Summary
Het recombinante antilichaameiwit dat tot expressie komt in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-cellen en monoklonale antilichamen geproduceerd met behulp van traditionele hybridoma-technologie kan het varkensaminopeptidase N (APN) -eiwit herkennen en eraan binden.
Abstract
Porcine aminopeptidase N (APN), een membraangebonden metallopeptidase dat overvloedig aanwezig is in dunne darmslijmvlies, kan een mucosale immuunrespons initiëren zonder enige interferentie zoals lage eiwitexpressie, enzyminactiviteit of structurele veranderingen. Dit maakt APN een aantrekkelijke kandidaat bij de ontwikkeling van vaccins die zich selectief richten op het slijmvliesepitheel. Eerdere studies hebben aangetoond dat APN een receptoreiwit is voor zowel enterotoxigene Escherichia coli (E. coli) F4 als overdraagbare gastro-enteritisvirus. APN is dus veelbelovend in de ontwikkeling van antilichaam-medicijnconjugaten of nieuwe vaccins op basis van APN-specifieke antilichamen. In deze studie vergeleken we de productie van APN-specifieke monoklonale antilichamen (mAbs) met behulp van traditionele hybridoma-technologie en recombinante antilichaamexpressiemethode. We hebben ook een stabiel getransfecteerde ovarium (CHO) cellijn van de Chinese hamster vastgesteld met behulp van pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN en een E. coli-expressie BL21 (DE3) stam met de pET28a (+)-rAbs-APN-vector. De resultaten tonen aan dat antilichamen die tot expressie komen in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-cellen en mAbs geproduceerd met behulp van hybridomen het APN-eiwit kunnen herkennen en eraan kunnen binden. Dit vormt de basis voor verdere opheldering van de APN-receptorfunctie voor de ontwikkeling van therapieën gericht op verschillende APN-specifieke epitopen.
Introduction
Aminopeptidase N (APN), een maanlichtenzym dat behoort tot de metalloproteïnase M1-familie, fungeert als een tumormarker, receptor en signaalmolecuul via enzymafhankelijke en enzymonafhankelijke routes 1,2. Naast het splitsen van de N-terminale aminozuurresiduen van verschillende bioactieve peptiden voor de regulatie van hun biologische activiteit, speelt APN een belangrijke rol in de pathogenese van verschillende ontstekingsziekten. APN neemt deel aan antigeenverwerking en -presentatie door bijgesneden peptiden die stevig binden aan belangrijke histocompatibiliteitscomplex klasse II-moleculen 2,3. APN oefent ook ontstekingsremmende effecten uit door zich te binden met G-eiwit-gekoppelde receptoren die deelnemen aan meervoudige signaaltransductie, cytokinesecretie moduleren en bijdragen aan Fc-gammareceptor-gemedieerde fagocytose in de immuunrespons 4,5,6,7.
Als een wijd verspreide membraangebonden exopeptidase is APN overvloedig aanwezig in het dunne darmslijmvlies van varkens en is nauw verbonden met receptorgemedieerde endocytose 1,5,8. APN herkent en bindt het spike-eiwit van het overdraagbare gastro-enteritisvirus voor celinvoer en interageert direct met de FaeG-subeenheid van enterotoxigene Escherichia coli F4 fimbriae om bacteriële hechting met gastheercellen te beïnvloeden 9,10,11. APN is dus een potentieel therapeutisch doelwit bij de behandeling van virale en bacteriële infectieziekten.
Sinds de ontwikkeling van hybridoma-technologie en andere strategieën voor de productie van monoklonale antilichamen (mAbs) in 1975, zijn mAbs op grote schaal gebruikt in immunotherapie, medicijnafgifte en diagnose12,13,14. Momenteel worden mAbs met succes gebruikt om ziekten te behandelen, zoals kanker, inflammatoire darmaandoeningen en multiple sclerose12,15. Vanwege hun sterke affiniteit en specificiteit kunnen mAbs ideale doelwitten zijn bij de ontwikkeling van antilichaam-geneesmiddelconjugaten (ADC) of nieuwe vaccins16,17. Het APN-eiwit is van cruciaal belang voor het selectief afleveren van antigenen aan specifieke cellen en kan een specifieke en sterke mucosale immuunrespons tegen pathogenen veroorzaken zonder enige interferentie, waaronder lage eiwitexpressie, enzyminactiviteit of structurele veranderingen 5,8,18. Daarom zijn therapeutische producten op basis van APN-specifieke mAbs veelbelovend tegen bacteriële en virale infecties. In deze studie beschrijven we de productie van APN-specifieke mAbs met behulp van hybridoma-technologie en expressie van anti-APN recombinante antilichamen (rAbs) met behulp van prokaryote en eukaryote vectoren. Het resultaat geeft aan dat het APN-eiwit werd herkend door zowel rAbs uitgedrukt in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-cellen als hybridoom-afgeleide mAbs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven in deze studie werden goedgekeurd door de Yangzhou University Institutional Animal Care and Use Committee (SYXK20200041).
