Summary
Qui, presentiamo una nuova pipeline di miRNA completamente automatizzata, mirMachine che 1) può identificare i miRNA noti e nuovi in modo più accurato e 2) è completamente automatizzata e liberamente disponibile. Gli utenti possono ora eseguire un breve script di invio per eseguire la pipeline mirMachine completamente automatizzata.
Abstract
Di diversi tipi di RNA non codificanti, i microRNA (miRNA) sono stati probabilmente sotto i riflettori nell'ultimo decennio. Come regolatori post-trascrizionali dell'espressione genica, i miRNA svolgono ruoli chiave in vari percorsi cellulari, tra cui sia lo sviluppo che la risposta allo stress biotico, come la siccità e le malattie. Avere sequenze genomiche di riferimento di alta qualità ha permesso l'identificazione e l'annotazione dei miRNA in diverse specie di piante, dove le sequenze di miRNA sono altamente conservate. Poiché i processi di identificazione e annotazione dei miRNA computazionali sono per lo più processi soggetti a errori, le previsioni basate sull'omologia aumentano l'accuratezza della previsione. Abbiamo sviluppato e migliorato la pipeline di annotazione dei miRNA, SUmir, nell'ultimo decennio, che è stata utilizzata per diversi genomi vegetali da allora.
Questo studio presenta una nuova pipeline di miRNA completamente automatizzata, mirMachine (miRNA Machine), (i) aggiungendo un ulteriore passo di filtraggio sulle previsioni della struttura secondaria, (ii) rendendolo completamente automatizzato e (iii) introducendo nuove opzioni per prevedere miRNA noti basati sull'omologia o nuovi miRNA basati su piccole letture di sequenziamento dell'RNA utilizzando la pipeline precedente. La nuova pipeline di miRNA, mirMachine, è stata testata utilizzando The Arabidopsis Information Resource, TAIR10, rilascio del genoma di Arabidopsis e il genoma di riferimento del grano v2 dell'International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC).
Introduction
I progressi nelle tecnologie di sequenziamento di prossima generazione hanno ampliato la comprensione delle strutture dell'RNA e degli elementi regolatori, rivelando RNA non codificanti (ncRNA) funzionalmente importanti. Tra i diversi tipi di ncRNA, i microRNA (miRNA) costituiscono una classe regolatrice fondamentale di piccoli RNA con una lunghezza compresa tra 19 e 24 nucleotidi nelle piante 1,2. Dalla scoperta del primo miRNA nel nematode Caenorhabditis elegans3, la presenza e le funzioni dei miRNA sono state ampiamente studiate anche nei genomi animali e vegetali 4,5,6. I miRNA funzionano prendendo di mira gli mRNA per la scissione o la repressione traslazionale7. Prove crescenti hanno anche dimostrato che i miRNA sono coinvolti in una vasta gamma di processi biologici nelle piante, tra cui crescita e sviluppo8, autobiogenesi9 e diverse risposte allo stress biotico e abiotico10.
Nelle piante, i miRNA vengono inizialmente elaborati da lunghi trascritti primari chiamati pri-miRNA11. Questi pri-miRNA generati dalla RNA polimerasi II all'interno del nucleo sono lunghi trascritti che formano una struttura di ripiegamento imperfetta12. I pri-miRNA subiscono successivamente un processo di scissione per produrre precursori endogeni a forcina a singolo filamento (ss) di miRNA chiamati pre-miRNA11. Il pre-miRNA forma una struttura simile a una forcina in cui un singolo filamento si piega in una struttura a doppio filamento per asportare un duplex di miRNA (miRNA / miRNA *)13. La proteina dicer-like taglia entrambi i filamenti del duplex miRNA/miRNA*, lasciando 2-nucleotide 3'-oversporgenze14,15. Il duplex del miRNA è metilato all'interno del nucleo, che protegge l'estremità 3' del miRNA dalla degradazione e dall'attività di uridilazione16,17. Un'elicasi svolge il duplex di miRNA metilato dopo l'esportazione ed espone il miRNA maturo al complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC) nel citosol18. Un filamento del duplex è costituito da miRNA maturi incorporati in RISC, mentre l'altro filamento, miRNA*, è degradato. Il complesso miRNA-RISC si lega alla sequenza bersaglio portando alla degradazione dell'mRNA in caso di piena complementarità o alla repressione traslazionale in caso di complementarità parziale13.
