Summary
这里描述了一个顶空固相微萃取气相色谱平台，用于在成熟的黑醋栗果实中快速、可靠和半自动地进行挥发性鉴定和定量。该技术可用于增加有关水果香气的知识，并选择具有增强风味的品种以进行育种。
Abstract
人们越来越有兴趣测量成熟水果排放的挥发性有机化合物（VOCs），以培育具有增强感官特性的品种或品种，从而提高消费者的接受度。最近开发了高通量代谢组学平台，用于量化不同植物组织中的各种代谢物，包括负责水果味道和香气质量的关键化合物（挥发性组学）。这里描述了一种使用顶空固相微萃取（HS-SPME）与气相色谱-质谱（GC-MS）结合使用的方法，用于鉴定和定量成熟黑醋栗果实排放的VOCs，这种浆果因其风味和健康益处而受到高度赞赏。
收获黑醋栗植物（Ribes nigrum）的成熟果实并直接在液氮中冷冻。组织均质后产生细粉，解冻样品并立即与氯化钠溶液混合。离心后，将上清液转移到含有氯化钠的顶空玻璃小瓶中。然后使用固相微萃取（SPME）纤维和与离子阱质谱仪耦合的气相色谱仪提取VOC。通过积分峰面积，对所得离子色谱图进行挥发性定量，对每个VOC使用特定的 m / z 离子。通过比较在与样品相同条件下运行的纯商业标准的保留时间和质谱，确认了正确的VOC注释。在不同欧洲地区种植的成熟黑醋栗果实中鉴定出60多种VOC。在已确定的VOC中，关键的芳香化合物，如萜类化合物和C6挥发物，可用作黑醋栗果实质量的生物标志物。此外，还讨论了该方法的优缺点，包括预期的改进。此外，还强调了使用控制装置进行批量校正和最小化漂移强度。
Introduction
风味是任何水果的基本质量特征，会影响消费者的接受度，从而显着影响适销性。风味感知涉及味道和嗅觉系统的组合，并且在化学上取决于成熟水果排放的各种化合物的存在和浓度，这些化合物积聚在可食用植物部分，或者在VOC的情况下，由成熟的水果排放1，2。虽然传统育种一直专注于产量和抗虫性等农艺性状，但由于遗传复杂性和难以正确表型这些特征，水果品质性状（包括风味）的改善长期以来一直被忽视，导致消费者不满3，4。代谢组学平台的最新进展已成功鉴定和量化负责水果味道和香气的关键化合物5，6，7，8。此外，代谢物分析与基因组或转录组学工具的结合可以阐明水果风味背后的遗传学，这反过来将有助于育种计划开发具有增强感官特征的新品种2，4，9，10，11，12，13，14。
黑醋栗（Ribes nigrum）浆果因其风味和营养特性而受到高度赞赏，在欧洲，亚洲和新西兰的温带地区广泛种植15。大部分生产是加工食品和饮料，这在北欧国家非常受欢迎，主要是由于浆果的感官特性。水果的强烈颜色和风味是成熟水果中存在的花青素，糖，酸和VOC的组合的结果16，17，18。对黑醋栗挥发物的分析可以追溯到20世纪60年代19，20，21。最近，一些研究集中在黑醋栗VOCs上，确定了水果香气感知的重要化合物，并评估了基因型，环境或储存和加工条件对VOC含量的影响5，17，18，22，23。
由于其众多优点，高通量易失性分析的首选技术是HS-SPME/GC-MS24，25。涂有聚合物相的二氧化硅纤维安装在注射器装置上，允许吸附纤维中的挥发物，直到达到平衡相。顶空萃取可保护纤维免受基质中存在的非挥发性化合物的影响24。SPME可以成功地分离出大量高度可变浓度（十亿分之一到百万分之一）的挥发性有机化合物25。此外，它是一种无溶剂技术，需要有限的样品处理。HS-SPME的其他优点是易于自动化和相对较低的成本。
然而，其成功可能有限，具体取决于VOC的化学性质，提取方案（包括时间，温度和盐浓度），样品稳定性以及足够的果实组织的可用性26，27。本文提出了一种通过HS-SPME分离黑加仑VOCs的方案，并通过气相色谱结合离子阱质谱仪进行分析。在植物材料的数量，样品稳定性以及提取和色谱的持续时间之间实现了平衡，以便能够处理大量的黑醋栗样品，其中一些在本研究中提出。特别是，五个品种（"Andega"，"Ben Tron"，"Ben Gairn"，"Ben Tirran"和"Tihope"）的VOC图谱和/或色谱图将作为示例数据进行介绍和讨论。此外，在其他水果浆果物种（如草莓（Fragaria x ananassa），覆盆子（Rubusidaeus）和蓝莓（Vaccinium spp.）中，相同的方案已成功用于VOC测量。