1. Bereiding van apn-eiwitantigeen bij varkens
OPMERKING: De pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) stam en de APN stabiel tot expressie gebrachte cellen pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 werden geconstrueerd in een eerdere studie11.
- Herstel bacteriën uit een bevroren glycerolvoorraad en streep op Luria-Bertani (LB) platen met 50 μg / ml kanamycine (Km +) voor isolatie van één kolonie.
- Selecteer een enkele kolonie uit de vers gestreepte plaat, kweek in 4 ml LB-medium (10 g / L trypton, 10 g / L natriumchloride (NaCl) en 5 g / L gistextract, pH 7,2) aangevuld met Km + (50 μg / ml), en laat een nacht (12-16 uur) groeien met roeren (178 tpm) bij 37 °C.
- Verdun de bereide bacteriën op 1:100 in verse Km+ LB-bouillon en incubeer bij 37 °C met schudden gedurende 2-3 uur totdat de OD600 0,4-0,6 bereikt.
- Voeg isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe aan het medium tot een eindconcentratie van 0,4 mM en incubeer de culturen gedurende nog eens 10 uur bij 16 °C.
- Centrifugeer en oogst de bacteriën daarom met behulp van IPTG-inductie (10.000 × g, 4 °C 15 min).
- Resuspendeerde de celpellet met behulp van 5 ml LEW (Lysis/Equilibration/Wash) buffer (50 mM watervrij natriumfosfaat monobasisch (NaH2PO4) en 300 mM NaCl, pH 8,0) met 1 mg/ml lysozym. Roer de bacteriële suspensie gedurende 30 minuten op ijs en soniceer volledig (15 s puls en 20 s uit, 15 min) met behulp van een ultrasone homogenisator.
- Centrifugeer het ruwe cellysaat bij 4 °C en 10.000 × g gedurende 30 minuten om celafval te verwijderen. Breng supernatant over in een vooraf gebalanceerde kolom en incuber 1-2 minuten voor de zwaartekrachtdrainage. Herhaal deze stap drie keer.
- Was de kolom met 20 ml LEW-buffer en giet af met behulp van de zwaartekracht. Elueer het histidine-gelabelde APN-eiwit met behulp van 9 ml elutiebuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl en 250 mM imidazool, pH 8,0) en verzamel in dialysebuizen.
- Dialyseer de eiwitoplossing 's nachts bij 4 °C in natriumcarbonaat-natriumbicarbonaat (PBS, 135 mM NaCl, 4,7 mM kaliumchloride, 2 mM NaH 2 PO4 en 10 mM dodecahydraat natriumfosfaat dibasisch, pH7,2) buffer.
- Analyseer met behulp van een 12,0% SDS-PAGE-gel en western blotting om de zuiverheid van het APN-eiwit te beoordelen.
- Laad 5 μg eiwit in elke put van de gel en laat 1,5 uur op 110 V draaien. Breng vervolgens eiwit over op een PVDF-membraan gedurende 50 minuten bij 15 V. Bepaal de concentratie van het gezuiverde eiwit met behulp van een BCA-test.
2. Immunisatie van dieren
- Subcutane (s.c) injecteer vrouwelijke BALB/c muizen, 6-8 weken oud, met 50 μg APN eiwit of PBS (negatieve controle) gemengd met adjuvantia eenmaal per 2 weken. Gebruik het adjuvans van complete Freund dat de door hitte gedode Mycobacteria bevat voor initiële immunisatie en het onvolledige adjuvans van Freund voor boosterimmunisaties. Meng gelijke volumes APN-eiwit (of PBS) en Freund's adjuvans of onvolledig Freund's adjuvans, respectievelijk.
- Detecteer antilichaamtiters tegen APN in de sera van deze muizen door indirecte enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA) met behulp van een microtiterplaat bedekt met 5 μg / ml APN-eiwit verdund in 0,05 M PBS (pH 9,6). .
3. Hybridoma-technologie om monoklonale antilichamen tegen APN te produceren
- Injecteer intraperitoneaal (i.p.) 100 μg APN-eiwit in de geselecteerde muizen voor een laatste antigeenboost.
