Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

mirMachine: חנות אחת לביאור miRNA צמחי

Published: May 1, 2021 doi: 10.3791/62430
Automatic Translation
1, 1, 2
1U.S. Department of Agriculture - Agricultural Research Service, Western Regional Research Center, Crop Improvement and Genetics Research Unit, CA, USA, 2Montana BioAgriculture Inc., Missoula, MT, USA

Summary

כאן אנו מציגים צינור miRNA חדש ואוטומטי לחלוטין, mirMachine ש-1) יכול לזהות miRNAs ידועים וחדשניים בצורה מדויקת יותר ו-2) הוא אוטומטי לחלוטין וזמין באופן חופשי. משתמשים יכולים כעת לבצע סקריפט הגשה קצר כדי להפעיל את צינור mirMachine האוטומטי לחלוטין.

Abstract

מבין סוגים שונים של רנ"א שאינם מקודדים, מיקרו-רנ"א (miRNAs) היו ללא ספק באור הזרקורים בעשור האחרון. כמווסתים לאחר שעתוק של ביטוי גנים, miRNAs ממלאים תפקידי מפתח במסלולים תאיים שונים, כולל התפתחות ותגובה ללחץ a/ביוטי, כגון בצורת ומחלות. רצפי גנום ייחוס איכותיים אפשרו זיהוי וביאור של miRNAs במספר מיני צמחים, שבהם רצפי miRNA נשמרים מאוד. מכיוון שתהליכי זיהוי וביאור miRNA חישוביים הם בעיקר תהליכים מועדים לשגיאות, תחזיות מבוססות הומולוגיה מגבירות את דיוק החיזוי. פיתחנו ושיפרנו את צינור ביאור miRNA, SUmir, בעשור האחרון, המשמש למספר גנומים של צמחים מאז.

מחקר זה מציג צינור miRNA חדש ואוטומטי לחלוטין, mirMachine (miRNA Machine), על ידי (i) הוספת שלב סינון נוסף על תחזיות המבנה המשני, (ii) הפיכתו לאוטומטי לחלוטין, ו-(iii) הצגת אפשרויות חדשות לחיזוי miRNA ידוע המבוסס על הומולוגיה או miRNAs חדשים המבוססים על קריאות ריצוף RNA קטנות באמצעות הצינור הקודם. צינור miRNA החדש, mirMachine, נבדק באמצעות משאב המידע Arabidopsis, TAIR10, שחרור הגנום של Arabidopsis וקונסורציום ריצוף החיטה הבינלאומי (IWGSC) גנום ייחוס חיטה v2.

Introduction

ההתקדמות בטכנולוגיות ריצוף הדור הבא הרחיבה את ההבנה של מבני RNA ואלמנטים רגולטוריים, וחשפה רנ"א חשובים מבחינה פונקציונלית שאינם מקודדים (ncRNAs). מבין סוגים שונים של ncRNAs, מיקרו-רנ"א (miRNAs) מהווים סוג ויסות בסיסי של רנ"א קטנים באורך שבין 19 ל-24 נוקלאוטידים בצמחים 1,2. מאז גילוי ה-miRNA הראשון בנמטודה Caenorhabditis elegans3, נוכחותם ותפקודם של miRNAs נחקרו בהרחבה גם בגנומים של בעלי חיים וצמחים, כמו גםב-4,5,6. miRNAs פועלים על ידי מיקוד mRNA עבור ביקוע או דיכוי תרגום7. עדויות מצטברות הראו גם כי miRNAs מעורבים במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים בצמחים, כולל גדילה והתפתחות8, ביוגנזה עצמית9, ומספר תגובות עקה ביוטיות וא-ביוטיות10.

