Summary
En headspace solid fas mikroextraction-gas-kromatografi plattform beskrivs här för snabb, pålitlig och halvautomatisk flyktig identifiering och kvantifiering i mogna svarta vinbärsfrukter. Denna teknik kan användas för att öka kunskapen om fruktarom och för att välja sorter med förbättrad smak för avel.
Abstract
Det finns ett ökande intresse för att mäta flyktiga organiska föreningar (VOC) som släpps ut av mogna frukter i syfte att odla sorter eller sorter med förbättrade organoleptiska egenskaper och därmed öka konsumenternas acceptans. Metabolomiska plattformar med hög genomströmning har nyligen utvecklats för att kvantifiera ett brett spektrum av metaboliter i olika växtvävnader, inklusive viktiga föreningar som ansvarar för fruktsmak och aromkvalitet (volatilomik). En metod som använder headspace solid fas mikroextraction (HS-SPME) i kombination med gaskromatografi-mas spektrometri (GC-MS) beskrivs här för identifiering och kvantifiering av VOC som släpps ut av mogna svarta vinbärsfrukter, en bär som är mycket uppskattad för sin smak och hälsofördelar.
Mogna frukter av svarta vinbärsväxter (Ribes nigrum) skördades och frystes direkt i flytande kväve. Efter vävnad homogenisering för att producera ett fint pulver tinades prover och blandades omedelbart med natriumkloridlösning. Efter centrifugering överfördes supernatanten till en headspace glasflaska som innehåller natriumklorid. VOC extraherades sedan med hjälp av en solid fas microextraction (SPME) fiber och en gas kromatograf kopplad till en jon fälla masspektrometer. Flyktig kvantifiering utfördes på de resulterande jonkromatogrammen genom att integrera topparealen, med hjälp av en specifik m/z-jon för varje VOC. Korrekt VOC-anteckning bekräftades genom att man jämförde retentionstider och masspektra av rena kommersiella standarder som körs under samma förhållanden som proverna. Mer än 60 flyktiga organiska föreningar identifierades i mogna svarta vinbärsfrukter som odlades på motsatta europeiska platser. Bland de identifierade flyktiga organiska föreningarna kan viktiga aromföreningar, såsom terpenoider och C6-flyktiga ämnen, användas som biomarkörer för svartvinbärsfruktkvalitet. Dessutom diskuteras fördelar och nackdelar med metoden, inklusive framtida förbättringar. Dessutom har användningen av kontroller för batchkorrigering och minimering av driftintensiteten betonats.
Introduction
Smak är ett viktigt kvalitetsdrag för alla frukter, vilket påverkar konsumenternas acceptans och därmed väsentligt påverkar säljbarheten. Smakuppfattningen innebär en kombination av smak- och luktsystem och beror kemiskt på närvaron och koncentrationen av ett brett spektrum av föreningar som ackumuleras i ätliga växtdelar, eller när det gäller flyktiga organiska föreningar, släpps ut av den mogna frukten1,2. Medan traditionell avel har fokuserat på agronomiska egenskaper som utbyte och skadedjursresistens, har fruktkvalitetsförädling, inklusive smak, länge försummats på grund av den genetiska komplexiteten och svårigheten att korrekt fenotypa dessa egenskaper, vilket leder till konsumenternas missnöje3,4. De senaste framstegen inom metabolomiska plattformar har varit framgångsrika när det gäller att identifiera och kvantifiera viktiga föreningar som ansvarar för fruktsmak och arom5,6,7,8. Dessutom möjliggör kombinationen av metabolitprofilering med genomiska eller transkriptomiska verktyg klargörandet av genetiken bakom fruktsmaken, vilket i sin tur kommer att hjälpa avelsprogram att utveckla nya sorter med förbättrade organoleptiska egenskaper2,4,9,10,11,12,13,14.