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Protocol
1. 水果收获
- 每个基因型和/或处理种植4至6株植物，以确保足够的果实材料和变异性。
- 如果可能的话，在同一天收获样品;如果没有足够的水果材料，将不同日期收获的样品汇集在一起。
注意：建议收获时间（上午，中午，下午）保持大致相同，因为VOC曲线受白天/昼夜节律的影响28，29，30，31。 - 通过目视观察评估水果成熟阶段32。来自同一成熟阶段的池水果，因为成熟状态强烈影响VOC排放。丢弃任何受损或病原体感染的水果。
注意：为了更好地评估水果的成熟度，可以进行质地分析33。此外，花后计数天数可用于确保混合的果实属于类似的成熟阶段。 - 每个生物重复（3至5个）至少包括10-15个水果，用于VOC分析。
注意：在这里，2018年夏季在两个地点（波兰和苏格兰）收获了"Andega"，"Ben Tron"，"Ben Gairn"，"Ben Tirran"和"Tihope"品种的三个单独的13-20个水果（生物复制品）池，并直接在液氮中冷冻。然后将样品送到实验室并按如下所述进行处理。 - 收获后，立即将所有水果冷冻在液氮中，然后将其储存在-80°C直至加工。
注意：如果可能的话，水果可以在收获后直接加工。在这种情况下，新鲜水果可以在混合器中均质，称重并直接分析（步骤3.1开始）。但是，为了防止水果进一步收获后降解过程，新鲜材料应储存在冷却器（4°C）中并尽快加工。如果处理不当，液氮会产生冷灼伤，并可能在通风不良的空间内引起窒息。
2. 水果样品和试剂制备
- 将水果研磨成细粉，注意始终在液氮的帮助下保持冷冻。使用低温研磨机、珠磨机或研钵和研杵进行均质化。用液氮预冷不锈钢研磨罐或研钵和研杵，以避免样品解冻。
注意：将样品匀浆成细粉以确保适当的VOC提取至关重要。 - 在先前在液氮中冷却的5 mL管中称量1克冷冻材料（从步骤2.1开始），并注意确切的重量。将材料保持在-80°C，直到处理步骤3.1。
- 在分析中包括"参考"或"对照"样品，以检查技术变化，包括VOC提取和HS-SPME / GC-MS性能。为此，将随机选择的水果样品的混合物汇集在一起，每天至少包括一个对照样品进行VOC分析。此外，如步骤2.5所述，使用内部标准，以尽量减少强度漂移的影响。
- 在高效液相色谱（HPLC）级水中制备20%（w / v）氯化钠溶液（以下简称NaCl溶液）。在磁力搅拌器的帮助下溶解NaCl;确保每个样品提供1 mL溶液。
- 从纯商业标准品（以下简称内标）制备1 ppm的 N-十五烷（D32，98%）HPLC级甲醇溶液。
注： N-十五烷-d32将用作内标，每个样品需要5μL。甲醇应在通风橱下操作。 - 在HPLC级甲醇中制备1 ppm溶液，用于VOC鉴定（本研究中使用的商业标准品列表见 表1 ）。
- 准备10 mL螺旋盖顶空小瓶，在每个所需小瓶中加入0.5g NaCl。确保螺旋盖包括由柔软材料（ 即硅胶）组成的隔膜，内侧有一层薄的聚四氟乙烯薄膜，以避免污染。
3. 样品制备
- 将1mL NaCl溶液加入含有称量的冷冻样品的5mL管中。摇动试管，直到样品完全解冻并匀浆。
- 在室温下以5000× g 离心5分钟。
- 将带有1000μL移液器吸头的上清液转移到含NaCl的顶空小瓶中。切开尖端的末端以方便此过程。
- 向每个含有样品的顶空小瓶中加入5μL内标。
4. HS-SPME/GC-MS数据采集
- 将封闭的顶空小瓶在室温下放入GC-MS自动进样器中，以进行自动HS-SPME / GC-MS运行，如第4节所述。不要将生物重复放置在自动进样器中的连续位置;相反，随机分布它们以最大限度地减少强度漂移的影响。
注：可一次将约 10-12 个小瓶放入自动进样器中，而不会影响样品稳定性。 - 在50°C下预孵育顶空小瓶10分钟，并在17× g下搅拌。
- 将SPME设备插入小瓶中，将纤维暴露在顶空，在50°C下以17× g搅拌30分钟进行VOC提取。