Sulla base delle caratteristiche di espressione e biogenesi, sono state descritte le linee guida per l'annotazione dei miRNA15,19. Con le linee guida definite, Lucas e Budak hanno sviluppato la pipeline SUmir per eseguire un'identificazione basata sull'omologia in silico dei miRNA nelle piante9. La pipeline SUmir era composta da due script: SUmirFind e SUmirFold. SUmirFind esegue ricerche di somiglianza con set di dati miRNA noti attraverso lo screening BLAST (Basic Local Alignment Search) del National Center for Biotechnology Information (NCBI) con parametri modificati per includere hit con solo 2 o meno disallineamenti ed evitare pregiudizi verso hit più brevi (blastn-short -ungapped -penalty -1 -reward 1). SUmirFold valuta la struttura secondaria delle sequenze di miRNA putativi dai risultati di BLAST20 utilizzando UNAfold21. SUmirFold differenzia i miRNA dai piccoli RNA interferenti identificando le caratteristiche della struttura della forcina. Inoltre, differenzia i miRNA da altri ssRNA come tRNA e rRNA in base ai parametri, all'indice minimo di energia di piegatura > 0,67 e al contenuto di GC del 24-71%. Questa pipeline è stata recentemente aggiornata aggiungendo due passaggi aggiuntivi per (i) aumentare la sensibilità, (ii) aumentare l'accuratezza delle annotazioni e (iii) fornire la distribuzione genomica dei geni miRNA previsti22. Data l'elevata conservazione delle sequenze di miRNA vegetali23, questa pipeline è stata originariamente progettata per la previsione dei miRNA basata sull'omologia. I nuovi miRNA, tuttavia, non potevano essere identificati con precisione con questa analisi bioinformatica poiché si basava fortemente sulla conservazione della sequenza dei miRNA tra specie strettamente correlate.
Questo articolo presenta una nuova pipeline di miRNA completamente automatizzata, mirMachine che 1) può identificare i miRNA noti e nuovi in modo più accurato (ad esempio, la pipeline ora utilizza nuove previsioni di miRNA basate su sRNA e identificazione di miRNA basata sull'omologia) e 2) è completamente automatizzata e liberamente disponibile. I risultati hanno incluso anche le distribuzioni genomiche dei miRNA previsti. mirMachine è stato testato sia per le previsioni basate sull'omologia che su quelle basate su sRNA-seq nei genomi del grano e dell'Arabidopsis . Sebbene inizialmente rilasciato come software libero, UNAfold è diventato un software commerciale nell'ultimo decennio. Con questo aggiornamento, lo strumento di previsione della struttura secondaria è stato commutato da UNAfold a RNAfold in modo che mirMachine possa essere liberamente disponibile. Gli utenti possono ora eseguire un breve script di invio per eseguire la pipeline mirMachine completamente automatizzata (esempi sono forniti in https://github.com/hbusra/mirMachine.git).
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Protocol
1. Dipendenze software e installazione
- Installare le dipendenze software dal loro sito principale o utilizzando conda.
- Scarica e installa Perl, se non è già installato, dal suo sito principale (https://www.perl.org/get.html).
NOTA: i risultati rappresentati sono stati previsti utilizzando Perl v5.32.0. - Scarica Blast+, un programma di allineamento, dal suo sito principale (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK279671/) come eseguibile e come codice sorgente.
NOTA: i risultati rappresentati sono stati previsti utilizzando BLAST 2.6.0+. - Installare il pacchetto precompilato di RNAfold da https://www.tbi.univie.ac.at/RNA/.