Svarta vinbär (Ribes nigrum) bär är mycket uppskattade för sina smak- och näringsegenskaper, som odlas i stor utsträckning över de tempererade zonerna i Europa, Asien och Nya Zeeland15. Merparten av produktionen sker för livsmedelsprodukter och drycker, som är mycket populära i Norden, främst på grund av bärens organoleptiska egenskaper. Fruktens intensiva färg och smak är resultatet av en kombination av antocyaniner, sockerarter, syror och FLYKT som finns i de mogna frukterna16,17,18. Analysen av svarta vinbärs flyktiga går tillbaka till 1960-talet19,20,21. På senare tid har flera studier fokuserat på svarta vinbär VOC, identifiera viktiga föreningar för frukt arom uppfattning och bedöma effekterna av genotyp, miljö, eller lagring och bearbetning villkor på VOC innehåll5,17,18,22,23.
På grund av dess många fördelar är den teknik som valts för flyktig profilering med hög genomströmning HS-SPME/GC-MS24,25. En kiseldioxidfiber, belagd med en polymerfas, är monterad på en sprutanordning, vilket möjliggör adsorption av flyktiga ämnen i fibern tills en jämviktsfas uppnås. Headspace extraktion skyddar fibern från de icke-volatila föreningarna som finns i matrisen24. SPME kan framgångsrikt isolera ett stort antal flyktiga organiska föreningar som förekommer vid mycket varierande koncentrationer (delar per miljard till delar per miljon)25. Dessutom är det en lösningsmedelsfri teknik som kräver begränsad provbehandling. Andra fördelar med HS-SPME är den enkla automatiseringen och dess relativt låga kostnad.
Dess framgång kan dock begränsas, beroende på voc:s kemiska karaktär, extraktionsprotokollet (inklusive tid, temperatur och saltkoncentration), provstabilitet och tillgången på tillräcklig fruktvävnad26,27. Detta dokument presenterar ett protokoll för svarta vinbär VOC isolerade av HS-SPME och analyseras av gas kromatografi i kombination med en jon fälla masspektrometer. En balans mellan mängden växtmaterial, provstabilitet och varaktigheten av extraktion och kromatografi uppnåddes för att kunna bearbeta ett stort antal svarta vinbärsprover, varav några presenterades i denna studie. Voc-profiler och/eller kromatogram av fem sorter (Andega", "Ben Tron", "Ben Gairn", "Ben Tirran" och "Tihope") kommer att presenteras och diskuteras som exempeldata. Dessutom har samma protokoll framgångsrikt omsatts i praktiken för VOC-mätning hos andra fruktbärsarter som jordgubb (Fragaria x ananassa), hallon (Rubusidaeus) och blåbär (Vaccinium spp.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fruktskörd
- Odla mellan 4 och 6 plantor per genotyp och/eller behandling för att säkerställa tillräckligt med fruktmaterial och variabilitet.
- Om möjligt skörda proverna samma dag. Om det inte finns tillräckligt med fruktmaterial, slå ihop prover som skördats vid olika datum.
OBS: Det rekommenderas att skördetiden (morgon, middag, eftermiddag) förblir ungefär identisk eftersom VOC-profiler påverkas av dagtid/ dygnsrytm28,29,30,31. - Utvärdera fruktmognadsstadiet genom visuell observation32. Poolfrukter från samma mognadsstadium, eftersom mogningsstatus starkt påverkar VOC-utsläpp. Kassera alla skadade eller patogeninfekterade frukter.
OBS: För att bättre bedöma fruktmognad kan texturanalys utföras33. Dessutom kan räkningen dagar efter blomningen användas för att säkerställa att poolade frukter tillhör ett liknande mogningsstadium. - Inkludera minst 10-15 frukter per biologisk replikat (3 till 5) för VOC-analys.
OBS: Här skördades tre separata pooler med 13-20 frukter (biologiska replikat) av "Andega", "Ben Tron", "Ben Gairn", "Ben Tirran" och "Tihope"-sorter på två platser (Polen och Skottland) sommaren 2018 och frystes direkt i flytande kväve. Prover skickades sedan till laboratoriet och bearbetades enligt beskrivningen nedan. - När du har skördat, frys alla frukter omedelbart i flytande kväve och förvara dem därefter vid -80 °C tills bearbetningen.
OBS: Om möjligt kan frukt bearbetas direkt efter skörden. I det här fallet kan färska frukter homogeniseras i en mixer, vägas och analyseras direkt (steg 3.1 framåt). För att förhindra att frukter ytterligare postharvest degradativa processer, bör det färska materialet lagras i en kylare (4 °C) och bearbetas så snabbt som möjligt. Om det inte hanteras på rätt sätt kan flytande kväve orsaka kalla brännskador och kan orsaka kvävning i dåligt ventilerade utrymmen.