- 将光纤在250°C下以无分裂模式引入注射口1分钟，以进行挥发性解吸。
- 在SPME清洁站中用氮气（1 bar N2，≥99.8%纯度）在250°C下清洁纤维5分钟。 重复使用光纤约100倍。
- 使用与离子阱质谱仪耦合的气相色谱仪分析VOC（见 材料表），并在1 mL / min的恒定氦气流（He ≥99.9999%纯度）下进行色谱分析，其色谱柱的尺寸为60 m x 0.25 mm x 1μm厚度。使用在40°C下等温的烘箱温度程序3分钟，然后以8°C / min升温至250°C，并在250°C下保持5分钟。对于质谱，将传输线和离子源温度分别设置为260°C和230°C。将电离能设置为70 eV，记录的质量范围设置为 m / z 35-220，每秒6次扫描。
- 如上所述，提取和分析商业标准的1 ppm溶液。此外，在样品数据采集之前，运行含有所有稀释的商业标准品的混合物，与300μLNaCl溶液和900μLHPLC级水混合，以检查设备的正确校准。此外，在每批中单独包括含有NaCl溶液的空白样品。
5. GC-MS谱图谱图分析：VOC鉴定和半定量
- 使用制造商提供的软件打开原始GC-MS配置文件。为了鉴定化合物，比较其保留时间和质谱，以及从样品色谱图中确定的Kovats线性保留指数以及从真实标准品中获得的保留指数。对于每种商业标准，注释保留时间和最丰富的 m / z 离子。然后，为每个VOC选择特定的 m / z 离子（表1）。
- 根据标准保留时间和所选 GC-MS 原始文件的所选 m/z 离子自动集成 VOC 峰。为此，请为每个VOC提供一个列表，其中包含保留时间和选定的 m / z 离子。虽然软件会自动积分与序列设置中提供的相同保留时间和 m/z 离子相对应的峰面积，但请检查每个峰值的正确积分，并在必要时手动校正。
- 计算每个VOC相对于内标的峰值面积，以最大限度地减少仪器变化和强度漂移。
注意：在分析来自不同基因型或生长和储存条件的水果时，强烈建议确定相对于水果干重含量的VOC含量，以排除由于含水量差异而产生的稀释效应。 - 对于批量效应校正，将每个样品的VOC峰面积归一化为同一运行中分析的对照样品中的相应峰面积。
注：获得相对VOC定量;然而，出于实验的目的，可以相对于任何样品确定VOC含量（例如，未处理的水果以比较储存对VOC水平的影响）。
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Representative Results
在不同条件或地点生长或属于不同基因型的大量水果作物中进行高通量VOC分析对于准确的香气表型是必要的。本文介绍了一个快速、半自动化的HS-SPME/GC-MS平台，用于黑加仑品种的VOC相对定量。VOC检测和鉴定基于为分析浆果果实种类而开发的文库（表1）。在上述条件下，HS-SPME/GC-MS获得的典型成熟黑醋栗果实挥发性剖面图（总离子色谱图）如图 1A所示。总共确定了63种VOC，属于几种化学类别，其中大多数是酯类（27种），醛类（12种），醇类（8种），酮类（7种），萜烯（5种）和呋喃（3）（表1）。
萜类化合物、酯类化合物和C6化合物被描述为在黑醋栗挥发物中占主导地位，并且对新鲜水果的香气很重要5，17。与之前的这些研究一致，图1A中观察到的一些最丰富的峰对应于两个单萜（芳樟醇和松油醇）和两个C6化合物（（E）-2-己烯醛和（Z）-3-己烯醛）。从黑醋栗剖面中获得的样品质谱及其与纯商业标准品光谱的比较分别显示在图1B和图1C中，用于（E）-2-己烯醛和松油醇。
图1：HS-SPME/GC-MS（来自"Andega"品种）获得的成熟黑醋栗果实的代表性色谱图。（Z）-3-己烯醛（保留时间14.33分钟），（E）-2-己烯醛（15.86分钟），芳樟醇（21.65分钟）和松油醇（24.01分钟）峰分别表示为数字1，2，3和4。（B）来自黑醋栗剖面的对应于（E）-2-己烯峰的质谱，并与纯商业标准进行比较。（C）来自黑醋栗剖面的对应松油醇峰的质谱以及与纯商业标准的比较。缩写：HS-SPME/GC-MS = 顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用。请点击此处查看此图的放大版本。