- Drie dagen later euthanaseer de muizen met pentobarbitalnatrium (50 mg / kg, v / v, intraperitoneaal) en cervicale dislocatie.
- Verzamel milt en was twee keer met DMEM om bloed- en vetcellen te verwijderen. Filter de miltcelsuspensie met behulp van een koperen rooster met 200 mazen om weefselresten te verwijderen en oogst miltcellen met behulp van centrifugatie (1500 × g, 10 min) om het membraan van de milt te verwijderen.
- Zaad muis myeloom SP2/0 cellen in een 25 cm 2 kolf met 5 ml DMEM aangevuld met 6% foetaal runderserum (FBS) en kweek bij 37 °C, 6% CO2 atmosfeer om de levensvatbaarheid van de cel te behouden. Na 5-6 dagen kweek bereiken de cellen 80% -90% samenvloeiing na reanimatie en bevinden ze zich in de groeilogfase. Onder de microscoop zijn de cellen rond, helder en helder.
- Verzamel een dag voor hybridisatie macrofagen uit peritoneale holtes van de muizen volgens een eerder gepubliceerde methode12,19.
- Zaad peritoneale macrofagen met een dichtheid van 0,1-0,2 × 105/ml in 96-putplaten, elk putje met 100 μL HAT-medium (DMEM aangevuld met 10% FBS en 1x HAT-supplement), en incubeer bij 37 °C, 6% CO2 bevochtigde atmosfeer 's nachts.
- Voor hybridisatie, zuig voorzichtig SP2 / 0-cellen op met een pipet van 8-10 flessen en suspensie in 10 ml serumvrij DMEM-medium. Was cellen met verse DMEM, centrifugeer (1500 × g, 10 min) tweemaal en suspensie vervolgens opnieuw in 10 ml DMEM.
- Meng de gekwantificeerde miltcellen met SP2/0-cellen in een verhouding van 10:1 en breng ze over in buisjes van 50 ml. Centrifugeer (1500 × g, 10 min) en gooi het supernatant weg. Verzamel de celpellets aan de onderkant van de buizen en tik met de handpalm om de pellets los te maken voordat ze worden gehybridiseerd.
- Voeg 1 ml polyethyleenglycol 1500 (PEG 1500), voorverwarmd tot 37 °C, druppelsgewijs met behulp van een druppelaar toe aan de losgemaakte celpellet gedurende een periode van 45 s terwijl de bodem van de buis voorzichtig wordt gedraaid.
- Voeg langzaam 1 ml DMEM voorverwarmd tot 37 °C toe aan het bovenstaande mengsel gedurende de periode van 90 s, gevolgd door nog eens 30 ml verse DMEM. Plaats de fusiebuis gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 °C.
- Na incubatie in het warme bad, oogst de cellen en suspensie opnieuw in HAT-medium. Vervolgens kweek in een 96-well plaat ingeënt met peritoneale macrofagen.
- Voeg vijf dagen later 100 μL vers HAT-medium toe aan elke put en incubeer de plaat gedurende nog eens 5 dagen, waarna het medium wordt vervangen door HT-medium (DMEM aangevuld met 10% FBS en 1x HT-supplement).
- Gebruik een microtiterplaat bedekt met 5 μg / ml APN-eiwit verdund in 0,05 M PBS (pH 9,6) om monoklonale antilichamen in het hybridoma-supernatant te analyseren met behulp van ELISA-assay.
- Wanneer het medium in de putten van de 96-putplaat geel wordt (als gevolg van celgroei en metabolietafgifte, daalt de pH in het medium tot 6,8 en fenolrood verandert van fuchsia in geel) of celclusters worden waargenomen, verwerven 100 μL supernatant uit de geselecteerde putten en voegen toe aan de putten van de gecoate ELISA-plaat. Gebruik een microplaatlezer om de OD450-waarden te meten.
- Gebruik de polyklonale antilichamen tegen APN en niet-geïnfecteerd muizenserum als respectievelijk positieve en negatieve controle en gebruik PBS als blanco controle. In deze studie werd de OD450-verhouding tussen monster en negatieve controle (P / N) ≥ 2,1 erkend als positieve selectiestandaard.
- Na drie opeenvolgende positieve selectierondes selecteert u het hybridoom met een verhoogde serologische respons tegen het APN-eiwit voor een beperkte verdunningstest.
- Bereid peritoneale macrofagen en zaad in 96-putplaten zoals eerder beschreven.
- Suspensie hybridoma cellen in HT medium met een gemiddelde van 0,5-2 cellen per put en kweek in een 37 °C, 6% CO2 incubator. Herhaal deze stap drie of vier keer totdat het positieve percentage aangegeven door ELISA-immunoassay 100% bereikt.