בצמחים, miRNAs מעובדים בתחילה מתעתיקים ראשוניים ארוכים הנקראים pri-miRNAs11. פרי-miRNAs אלה הנוצרים על ידי RNA פולימראז II בתוך הגרעין הם תעתיקים ארוכים היוצרים מבנה אחורי מתקפל לא מושלם12. הפרי-miRNAs עוברים מאוחר יותר תהליך ביקוע כדי לייצר מבשרי סיכות ראש חד-גדיליות אנדוגניות (ss) של miRNAs הנקראים pre-miRNAs11. הקדם-miRNA יוצר מבנה דמוי סיכת שיער שבו גדיל יחיד מתקפל למבנה דו-גדילי כדי לכרות דופלקס miRNA (miRNA/miRNA*)13. חלבון דמוי דיקר חותך את שני הגדילים של הדופלקס miRNA/miRNA*, ומשאיר 2-נוקלאוטיד 3'-overhangs14,15. דופלקס miRNA הוא מתילציה בתוך הגרעין, אשר מגן על 3'-קצה של miRNA מפני השפלה ופעילות uridylation16,17. הליקאז משחרר את דופלקס ה-miRNA שעבר מתילציה לאחר הייצוא וחושף את ה-miRNA הבוגר לקומפלקס ההשתקה המושרה על-ידי רנ"א (RISC) בציטוזול18. גדיל אחד של הדופלקס הוא miRNA בוגר המשולב ב-RISC , ואילו הגדיל השני, miRNA*, מתפרק. קומפלקס miRNA-RISC נקשר לרצף המטרה המוביל להתפרקות mRNA במקרה של השלמה מלאה או דיכוי תרגומי במקרה של השלמה חלקית13.

בהתבסס על תכונות הביטוי והביוגנזה, תוארו קווים מנחים לביאור miRNA15,19. עם ההנחיות שהוגדרו, לוקאס ובודאק פיתחו את צינור SUmir לביצוע הומולוגיה מבוססת זיהוי miRNA סיליקו בצמחים9. צינור SUmir הורכב משני תסריטים: SUmirFind ו- SUmirFold. SUmirFind מבצעת חיפושי דמיון מול מערכי נתונים ידועים של miRNA באמצעות המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI) סריקת כלי חיפוש יישור מקומי בסיסי (BLAST) עם פרמטרים ששונו כדי לכלול להיטים עם רק 2 או פחות אי התאמות וכדי למנוע הטיה לכיוון פגיעות קצרות יותר (blastn-short -unapped -עונש -1 -פרס 1). SUmirFold מעריך את המבנה המשני של רצפי miRNA פוטטיביים מתוצאות BLAST20 באמצעות UNAfold21. SUmirFold מבדיל בין miRNAs לבין רנ"א מפריעים קטנים על ידי זיהוי המאפיינים של מבנה סיכות הראש. יתר על כן, הוא מבדיל miRNAs מ ssRNAs אחרים כגון tRNA ו rRNA על ידי הפרמטרים, מדד אנרגיה קיפול מינימלי > 0.67 ותכולת GC של 24-71%. צינור זה עודכן לאחרונה על ידי הוספת שני שלבים נוספים כדי (i) להגביר את הרגישות, (ii) להגדיל את דיוק הביאור, ו-(iii) לספק הפצה גנומית של הגנים miRNA חזוי22. בהתחשב בשימור הגבוה של רצפי miRNA צמחיים23, צינור זה תוכנן במקור לחיזוי miRNA מבוסס הומולוגיה. עם זאת, לא ניתן היה לזהות במדויק את ה-miRNAs החדשים עם ניתוח ביואינפורמטיקה זה, שכן הוא הסתמך במידה רבה על שימור רצפים של miRNAs בין מינים קרובים.

מאמר זה מציג צינור miRNA חדש ואוטומטי לחלוטין, mirMachine כי 1) יכול לזהות miRNAs ידועים וחדשים בצורה מדויקת יותר (לדוגמה, הצינור משתמש כעת בתחזיות miRNA חדשניות מבוססות sRNA-seq כמו גם זיהוי miRNA מבוסס הומולוגיה) ו-2) הוא אוטומטי לחלוטין וזמין באופן חופשי. התפוקות כללו גם את ההתפלגויות הגנומיות של ה-miRNAs החזויים. mirMachine נבדקה הן לתחזיות מבוססות הומולוגיה והן לתחזיות מבוססות sRNA-seq בגנומים של חיטה וערבידופסיס . למרות ששוחררה בתחילה כתוכנה חופשית, UNAfold הפכה לתוכנה מסחרית בעשור האחרון. עם שדרוג זה, כלי חיזוי המבנה המשני הועבר מ- UNAfold ל- RNAfold כך ש- mirMachine יכול להיות זמין באופן חופשי. משתמשים יכולים כעת לבצע סקריפט הגשה קצר כדי להפעיל את צינור mirMachine האוטומטי לחלוטין (דוגמאות מסופקות ב- https://github.com/hbusra/mirMachine.git).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תלות בתוכנה והתקנה

