laser scanning mikroskopi och fluorescensaktiverad cell sortering för att observera bakteriella aggregat med hög upplösning. Detta dokument beskriver metoder för att bedöma aggregerade populationer under antimikrobiell behandling som en plattform för framtida studier.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (Pa) är en av de vanligaste opportunistiska patogenerna i samband med cystisk fibros (CF). När Pa kolonisering är etablerad bildar en stor del av de infekterande bakterierna biofilmer inom luftvägssputum. Pa biofilmer isolerade från CF sputum har visat sig växa i små, täta aggregat på ~ 10-1,000 celler som är rumsligt organiserade och uppvisar kliniskt relevanta fenotyper såsom antimikrobiell tolerans. En av de största utmaningarna med att studera hur Pa-aggregat svarar på den föränderliga sputummiljön är bristen på näringsmässigt relevanta och robusta system som främjar aggregerad bildning. Med hjälp av ett syntetiskt CF sputum medium (SCFM2) kan livshistoriken för Pa-aggregat observeras med hjälp av konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) och bildanalys i upplösningen av en enda cell. Detta in vitro-system gör det möjligt att observera tusentals aggregat av varierande storlek i realtid, tre dimensioner och på mikronskalan. På individ- och befolkningsnivå underlättar förmågan att gruppera aggregat efter fenotyp och position observation av aggregat i olika utvecklingsstadier och deras svar på förändringar i mikromiljön, såsom antibiotikabehandling, som ska differentieras med precision.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa (Pa) är en opportunistisk patogen som etablerar kroniska infektioner hos immunkomprometterade individer. För dem med den genetiska sjukdomen cystisk fibros (CF), kan dessa infektioner sträcka sig över en livstid. CF orsakar uppbyggnaden av en trögflytande, näringsrik sputum i luftvägarna, som koloniseras av en mängd olika mikrobiella patogener över tiden. Pa är en av de vanligaste CF patogenerna, kolonisera luftvägarna i tidig barndom och upprätta svårbehandlade infektioner¹. Pa är fortfarande ett betydande kliniskt problem och anses vara en ledande orsak till dödlighet hos dem med CF, trots förbättrade terapiregimer under de senaste^{åren 2,3}. Denna envishet fenotyp och ökande antibiotikatolerans har tjänat Pa en plats i en grupp patogener som identifierats av både Centers for Disease Control (CDC) och Världshälsoorganisationen (WHO) som forskningsprioriteringar för utveckling av nya terapeutiska strategier - ESKAPE patogener⁴.

Liksom andra ESKAPE patogener, förvärvade antibiotikaresistens är vanligt i Pa, men det finns också många inneboende egenskaper som bidrar till Pa antimikrobiell tolerans. Bland dessa är Pas förmåga att bilda aggregerade mycket täta kluster av ~ 10-1 000 celler, som kan observeras vid flera infektioner, inklusive CF patientens sputum^5,6. I likhet med Pa som studerats i andra biofilmsystem uppvisar Pa-aggregat kliniskt relevanta fenotyper såsom ökad resistens mot antibiotika och aktivering av cellcellskommunikation (kvorumavkänning (QS)). Till exempel har aggregat av Pa visat sig använda QS-reglerade beteenden för att bekämpa andra mikrober samt tolerera antimikrobiella behandlingar som produktion av pyocyanin⁷. Förmågan att studera sådana beteenden ger en spännande inblick i bakteriella ekosystem i en miljö som liknar den där de finns i människokroppen.

En av de största utmaningarna med att studera hur Pa-aggregat svarar på den föränderliga sputummiljön är bristen på näringsmässigt relevanta och robusta system som främjar aggregerad bildning. Mycket av det som är känt om Pa har upptäckts med hjälp av in vitro-system där celler växer planktoniskt eller i en karakteristisk ytbundet "svamp" -arkitektur som inte har observerats in vivo⁸. Medan klassiska biofilm tillväxt modeller, såsom flödesceller eller fast agar, har gett omfattande och värdefull kunskap om bakteriella beteenden och mekanismer för antibiotikatolerans, översätter dessa resultat inte alltid in vivo. Många in vitro-modeller har en begränsad förmåga att efterlikna tillväxtmiljön på den mänskliga infektionsplatsen, vilket kräver kostsamma in vivo-studier. Många in vivo-modeller saknar i sin tur den flexibilitet och upplösning som in vitro-teknik ger.

Syntetisk cystisk fibros sputum (SCFM2) är utformad för att ge en miljö för Pa tillväxt liknande den som upplevs under kronisk infektion i CF lungan. SCFM2 innehåller näringskällor som identifierats i expectorated CF sputa utöver mucin, lipider och DNA. Pa tillväxt i SCFM2 kräver en nästan identisk gen inställd på den som krävs för tillväxt i faktisk sputum och stöder naturlig Pa aggregerad^{bildande 9,10}. Efter inokulering bildar planktoniska celler aggregat som ökar i storlek genom expansion. Enskilda celler (kallas migranter) frigörs från aggregat, migrerar till ofärgade områden och bildar nya aggregat¹⁰. Denna livshistoria kan observeras med CLSM och bildanalys vid upplösningen av en enda cell. Aggregat av Pa som bildas i SCFM2 är av liknande storlekar som de som observerats i CF lung¹⁰. Denna modell gör det möjligt att observera flera aggregat av varierande storlek i realtid och i tre dimensioner på mikronskalan. Timelapse-mikroskopi gör det möjligt att spåra tusentals (~ 50 000) aggregat i ett experiment. Användningen av programvara för bildanalys möjliggör kvantifiering av aggregerade fenotyper från mikrografer, inklusive aggregerad volym, yta och position i tre dimensioner till närmaste 0,1 μm, både på individaggregats- och befolkningsnivå. Att ha förmågan att gruppera aggregat efter fenotyp och position möjliggör differentiering av aggregat i olika utvecklingsstadier med precision, liksom deras svar på en föränderlig mikromiljö^6,11.