- In alternativa, installare questi software utilizzando il seguente conda: i) conda install -c bioconda blast; ii) Conda install -c bioconda viennarna.
- Scarica e installa Perl, se non è già installato, dal suo sito principale (https://www.perl.org/get.html).
2. La configurazione e il test di mirMachine
- Scaricare la versione più recente degli script mirMachine e dello script di invio mirMachine da GitHub, https://github.com/hbusra/mirMachine.git, quindi impostare il percorso degli script nel PATH.
- Utilizzare i dati di test forniti in GitHub per assicurarsi che mirMachine insieme a tutte le relative dipendenze siano stati scaricati correttamente.
- Eseguire mirMachine sui dati di test mostrati di seguito.
bash mirMachine_submit.sh -f iwgsc_v2_chr5A.fasta -i mature_high_conf_v22_1.fa.filtered.fasta -n 10
NOTA: impostare l'opzione -n su 10 poiché i dati del test contengono un solo cromosoma del genoma del grano. Per impostazione predefinita, l'opzione -n è impostata su 20. - Controlla i file di output hairpins.tbl.out.tbl per i miRNA maturi previsti, i loro precursori previsti e le loro posizioni sui cromosomi.
- Controllare i file di registro per gli output e gli avvisi del programma.
3. Identificazione di miRNA basata sull'omologia
- Esegui la mirMachine usando lo script bash mostrato di seguito:
bash mirMachine_submit.sh -f $genome_file -i $input_file -m $mismatches -n $number_of_hits - Controlla i miRNA previsti. Trova il file di output denominato $input_file.results.tbl.hairpins.tbl.out.tbl per i miRNA previsti. Trova il file di output denominato $input_file.results.tbl.hairpins.fsa per le sequenze FASTA pre-miRNA. Individuare il file di output denominato $input_file.results.tbl.hairpins.log per il file di registro della forcina.
4. Nuova identificazione dei miRNA
- Pre-elaborare i file sRNA-seq FASTQ nel formato FASTA corretto. Tagliare gli adattatori se necessario. Non tagliare letture di bassa qualità; Invece, rimuovili. Rimuovere le letture contenenti N. Converti il file FASTQ in file FASTA ($input_file).
- Esegui mirMachine usando lo script bash mostrato di seguito.
bash mirMachine_submit.sh -f $genome_file -i $input_file -n $number_of_hits -sRNAseq -lmax $lmax -lmin $lmin -rpm $rpm
NOTA: $mismatches è stato impostato su 0 per le previsioni basate su sRNA-seq. - Controlla i miRNA previsti. Trova il file di output denominato $input_file.results.tbl.hairpins.tbl.out.tbl per i miRNA previsti. Trova il file di output denominato $input_file.results.tbl.hairpins.fsa per le sequenze FASTA pre-miRNA. Individuare il file di output denominato $input_file.results.tbl.hairpins.log per il file di registro della forcina.
5. Parametri di anticipo
NOTA: le impostazioni predefinite sono definite per tutti i parametri ad eccezione del file del genoma e del file miRNA di input.
- Impostare l'opzione -db su un database blast per ignorare il database di riferimento dell'edificio all'interno della pipeline.
- Impostare l'opzione -m sul numero di mancate corrispondenze consentite.
NOTA: per impostazione predefinita, l'opzione - m è stata impostata su 1 per le previsioni basate sull'omologia e 0 per le previsioni basate su sRNA-seq. - Impostare - n sul numero di hit da eliminare dopo l'allineamento (il valore predefinito è 20). Cambia questo in base alla specie.
- Utilizzare - long per valutare le strutture secondarie per l'elenco dei sospetti.
- Usa - s per attivare la nuova previsione dei miRNA basata sui dati sRNA-seq.
- Impostare l'opzione - lmax sulla lunghezza massima delle letture sRNA-seq da includere nello screening.
- Impostare l'opzione - lmax sulla lunghezza minima delle letture sRNA-seq da includere nello screening.