  1. התקן יחסי תלות של תוכנה מאתר הבית שלהם או באמצעות conda.
    1. הורד והתקן את Perl, אם הוא עדיין לא מותקן, מאתר הבית שלו (https://www.perl.org/get.html).
      הערה: התוצאות המיוצגות נחזו באמצעות Perl v5.32.0.
    2. הורד את Blast+, תוכנית יישור, מאתר הבית שלה (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK279671/) כקובץ הפעלה וכקוד מקור.
      הערה: התוצאות המיוצגות נחזו באמצעות BLAST 2.6.0+.
    3. התקן חבילה מוכנה מראש של RNAfold מ- https://www.tbi.univie.ac.at/RNA/.
    4. לחלופין, התקן תוכנות אלה באמצעות הקונדה הבאה: i) conda להתקין -c bioconda blast; II) קונדה להתקין -C ביוקונדה וינרנה.

2. ההתקנה והבדיקה של mirMachine

  1. הורד את הגרסה העדכנית ביותר של סקריפטים mirMachine ואת סקריפט השליחה mirMachine מ- GitHub, https://github.com/hbusra/mirMachine.git, ולאחר מכן הגדר את נתיב הסקריפטים ל- PATH.
  2. השתמש בנתוני הבדיקה המסופקים ב- GitHub כדי לוודא שה- mirMachine יחד עם כל יחסי התלות שלו הורדו כראוי.
  3. הפעל את mirMachine על נתוני הבדיקה המוצגים להלן.
    bash mirMachine_submit.sh -f iwgsc_v2_chr5A.fasta -i mature_high_conf_v22_1.fa.filtered.fasta -n 10
    הערה: הגדר את האפשרות - n ל- 10 מכיוון שנתוני הבדיקה מכילים רק כרומוזום אחד של גנום החיטה. בברירות מחדל, האפשרות -n מוגדרת ל - 20.
  4. שלוט בקבצי הפלט של סיכות השיער.tbl.out.tbl עבור ה-miRNAs הבוגרים החזויים, המבשרים החזויים שלהם ומיקומם על הכרומוזומים.
  5. בדוק את קבצי יומן הרישום עבור יציאות התוכנית ואזהרות.

3. זיהוי miRNA מבוסס הומולוגיה

  1. הפעל את mirMachine באמצעות סקריפט bash המוצג להלן:
    bash mirMachine_submit.sh -f $genome_file -i $input_file -m $mismatches -n $number_of_hits
  2. בדוק את miRNAs חזוי. מצא את קובץ הפלט בשם $input_file.results.tbl.hairpins.tbl.out.tbl עבור miRNAs החזויים. מצא את קובץ הפלט בשם $input_file.results.tbl.hairpins.fsa עבור רצפי FASTA שלפני miRNA. מצא את קובץ הפלט בשם $input_file.results.tbl.hairpins.log עבור קובץ יומן סיכות השיער.

4. זיהוי miRNA חדשני

  1. עיבוד מקדים של קבצי sRNA-seq FASTQ לפורמט FASTA מתאים. חתוך מתאמים במידת הצורך. אל תחתוך קריאות באיכות נמוכה; במקום זאת, הסר אותם. הסר קריאות המכילות N. המר את קובץ FASTQ לקובץ FASTA ($input_file).
  2. הפעל את mirMachine באמצעות סקריפט bash המוצג להלן.
    bash mirMachine_submit.sh -f $genome_file -i $input_file -n $number_of_hits -sRNAseq -lmax $lmax -lmin $lmin -rpm $rpm
    הערה: $mismatches הוגדר ל-0 עבור תחזיות מבוססות sRNA-seq.
  3. בדוק את miRNAs חזוי. מצא את קובץ הפלט בשם $input_file.results.tbl.hairpins.tbl.out.tbl עבור miRNAs החזויים. מצא את קובץ הפלט בשם $input_file.results.tbl.hairpins.fsa עבור רצפי FASTA pre-miRNA. מצא את קובץ הפלט בשם $input_file.results.tbl.hairpins.log עבור קובץ יומן סיכות השיער.