- Selecteer onder de druk van continu bevriezen en ontdooien de positieve hybridoomcellen die in staat zijn om stabiel anti-APN-antilichamen af te scheiden en normaal te prolifereren.
- Dien een enkele i.p. injectie van 0,3 ml pristane toe aan elke muis (8-10 weken). Injecteer elke muis 10 dagen na ontvangst met 2-5 x 105 hybridomacellen in 0,5 ml PBS (pH 7,2).
- Verzamel voorzichtig peritoneale vloeistof uit de peritoneale holte van deze muizen 8 tot 10 dagen na de injectie.
- Oogst de supernatanten door centrifugatie bij 5.000 × g gedurende 15 minuten en zuiver antilichamen in de supernatanten met 33% verzadigd ammoniumsulfaat [(NH 4)2SO4] precipitatie en eiwit A agarose.
4. Karakterisering van mAbs tegen APN-eiwit
- Bepaal het immunoglobuline subtype van de verzamelde mAbs met behulp van een SBA Clonotyping System-HRP20. Gebruik SDS-PAGE en western blotting om de zuiverheid en specificiteit van mAb te beoordelen.
- Analyseer mAb-epitoopspecificiteit tegen het APN-eiwit met behulp van ELISA21. Additiviteitswaarde (AV) is de verhouding tussen OD mAbs (a+b) en (OD mAbs-a+OD mAbs-b), die wordt gebruikt om te evalueren ofmAbs dezelfde antigene site herkennen; ODmAbs-a en OD mAbs-b vertegenwoordigen de OD450-waarden van verschillende monoklonale antilichamen tegen APN alleen, en OD mAbs(a +b) vertegenwoordigen de OD450-waarden van een 1: 1-mengsel van tweemAbs tegen APN.
- Beoordeel elk monster ten minste vier replicaties en herhaal het hele experiment ten minste drie keer.
5. Uitdrukking van rAbs tegen APN
- Extraheer totaal RNA uit de bovengenoemde hybridoomcellen en milt van APN-geïmmuniseerde muizen (bijv. TRIzol)22. Synthetiseer complementair DNA (cDNA) met behulp van een cDNA-synthesekit volgens de instructies van de fabrikant.
- Versterk variabele gebieden van mAbs met behulp van geneste PCR en bepaal zware keten (VH) en lichte keten (VL) sequenties met behulp van sequencing. Analyseer de genen die coderen voor VH en VL met behulp van de IMGT-muisgenoomanalysetool (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
- Combineer de VH- en VL-genen met leadersequenties en subkloon ze sequentieel in respectievelijk de pET28a (+) en pIRES2-ZsGreen1-vectoren, met behulp van naadloze kloontechnologie om littekenloze DNA-fragmentinbrenging mogelijk te maken. De specifieke primers staan vermeld in tabel 1.
- Kweek de pET28a (+)-rAbs-APN-BL21-getransformeerde bacteriën in aanwezigheid van 0,4 mM IPTG in orbitale shakers bij 37 °C gedurende 10 uur. Induceer, zuiver en beoordeel vervolgens op de expressie van het rAbs-eiwit met behulp van routinematige eiwitzuivering.
- Zaai 100 μL 0,5 x 105 CHO-cellen per put in een 96-well plaat en incubeer bij 37 °C in een 6% CO 2-atmosfeer gedurende 18-24 uur. Wanneer de cellen 80-90% confluentie bereiken, verdunt u het pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-plasmide met Opti-MEM tot een eindconcentratie van 0,1 μg / μL en incubeert u 5 minuten bij kamertemperatuur voordat u het gebruikt voor transfectie.
- Meng voorzichtig 50 μL verdunde pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN plasmide met 1 μL Lipofectamine 2000 en 49 μL Opti-MEM en incubeer het mengsel gedurende nog eens 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 100 μL mengsel toe aan elke put van een 96-putplaat met CHO-cellen en incubeer bij 37 °C in 6% CO 2-atmosfeer gedurende 4-6 uur.
- Vervang het medium 4-6 h na transfectie door DMEM-F12-medium aangevuld met 10% FBS en incuber de plaat gedurende nog eens 48 uur. Voeg vervolgens 400 μg / ml G418 toe aan elke put om de stabiel getransfecteerde cellen te selecteren.
- Na 10 dagen selectie met DMEM-F12 medium aangevuld met 10% FBS en 400 μg/ml G418, sorteert u de cellen (3,0 × 107 cellen/ml) door fluorescentie-geactiveerde celsortering. Ongeveer 10-15% van de celpopulatie was positief.