2. Fruktprov och reagensberedning
- Mala frukterna till ett fint pulver, var noga med att alltid hålla dem frysta med hjälp av flytande kväve. Använd en kryogen kvarn, pärlkvarn eller en mortel och mortel för homogenisering. Förkyl rostfria slipburkar eller mortel och mortel med flytande kväve för att undvika provupptining.
OBS: Det är viktigt att homogenisera prover till ett fint pulver för att säkerställa korrekt VOC-extraktion. - Väg 1 g fryst material (från steg 2.1) i ett 5 ml-rör som tidigare kylts i flytande kväve och notera den exakta vikten. Håll materialet vid -80 °C tills bearbetningssteg 3.1.
- Inkludera "referens" eller "kontroll" prover i analysen för att kontrollera teknisk variation, inklusive VOC-extraktion och HS-SPME/GC-MS prestanda. För detta ändamål, slå samman en blandning av slumpmässigt utvalda fruktprover och inkludera minst ett kontrollprov per dag för VOC-analys. Använd dessutom en intern standard, som beskrivs i steg 2.5. för att minimera effekten av intensitetsdrift.
- Förbered 20% (w/v) natriumkloridlösning i högpresterande vatten av vätskekromatografi (HPLC) (nedan kallad NaCl-lösning). Lös upp NaCl med hjälp av en magnetisk omrörare; säkerställa tillgången på 1 ml av lösningen per prov.
- Förbered en 1 ppm-lösning i HPLC-klass metanol av N-pentadecane (D32, 98%) från ren kommersiell standard (nedan kallad intern standard).
OBS: N-pentadecane-d32 kommer att användas som en intern standard, och 5 μL per prov kommer att behövas. Metanol bör manipuleras under en rökhuv. - Förbered 1 ppm-lösningar i HPLC-klass metanol av rena kommersiella standarder för VOC-identifiering (se tabell 1 för den förteckning över kommersiella standarder som används i denna studie).
- Förbered 10 ml skruvlocks frontutrymmesflaska genom att tillsätta 0,5 g NaCl i varje nödvändig injektionsflaska. Se till att skruvlocken innehåller ett septum bestående av ett mjukt material, dvs. silikon, med en tunn polytetrafluoretylenfilm på insidan, för att undvika förorening.
3. Provberedning
- Tillsätt 1 ml NaCl-lösning till 5 ml-röret som innehåller det vägda frysta provet. Skaka röret tills provet är helt tinat och homogeniserat.
- Centrifug vid 5000 × g i 5 min vid rumstemperatur.
- Överför supernatanten med en pipettspets på 1000 μL till den NaCl-innehållande huvudutrymmesflaskan. Klipp änden av spetsen för att underlätta denna process.
- Tillsätt 5 μL intern standard till varje provhaltig huvudutrymmesflaska.
4. Datainsamling av HS-SPME/GC-MS
- Placera den slutna huvudutrymmet i en GC-MS autosampler vid rumstemperatur, för en automatiserad HS-SPME/GC-MS-körning, som beskrivs i avsnitt 4. Placera inte biologiska replikat i på varandra följande positioner i autosamplern. fördela dem istället slumpmässigt för att minimera effekten av intensitetsdrift.
OBS: Cirka 10-12 injektionsflaska kan placeras på en gång i autosamplern, utan att det påverkar provstabiliteten. - Förincubera huvudrymdsflaskan 10 min vid 50 °C med omrörning vid 17 x g.
- Sätt in en SPME-enhet i injektionsflaskan för att exponera fibern för huvudutrymmet för VOC-extraktion i 30 min vid 50 °C med omrörning vid 17 x g.
- För in fibern i insprutningsporten i 1 min vid 250 °C i splitless-läge för flyktig desorption.
- Rengör fibern i en SPME-rengöringsstation med kväve (1 bar N2, ≥ 99,8% ren) i 5 min vid 250 °C. Återanvänd fibern ca 100x.