5. פרמטרים מתקדמים

הערה: ברירות המחדל מוגדרות עבור כל הפרמטרים למעט קובץ הגנום וקובץ miRNA הקלט.

  1. הגדר את האפשרות -db למסד נתונים של פיצוץ כדי לדלג על מסד הנתונים של הפניה לבניין בתוך הצינור.
  2. הגדר את האפשרות - m למספר אי-ההתאמות המותרות.
    הערה: בברירת המחדל, האפשרות -m הוגדרה ל- 1 עבור תחזיות מבוססות הומולוגיה ו- 0 עבור תחזיות מבוססות sRNA-seq.
  3. הגדר את ה- -n למספר הפגיעות שיש לבטל לאחר יישור (ברירת המחדל היא 20). שנה זאת בהתבסס על המינים.
  4. השתמש ב- -long כדי להעריך את המבנים המשניים עבור רשימת החשודים.
  5. השתמש ב-s כדי להפעיל את חיזוי miRNA החדש בהתבסס על נתוני sRNA-seq .
  6. הגדר את האפשרות -lmax לאורך המרבי של קריאות sRNA-seq שייכללו בהקרנה.
  7. הגדר את האפשרות -lmax לאורך המינימלי של קריאות sRNA-seq שייכללו בהקרנה.
  8. השתמש באפשרות -סל"ד כדי להגדיר את סף הקריאות למיליון ( סל" ד).
    הערה: עבור פרמטרים מתקדמים כמו אורך ה-pri-miRNAs/pre-miRNAs, משתמשים מנוסים מוזמנים לשנות את הסקריפטים לצורך מחקר העניין שלהם. בנוסף, אם המשתמשים מתכוונים לדלג על שלבים מסוימים או מעדיפים להשתמש בפלטים שהשתנו, ניתן לשנות את סקריפט השליחה פשוט על ידי הוספת # בתחילת השורות כדי לדלג על שורות אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

צינור miRNA, mirMachine, שתואר לעיל הוחל על נתוני הבדיקה להערכה מהירה של ביצועי הצינור. רק ה-miRNAs הצמחיים בעלי הביטחון הגבוה שהופקדו ב-miRBase v22.1 נבדקו מול כרומוזום 5A של הגנום RefSeq של חיטה IWGSC v224. mirMachine_find החזיר 312 כניסות לרשימה הלא-מיותרת של 189 miRNAs בעלי ביטחון גבוה עם מקסימום של אי-התאמה אחת מותרת (טבלה 1). mirMachine_fold סיווג 49 מהם כ-miRNAs פוטטיביים בהתאם להערכת המבנה המשני. הקבוצה המיוצגת הגבוהה ביותר של miRNAs הייתה miR9666 עם סך של 18 miRNAs שזוהו (איור 1). חלק מה-miRNAs חלקו את אותו miRNA בוגר, אך עובדו מרצף קדם-miRNA שונה. שמותיהם של miRNAs אלה שונו על ידי שם המשפחה miRNA ואחריו מספר ייחודי, למשל, miR156-5p-1 ו- miR156-5p-2. מבין 49 ה-miRNAs הפוטטיביים, זוהו 20 רצפי miRNA בוגרים שאינם יתירים. ניתן לתמלל miRNAs מסוימים מיותר ממקום אחד וכתוצאה מכך מספר גדול יותר של miRNAs מיוצגים. בנתוני הבדיקה, miR9666-3p-5 היה מיוצג פעמיים: אחד על גדיל החישה (ב-602887137) והשני על גדיל האנטיסנס (ב-542053079). כל המיקומים מסופקים ב- GitHub תחת קובץ הפלט TestData בשם mature_high_conf_v22_1.fa.filtered.fasta.results.tbl. סיכות שיער.tbl.out.tbl.