- Serieel verdunnen van geoogste positieve cellen, zaad met een gemiddelde van 0,5-2 cellen per put in een 96-well plaat, en kweek in een 37 °C, 6% CO2 incubator. Behoud de stabiel getransfecteerde pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO cellen met behulp van selectie met G418 (200 μg/ml).
- De FBS-concentratie in het hierboven beschreven celkweekmedium neemt geleidelijk af van 10% tot 0% tijdens de logaritmische groeifase gedurende de periode van 3 weken. Pas vervolgens de aanhangende CHO-cellen aan om de groei in suspensie in een serumvrij medium aan te passen.
- Kweek de gezaaide pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-cellen in de logaritmische groeifase in serumvrij medium met een dichtheid van 0,8-1,0 × 105 cellen/ml in schudkolven bij 80-110 rpm schudsnelheid en 37°C, 6% CO2.
- Verzamel de celsuspensie elke 12 uur om veranderingen in de levensvatbaarheid en vitaliteit van de cel te bepalen met behulp van een celtelkit (bijv. CCK-8) volgens de instructies van de fabrikant.
- Antilichaamexpressie bereikt piekniveaus wanneer de levensvatbaarheid van cellen afneemt tot 80% en de celdichtheid 1,0-2,0 × 106 cellen / ml bereikt. Oogst celsupernatanten met behulp van centrifugatie, filter met een polytetrafluorethyleenmembraanfilter van 0,22 μm en zuiver met proteïne A agarose.
- Bevestig de productie van APN-specifieke antilichamen met behulp van indirecte immunofluorescentietests (IFA).
- Bepaal antilichaamtiters en bindingsaffiniteiten met behulp van ELISA-assay zoals eerder beschreven. 23 Bereken de evenwichtsdissociatieconstante (KD-waarde ) van de antilichamen met een logistische vergelijking met vier parameters met behulp van software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie werd het gezuiverde oplosbare APN-eiwit (2,12 mg / ml) gebruikt voor immunisatie van muizen. Muizen die vier keer met tussenpozen van 14 dagen met het APN-eiwit waren geïmmuniseerd, vertoonden een hogere antilichaamtiter tegen APN in hun sera. Hoewel 14 hybridomen werden verkregen met behulp van de fusie-experimenten, overleefden slechts 9 hybridomen de drie continue vries-dooicycli, wat resulteerde in 9 stabiele klonen die antilichamen tegen APN uitscheidden. Al deze cellen zijn rond, helder en helder (figuur 1). De gezuiverde mAbs met zware en lichte ketens (respectievelijk 50 kDa en 25 kDa) werden bevestigd door SDS-PAGE en gevonden in de gezuiverde ascites (figuur 2). De titers van deze anti-APN mAbs in kweeksupernatanten en ascites zijn weergegeven in tabel 2.
Het resultaat van muis mAbs isotypering onthulde dat mAbs afgeleid van klonen 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 en 6C56 IgG2b subklassen bezaten, terwijl APN-2A20 een IgG2a κappa- (κ) type antilichaam was, en mAbs APN-3FD9, -3F10 en -10F3 behoorden tot het IgM-type en verwerkte κ lichte ketens (tabel 3). Zoals weergegeven in tabel 4, vertoonden de meeste van deze mAbs AV-waarden van meer dan 50%, wat aangeeft dat ze zich richtten op verschillende epitopen in de APN, terwijl het APN-5C51-antilichaam antigene epitopen herkende die vergelijkbaar waren met die herkend door APN-3C48, -5B31 en -6C56 mAbs.
APN-5B36 vertoonde een aanzienlijk hogere antilichaamtiter in vergelijking met die van andere mAbs. Daarom werd het APN-5B36 VH-VL-gen versterkt en geligeerd in een pET28a (+) of pIRES2-ZsGreen1-vector om respectievelijk de recombinante expressieplasmiden pET28a (+)-rAbs-APN en pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN te construeren (figuur 3). De antilichamen die tot expressie komen door zowel pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) als pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO cellen werden gezuiverd en geanalyseerd met behulp van ELISA- en IFA-assays. Zoals te zien is in figuur 4, herkende echter alleen het antilichaam dat tot expressie kwam in het supernatant van pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-cellen het APN-eiwit, net als hybridoom-afgeleide mAbs. Dit recombinante antilichaam bestond uit IgG2b zware ketens en lambda lichte ketens, en vertoonde een titer van 2,56 × 105 zoals bepaald met behulp van ELISA. De binding van APN-5B36 mAbs aan APN-eiwitten bereikte eerder een evenwicht dan rAbs (figuur 5), met een KD-waarde van (4,232±0,475) × respectievelijk 10-9 en (2,201±0,367) × 10-8 mol/l.