- Utilizzare l'opzione -rpm per impostare la soglia di letture per milione (RPM).
NOTA: Per parametri avanzati come la lunghezza dei pri-miRNA/pre-miRNA, gli utenti esperti sono incoraggiati a modificare gli script per la loro ricerca di interesse. Inoltre, se gli utenti intendono saltare alcuni passaggi o preferiscono utilizzare output modificati, lo script di invio può essere modificato semplicemente aggiungendo # all'inizio delle righe per saltare tali righe.
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Representative Results
La pipeline di miRNA, mirMachine, descritta sopra è stata applicata ai dati di test per la valutazione rapida delle prestazioni della pipeline. Solo i miRNA vegetali ad alta confidenza depositati nella miRBasi v22.1 sono stati sottoposti a screening contro il cromosoma 5A del genoma RefSeq v224 del grano IWGSC. mirMachine_find restituito 312 hit per l'elenco non ridondante di 189 miRNA ad alta confidenza con un massimo di 1 mancata corrispondenza consentita (Tabella 1). mirMachine_fold classificato 49 di loro come miRNA putativi a seconda della valutazione della struttura secondaria. Il gruppo di miRNA più rappresentato è stato miR9666 con un totale di 18 miRNA identificati (Figura 1). Alcuni miRNA condividevano lo stesso miRNA maturo, ma elaborati da una diversa sequenza pre-miRNA. Questi miRNA sono stati rinominati con il nome della famiglia di miRNA seguito da un numero univoco, ad esempio miR156-5p-1 e miR156-5p-2. Tra i 49 miRNA putativi, sono state identificate 20 sequenze di miRNA maturi non ridondanti. Alcuni miRNA possono essere trascritti da più di un locus risultando in un numero maggiore di miRNA rappresentati. Nei dati del test, miR9666-3p-5 è stato rappresentato due volte: una sul filamento di senso (a 602887137) e l'altra sul filamento antisenso (a 542053079). Tutti i percorsi vengono forniti in GitHub nel file di output TestData denominato mature_high_conf_v22_1.fa.filtered.fasta.results.tbl. hairpins.tbl.out.tbl.
L'evidenza di espressione in un genoma vegetale è sufficiente, data la conservazione dei miRNA nelle piante; tuttavia, un set di dati miRNA ad alta affidabilità fornisce solo una quantità limitata di dati. Pertanto, è preferibile che l'utente utilizzi i miRNA ad alta affidabilità e/o convalidati sperimentalmente come set di dati di riferimento e salti la fase di convalida dell'espressione, oppure utilizzare tutti i miRNA vegetali disponibili come set di dati di riferimento e cercare successivamente le prove di espressione. Qui, poiché i miRNA ad alta confidenza sono stati utilizzati come set di riferimento, che era stato convalidato sperimentalmente in uno dei genomi della pianta, la fase di convalida dell'espressione è stata saltata per i dati del test.
mirMachine è stato confrontato utilizzando piante monocotiledoni e dicotiledoni tra cui Arabidopsis thaliana (Arabidopsis, rilascio TAIR10) e Triticum aestivum (grano, IWGSC RefSeq v2). Sono state valutate le prestazioni delle previsioni basate sull'omologia e sulla sRNA-seq e i risultati sono stati confrontati con il miRDP225, uno strumento di previsione dei miRNA basato su NGS. Le previsioni basate sull'omologia sono state eseguite utilizzando l'elenco non ridondante delle sequenze di miRNA mature delle piante depositate nella miRbase v2226. Le previsioni basate su sRNA-seq sono state eseguite utilizzando i set di dati disponibili pubblicamente; GSM2094927 per Arabidopsis e GSM1294661 per il grano. Oltre ai risultati grezzi, le previsioni basate sull'omologia sono state filtrate per l'evidenza di espressione di miRNA maturi e sequenze di stelle miRNA utilizzando gli stessi set di dati sRNA-seq.
La Figura 2 mostra le prestazioni di ogni utensile e le impostazioni di mirMachine sulle due specie. La sensibilità è stata calcolata come il numero totale di miRNA noti identificati diviso per il numero totale di miRNA identificati. I risultati hanno mostrato che mirMachine ha sovraperformato miRDP2 in termini di sensibilità e le vere previsioni positive nei dati di Arabidopsis . Per i dati sul grano, la previsione basata sull'omologia di mirMachine, supportata da prove di espressione, ha fornito una sensibilità migliore rispetto a miRDP2. Per entrambi i genomi, miRDP2 ha predetto un numero maggiore di veri positivi rispetto a mirMachine sRNA-seq e previsioni basate sull'omologia con evidenza di espressione. Va notato che miRDP2 abbassa la soglia di espressione (RPM, letture per milione) da 10 a 1 per la previsione di miRNA noti, con conseguente maggiore previsione vera positiva. In generale, la mirMachine può essere utilizzata per l'identificazione di miRNA sia nuovi che noti. Un vantaggio della mirMachine è la sua capacità di prevedere la distribuzione a livello di genoma dei presunti miRNA senza una limitazione di tessuti e condizioni specifici. Infine, la mirMachine è facile da usare e offre flessibilità per regolare parametri come numero di hit, disallineamenti, lunghezza dei miRNA e RPM per scopi di ricerca specifici. Nel loro insieme, la mirMachine fornisce previsioni accurate per i presunti miRNA nei trascrittomi e nei genomi delle piante.
Figura 1: La distribuzione delle famiglie di miRNA identificate dal cromosoma 5A del genoma di riferimento del grano IWGSC v2. Le etichette dei dati mostrano la famiglia di miRNA e il numero di miRNA appartenenti a ciascuna famiglia di miRNA. Abbreviazioni: miRNA = microRNA; IWGSC = International Wheat Genome Sequencing Consortium. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Valutazione delle prestazioni della mirMachine. I confronti della sensibilità e del numero totale di miRNA noti previsti (veri positivi) sono mostrati per la mirMachine con previsioni basate sull'omologia e basate su sRNA-seq e il software miRDP2. Abbreviazione: miRNA = microRNA. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Genoma | Dimensione del genoma | Set di dati di miRNA di riferimento | mirMachine_find hit | mirMAchine_fold hit | # di famiglie di miRNA |
| Dati di prova | ~0,7 GB | 189 | 312 | 49 | 9 |
| Chr5A |
Tabella 1: Statistiche della mirMachine. I dati del test provengono dal cromosoma 5A del genoma di riferimento del grano IWGSC v2. Abbreviazioni: miRNA = microRNA; IWGSC = International Wheat Genome Sequencing Consortium.
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Discussion
La nostra pipeline di miRNA, SUmir, è stata utilizzata per l'identificazione di molti miRNA vegetali nell'ultimo decennio. Qui, abbiamo sviluppato una nuova pipeline di identificazione e annotazione dei miRNA completamente automatizzata e disponibile gratuitamente, mirMachine. Inoltre, un certo numero di pipeline di identificazione dei miRNA, tra cui, ma non solo, la pipeline precedente, dipendevano dal software UNAfold21, che è diventato un software commerciale nel tempo, sebbene una volta fosse liberamente disponibile. Questa nuova mirMachine completamente automatizzata non dipende più da UNAfold; invece, l'RNAfold liberamente disponibile dal pacchetto ViennaRNA27 viene utilizzato per la previsione della struttura secondaria. Inoltre, tutti gli script per la mirMachine sono stati raccolti in uno script bash con parametri regolabili per rendere mirMachine uno strumento di previsione e annotazione dei miRNA completamente automatizzato e disponibile gratuitamente.
La mirMachine ha beneficiato delle caratteristiche dei miRNA vegetali e della loro biogenesi. A differenza dei pre-miRNA animali, i pre-miRNA vegetali sono variabili in lunghezza e caratteristiche strutturali15. Di conseguenza, è stato fissato un criterio per l'identificazione dei miRNA vegetali a seconda delle caratteristiche dei miRNA e della loro biogenesi15. Non è stato fissato alcun limite per la lunghezza dei pre-miRNA poiché la lunghezza dei pre-miRNA vegetali può variare notevolmente e potrebbe essere lunga centinaia di nucleotidi. Invece, il ripiegamento della struttura pri-miRNA, che era limitato a ~ 700 bp di lunghezza, è stato valutato per la prima volta. Successivamente, la sequenza pre-miRNA è stata prevista dalle sequenze di pri-miRNA candidate e valutata per le corrette statistiche di ripiegamento.
Molti genomi vegetali, in particolare cereali agronomicamente importanti come grano e orzo, possiedono genomi altamente ripetitivi28,29,30. Oltre all'elevato contenuto di ripetizioni, in alcune di queste piante si osserva la poliploidia24, introducendo ulteriori complessità nell'identificazione in silico e nella caratterizzazione delle strutture dei miRNA. Le ripetizioni sono una fonte importante per la produzione di siRNA31, che assomigliano ai miRNA nelle loro forme mature; tuttavia, differiscono in biogenesi e funzione32,33. È estremamente difficile eliminare i siRNA dalle liste di miRNA candidati. Infatti, il database di miRNA più utilizzato, la miRBasi26, è stato segnalato per contenere un gran numero di siRNA annotati falsamente come miRNA34,35. Sulla base delle differenze nella loro biogenesi, la mirMachine filtra i piccoli RNA che formano una coppia perfetta con il filamento antisenso come siRNA e posiziona quelle sequenze nella tabella sospetta. Inoltre, la mirMachine ha l'opzione -n, che definisce il numero massimo di hit per filtrare gli RNA candidati come siRNA.
L'evidenza di espressione è necessaria per convalidare tutti i miRNA previsti in silico. Poiché i miRNA sono altamente conservati tra i genomi delle piante, l'evidenza di espressione in uno dei genomi vegetali dovrebbe essere sufficiente a confermare la validità del miRNA previsto. L'uso di sequenze di miRNA mature ad alta confidenza nel processo di screening iniziale ha il vantaggio di fornire prove di espressione per tutti i miRNA previsti; tuttavia, la breve lista di set di dati iniziali di miRNA limita la previsione di un insieme completo di miRNA in un genoma. In alternativa, un set completo di miRNA vegetali depositati nel database miRBase può essere utilizzato come set di dati iniziale invece di filtrare i miRNA ad alta confidenza. Si consiglia agli utenti di cercare prove di espressione attraverso tag di sequenza espressi, microarray di miRNA o piccoli dati di sequenziamento dell'RNA per almeno uno dei genomi delle piante se non sono disponibili dati di espressione per le specie di interesse.
Le previsioni basate sull'omologia dei miRNA possono aiutare a chiarire la distribuzione a livello di genoma della famiglia nota di miRNA. È probabile che questi miRNA siano espressi in determinati tessuti e condizioni. Uno svantaggio delle previsioni basate sull'omologia è la mancanza di capacità di identificare nuove famiglie di miRNA. Al contrario, le previsioni basate su sRNA-seq potrebbero identificare nuovi miRNA con un costo elevato di un numero elevato di falsi positivi. Pertanto, la scelta dell'approccio migliore spetta agli utenti e alla ricerca di interesse. La mirMachine qui presentata può aiutare l'identificazione dei miRNA sulla base dell'omologia con i miRNA noti o sul sequenziamento dell'sRNA.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK279671/ | Blast+ | ||
| https://github.com/hbusra/mirMachine.git | mirMachine submission script | ||
| https://www.perl.org/get.html | Perl | ||
| https://www.tbi.univie.ac.at/RNA/ | RNAfold | ||
| Arabidopsis TAIR10 | |||
| Triticum aestivum (wheat, IWGSC RefSeq v2) |
References
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