ראיות ביטוי בגנום אחד של צמח מספיקות, בהתחשב בשימור miRNAs בצמחים; עם זאת, ערכת נתונים של miRNA בביטחון גבוה מספקת רק כמות מוגבלת של נתונים. לכן, ההעדפה של המשתמש היא להשתמש ב- miRNAs בעלי ביטחון גבוה ו/או מאומתים בניסוי כערכת נתוני הייחוס ולדלג על שלב אימות הביטוי, או להשתמש בכל ה- miRNAs הצמחיים הזמינים כערכת נתוני הייחוס ולחפש את ראיות הביטוי לאחר מכן. כאן, כאשר ה-miRNAs בעלי הביטחון הגבוה שימשו כקבוצת הייחוס, אשר אומתה באופן ניסיוני באחד הגנומים של הצמח, דילג על שלב אימות הביטוי עבור נתוני הבדיקה.

mirMachine נבדק באמצעות צמחי מונוקוט ודיקוט, כולל אראבידופסיס תליאנה (ערבידופסיס, שחרור TAIR10) וטריטיקום אסטיבום (חיטה, IWGSC RefSeq v2). הביצועים של התחזיות מבוססות ההומולוגיה וה-sRNA-seq הוערכו, והתוצאות הושוו ל-miRDP225, כלי חיזוי miRNA מבוסס NGS. תחזיות מבוססות הומולוגיה בוצעו באמצעות רשימה לא מיותרת של רצפי miRNA בוגרים צמחיים שהופקדו ב- miRbase v2226. תחזיות מבוססות sRNA-seq בוצעו באמצעות מערכי הנתונים הזמינים לציבור; GSM2094927 עבור Arabidopsis ו- GSM1294661 עבור החיטה. בנוסף לתוצאות הגולמיות, התחזיות המבוססות על הומולוגיה סוננו לראיות הביטוי של רצפי כוכבי miRNA ו-miRNA בוגרים באמצעות אותם מערכי נתונים של sRNA-seq.

איור 2 מראה את הביצועים של כל כלי ואת הגדרות mirMachine בשני המינים. הרגישות חושבה כמספר הכולל של miRNAs ידועים שזוהו חלקי המספר הכולל של miRNAs שזוהו. התוצאות הראו כי mirMachine השיג ביצועים טובים יותר מ-miRDP2 מבחינת הרגישות והתחזיות החיוביות האמיתיות בנתוני Arabidopsis . עבור נתוני החיטה, חיזוי מבוסס הומולוגיה של mirMachine, הנתמך על ידי ראיות ביטוי, סיפק רגישות טובה יותר מאשר miRDP2. עבור שני הגנומים, miRDP2 חזה מספר גבוה יותר של חיוביים אמיתיים בהשוואה ל-mirMachine sRNA-seq ותחזיות מבוססות הומולוגיה עם ראיות ביטוי. יש לציין כי miRDP2 מוריד את סף הביטוי (RPM, קורא למיליון) מ 10 ל 1 עבור חיזוי של miRNAs ידועים, וכתוצאה מכך תחזיות חיוביות אמיתיות גבוהות יותר. באופן כללי, mirMachine יכול לשמש לזיהוי של miRNAs חדשים וידועים. אחד היתרונות של mirMachine הוא יכולתו לחזות התפלגות גנומית רחבה של miRNAs פוטטיביים ללא הגבלה של רקמות ותנאים ספציפיים. לבסוף, mirMachine הוא ידידותי למשתמש ומספק גמישות להתאמת פרמטרים כגון מספר פגיעות, אי התאמות, אורך miRNAs ו- RPMs למטרות מחקר ספציפיות. יחד, mirMachine מספק תחזיות מדויקות עבור miRNAs פוטטיביים בתעתיקים ובגנומים של הצמחים.