| Abc | Volgorde (5'-3') | ||
| VH-VL-F | CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG | ||
| VH-VL-R | CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT | ||
| pET28a (+)-F | TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pET28a (+)-R | CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
| pIRES2-ZsGroen1-F | CGACGGTACCGCGGGCCCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pIRES2-ZsGroen1-R | GGGGGGGAGGAGGAGGCGGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
Tabel 1. De specifieke primers die in dit onderzoek zijn gebruikt.
| Cellen | Titers van supernatanten (U/ml) | Titers van ascites (U/ml) |
| 2A20 | 0,64×104 | 3.20×105 |
| 5B31 | 1.28×104 | 1.60×105 |
| 5B36 | 0,64×104 | 1.28×106 |
| 3C48 | 0,16×104 | 0,80×105 |
| 5C51 | 0,16×104 | 0,80×104 |
| 6C56 | 0,80×103 | 0,80×104 |
| 3FD9 | 0,80×103 | 0,80×104 |
| 3F10 | 0,16×104 | 0.16×105 |
| 10F3 | 0,80×103 | 0,32×105 |
Tabel 2. De ELISA-titers van APN mAbs.
| Ig | IgA | Igm | IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | Kappa | Lambda | Samenvatting | |
| 2A20 | 1.735 | 0.023 | 0.011 | 0.006 | 0.903 | 0.044 | 0.015 | 0.137 | 0.073 | IgG2a, Kappa |
| 5B31 | 1.199 | 0.006 | 0.003 | 0.005 | 0.005 | 1.731 | 0.004 | 0.004 | 0.413 | IgG2b, Lambda |
| 5B36 | 1.652 | 0.012 | 0.013 | 0.01 | 0.008 | 2.41 | 0.002 | 0.003 | 0.707 | IgG2b, Lambda |
| 3C48 | 0.951 | 0.063 | 0.068 | 0.104 | 0.062 | 1.785 | 0.059 | 0.065 | 0.51 | IgG2b, Lambda |
| 5C51 | 1.064 | 0.008 | 0.007 | 0.008 | 0.008 | 1.87 | 0.004 | 0.004 | 0.415 | IgG2b, Lambda |
| 6C56 | 0.78 | 0.062 | 0.06 | 0.063 | 0.063 | 1.516 | 0.062 | 0.061 | 0.387 | IgG2b, Lambda |
| 3FD9 | 1.474 | 0.007 | 1.678 | 0.003 | 0.016 | 0.081 | 0.002 | 0.519 | 0.059 | IgM, Kappa |
| 3F10 | 1.21 | 0.002 | 1.454 | 0.009 | 0.008 | 0.054 | 0.003 | 0.414 | 0.096 | IgM, Kappa |
| 10F3 | 1.179 | 0.058 | 1.562 | 0.152 | 0.131 | 0.179 | 0.044 | 0.359 | 0.049 | IgM, Kappa |
Tabel 3. Isotypen van van hybridoom afgeleide APN mAbs.
| mAbs | AV (100 %) | ||||||||
| 2A20 | 5B31 | 5B36 | 3C48 | 5C51 | 6C56 | 3FD9 | 3F10 | 10F3 | |
| 2A20 | - | 0.601 | 0.905 | 0.889 | 0.804 | 0.884 | 1.009 | 1.047 | 0.914 |
| 5B31 | 0.601 | - | 0.871 | 0.754 | 0.464 | 0.694 | 0.613 | 0.88 | 0.989 |
| 5B36 | 0.905 | 0.871 | - | 0.794 | 0.684 | 0.934 | 0.91 | 1.07 | 0.959 |
| 3C48 | 0.889 | 0.754 | 0.794 | - | 0.461 | 0.709 | 0.428 | 1 | 0.787 |
| 5C51 | 0.804 | 0.464 | 0.684 | 0.461 | - | 0.301 | 0.601 | 0.594 | 0.852 |
| 6C56 | 0.884 | 0.694 | 0.934 | 0.709 | 0.301 | - | 1.216 | 0.583 | 0.389 |
| 3FD9 | 1.009 | 0.613 | 0.91 | 0.428 | 0.601 | 1.216 | - | 1.737 | 0.744 |
| 3F10 | 1.047 | 0.88 | 1.07 | 1 | 0.594 | 0.583 | 1.737 | - | 0.682 |
| 10F3 | 0.914 | 0.989 | 0.959 | 0.787 | 0.852 | 0.389 | 0.744 | 0.682 | - |
Tabel 4. Discriminatie van antigeen-epitoopspecificiteit van APN-specifieke mAbs. AV-waarden groter dan 0,5 geven aan dat deze twee mAbs verschillende antigene plaatsen herkennen; AV-waarden kleiner dan 0,5 geven aan dat deze twee mAbs een vergelijkbare antigene plaats herkennen.