- Analysera VOC med en gaskromatograf kopplad till en jonfälla masspektrometer (se tabellen över material) och utför kromatografi under ett konstant flöde av helium (Han ≥ 99,9999% renhet) på 1 ml/min, med en kolumn som har dimensioner på 60 m x 0,25 mm x 1 μm tjocklek. Använd ett ugnstemperaturprogram som är isotermiskt vid 40 °C i 3 minuter, följt av en 8 °C/min ramp till 250 °C och håller vid 250 °C i 5 min. För masspektrometri ställer du in överföringslinjens och jonkällans temperaturer på 260 °C respektive 230 °C. Ställ in joniseringsenergin på 70 eV och det registrerade massintervallet till m/z 35-220 vid 6 skanningar per s.
- Extrahera och analysera 1 ppm lösningar av kommersiella standarder enligt beskrivningen ovan. Dessutom, kör en blandning som innehåller alla utspädda kommersiella standarder blandat med 300 μL NaCl-lösning och 900 μL HPLC-vatten innan provdata inhämtas för att kontrollera korrekt kalibrering av utrustningen. Inkludera dessutom ett tomt prov som innehåller NaCl-lösningen ensam i varje sats.
5. Analys av GC-MS-profilkromatogram: VOC-identifiering och halvkvantifiering
- Öppna råa GC-MS-profilfiler med programvaran som tillhandahålls av tillverkaren. För att identifiera föreningar, jämför deras retentionstider och masspektra och Kovats linjära retentionsindex som bestäms från kromatogrammen i proverna med retentionsindex som erhållits från autentiska standarder. För varje kommersiell standard, kommentera retentionstid och de vanligaste m/z-jonerna . Välj sedan en specifik m/z-jon för varje VOC (tabell 1).
- Integrera VOC-toppar automatiskt baserat på standardlagringstider och valda m/z-joner för de valda GC-MS-råfilerna. För detta tillhandahåller du en lista för varje VOC med kvarhållningstid och vald m/z-jon . Även om programvaran automatiskt integrerar toppområde som motsvarar samma retentionstid och m/z-jon som anges i sekvensinställningen, kontrollera rätt integrering av varje topp och korrigera den manuellt om det behövs.
- Beräkna toppytan för varje VOC i förhållande till den interna standardens för att minimera instrumentell variation och intensitetsdrift.
OBS: Vid analys av frukt från olika genotyper eller tillväxt- och lagringsförhållanden rekommenderas det starkt att bestämma VOC-halten i förhållande till frukt torrviktshalten för att utesluta utspädningseffekter på grund av skillnader i vattenhalt. - För korrigering av batcheffekt normaliserar du VOC-toppområdet för varje prov till motsvarande toppområde i kontrollexemplet som analyseras i samma körning.
OBS: En relativ VOC-kvantifiering erhålls. Vid försöket kan dock VOC-halten sedan bestämmas i förhållande till vilket prov som helst (t.ex. obehandlade frukter för att jämföra lagringseffekten på VOC-nivåerna).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
VOC-profilering med hög genomströmning i en stor uppsättning fruktgrödor som odlas under olika förhållanden eller platser eller tillhör distinkta genotyper är nödvändig för noggrann aromafenotypning. Här presenteras en snabb och halvautomatisk HS-SPME/GC-MS-plattform för relativ VOC-kvantifiering i svarta vinbärssorter. VOC-upptäckt och identifiering baserades på ett bibliotek som utvecklades för att profilera bärfruktsarter (tabell 1). En typisk mogen flyktig profil för svarta vinbärsfrukter (totalt jonkromatogram) som erhålls av HS-SPME/GC-MS under ovan nämnda förhållanden visas i figur 1A. Totalt identifierades 63 flyktiga organiska föreningar, som tillhörde flera kemiska klasser, varav de flesta var estrar (27), aldehyder (12), alkoholer (8), ketoner (7), terpener (5) och furaner (3) (tabell 1).
Terpenoidföreningar, estrar och C6 föreningar har beskrivits dominera svarta vinbär volatilom och vara viktigt för doften av den färska frukten5,17. I enlighet med dessa tidigare studier motsvarar några av de mest rikliga topparna i figur 1A två monoterpener (linalool och terpineol) och två C6-föreningar ((E)-2-hexenal och (Z)-3-hexenal). Exempel på massspektra från svarta vinbärsprofiler och deras jämförelse med spektra av rena handelsnormer visas för (E)-2-hexenal och terpineol i figur 1B respektive figur 1C.
Figur 1: Representativa kromatogram från mogna svarta vinbärsfrukter som erhållits av HS-SPME/GC-MS (från "Andega"-sorten). (A) Totalt jonkromatogram. (Z)-3-hexenal (Retentionstid 14,33 min), (E)-2-hexenal (15,86 min), linalool (21,65 min) och terpineol (24,01 min) toppar anges med siffrorna 1, 2, 3 respektive 4. B) Massspektrum som motsvarar (E)-2-hexenal topp från en svartvinbärsprofil och jämförelse med en ren kommersiell standard. C) Massspektrum som motsvarar terpininolstoppar från en svartvinbärsprofil och jämförelse med en ren kommersiell standard. Förkortning: HS-SPME/GC-MS = headspace solid fas mikroextraction i kombination med gaskromatografi-masspektrometri. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Medan terpener har avbildats som indikatorer på svartvinbärsfrukt friskhet, C6 föreningar är kända som "gröna blad flyktiga", ger "gröna" anteckningar till frukt och vegetabilisk arom34. Halvkvantifieringen av dessa flyktiga organiska föreningar som släpps ut av mogna frukter av olika svarta vinbärssorter kan således vara det första steget för att förbättra smakrelaterade egenskaper. Eftersom miljö- och växttillväxtförhållandena starkt påverkar voc-halten i frukt, som är en av de största nackdelarna för aromuppfödning, var ett av målen med denna studie att validera hypotesen att halvkvantifieringen av de identifierade flyktiga organiska föreningarna i samma sorter (Ben Tron", "Ben Gairn", "Ben Tirran" och "Tihope") var reproducerbar på diametralt motsatta europeiska platser som Polen och Skottland. Som förväntat visade huvudkomponentanalysen av VOC-profilerna för fyra olika svarta vinbärssorter att miljön starkt påverkar flyktigt innehåll, eftersom huvudkomponenten (PC) 1 separerar prover baserat på deras placering (figur 2). Effekten av genotyp kan dock observeras med PC2, eftersom "Ben Tirran" är tydligt skild från de återstående sorterna (figur 2).
Figur 3 visar det relativa innehållet i linalool och (E)-2-hexenal i de fyra bedömda svarta vinbärsskulterna. För båda platserna normaliserades VOC-halten till samma kontrollprov, för vilket halvkvantifieringen bekräftade att linaloolhalten i allmänhet var högre i Polen än i Skottland, medan (E)-2-hexenal visar den motsatta trenden (figur 3). Detta resultat visar miljöpåverkan på VOC-halten i svarta vinbärsfrukter, även om andelen av de två flyktiga ämnena i de fyra bedömda sorterna var konstant, med "Ben Tirran" och "Ben Tron"-sorter som visade de högsta mängderna linalool respektive (E)-2-hexenal (figur 3). Sammantaget tyder dessa resultat på att den föreslagna metoden är giltig för voc-innehåll av fenotyp och i kombination med genetiska metoder får användas för fruktkvalitetsuppfödning.
Figur 2: PCA för att bedöma variansen mellan VOC-profiler i de fyra svarta vinbärssorter som odlas i Polen och Skottland. PC1 (miljö) förklarar 46,2 % av variabiliteten, medan PC2 (genotyp) bidrar med 24,8 % av variansen i datauppsättningen. Förkortningar: PCA = huvudkomponentanalys; PC1 = den första huvudkomponenten; PC2 = den andra huvudkomponenten; VOC = flyktig organisk förening. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Relativt innehåll av två representativa flyktiga organiska föreningar i doftprofiler för svarta vinbär och (E)-2-hexenal, skördade i Skottland och Polen. Fyra olika svarta vinbärssorter bedömdes (Ben Gairn", "Ben Tirran", "Ben Tron" och "Tihope"). Staplarna representerar medelvärdena för två biologiska replikat och felstaplar representerar standardavvikelsen. Statistiska jämförelser utfördes av enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc-test för att fastställa betydande skillnader i VOC-innehåll mellan sorter och länder. För VOC-innehåll med samma gemener (a, ab, b) observerades inga signifikanta skillnader vid P < 0, 05. Förkortningar: VOC = flyktiga organiska föreningar; ANOVA = analys av varians. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Tabell 1: Förteckning över flyktiga organiska föreningar som identifierats av HS-SPME/GC-MS i svarta vinbärsfrukter. Retentionstid (min), vald m/z-jon för VOC-identifiering och halvkvantifiering, arombeskrivning, kemisk klass och formel samt CAS-nummer anges. Förkortningar: HS-SPME/GC-MS = mikroextraktion i huvudrymden i fast fas i kombination med gaskromatografi-masspektrometri. VOC = flyktiga organiska föreningar; KRI = Kovats retentionsindex; CAS-nummer = Registernummer för Chemical Abstracts Service. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uppfödning för fruktarom har länge hindrats av den komplexa genetik och biokemi som ligger till grund för syntesen av flyktiga föreningar och bristen på teknik för korrekt fenotypning. De senaste framstegen inom metabolomiska plattformar, i kombination med genomiska verktyg, gör det dock äntligen möjligt att identifiera de metaboliter som ansvarar för konsumenternas preferenser och att odla grödor med förbättrad smak3. Medan de flesta framsteg har gjorts i modellen frukt, tomat9,10, kan liknande resultat uppnås i andra ekonomiskt relevanta grödor som jordgubbe, äpple eller blåbär2,12,35,36.
Detta dokument presenterar en snabb och reproducerbar HS-SPME/ GC-MS-baserad plattform som framgångsrikt har använts för att mäta VOC-innehåll i olika bärarter, inklusive svarta vinbär, en frukt som är mycket uppskattad för sin känsliga smak och anmärkningsvärda näringsvärde. Jämfört med tidigare publicerade metoder uppnåddes den viktigaste förbättringen genom att minska den totala kromatografiska körtiden. Det var faktiskt möjligt att öka temperaturrampen från 5 °C/min till 8 °C/min med tillräcklig upplösning, vilket minskade den kromatografiska tiden från 50 min till 35 min (figur 1A)27. Dessutom verkar den höga mängden NaCl som läggs till proverna (1 ml 20% NaCl-lösning + 0,5 g fast NaCl) ha en positiv inverkan på provstabiliteten över tid. Faktum är att flyktiga profiler var stabila över tid, och i kombination med snabbare kromatografi, tillät mätning av upp till 20-22 prover per dag.
Användningen av en intern standard, såsom N-pentadecane-d32, tillsammans med en korrekt fördelning av de biologiska replikaten längs körningen, är nödvändig för att förhindra intensitetsdrift37. Dessutom måste kontroll- eller referensprover köras minst en gång per dag för analys för partikorrigering. Variationer mellan partier orsakas främst av förändringar i detektorkänslighet eller av fiberåldring27. Även om detta protokoll möjliggjorde detektion av mer än 60 flyktiga organiska föreningar som finns i huvudutrymmet för mogna svarta vinbärsfrukter, måste läsarna ta hänsyn till att detta antal enkelt kan ökas genom att lägga till rena kommersiella standarder i det föreslagna biblioteket (tabell 1). Till exempel upptäckte publicerade studier ett stort antal terpenoidföreningar som inte ingick i denna analys5,17. I den meningen kan ett mer svartvinbärs-aromspecifikt VOC-bibliotek lätt sättas ihop, om det behövs. Målet med denna studie var dock att anpassa ett tidigare etablerat bibliotek27 för VOC-mätning i olika bär, inklusive hallon, jordgubbe och svarta vinbärsfrukter.
Det är anmärkningsvärt att det protokoll som presenteras här har flera fördelar och nackdelar, som andra HS-SPME/GC-MS-plattformar, som redan har diskuterats någon annanstans25,26,38. Även om det erbjuder enkel automatisering, vilket gör det till den teknik som väljs när ett stort antal prover måste analyseras, är dess största nackdel dess mottaglighet för matriseffekter38. Dessutom bör särskild försiktighet iakttas vid valet av SPME-fiberbeläggning och med provtagningsförhållanden beroende på den kemiska karaktären hos de riktade flyktiga organiska föreningarna25,27. Sammanfattningsvis presenteras ett snabbt och halvautomatiskt protokoll för VOC-profilering i bärfrukthuvudutrymme här och kan enkelt anpassas för användning med en ökad biblioteksstorlek, om det behövs. Det förväntas att denna plattform kan anpassas till andra fruktarter och i kombination med genomiska studier och/eller sensorisk analyspanel kommer att bidra till att gyromprofilering och förbättring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna tackar Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación från Universitetet i Malaga för HS-SPME/GC-MS mätningar. Vi erkänner hjälpen från Sara Fernández-Palacios Campos i den flyktiga kvantifieringen. Vi tackar också GoodBerrys konsortiemedlemmar för att de tillhandahåller fruktmaterialet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL screw top headspace vials | Thermo Scientific | 10-HSV | |
| 18 mm screw cap Silicone/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 5 mL Tube with HDPE screw cap | VWR | 216-0153 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002415 | |
| Methanol for HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
| N-pentadecane (D32, 98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
| Sodium chloride | Merck | S9888 | |
| SPME fiber PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
| Stainless grinding jars for TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill |
| Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Triplus RSH autosampler with automated SPME device | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | software |
References
- Klee, H. J. Improving the flavor of fresh fruits: Genomics, biochemistry, and biotechnology. New Phytologist. 187 (1), 44-56 (2010).
- Ferrão, L. F. V., et al. Genome-wide association of volatiles reveals candidate loci for blueberry flavor. New Phytologist. 226 (6), 1725-1737 (2020).
- Klee, H. J., Tieman, D. M. The genetics of fruit flavour preferences. Nature Reviews Genetics. 19, 347-356 (2018).
- Vallarino, J. G., et al. Identification of quantitative trait loci and candidate genes for primary metabolite content in strawberry fruit. Horticulture Research. 6, 4 (2019).
- Jung, K., Fastowski, O., Poplacean, I., Engel, K. H. Analysis and sensory evaluation of volatile constituents of fresh blackcurrant (Ribes nigrum L.) fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (43), 9475-9487 (2017).
- Vallarino, J. G., et al. Genetic diversity of strawberry germplasm using metabolomic biomarkers. Scientific Reports. 8, 14386 (2018).
- Zhang, W., et al. Insights into the major aroma-active compounds in clear red raspberry juice (Rubus idaeus L. cv. Heritage) by molecular sensory science approaches. Food Chemistry. 336, 127721 (2021).
- Farneti, B., et al. Exploring blueberry aroma complexity by chromatographic and direct-injection spectrometric techniques. Frontiers in Plant Science. 8, 617 (2017).
- Tikunov, Y., et al. The genetic and functional analysis of flavor in commercial tomato: the FLORAL4 gene underlies a QTL for floral aroma volatiles in tomato fruit. The Plant Journal. 103 (3), 1189-1204 (2020).
- Tieman, D., et al. A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor. Science. 355 (6323), 391-394 (2017).
- Sánchez-Sevilla, J. F., Cruz-Rus, E., Valpuesta, V., Botella, M. A., Amaya, I. Deciphering gamma-decalactone biosynthesis in strawberry fruit using a combination of genetic mapping, RNA-Seq and eQTL analyses. BMC Genomics. 15, 218 (2014).
- Kumar, S., et al. Genome-wide scans reveal genetic architecture of apple flavour volatiles. Molecular Breeding. 35, 118 (2015).
- Bauchet, G., et al. Identification of major loci and genomic regions controlling acid and volatile content in tomato fruit: implications for flavor improvement. New Phytologist. 215 (2), 624-641 (2017).
- Sánchez, G., et al. An integrative ' omics' approach identifies new candidate genes to impact aroma volatiles in peach fruit. BMC Genomics. 14, 343 (2013).
- Hummer, K. E., Dale, A.
- Vagiri, M., et al. Phenols and ascorbic acid in black currants (Ribes nigrum L.): Variation due to genotype, location, and year. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (39), 9298-9306 (2013).
- Marsol-Vall, A., Kortesniemi, M., Karhu, S. T., Kallio, H., Yang, B. Profiles of volatile compounds in blackcurrant (Ribes nigrum) cultivars with a special focus on the influence of growth latitude and weather conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (28), 7485-7495 (2018).
- Varming, C., Petersen, M. A., Poll, L. Comparison of isolation methods for the determination of important aroma compounds in black currant (Ribes nigrum L.) juice, using nasal impact frequency profiling. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52 (6), 1647-1652 (2004).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants I. Higher boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 18, 1105-1114 (1964).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants. III. Chemical characterization of different varieties and stages of ripeness by gas chromatography. Acta Chemica Scandinavica. 20, 529-535 (1966).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants II. Lower boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 20, 522-528 (1966).
- Marsol-Vall, A., Laaksonen, O., Yang, B. Effects of processing and storage conditions on volatile composition and odor characteristics of blackcurrant (Ribes nigrum) juices. Food Chemistry. 293, 151-160 (2019).
- Del Castillo, M. L. R., Dobson, G. Varietal differences in terpene composition of blackcurrant (Ribes nigrum L) berries by solid phase microextraction/gas chromatography. Journal of the Science of Food and Agriculture. 82 (13), 1510-1515 (2002).
- Azzi-Achkouty, S., Estephan, N., Ouaini, N., Rutledge, D. N. Headspace solid-phase microextraction for wine volatile analysis. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2009-2020 (2017).
- Vallarino, J. G., et al. Acquisition of volatiles compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabolomics: Methods and Protocols. Antonio, C. 1778, 225-239 (2018).
- Moreira, N., Lopes, P., Cabral, M., Guedes de Pinho, P. HS-SPME/GC-MS methodologies for the analysis of volatile compounds in cork material. European Food Research and Technology. 242, 457-466 (2016).
- Rambla, J. L., López-Gresa, M. P., Bellés, J. M., Granell, A. Metabolomic profiling of plant tissues. Plant Functional Genomics and Protocols, Methods in Molecular Biology. Alonso, J. M., Stepanova, A. N. 1284, Springer Science+Businesss. 221-235 (2015).
- Abbas, F., et al. Volatile terpenoids: multiple functions, biosynthesis, modulation and manipulation by genetic engineering. Planta. 246 (5), 803-816 (2017).
- Kolosova, N., Gorenstein, N., Kish, C. M., Dudareva, N. Regulation of circadian methyl benzoate emission in diurnally and nocturnally emitting plants. Plant Cell. 13 (10), 2333-2347 (2001).
- Dudareva, N., Pichersky, E., Gershenzon, J.
- Borges, R. M., Ranganathan, Y., Krishnan, A., Ghara, M., Pramanik, G. When should fig fruit produce volatiles? Pattern in a ripening process. Acta Oecologica. 37 (6), 611-618 (2011).
- Jarret, D. A., et al. A transcript and metabolite atlas of blackcurrant fruit development highlights hormonal regulation and reveals the role of key transcription factors. Frontiers in Plant Science. 9, 1-22 (2018).
- Li, B., Lecourt, J., Bishop, G. Advances in non-destructive early assessment of fruit ripeness towards defining optimal time of harvest and yield prediction-a review. Plants. 7 (1), 3 (2018).
- Ul-Hassan, M. N., Zainal, Z., Ismail, I. Green leaf volatiles: Biosynthesis, biological functions and their applications in biotechnology. Plant Biotechnology Journal. 13 (6), 727-739 (2015).
- Gaston, A., Osorio, S., Denoyes, B., Rothan, C. Applying the Solanaceae strategies to strawberry crop improvement. Trends in Plant Science. 25 (2), 130-140 (2020).
- Gilbert, J. L., et al. Identifying breeding priorities for blueberry flavor using biochemical, sensory, and genotype by environment analyses. PLoS ONE. 10 (9), 0138494 (2015).
- Bueno, M., Resconi, V. C., Campo, M. M., Ferreira, V., Escudero, A. Development of a robust HS-SPME-GC-MS method for the analysis of solid food samples. Analysis of volatile compounds in fresh raw beef of differing lipid oxidation degrees. Food Chemistry. 281, 49-56 (2019).
- Burzynski-Chang, E. A., et al. HS-SPME-GC-MS analyses of volatiles in plant populations-quantitating compound × individual matrix effects. Molecules. 23 (10), 2436 (2018).