Figure 1
איור 1: התפלגות משפחות miRNA שזוהו מכרומוזום 5A של גנום הייחוס של חיטה IWGSC v2. תוויות הנתונים מציגות את משפחת ה-miRNA ואת מספר ה-miRNAs השייכים לכל משפחת miRNA. קיצורים: miRNA = מיקרו-רנ"א; IWGSC = קונסורציום ריצוף גנום חיטה בינלאומי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הערכת ביצועים של mirMachine. השוואות של הרגישות והמספר הכולל של miRNAs ידועים שנחזו (חיוביים אמיתיים) מוצגות עבור mirMachine עם תחזיות מבוססות הומולוגיה ומבוססות sRNA-seq ותוכנת miRDP2. קיצור: miRNA = מיקרו-רנ"א. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

גנום גודל הגנום ערכת נתונים של miRNA ייחוס mirMachine_find להיטים mirMAchine_fold להיטים # של משפחות miRNA
נתוני בדיקה ~0.7 ג'יגה-בתים 189 312 49 9
Chr5A

טבלה 1: סטטיסטיקה של מיר-מאשין. נתוני הבדיקה הם מכרומוזום 5A של גנום הייחוס של חיטה IWGSC v2. קיצורים: miRNA = מיקרו-רנ"א; IWGSC = קונסורציום ריצוף גנום חיטה בינלאומי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

צינור ה-miRNA שלנו, SUmir, שימש לזיהוי של miRNAs צמחיים רבים בעשור האחרון. כאן, פיתחנו צינור זיהוי וביאור miRNA חדש, אוטומטי לחלוטין וזמין באופן חופשי, mirMachine. יתר על כן, מספר צינורות זיהוי miRNA כולל, אך לא מוגבל לצינור הקודם, היו תלויים בתוכנת UNAfold21, שהפכה עם הזמן לתוכנה מסחרית, אם כי בעבר הייתה זמינה באופן חופשי. mirMachine חדש ואוטומטי לחלוטין זה אינו תלוי עוד ב- UNAfold; במקום זאת, ה-RNAfold הזמין באופן חופשי מחבילת ViennaRNA27 משמש לחיזוי מבנה משני. בנוסף, כל הסקריפטים עבור mirMachine נאספו בסקריפט bash עם פרמטרים מתכווננים כדי להפוך את mirMachine לכלי חיזוי וביאור miRNA אוטומטי לחלוטין וזמין באופן חופשי.

ה-mirMachine נהנה מהמאפיינים של miRNAs צמחיים ומהביוגנזה שלהם. בניגוד ל-pre-miRNAs של בעלי חיים, קדם-miRNAs של צמחים משתנים באורכם ובתכונות המבניותשלהם 15. כתוצאה מכך, נקבע קריטריון לזיהוי miRNAs צמחיים בהתאם למאפיינים של miRNAs והביוגנזה שלהם15. לא נקבע חתך עבור אורך הקדם-miRNA מכיוון שאורך הקדם-miRNAs הצמחיים יכול להשתנות באופן מדהים ויכול להיות באורך של מאות נוקלאוטידים. במקום זאת, קיפול מבנה pri-miRNA, שהיה מוגבל לאורך של ~700 bp, הוערך לראשונה. מאוחר יותר, רצף קדם-miRNA נחזה מרצפי pri-miRNA המועמדים והוערך לסטטיסטיקות קיפול נכונות.

גנומים צמחיים רבים, במיוחד דגנים חשובים מבחינה אגרונומית כמו חיטה ושעורה, הם בעלי גנומים שחוזרים על עצמם 28,29,30. מלבד התכולה החוזרת הגבוהה, פוליפלואידיה נצפית בחלק מהצמחים הללו24, ומציגה מורכבויות נוספות לזיהוי ואפיון הסיליקו של מבני ה-miRNA. החזרות הן מקור עיקרי לייצור siRNAs31, הדומים ל-miRNAs בצורותיהם הבוגרות; עם זאת, הם נבדלים זה מזה בביוגנזה ובתפקוד32,33. קשה מאוד להעלים את ה-siRNAs מרשימות ה-miRNA המועמדות. למעשה, דווח כי מסד הנתונים הנפוץ ביותר של miRNA, miRBase26, מכיל מספר גדול של siRNAs המבוארים באופן כוזב כ-miRNAs34,35. בהתבסס על ההבדלים בביוגנזה שלהם, mirMachine מסנן את הרנ"א הקטנים שיוצרים זוג מושלם עם גדיל האנטיסנס כ-siRNAs וממקם את הרצפים האלה בטבלה החשודה. בנוסף, ל- mirMachine יש את האפשרות -n, המגדירה את המספר המרבי של פגיעות כדי לסנן את ה- RNAs המועמדים כ- siRNAs.