Figuur 1. Afbeelding van hybridomen. Onder microscopische analyse zijn hybridomen rond, helder en helder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Recombinante antilichaamexpressieniveaus en ascites geanalyseerd met behulp van SDS-PAGE. a) baan M, eiwitmerker; baan 1, gezuiverd pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) lysaat; baan 2, pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) supernatant; baan 3, ascites vloeistof gezuiverd door 33% (NH 4)2SO4 neerslag. B) baan M, eiwitmerker; baan 1, ascites vloeistof gezuiverd met behulp van eiwit A agarose. In deze test werd 3-5 μg totaal eiwit in elke baan van de gel geladen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Recombinante expressieplasmiden pET28a (+)-rAbs-APN en pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN geanalyseerd met behulp van agarosegel-elektroforese. Lane M, Trans 2K plus DNA-marker; baan 1, pET28a (+) vector (5369 bp); baan 2 en 5, VH-VL gen gecombineerd met APN-5B36 leader sequence; baan 3, pET28a (+)-rAbs-APN plasmide uitgedrukt in BL21 (DE3) E. coli; baan 4, pIRES2-ZsGreen1 vector (5283 bp); baan 6, pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN plasmide uitgedrukt in DH5α E. coli. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Expressie van recombinant antilichaameiwit en ascites geanalyseerd met behulp van indirecte immunofluorescentie. pEGFP-C1-APN-IPEC-J2-cellen (groene fluorescentie) die stabiel APN tot expressie brengen, werden behandeld met (A) PBS, gebruikt als controlebehandeling; B) gezuiverd eiwit, uitgedrukt door pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3); C) APN-polyklonaal antilichaam (1:500); (D) gezuiverde ascitesvloeistof (1:500); E) gezuiverd supernatant verkregen uit pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO cellen (1:500). DAPI werd gebruikt als nucleaire tegenvlek in confocale microscopie. De cellen geïncubeerd met het DyLight 549-geconjugeerde geitenantimuis IgG secundaire antilichaam (1:200) en behandeld met gezuiverde ascites en gezuiverd supernatant van pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO cellen vertoonden een robuust rood-fluorescentiesignaal dat indicatief was zoals het APN polyklonale antilichaam dat deed. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Bepaling van relatieve bindingsaffiniteiten met antilichamen met behulp van de ELISA22. Absorptie van monsters die APN-5B36 mAbs of rAbs bevatten, in afwezigheid en aanwezigheid van APN-eiwit, werd gemeten bij de golflengte van 450 nm. De bindingscurve werd uitgezet met behulp van een logistische curve met vier parameters; X-as toont de logaritmische concentratie van antilichamen en y-as toont de absorptie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inductie van mucosale immuniteit is een van de meest effectieve benaderingen bij het tegengaan van pathogenen en bij het voorkomen en behandelen van verschillende ziekten. APN, een sterk tot expressie gebracht membraangebonden eiwit in het darmslijmvlies, is betrokken bij de inductie van adaptieve immuunrespons en bij receptorgemedieerde virale en bacteriële endocytose 1,5,8. APN wordt gebruikt als antigeendeeltjes in vele formaten van antigeenlading en vaccinafgifte. De orale toediening van APN-gerichte antilichamen kan ook effectieve immuunresponsen veroorzaken 18,24,25. Monoklonale antilichamen gericht op verschillende APN-specifieke epitopen vereisen echter verder onderzoek.
De hier beschreven methoden werden gebruikt om monoklonale antilichamen tegen APN te produceren met behulp van zowel traditionele hybridoma- als recombinante technologieën. Deze aanpak kan worden gebruikt bij de productie van andere mAbs. Ten eerste volgden we een eerder genoemd protocol om negen mAbs te verkrijgen die zijn afgeleid van verschillende hybridoma-klonen. Hoewel de titers van deze mAbs in celsupernatanten en ascites verschillend waren, bevatten alle mAbs de 50 kDa zware keten en 25 kDa lichte keten en vertoonden ze een specifieke binding met het varkens APN-eiwit. De resultaten van isotypering en identificatie van antigeen-epitopen toonden aan dat de meeste mAbs zich richtten op verschillende epitopen en tot verschillende antilichaamtypen behoorden. Deze resultaten geven aan dat traditionele hybridoma-technologie een effectieve keuze blijft bij de productie van mAbs.
Benaderingen die worden gebruikt voor de productie van recombinant-antilichamen kunnen de mAb-productie-efficiëntie verhogen en arbeids- en tijdgerelateerde kosten minimaliseren. Daarom zijn deze benaderingen in populariteit toegenomen, vooral bij de ontwikkeling van antilichamen voor diagnostische en therapeutische toepassingen16,17,26. rAbs vertonen verschillende voordelen ten opzichte van hybridoma-afgeleide mAbs. Ten eerste kunnen rAbs in vitro worden geproduceerd door antilichaamgenen te klonen in expressievectoren, waardoor het gebruik van dieren bij de productie van antilichamen wordt geëlimineerd. Bovendien resulteert het gebruik van eukaryote of prokaryote expressiesystemen om rAbs te produceren in lage batch-to-batch variaties en verhoogt het de betrouwbaarheid en stabiliteit van het eindproduct. Daarentegen herkennen of binden mAbs geproduceerd met behulp van hybridomen vaak niet aan de beoogde antigeen-epitopen en worden ze beïnvloed door hybridoma-cellijndrift, contaminatie en genverlies en mutaties. Momenteel worden van hybridomen afgeleide mAbs meestal gebruikt in diagnostische of therapeutische immuunreagentia, wat de noodzaak benadrukt om stabiele en betrouwbare antilichamen te produceren in een beperkte productieperiode. Voor diagnostische en therapeutische toepassingen is recombinante antilichaamtechnologie een betere keuze dan de traditionele op hybridoom gebaseerde benadering. Dit komt omdat recombinante antilichaamtechnologie ons in staat stelt om de sequentie van rAbs te wijzigen om immunoglobuline-isotypen te schakelen, waardoor de bindingsspecificiteit van het antilichaam 14,16,17 wordt verhoogd.
In deze studie gebruikten we antilichaam-engineeringtechnologie om APN-gerichte recombinante antilichamen te verkrijgen. We ontdekten dat zowel de milt van geïmmuniseerde muizen als hybridomacellen even effectief waren voor het versterken van de mAb zware en lichte ketensequenties. Het antilichaam uitgedrukt door pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) herkende APN niet effectief in ELISA- of indirecte immunofluorescentietests. RAbs uitgedrukt door de pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO celsuspensie en hybridoma-afgeleide mAbs herkenden en binden het APN-eiwit echter effectief. De methoden die in deze studie worden beschreven, kunnen worden gebruikt om op APN-antilichamen gebaseerde ADC en andere therapeutische producten te ontwikkelen die zich richten op verschillende APN-specifieke epitopen. Deze studie zal ook helpen bij het verder verduidelijken van de rol van APN bij de preventie en behandeling van verschillende ziekten. Strategieën om de affiniteit en opbrengst van rAbs te verbeteren, vereisen echter verder onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling. Alle auteurs keurden de publicatie van het manuscript goed en gaven hun uitdrukkelijke toestemming.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Chinese National Science Foundation Grant (nr. 32072820, 31702242), subsidies van Jiangsu Government Scholarship for Overseas Studies (JS20190246) en High-level Talents van Yangzhou University Scientific Research Foundation, een project opgericht door het Priority Academic Program of Development Jiangsu High Education Institution.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | 8.0 | Scientific data analysis and graphing |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
- Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).
- Mina-Osorio, P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target. Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).
- Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders. The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).
- Villaseñor-Cardoso, M. I., Frausto-Del-Río, D. A., Ortega, E. Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages. BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).
- Melkebeek, V., et al. Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).
- Morgan, R., et al. Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity. Arthritis & Rheumatology. 67 (1), Hoboken, N.J. 74-85 (2015).
- Du, Y., et al. Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13. The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).
- Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells. Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).
- Reguera, J., et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).
- Delmas, B., et al. Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV. Nature. 357 (6377), (1992).
- Xia, P., et al. Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae. Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).
- Nakamura, R. M. Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications. Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).
- Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays. Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- El Miedany, Y. MABS: targeted therapy tailored to the patient's need. British Journal of Nursing. 24 (16), Suppl 1 4-13 (2015).
- Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Pharmacology Research & Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Bakshi, S., et al. Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium. Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).
- Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B. Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).
- Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies. Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).
- Zhou, M., et al. Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).
- Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).
- Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. Advances in oral subunit vaccine design. Vaccines. 9, 1 (2020).
- Baert, K., et al. β-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system. Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).
- Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).