Tillämpningen av SCFM2 för att studera Pa-aggregat i låg volym och hög genomströmningsanalyser gör det till en flexibel, kostnadseffektiv modell. Som definierat medium erbjuder SCFM2 enhetlighet och reproducerbarhet på flera plattformar, vilket ger en näringsmässigt och fysiskt relevant metod för att studera Pa-aggregat in vitro^9. Applikationer inkluderar dess användning i kombination med CLSM för att observera rumslig organisation och antibiotikatolerans vid hög upplösning (som beskrivs i detta metodpapper). Förmågan att utföra experiment som ger data i mikronskala i realtid gör det möjligt att studera interaktioner mellan arter och mellan arter eftersom de kan förekomma in vivo. Till exempel har SCFM2 tidigare använts för att studera den rumsliga dynamiken i cellcellskommunikation i aggregerade populationer via ett nätverk av system som används av Pa för att reglera flera gener som bidrar till virulens och patogenes⁶.

Figur 1: Grafisk skildring av deviktigaste experimentella stegen. B)Aggregat överförs till det konfokala mikroskopet och antibiotika tillsätts. Avbildade är tre tekniska replikat (kamrar 1-3) och en kontrollbrunn (4) av inokulerad SCFM2 utan antibiotikabehandling. Aggregat avbildas med CLSM under loppet av 18 h. (C) Efter den första 18-h imaging behandlas aggregat med propidium iodid för att visualisera döda celler och avbildas med CLSM (D) Aggregat med önskad fenotyp separeras från SCFM2 med FACS. Förkortningar: SCFM2 = syntetisk cystisk fibros sputum medium; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = konfokal laserskanningsmikroskopi; FACS = fluorescensaktiverad cellsortering. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Här demonstreras nyttan av SCFM2 för att studera effekten av antibiotikabehandling på Pa-aggregat i realtid, följt av användning av en cellsorteringsmetod för att isolera populationer av aggregat med distinkta fenotyper för nedströmsanalys ( figur1).

Protocol

1. Förbered syntetiskt cystiskt fibrosmedium (SCFM2)

ANM.: Beredningen av SCFM2 omfattar tre huvudsteg som beskrivs nedan(figur 2). Fullständig information och referenser finns i^9,10,12.

Figur 2: Beredning och inokulering av SCFM2-medium. a)Buffrad bas bereds med salter och aminosyror som förtecknas i tabell 1 och tabell 2. Buffrad bas kan förvaras vid 4 °C i upp till 30 dagar, men måste skyddas mot ljusexponering. B)Mucin och DNA tillsätts till en alikvot av buffrad bas och löses upp till lösning över natten vid 4°C.( C) Lipid och ytterligare lager tillsätts till övernattningslösningen och inkuberas vid 37 °C med omrörning vid 250 varv/min i 20 min. SFCM2 vaccineras sedan med tvättade, stockfasceller vid en OD₆₀₀ = 0,05. Förkortningar: SCFM2 = syntetisk cystisk fibros sputum medium. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

1. Sterilisering av svinslemhinnan
   1. Bered steril mucin vid en slutlig koncentration av 5 mg/ml i SCFM2. Till exempel, för en 5 ml volym SCFM2, väg 25 mg typ II mucin i en steril Petri-maträtt och placera i en ultraviolett (UV) sterilisator i 4 timmar, försiktigt agitera varje timme.
   2. Efter 4 timmar överför du det UV-behandlade mucinet till autoklaverade 1,7 ml-rör under sterila förhållanden och förvaras vid -20 °C.
   3. För att bekräfta fullständig sterilisering, lös upp ett prov av mucin i en steril vätska, såsom vatten eller Luria Bertani (LB) buljong, och observera under ett mikroskop.
      OBS: Steriliserat mucin kan förvaras vid -20 °C i upp till 6 månader.
2. Förberedelse av buffrad bas
   1. Förbered salt- och aminosyrabuljonglösningar genom att tillsätta lämpliga mängder viktprocent till avjoniserat vatten enligt tabell 1. Filtersterilisera alla stamlösningar med hjälp av ett 0,22 μm-filter, linda in folie för att skydda mot ljusnedbrytning och förvara vid 4 °C i upp till en månad.
   2. Förbered buffrad bas genom att kombinera 190 ml avjoniserat vatten med aminosyra- och saltlagerlösningar efter volymer som anges i tabell 1. Justera lösningen till pH 6,8 och öka till en slutlig volym på 250 ml. Filtersterilisera med ett filter på 0,22 μm och förvara vid 4 °C i upp till 30 dagar.
   3. Kvällen före försöket alikvoten den önskade mängden buffrad bas i en glasodlingskolv och tillsätt mucin (5 mg/ml enligt beskrivningen i steg 1.1.1) och renat laxsperma-DNA (0,6 mg/ml). Agitera försiktigt, linda in folie och låt vid 4 °C över natten så att mucin och DNA kan lösas upp till lösning.
      OBS: Laxsperma DNA-alikvoter ska tinas på is, virvlas och tillsättas till buffrad bas och mucin. Tryptofan-, sparris- och tyrosinlagerlösningar måste beredas i lösningar av NaOH (se tabell 1 för koncentrationer) i stället för avjoniserat vatten. Håll buffrad bas och alla lagerlösningar inslagna i folie för att skydda mot ljusexponering. De flesta lager kommer att vara stabila i upp till en månad. Lager som blir missfärgade bör inte användas och bör bytas ut före användning.
3. Tillägg av kompletterande lager
   1. På experimentdagen lägger du till de lager som anges i tabell 2 till den buffrade basen som innehåller mucin och DNA.
      OBS: Förbered en färsk FeSO_4-lösning på experimentdagen, men alla andra lager kan göras i förväg och lagras i 30 dagar vid 4 °C. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC) innehåller kloroform. Hantera försiktigt och använd inte nära öppna lågor. Efter tillsats av DOPC, inkubera SCFM2 vid 37 °C med skakningar (250 varv/min) i minst 20 min (för 5 ml kultur). Denna inkubationsperiod gör det möjligt för kloroformen i DOPC att avdunsta. Kolven får inte vara lufttät. Täck istället kolvens öppning löst med folie.

2. Realtidsbedömning av antimikrobiell tolerans i bakterieaggregat

1. Förbered kulturer över natten
   1. Kvällen före experimentet, inokulera 5 ml LB-buljong med flera kolonier av Pa PAO1-pMRP9-1¹³ från en LB agarplatta som innehåller antibiotika (karbinicillin 300 μg/ml). Odla över natten vid 37 °C med agitation vid 250 varv/min.
      OBS: Odla över natten kulturer med tillsats av antibiotika som krävs för valet av nödvändiga plasmider (här, det gröna fluorescerande proteinet (GFP) uttryck plasmid, pMRP9-1). Observera att Pa-celler ska tvättas innan SCFM2 vaccinelas. LB kan ersätta andra rika laboratoriemedier med kulturer över natten. Alla bakteriella isolat bör hanteras med lämpliga BSL-2 riktlinjer i hela detta protokoll.
2. Inokulera SCFM2
   1. På experimentdagen späds över natten kulturer av Pa 1:10 (kultur: flytande media) genom att inokulera 500 μL i 5 ml färsk LB-buljong. Odla celler tills loggfasen (60-90 min) vid 37 °C med omrörning vid 250 varv/min.
   2. Centrifuge stockfas kulturer på 10,000 × g i 5 min. Tvätta cellerna genom att ta bort supernatanten och återanvända i 3 ml filtersteriliserad fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7.0). Upprepa två gånger och återanvänd pelleten i en slutlig volym på 1 ml PBS.
   3. Mät de tvättade cellernas absorbans med hjälp av en spektrofotometer vid 600 nm (OD₆₀₀₎och beräkna den kulturvolym som krävs för en start OD₆₀₀ på 0,05 i 5 ml SCFM2. Inokulera Pa i SCFM2 och virvel försiktigt för att fördela celler i hela. Pipett 1 ml av den inokulerade SCFM2 i varje kammare med en 4-brunns, glasbotten, optisk skål och inkubera i 4 timmar statiskt vid 37 °C.
      OBS: Pa-kulturerna fördubblas är beroende av belastningen och tillgången på syre. I SCFM2, under de förhållanden som beskrivs här, är pa:s fördubblingstid ~1,4 h¹⁰.

3. Visualisera aggregat under antibiotikabehandling med konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM)

OBS: I det här avsnittet beskrivs användningen av konfokal laserskanningsmikroskop och bildinspelningsprogram för avbildning av Pa-aggregat i SCFM2. Målet är att observera och karakterisera den återstående (toleranta) bakteriella biomassan efter behandling med antibiotika. De steg som beskrivs kan utföras med framgång på andra konfokala mikroskop, även om instrumenthandboken bör refereras till för specifik vägledning.

1. Bild Pa kulturer med antingen en uppvärmd kammare eller en uppvärmd mikroskopplatta monterad på mikroskopstadiet för att upprätthålla en omgivningstemperatur på 37 °C. Starta inkubationsmodulen minst 2 timmar före experimentstarten så att alla apparater kan uppnå önskad temperatur och minska ytterligare expansion och rörelse under datainsamlingen.
2. Efter 4 h, överför SCFM2 kulturer som innehåller Pa celler till det uppvärmda mikroskopstadiet. Utse 3 av 4 brunnar som tekniska replikat för antibiotikabehandling och betrakta den^{4: e} samt en icke-behandlingskontroll, som endast innehåller Pa-celler i SCFM2, utan antibiotika. Identifiera aggregat med brightfield-mikroskopi på fliken Hitta innan du excitation av fluorescerande reportrar. Definiera ett område för avbildning inom varje brunn och lagra dess position (x-y-z-koordinater) med hjälp av positionsmodulen i bildframställningsprogrammet.
3. Använd ett 63x oljesänkningsmål för att visualisera Pa-kulturer som innehåller GFP-uttrycket plasmid pMRP9-1 i SCFM2 med en excitationsvåglängd på 488 nm och utsläppsvåglängd på 509 nm. Ta bilder med z-stack-alternativet i förvärvsmodulen med 1 μm intervall (totalt 60 segment). Använd modulen Line-averaging för att minska bakgrundsfluorescensen i GFP-kanalen inom den totala volymen av z-stackbilderna på 60 μm (1 093,5 mm³). Ta kontrollbilder av oinokulerad SCFM2 genom att använda identiska inställningar för att bestämma bakgrundsflödet för bildanalys.
   OBS: Bilder förvärvas genom att producera 512 pixlar x 512 pixlar (0,26 μm x 0,26 μm pixlar) 8-bitars z-stack bilder som är 60 μm från täckplattans botten.
4. Använd alternativet tidsserier i bildbehandlingsprogrammet för att fånga 60 segment vid varje position (brunn) med 15 minuters intervall under en period av 18 timmar. Använd den definitiva fokusstrategin i programvaran för att lagra ett fokusplan för varje position, som returneras till vid varje tidpunkt under hela experimentet.
5. Efter totalt 4,5 h inkubation, avbilda varje position med hjälp av ovanstående inställningar för att bestämma den aggregerade biomassan i var och en av de fyra brunnarna före tillsats av antibiotika.
6. Efter 6 h total inkubation, tillsätt antibiotika vid 2x-under minsta hämmande koncentration (MIC) till varje replikat. Pipett direkt och försiktigt in i mitten av brunnen, strax under luft-flytande interfasen. Underhåll alla kulturer i den uppvärmda konfokalkammaren.
   OBS: Här användes kolistinsulfat vid en koncentration av 140 μg/ml.
7. Börja avbildning efter antibiotikabehandling genom att klicka på alternativet Startexperiment i bildbehandlingsprogrammet.
   OBS: Den använda antibiotikakoncentrationen är beroende av antibiotikumet, Pa-isolatet och om användaren vill undersöka dödande eller toleranseffekter. Detta experiment använder en enda dos. Ytterligare doser kan tillsättas utan att störa kulturer om det behövs.

4. Propidiumididfärgning av Pa-aggregat

OBS: Propidiumididid (PI) används ofta som färgreagens för att identifiera icke-livskraftiga (döda) bakterieceller i kulturen. Här används den för att identifiera aggregat som är känsliga för antibiotikabehandling som tillämpas i avsnitt 3. I hela det här protokollet används uttryck och identifiering av GFP i Pa-celler som huvudproxy för cellens livskraft. Detta sista steg gör det möjligt att använda konfokal avbildning igen för att identifiera rumslig positionering av levande/döda aggregat i förhållande till varandra. Dessutom identifieras aggregat som levande/döda för ytterligare cellsortering nedströms i avsnitt 5.

1. Efter 18 timmar, tillsätt PI till varje brunn i den fyrakammar optiska bottenrätten som innehåller SCFM2-kulturer. Följ tillverkarens instruktioner för volymen av PI och inkubationstiden (t.ex.~ 2 μL per ml kultur, ~ 20-30 min).

5. Isolera levande celler från aggregat med hjälp av en FACS-metod

FACS presenterar en kraftfull plattform för att sortera och isolera grupper av celler enligt en fluorescerande taggad fenotyp. Här används FACS för att isolera levande (antibiotikatoleranta) aggregat från icke-livskraftiga aggregat.

1. Efter färgning med propidiumidid, ta bort kulturerna från inkubation och överför till ett FACS-instrument i en isolerad behållare för att bibehålla 37 °C.
2. Kör 1 ml alikvoter av SCFM2 som innehåller Pa-aggregat med lägsta flödeshastighet.
   OBS: Varje alikvot innehåller ~15 000 aggregat.
3. För att upptäcka GFP, belysa cellerna med en 488 nm laser och registrera den fluorescerande signalhöjden vid 530/30 nm. Visualisera PI-färgningen genom excitation med en 561 nm laser och registrera den fluorescerande signalhöjden vid 610/20 nm. Utför sortering med ett 70-u-munstycke.
   Sorterade aggregat kan slås samman på flera sätt beroende på användarens program. I detta fall användes FACS för att sortera livskraftiga Pa-aggregat för nedströms RNA-sekvensering. Alternativa ansökningar diskuteras nedan.

6. Bildanalys

OBS: Timelapse-mikroskopi genererar stora mängder data. Ett 18-h experiment för observation av Pa-aggregat i SCFM2 identifierar ~ 50 000 aggregat över tiden, som har potential att karakteriseras för volym och rumslig positionering. Använd en bildanalysprogramvara för att kvantifiera aggregerad dynamik i SCFM2:

1. För aggregerade studier i SCFM2, kvantifiera bakgrunden GFP fluorescens genom att skapa ett histogram av räkningar i GFP-kanalen som produceras för uninoculated SCFM2 och SCFM2 inokuleras med Pa stam PAO1 bär pMRP9-1. För att säkerställa att upptäckta GFP voxels korrelerar med Pa biomassa, definiera en GFP + voxel som ≥1,5x GFP bakgrundsräkningsvärdet.
   OBS: Bakgrundsflödet definieras som det högsta voxelvärdet för tre slumpmässigt valda positioner, i genomsnitt. Bakgrundsantal subtraheras som standardmått från alla pixlar i experimentella bilder av bildanalysprogramvaran.
2. Efter bakgrundssubtraktion i Surpass-modulen, producera isosurfaces för alla återstående voxels.
3. Om du vill identifiera enskilda aggregat aktiverar du alternativet Dela objekt och definierar aggregat som objekt med volymer på ≥5 μm³. Använd Vantage-modulen i bildanalysprogramvaran för att beräkna volymen, x-y-z och summan av GFP-voxels för varje enskilt objekt. Exportera dessa data till en extern statistisk plattform.
   OBS: Vissa bildanalysprogram tillåter export av flera kvantitativa fentoypes samtidigt, vilket gör det möjligt att beräkna korrelationer.
4. Filtrera data som exporteras från Vantage-modulen efter storlek för att säkerställa att inga föremål på <0,5 μm³ (spridd biomassa) finns kvar. För varje enskilt objekt i bilden beräknar du avståndet från sig själv i förhållande till andra objekt (aggregat) med hjälp av Vantage-modulen i bildanalysprogramvaran eller manuellt med följande ekvation.
   d = sqrt((x₂− x₁)² + (y₂−_{y 1})² + (z₂− z₁)²) (1)
5. Använd SUMMA- och GENOMSNITTsberäkningar för att hitta den totala biomassan och den genomsnittliga aggregerade volymen. Alternativt kan du exportera data till andra statistiska plattformar eller skript, t.ex.

Representative Results

Detta arbete beskriver metoder för att observera Pa aggregat med hög upplösning och i en miljö som liknar den för kronisk infektion i CF^{lunga 9,10,12}. SCFM2 tillhandahåller ett in vitro-system som främjar naturlig aggregering av Pa-celler i storlekar som liknar de som observerats under faktisk infektion¹⁰. SCFM2:s anpassningsförmåga som definierat medium kan utnyttjas för att närma sig många forskningsvägar. Målet med detta arbete är att lyfta fram ett arbetsflöde som involverar en kombination av mikroskopi och FACS, i syfte att uppmuntra dess användning för framtida forskning, samarbeten och applikationer.

Användningen av CLSM möjliggör temporal, högupplöst avbildning som kan användas för att studera dynamiken i att utveckla bakteriepopulationer. Detta arbete visar flera potentiella sätt på vilka Pa-aggregat kan karakteriseras efter behandling med antibiotika. Figur 3A ger en bred bild av livskraftiga Pa-aggregat efter antibiotikabehandling. Fyra timmar efter applicering av antibiotika kvarstår flera aggregat; färgintervall kan tillämpas för att representera olika egenskaper hos varje enskilt aggregat. Exempel på kvantifierbara egenskaper är volym, område, voxelintensitet (för användning av fluorescerande reportrar) och position i någon av x-y-z-axlarna.

Bildanalys med hjälp av dedikerad programvara möjliggör en helt anpassningsbar observation av data och identifierar varje aggregat som ett enskilt objekt, där kvantitativa data kan exporteras för vidare analys. Figur 3B är ett exempel på hur exporterade data kan användas. Här kan den totala biomassan av aggregerade populationer beräknas över tid. I dessa representativa data minskar behandling med antibiotika avsevärt biomassa jämfört med obehandlade aggregat. Kompletterande Video S1 är en kraftfull representation av hur tidsseriemikroskopi kan användas för att fysiskt observera aggregat inom dessa biomassadata efter antibiotikabehandling. Varje aggregat har färgkodats för att representera den beräknade volymen (μm³), vilket möjliggör en visuell post över aggregerade populationer, som också kan användas för ytterligare rumslig analys med hjälp av applikationer, både inom bildanalysprogramvaran och andra resurser (diskuteras inte^{här 10,15}).

Experiment som utvecklats för att identifiera mekanismer för antibiotikatolerans i Pa-aggregat producerar stora mängder data. Varje replik ger fysiska data på ~15 000 aggregat (totalt ~ 60 000 aggregat). Ett nytt tillvägagångssätt för hantering av dessa uppgifter har inneburit produktion av aggregerade värmekartor(figur 3C). Genom att beräkna hur aggregat av olika storlekar bidrar till den totala populationen kan mönster för hur aggregat svarar på antibiotikabehandling i förhållande till deras storlek, form och position i förhållande till varandra identifieras.

Figur 3: Exempel på aggregerad dataanalys. (A) Översikt över återstående aggregerad biomassa efter antibiotikabehandling. Isokirurgier av motsvarande GFP voxels har återges och färgkodats enligt volym (μm³). Skalstång = 30 μm. B)Total biomassa (μm³⁾av pa aggregerade populationer över tid i SCFM2. Blå linje representerar obehandlade aggregat, röd linje representerar aggregat behandlade med antibiotikumet, kolistin (140 μg/ml). Presenterade data inkluderar 3 biologiska replikat (± SEM). c)Aggregerade volymvärmekartor som representerar bidraget från enskilda aggregat i volymprocent (μm³x-axel) till total biomassa (μm^3,andra y-axeln) över tid (h, y-axel). Representativa uppgifter inkluderar Pa-aggregat i närvaro och frånvaro av antibiotika (som i figur 3B), där 0 h representerar tiden för antibiotikatillskott efter 6 h aggregerad tillväxt. Data inkluderar tre biologiska replikat (~ 50 000 totala aggregat). Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; SCFM2 = syntetisk cystisk fibros sputum medium; SEM = standardfel av medelvärdet; Pa = Pseudomonas aeruginosa. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Rumslig analys i detta skede innebär att använda uttrycket av GFP av Pa som en proxy för livskraft i närvaro av antibiotika. Tillsats av PI efter 18 timmar gör det möjligt att identifiera positionen för icke-livskraftiga aggregat i förhållande till livskraftiga aggregat(kompletterande figur S1). Det övergripande målet med denna metod är att identifiera rumsliga mönster mellan känsliga och toleranta aggregat efter behandling med antibiotika. Framtida studier kommer att innehålla flera tidpunkter utöver den slutpunktsanalys som beskrivs ovan.

Det sista steget i arbetsflödet använder en FACS-baserad metod för att sortera aggregat i SCFM2. Detta arbete visar FACS förmåga att separera livskraftiga celler från den återstående populationen av aggregat (inklusive icke-livskraftiga). Figur 4 visar användningen av FACS för att samla livskraftiga aggregat för ytterligare experiment som sekvensering med hög genomströmning, t.ex.RNA-sekvensering (RNA-seq). Efter behandling med antibiotika (figur 4A representerar en tidpunkt (18 h), alikvoter av SCFM2 som innehåller Pa-aggregat kan framgångsrikt separeras enligt deras fluorescerande egenskaper. Här har GFP identifierats för toleranta aggregat. Figur 4B är ett exempel på en sådan sorteringshändelse, där GFP-uttrycksceller separeras från den återstående kulturen (PI-behandlade aggregat). Dessutom kan aggregat tydligt identifieras från SCFM2, som producerar sin egen fluorescerande profil. Möjligheten att sortera celler på detta sätt har många tillämpningar (figur 5).

Figur 4: FACS of Pa-aggregat i SCFM2. a)Diagram över ett FACS-instrument som används för att separera livskraftiga och icke-livskraftiga Pa-aggregat från SCFM2. B)Representativt aggregat som separerats i SCFM2 och som genereras av FACS-programvara. Tre kvadranter indikerar levande aggregat (GFP), återstående kultur som innehåller icke-livskraftiga celler (RFP används som ett alternativ till propidiumididodfärgning här, båda excitable av 488 nm laser) och SCFM2 kontroll. Data representerar 1 av 3 biologiska replikat som innehåller ~15 000 händelser (aggregat). Förkortningar: FACS = fluorescensaktiverad cellsortering; SCFM2 = syntetisk cystisk fibros sputum medium; Pa = Pseudomonas aeruginosa; GFP = grönt fluorescerande protein; RFP = rött fluorescerande protein; PE-Texas Red-H = topphöjd för fykoerythrin-Texas Röda konjugatfärgade celler; FITC-H = topphöjd för fluorescein isothiocyanate-färgade celler.

Figur 5: Potentiella experimentella tillämpningar som använder SCFM2. (A) Exponering av Pa-aggregat för upprepade antibiotikadoser. B)Samkultur av Pa-aggregat med andra bakteriearter. C)Exponeringav Pa-aggregat för att vara värd för immunceller, t.ex. Förkortningar: SCFM2 = syntetisk cystisk fibros sputum medium; Pa = Pseudomonas aeruginosa; PMN = polymorfonukleära leukocyter; CLSM = konfokal laserskanningsmikroskopi; FACS = fluorescensaktiverad cellsortering; RNA-seq = RNA-sekvensering; 3D = tredimensionell; LC-MS/MS = flytande kromatografi/tandemmasspektrometri. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Kemisk	Lagerkoncentration (M)	Slutlig koncentration (mM)	Anteckningar
NaH 2 PO4 (påNaH 2)	0.2	1.3
Na 2 HPO4 (på2HPO4)	0.2	1.25
KNO3 (på 2)	1	0.35
K 2 SO4 (på2)	0.25	0.27
NH 4 Cl(på 4cl)		2.28	Lägg till heldragen direkt i buffrad bas
KCl (kcl)		14.94	Lägg till heldragen direkt i buffrad bas
NaCl (NaCl)		51.85	Lägg till heldragen direkt i buffrad bas
MOPPAR		10	Lägg till heldragen direkt i buffrad bas
Ser (ser)	0.1	1.45
Glu HCl	0.1	1.55
PRO	0.1	1.66
Gly (tecken)	0.1	1.2
Ala	0.1	1.78
Val (val)	0.1	1.12
Träffade	0.1	0.63
Ile	0.1	1.12
Leu	0.1	1.61
Orn HCl	0.1	0.68
Lys HCl	0.1	2.13
Arg HCl	0.1	0.31
Trp	0.1	0.01	Förberedd i 0,2 M NaOH
Asp	0.1	0.83	Förberedd i 0,5 M NaOH
Tyr	0.1	0.8	Förberedd i 1,0 M NaOH
Thr (19	0.1	1.07
Cys HCl	0.1	0.16
Phe (phe)	0.1	0.53
Hans HCl H2O	0.1	0.52
Lax spermier DNA		0,6 mg/ml
Svin Mucin		5 mg/nL

Tabell 1: Beredning av salt-, aminosyra-, DNA- och mucinlager som krävs för buffrad bas av syntetisk cystisk fibros sputum medium, SCFM2.

Kemisk	Lagerkoncentration (M)	Slutlig koncentration (mM)	Anteckningar
Dextros (D-glukos)	1	3
L-mjölksyra	1	9.3	Justera till pH 7.0 med NaOH
CaCl2*2H2O	1	1.75
MgCl2*6H2O	1	0.61
FeSO4 *7H2O	1 mg/ml	0.0036	Gör färsk dagligen
N-acetylglukosamin	0.25	0.3
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC)	25 mg/ml	100 μg/ml	Inkubera i minst 20 minuter vid 37 °C efter tillsats

Tabell 2: Beredning av ytterligare lager som krävs för buffrad bas av syntetisk cystisk fibros sputum medium, SCFM2.

Kompletterande figur S1: Pa-aggregat i SCFM2. En renderad konfokal mikrograf av livskraftiga (gröna) och icke-livskraftiga (röda) Pa-aggregat bildade i SCFM2. Skalstång = 5 μm. Förkortningar: SCFM2 = syntetisk cystisk fibros sputum medium; Pa = Pseudomonas aeruginosa. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande video S1: Aggregat i SCFM2 efter behandling med antibiotika. Pa aggregerade bilder tagna var 30: e minut i SCFM2 med CLSM. Aggregaten märks individuellt med färger som representerar aggregerad volym (μm³, färgskalan visas inte som representativ bild). Skalstång = 5 μm. Förkortningar: SCFM2 = syntetisk cystisk fibros sputum medium; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = konfokal laserskanningsmikroskopi. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Discussion

Detta arbete har introducerat metoder som kan kombineras för att studera bakteriella aggregerade populationer i närvaro och frånvaro av antibiotikabehandling. Högupplöst CLSM möjliggör visualisering av förändringar i aggregerad biomassa och den strukturella orienteringen av aggregat över realtid när de utsätts för antibiotika. Dessutom kan fysiska och strukturella egenskaper hos biomassan som kvarstår efter behandling med antibiotika kvantifieras, med målet att korrelera dessa observationer med framtida genuttrycksstudier som använder RNA-seq. Medan användningen av GFP-uttrycksceller möjliggör visualisering av det kollektiva och individuella beteendet hos antibiotikatoleranta celler, ger det bara en del av helhetsbilden. Mycket kan läras av den rumsliga positionering av celler som inte överlevde antibiotikabehandling, både individuellt och i förhållande till den överlevande och toleranta biomassan.

Tidsfördröjningsmikroskopi genererar stora mängder data. Ett 18-h experiment för observation av Pa-aggregat i SCFM2 identifierar ~ 50 000 aggregat över tiden, som har potential att karakteriseras för volym och rumslig positionering. CLSM som används här (se materialförteckningen)fångar högupplösta bilder av att utveckla aggregat för analys. Rumslig positionering av ett enskilt aggregat (i förhållande till omgivande aggregat) i tre dimensioner (± 0,1 μm) kan användas för att möjliggöra exakta mätningar av avståndet mellan aggregaten. Fysiska fenotyper av bakteriella aggregat kan bestämmas med hjälp av en kombination av analysmetoder. Bildåtergivning ger ytrendering och tredimensionell (3D) positionering. Internt genererade skript kan användas för att sortera aggregat efter fenotyp(t.ex.volym) och beräkna fördelningen av storlekssprydd biomassa. Ytterligare resurser finns tillgängliga för segmentera enskilda celler inom aggregat (t.ex.för att stödja användningen av transkriptionsreportrar¹⁴). Tillsammans ger dessa analysverktyg en bred bedömning av aggregerade fenotyper, med flexibiliteten att ändra analyser för nya intressen när data genereras.

Efter den första 18-h imaging behandlades aggregat med PI, en teknik som ofta kallas levande/död färgning. PI kommer in i celler med ett poröst (komprometterat) membran, vilket möjliggör visualisering av döda eller allvarligt stressade celler i motsats till levande celler som uttrycker GFP. Den rumsliga organisationen av bakteriesamhällen i CF-lungan som aggregat kan ge information om bakteriella samhällsbeteenden. Att identifiera livskraftiga och icke-livskraftiga celler, som är inspärrade i ett aggregat, underlättar identifieringen av fördelningen av celler inom samhället som kan vara mer känsliga för antibiotikabehandling. Kvantifiering av de fysiska förändringar som aggregat genomgår som svar på antibiotika samt identifiera genotypiska egenskaper hos antibiotikatoleranta aggregat kan informera framtida terapier mot Pa.

Användningen av PI har också nedströmsapplikationer i FACS-metoden i arbetsflödet, även om det bör noteras att det inte alltid är nödvändigt, eftersom livskraftiga celler i detta experiment kan differentieras genom GFP-uttryck. PI-färgning gör det dock möjligt att få rumslig information från aggregat i slutet av varje analys. Genom att markera användningen av FACS för att sortera aggregat visar detta metodpapper 1) att SCFM2 kan användas i en FACS-maskin utan att orsaka skador eller träskor trots sin viskositet, 2) FACS kan användas för att separera enstaka celler från ett aggregat och gruppera dem i distinkta populationer (fenotyper) och 3) PI-färgning har nytta för att separera döda celler från en population med FACS, särskilt om de andra intressecellerna inte uttrycker en fluorescerande markör. Användningen av levande-cell färgning tekniker belyser tillämpningen av detta protokoll för användning av kliniska isolat där genetisk manipulation ofta är svårt. Även om optimering sannolikt krävs stam för stam, kan aggregerade fenotyper identifieras med samma upplösning genom att använda många kommersiellt tillgängliga fluorforer.

Kompatibiliteten hos SCFM2 med FACS är en enorm fördel och gör det nu möjligt för utredare att isolera specifika enskilda celler från ett aggregat till distinkta populationer. Detta i sig har många tillämpningar för framtida studier som innehåller blandade populationer av celler. Till exempel, studera aggregering med andra arter eller heterogenitet inom enskilda arter aggregerar⁶. Denna spännande, högupplösta sorteringsprocess är allmänt tillgänglig i många institutioner och har många nedströmsapplikationer. Livskraftiga celler från aggregaten i denna studie sorterades för framtida RNA-seq experiment. Andra applikationer kan inkludera proteomik; Återförsäljning av aggregat för evolutionära studier, t.ex. samodling med andra arter, eller samodling med mänskliga immunceller (figur 5). Genom att kombinera dessa metoder med CLSM-bildframställningsexperiment kan korrelationen mellan observerade bakteriella egenskaper och beteenden och kvantitativa data identifiera mekanismer för bakteriesamhällen, relationer inom arter eller resistens mot antimikrobiella medel.

Vid sidan av de många fördelarna med dessa metoder finns det några fallgropar som bör åtgärdas. I denna studie används PI som slutpunktsmarkör för cellens livskraft. helst i framtiden skulle detta ersättas med cellaktivitetsmodeller för att skilja celler över flera tidpunkter. Dessa data fastställer dock användningen av SCFM2 till kulturaggregat som kan sorteras på flera andra sätt än levande/döda. Den främsta fördelen är att aggregat kan överföras direkt till FACS-maskinen utan tvätt och potentiella störningar av någon rumslig struktur som utvecklats under ett experiment. Sammantaget är detta en spännande plattform som kan användas av många labb för att främja samarbetsprojekt med dem som är intresserade av Pa, CF och mikrobiella beteenden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amino acids
Alanine	Acros Organics	56-41-7
Arginine HCl	MP	1119-34-2
Asparagine	Acros Organics	56-84-8	Prepared in 0.5 M NaOH
Cystine HCl	Alfa Aesar	L06328
Glutamic acid HCl	Acros Organics	138-15-8
Glycine	Acros Organics	56-40-6
Histidine HCl H2O	Alfa Aesar	A17627
Isoleucine	Acros Organics	73-32-5
Leucine	Alfa Aesar	A12311
Lysine HCl	Alfa Aesar	J62099
Methionine	Acros Organics	63-68-3
Ornithine HCl	Alfa Aesar	A12111
Phenylalanine	Acros Organics	63-91-2
Proline	Alfa Aesar	A10199
Serine	Alfa Aesar	A11179
Threonine	Acros Organics	72-19-5
Tryptophan	Acros Organics	73-22-3	Prepared in 0.2 M NaOH
Tyrosine	Alfa Aesar	A11141	Prepared in 1.0 M NaOH
Valine	Acros Organics	72-18-4
Antibiotic
Carbenicillin	Alfa Aesar	J6194903
Day-of Stocks
CaCl2 * 2H2O	Fisher Chemical	C79-500
Dextrose (D-glucose)	Fisher Chemical	50-99-7
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Fisher (Avanti Polar Lipids)	4235-95-4	shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform
FeSO4 * 7H2O	Acros Organics	7782-63-0	this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh
L-lactic acid	Alfa Aesar	L13242	pH stock to 7 with NaOH
MgCl2 * 6H2O	Acros Organics	7791-18-6
N-acetylglucosamine	TCI	A0092
Prepared solids
Porcine mucin	Sigma	M1778-100G	UV-sterilize
Salmon sperm DNA	Invitrogen	15632-011
Stain
Propidium iodide	Alfa Aesar	J66764MC
Salts
K2SO4	Alfa Aesar	A13975
KCl	Alfa Aesar	J64189	add solid directly to buffered base
KNO3	Acros Organics	7757-79-1
MOPS	Alfa Aesar	A12914	add solid directly to buffered base
NaCl	Fisher Chemical	S271-500	add solid directly to buffered base
Na2HPO4	RPI	S23100-500.0
NaH2PO4	RPI	S23120-500.0
NH4Cl	Acros Organics	12125-02-9	add solid directly to buffered base
Consumables
Conical tubes (15 mL)	Olympus plastics	28-101
Conical tubes (50 mL)	Olympus plastics	28-106
Culture tubes w/air flow cap	Olympus plastics	21-129
35 mm four chamber glass-bottom dish	CellVis	NC0600518
Luria Bertani (LB) broth	Genessee Scientific	11-118
Phosphate-buffered saline (PBS)	Fisher Bioreagents	BP2944100
Pipet tips (p200)	Olympus plastics	23-150RL
Pipet tips (p1000)	Olympus plastics	23-165RL
Serological pipets (5 mL)	Olympus plastics	12-102
Serological pipets (25 mL)	Olympus plastics	12-106
Serological pipets (50 mL)	Olympus plastics	12-107
Ultrapure water (RNase/DNase free); nanopure water	Genessee Scientific	18-194	Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1
Syringes (10  mL)	BD	794412
Syringes (50 mL)	BD	309653
0.22 mm PES syringe filter	Olympus plastics	25-244
PS cuvette semi-mico	Olympus plastics	91-408
Software
Biorender			To prepare the figures
FacsDiva6.1.3	Becton Dickinson, San Jose, CA
Imaris	Bitplane		version 9.6
Zen Black
Equipment
FacsAriallu	Becton Dickinson, San Jose, CA
LSM 880 confocal laser scanning microscope	Zeiss