ראיות ביטוי נדרשות כדי לאמת את כל ה-miRNAs שנחזו בסיליקו. מכיוון ש-miRNAs נשמרים מאוד בין גנומים של צמחים, ראיות ביטוי באחד הגנומים של הצמחים צריכות להיות מספיקות כדי לאשר את תקפותו של ה-miRNA החזוי. לשימוש ברצפי miRNA בוגרים בעלי ביטחון גבוה בתהליך הסינון הראשוני יש יתרון במתן ראיות ביטוי לכל ה-miRNAs החזויים; עם זאת, הרשימה הקצרה של מערך הנתונים הראשוני של miRNA מגבילה את הניבוי של קבוצה מקיפה של miRNAs בגנום. לחלופין, קבוצה מלאה של miRNAs צמחיים שהופקדו במסד הנתונים miRBase יכולה לשמש כמערך נתונים ראשוני במקום סינון עבור miRNAs בביטחון גבוה. מומלץ למשתמשים לחפש ראיות ביטוי באמצעות תגי רצף מבוטא, מיקרו-מערכים של miRNA או נתוני ריצוף RNA קטנים עבור לפחות אחד מהגנומים של הצמחים, אם נתוני ביטוי כלשהם אינם זמינים עבור המינים המעניינים.

תחזיות miRNA מבוססות הומולוגיה יכולות לסייע בהבהרת ההתפלגות הגנומית הרחבה של המשפחה הידועה של miRNAs. miRNAs אלה עשויים לבוא לידי ביטוי ברקמות ובתנאים מסוימים. חיסרון של תחזיות מבוססות הומולוגיה הוא חוסר היכולת לזהות משפחות miRNA חדשות. לעומת זאת, תחזיות מבוססות sRNA-seq יכולות לזהות miRNAs חדשים עם עלות של מספר גבוה של תוצאות חיוביות שגויות. לכן, הבחירה של הגישה הטובה ביותר היא עד המשתמשים ואת המחקר של עניין. mirMachine המוצג כאן יכול לסייע בזיהוי של miRNAs בהתבסס על הומולוגיה של miRNAs ידועים או ריצוף sRNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK279671/ Blast+
https://github.com/hbusra/mirMachine.git mirMachine submission script
https://www.perl.org/get.html Perl
https://www.tbi.univie.ac.at/RNA/ RNAfold
Arabidopsis TAIR10
Triticum aestivum (wheat, IWGSC RefSeq v2)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Voinnet, O. Origin, biogenesis, and activity of plant microRNAs. Cell. 136 (4), 669-687 (2009).
  2. Budak, H., Akpinar, B. A. Plant miRNAs: biogenesis, organization and origins. Functional & Integrative Genomics. 15 (5), 523-531 (2015).
  3. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
  4. Zhang, L., et al. Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1: evidence of cross-kingdom regulation by microRNA. Cell Research. 22 (1), 107-126 (2012).
  5. Pang, K. C., Frith, M. C., Mattick, J. S. Rapid evolution of noncoding RNAs: Lack of conservation does not mean lack of function. Trends in Genetics. 22 (1), 1-5 (2006).
  6. Guleria, P., Mahajan, M., Bhardwaj, J., Yadav, S. K. Plant small RNAs: biogenesis, mode of action and their roles in abiotic stresses. Genomics, Proteomics and Bioinformatics. 9 (6), 183-199 (2011).
  7. Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).
  8. Singh, A., et al. Plant small RNAs: advancement in the understanding of biogenesis and role in plant development. Planta. 248 (3), 545-558 (2018).
  9. Lucas, S. J., Budak, H. Sorting the wheat from the chaff: identifying miRNAs in genomic survey sequences of Triticum aestivum chromosome 1AL. PloS One. 7 (7), 40859 (2012).
  10. Li, S., Castillo-González, C., Yu, B., Zhang, X. The functions of plant small RNAs in development and in stress responses. Plant Journal. 90 (4), 654-670 (2017).
  11. Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization. EMBO Journal. 21 (17), 4663-4670 (2002).
  12. Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO Journal. 23 (2), 4051-4060 (2004).
  13. Bartel, D. P. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  14. Lee, Y., et al. The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. Nature. 425 (6956), 415-419 (2003).