虽然萜烯被描述为黑醋栗果实新鲜度的指标，但C6化合物被称为"绿叶挥发物"，赋予水果和蔬菜香气"绿色"香气34。因此，对不同黑醋栗品种的成熟果实排放的这些VOCs进行半定量可能是改善风味相关性状的第一步。此外，由于环境和植物生长条件强烈影响水果VOC含量，这是香气育种的主要缺点之一，本研究的目标之一是验证同一品种（"Ben Tron"，"Ben Gairn"，"Ben Tirran"和"Tihope"）中已鉴定的VOC的半定量在波兰和苏格兰等截然相反的欧洲地区可重复的假设。正如预期的那样，对四个不同黑加仑品种的VOC剖面进行主成分分析（PCA）表明，环境对挥发性含量有强烈影响，因为主成分（PC）1根据其位置分离样品（图2）。然而，基因型的影响可以用PC2观察到，因为"Ben Tirran"与其余品种明显分开（图2）。
图3显示了4个评估黑加仑品种中芳樟醇和（E）-2-己烯醛的相对含量。对于这两个位置，VOC含量被归一化到同一对照样品，其中半定量证实波兰的芳樟醇含量通常高于苏格兰，而（E）-2-己烯醛显示出相反的趋势（图3）。该结果表明了环境对黑醋栗果实中VOC含量的影响，尽管在四个评估品种中存在的两种挥发物的比例是恒定的，其中"Ben Tirran"和"Ben Tron"品种分别显示出芳樟醇和（E）-2-己烯醛的含量最高（图3）。综上所述，这些结果表明，所提出的方法对表型VOC含量有效，并结合遗传方法，可用于果实品质育种的目的。
图2：PCA评估波兰和苏格兰种植的四个黑加仑品种中VOC谱之间的差异。 PC1（环境）解释了46.2%的变异性，而PC2（基因型）贡献了数据集中24.8%的方差。缩写：PCA = 主成分分析;PC1 = 第一主成分;PC2 = 第二主成分;VOC = 挥发性有机化合物。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：在苏格兰和波兰收获的黑加仑香气特征中两种代表性VOC的相对含量 - 芳樟醇和（E）-2-己烯醛。 评估了四种不同的黑加仑品种（"Ben Gairn"，"Ben Tirran"，"Ben Tron"和"Tihope"）。条形表示两个生物重复的平均值，误差线表示标准偏差。通过单因子方差分析进行统计比较，然后进行Tukey的 事后 测试，以确定品种和国家之间VOC含量的显着差异。对于具有相同小写字母（a，ab，b）的VOC含量 ，P< 0.05时未观察到显着差异。缩写： VOCs = 挥发性有机化合物;方差分析 = 方差分析。 请点击此处查看此图的放大版本。
表1：黑醋栗果实中HS-SPME/GC-MS鉴定的挥发性有机化合物清单。 标明了保留时间（分钟）、用于 VOC 鉴定和半定量的选定 m/z 离子、香气描述、化学类别和配方以及 CAS 编号。缩写：HS-SPME/ GC-MS =顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用;挥发性有机化合物=挥发性有机化合物;KRI = 科瓦茨保留指数;化学文摘社编号 = 化学文摘社登记号。请点击此处下载此表格。
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Discussion
长期以来，由于挥发性化合物合成背后的复杂遗传学和生物化学以及缺乏适当表型的技术，水果香气的滋生一直受到阻碍。然而，代谢组学平台的最新进展，结合基因组工具，最终允许鉴定负责消费者偏好的代谢物，并培育出风味更好的作物3。虽然在模型水果番茄9，10方面取得了大部分进展，但在其他经济相关的作物物种（如草莓，苹果或蓝莓）中也可以取得类似的结果2，12，35，36。
本文提出了一种快速且可重复的基于HS-SPME / GC-MS的平台，该平台已成功用于测量不同浆果物种（包括黑醋栗）中的VOC含量，黑醋栗因其精致的风味和显着的营养价值而受到高度赞赏。与以前发表的方法相比，主要改进是通过减少总色谱运行时间来实现的。事实上，能够以足够的分辨率将温度斜坡从5°C/min提高到8°C/min，将色谱时间从50分钟缩短到35分钟（图1A）27。此外，随着时间的推移，向样品中添加的大量NaCl（1 mL 20%NaCl溶液+ 0.5g固体NaCl）似乎对样品的稳定性产生了积极影响。事实上，挥发性分布随着时间的推移是稳定的，并且结合更快的色谱法，每天可以测量多达20-22个样品。
使用内标，如 N-十五烷-d32，以及沿运行过程中生物重复的适当分布，对于防止强度漂移是必要的37。此外，对照或参考样品必须每天至少运行一次分析以进行批量校正。批次之间的差异主要是由检测器灵敏度的变化或纤维老化引起的27。虽然该协议能够检测成熟黑醋栗果实顶部空间中存在的60多种VOC，但读者必须考虑到，通过在拟议的库中添加纯商业标准，可以很容易地增加这个数字（表1）。例如，已发表的研究检测到大量未包含在该分析中的萜类化合物5，17。从这个意义上说，如有必要，可以很容易地将更黑醋栗香气特异性的VOC库放在一起。然而，本研究的目的是使先前建立的库27 适应不同浆果（包括覆盆子，草莓和黑醋栗果实）的VOC测量。
值得注意的是，这里介绍的协议与其他HS-SPME/GC-MS平台一样，具有几个优点和缺点，这些平台已在其他地方讨论过25，26，38。虽然它易于自动化，使其成为需要分析大量样品时的首选技术，但其主要缺点是其对基质效应的敏感性38。此外，在选择SPME纤维涂层和采样条件时应特别小心，具体取决于目标VOCs的化学性质25，27。总而言之，这里提出了一种用于浆果顶部空间中VOC分析的快速和半自动方案，如果需要，可以很容易地适应增加文库大小的使用。预计该平台可以适应其他水果品种，并且与基因组研究和/或感官分析小组结合使用将有助于作物香气分析和改善。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢马拉加大学的 Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación 对HS-SPME /GC-MS的测量。我们感谢萨拉·费尔南德斯-帕拉西奥斯·坎波斯在波动性定量方面提供的帮助。我们也感谢GoodBerry的财团成员提供水果材料。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL screw top headspace vials | Thermo Scientific | 10-HSV | |
| 18 mm screw cap Silicone/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 5 mL Tube with HDPE screw cap | VWR | 216-0153 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002415 | |
| Methanol for HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
| N-pentadecane (D32, 98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
| Sodium chloride | Merck | S9888 | |
| SPME fiber PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
| Stainless grinding jars for TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill |
| Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Triplus RSH autosampler with automated SPME device | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | software |
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