  15. Meyers, B. C., et al. Criteria for annotation of plant microRNAs. Plant Cell. 20 (12), 3186-3190 (2008).
  16. Sanei, M., Chen, X. Mechanisms of microRNA turnover. Current Opinion in Plant Biology. 27, 199-206 (2015).
  17. Li, J., Yang, Z., Yu, B., Liu, J., Chen, X. Methylation protects miRNAs and siRNAs from a 3′-end uridylation activity in Arabidopsis. Current Biology. 15 (16), 1501-1507 (2005).
  18. Rogers, K., Chen, X. Biogenesis, turnover, and mode of action of plant microRNAs. Plant Cell. 25 (7), 2383-2399 (2013).
  19. Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting criteria for plant microRNA annotation in the Era of big data. Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
  20. Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 10 (1), 421 (2009).
  21. Markham, N. R. N., Zuker, M. UNAFold: Software for nucleic acid folding and hybridization. Methods in Molecular Biology. 453, 3-31 (2008).
  22. Alptekin, B., Akpinar, B. A., Budak, H. A comprehensive prescription for plant miRNA identification. Frontiers in Plant Science. 7, 2058 (2017).
  23. Zhang, B., Pan, X., Cannon, C. H., Cobb, G. P., Anderson, T. A. Conservation and divergence of plant microRNA genes. Plant Journal. 46 (2), 243-259 (2006).
  24. Appels, R., et al. Shifting the limits in wheat research and breeding using a fully annotated reference genome. Science. 361 (6403), 7191 (2018).
  25. Wang, Y., Kuang, Z., Li, L., Yang, X. A bioinformatics pipeline to accurately and efficiently analyze the microRNA transcriptomes in plants. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e59864 (2020).
  26. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. MiRBase: Annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42, 68-73 (2014).
  27. Lorenz, R., et al. ViennaRNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26 (2011).
  28. Wicker, T., et al. Impact of transposable elements on genome structure and evolution in bread wheat. Genome Biology. 19 (1), 103 (2018).
  29. Flavell, R. B., Bennett, M. D., Smith, J. B., Smith, D. B. Genome size and the proportion of repeated nucleotide sequence DNA in plants. Biochemical Genetics. 12 (4), 257-269 (1974).
  30. Wicker, T., et al. The repetitive landscape of the 5100 Mbp barley genome. Mobile DNA. 8, 22 (2017).
  31. Yang, Q., Ye, Q. A., Liu, Y. Mechanism of siRNA production from repetitive DNA. Genes and Development. 29 (5), 526-537 (2015).
  32. Lam, J. K. W., Chow, M. Y. T., Zhang, Y., Leung, S. W. S. siRNA versus miRNA as therapeutics for gene silencing. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4 (9), 252 (2015).
  33. Bartel, B. MicroRNAs directing siRNA biogenesis. Nature Structural and Molecular Biology. 12 (7), 569-571 (2005).
  34. Meng, Y., Shao, C., Wang, H., Chen, M. Are all the miRBase-registered microRNAs true? A structure- and expression-based re-examination in plants. RNA Biology. 9 (3), 249-253 (2012).
  35. Berezikov, E., et al. Evolutionary flux of canonical microRNAs and mirtrons in Drosophila. Nature Genetics. 42 (1), author reply 9-10 6-9 (2010).

Tags

ביולוגיה גיליון 171
mirMachine: חנות אחת לביאור miRNA צמחי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cagirici, H. B., Sen, T. Z., Budak,… More

Cagirici, H. B., Sen, T. Z., Budak, H. mirMachine: A One-Stop Shop for Plant miRNA Annotation. J. Vis. Exp. (171), e62430, doi:10.3791/62430 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter